CN111187331A - 一种皂苷类化合物或其药学上可接受的盐、组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

一种皂苷类化合物或其药学上可接受的盐、组合物及其制备方法和用途 Download PDF

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CN111187331A CN202010064807.7A CN202010064807A CN111187331A CN 111187331 A CN111187331 A CN 111187331A CN 202010064807 A CN202010064807 A CN 202010064807A CN 111187331 A CN111187331 A CN 111187331A
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Abstract

本发明涉及一种皂苷类化合物或其药学上可接受的盐、组合物及其制备方法和用途，通过运用多种柱色谱分离方法对绞股蓝的化学成分进行系统的提取、分离和纯化，分离得到了侧链中含有糖基的达玛烷型四环三萜类结构的化合物。本发明技术方案所分离得到的化合物具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、降脂等活性。

Description

一种皂苷类化合物或其药学上可接受的盐、组合物及其制备 方法和用途
技术领域
本发明涉及天然产物药物领域，特别是涉及一种皂苷类化合物或其药学上可接受的盐、组合物及其制备方法和用途。
背景技术
绞股蓝(Gynostemmapentaphyllum(Thunb.)Makino)为葫芦科、绞股蓝属草质攀援植物，茎细弱，具分枝，具纵棱及槽，无毛或疏被短柔毛，又名七叶胆、五叶参、七叶参、小苦药，日本称之甘蔓茶。绞股蓝茎细弱，具分枝，具纵棱及槽，无毛或疏被短柔毛。绞股蓝喜阴湿温和的气候，多野生在林下、小溪边等荫蔽处，多年生攀援草本。分布于中国、缅甸、越南、马来西亚、朝鲜和日本等多国。在中国主要分布在湖南、湖北，云南、广西等省，有“南方人参”、“不老长寿药草”之称；在“星火计划”中，绞股蓝被列为待开发的“名贵中药材”之首位；国家卫生部将其列入保健品名单。本种全草入药，有消炎解毒、止咳祛痰，降血脂，调节血糖，降血压，防抗癌等功效。
目前，研究表明绞股蓝主要有效成份是绞股蓝皂苷、绞股蓝多糖、水溶性氨基酸、黄酮类、多种维生素、微量元素、矿物质等。其中，绞股蓝皂苷基本化学结构具有人参皂苷类似骨架四环三萜的达玛烷型结构，其中部分成分与人参皂苷完全相同。经过广泛的药理研究发现其具有较强的抗动脉硬化、降血脂的作用。绞股蓝中的主要活性成分为皂苷，现有技术中已经分离鉴定出的绞股蓝皂苷高达201种，其苷元大多数都为达玛烷型四环三萜类，侧链中含有糖基的结构极少在报道中见到。
申请人通过运用多种柱色谱分离方法对绞股蓝的化学成分进行系统的提取、分离和纯化，意外地分离得到了侧链中含有糖基的达玛烷型四环三萜类结构的化合物，并意外地发现所分离得到的化合物具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、降脂等活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种侧链中含有糖基的达玛烷型四环三萜类结构的化合物，并提供其组合物、制备方法及用途。
本发明为实现上述目的采用的技术方案是：一种皂苷类化合物或其药学上可接受的盐，具有如式(I)所示结构：
Figure BDA0002375641440000011
式(I)中：
R1为单糖残基或低聚糖残基中的任意一种；
R2为H、OH、任选取代的C1-C8烷硫基、任选取代的C1-C8烷氧基、任选取代的C1-C14烯基中的任一种；
R3为H、OH、单糖残基或低聚糖残基、低聚糖酯残基中的任一种；
R4为H、OH、任选取代的C1-C4烷基中的任一种；
R5为H、OH、任选取代的C1-C4烷基中的任一种；
在上述化合物结构式的定义及下文中，所使用的专业术语均具有如下含义：
C1-C14烷基：碳原子数为1-14的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基或叔丁基；
C1-C14烷氧基：碳原子数为1-14的直链或支链烷基，经氧原子键连接到结构上；
C1-C14烷硫基：碳原子数为1-14的直链或支链烷基，经硫原子键连接到结构上；
C1-C14烯基：碳原子数为1-14的烯基，例如乙烯基；
单糖残基：糖脱去H或OH后的基团；
低聚糖残基：由2-10个单糖通过糖苷键连接形成直链或支链的低度聚合糖脱去H或OH后的基团；
低聚糖酯残基：由2-10个单糖通过糖苷键连接形成直链或支链的低度聚合糖脱去H或OH后的基团且其中至少一个羟基与酸形成酯。
进一步地，式(I)中，所述的单糖残基为葡萄糖、鼠李糖或阿拉伯糖中任一种去氢或去羟基的残基；所述低聚糖残基为葡萄糖、鼠李糖或阿拉伯糖中任一种或任两种共聚形成的基团；所述低聚糖酯残基为葡萄糖、鼠李糖或阿拉伯糖中任一种或任两种共聚、酯化后形成的基团；优选的，单糖残基为-Glc、-Rha或-Ara，低聚糖残基为-Glc-Glc、-Glc-Glc-Glc或-Glc-Glc-Rha，低聚糖酯残基为-Glc-Glc-OAc；
再进一步地，低聚糖残基为-Glc2-Glc、-Glc2、3-(Glc)2、-Glc2-Glc2-Glc或-Glc2-Glc2-Rha、-Glc2-Glc6-Rha；低聚糖酯残基为-Glc2-Glc6-OAc；
进一步地，式(I)中，R1为-Glc、-Glc-Glc、-Glc-(Glc)2、-Glc-Glc-Glc或-Glc-Glc-Rha中的任一种，R3为H、-Glc、-Glc-Glc、-Glc-Glc-OAc；
再进一步地，R1为-Glc、-Glc2-Glc、-Glc2、3-(Glc)2、-Glc2-Glc2-Glc、-Glc2-Glc6-Rha或-Glc2-Glc2-Rha中的任一种，R3为H、-Glc、-Glc2-Glc、-Glc2-Glc6-OAc；
进一步地，式(I)中，R2为未取代的或由-OOH、-OH、O＝取代的碳原子数为6的烯基；R4为H、OH中的任一种；R5为H、OH中的任一种；
进一步地，式(I)中，
R2为
Figure BDA0002375641440000021
进一步地，式(Ⅰ)具体为以下化合物中的任一种：
Figure BDA0002375641440000031
Figure BDA0002375641440000041
所述的药学上可接受的盐可以为本发明的绞股蓝皂苷类化合物与化学上可接受的酸进行反应制得的盐，其中化学上可接受的酸可以是无机酸(如盐酸、硫酸、硝酸或氢溴酸等)或有机酸(如乙酸、丙酸、丙二酸、丁酸、乳酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、马来酸，苯甲酸、琥珀酸、苦味酸、酒石酸、柠檬酸、富马酸等)；所述的药学上可接受的盐也可以为本发明的绞股蓝皂苷类化合物与化学上可接受的碱进行反应制得的盐，其中化学上可(如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸钾、接受的碱可以是无机碱碳酸氢钠或碳酸氢钾)或有机碱(如三甲胺、三乙胺、吡啶等)；
进一步地，所述的药学可接受的盐可以为钾盐、钠盐、铵盐、钙盐、吡啶盐或胆碱盐。
本发明还公开了如上所述的皂苷类化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，用溶剂对绞股蓝进行提取，将得到的提取物用柱层析方法分离，经洗脱、后处理得到所述皂苷类化合物或其药学上可接受的盐；
进一步地，用60％乙醇对绞股蓝进行冷浸提取得到粗提物，用水混悬萃取后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取得到各极性部位提取物，乙酸乙酯提取物用硅胶柱层析，并用二氯甲烷/甲醇混合溶剂进行梯度洗脱、得到10个馏分(馏分1～10)；馏分7(二氯甲烷：甲醇体积比为8:2)经过高效液相色谱法分离得到化合物GP-1、GP-2；正丁醇层用D101大孔树脂(EtOH/H2O)分离、取70％部分用硅胶柱层析、并用二氯甲烷/甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，得到10个馏分(馏分1～10)；馏分7(二氯甲烷：甲醇体积比为10:2)和馏分8(二氯甲烷：甲醇体积比为10:3)合并用硅胶柱层析，并用二氯甲烷/甲醇混合溶剂进行梯度洗脱、经过高效液相色谱法分离得到化合物GP-3、GP-5至GP-14。
本发明还公开了一种药物组合物，包括如上所述的皂苷类化合物或其药学上可接受的盐中的至少一种；
进一步地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料；
进一步地，所述药物组合物的剂型为口服制剂或注射剂；
进一步地，所述口服制剂选自普通片剂、分散片、肠溶片、颗粒、胶囊、滴丸、散剂、口服液或乳剂，所述注射剂为小水针剂、输液剂或冻干粉针。
在一个实施方式中，药物组合物中含有的活性成份(即本发明化合物)的量可以根据患者的病情、医生诊断的情况特定的加以应用，活性化合物的量或浓度在一个较宽的范围内调节，通常，活性化合物的重量范围为组合物重量的1％～90％；优选的，活性化合物的重量范围为组合物重量的1％～20％。
尽管本发明的化合物可以不经任何配制直接给药，但所述的各种化合物优选以与药学上可接受的辅料制备成药物制剂使用。药学上可接受的辅料包括稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、稳定剂、溶剂等。
本发明所述稀释剂包括但不限于淀粉、微晶纤维素、蔗糖、糊精、乳糖、糖粉、葡萄糖等；所述润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、氯化钠、油酸钠、月桂醇硫酸钠、泊洛沙母等；所述粘合剂包括但不限于水、乙醇、淀粉浆、糖浆、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮等；所述崩解剂包括但不限于淀粉泡腾混合物即碳酸氢钠和枸橼酸、酒石酸、低取代羟丙基纤维素等；所述稳定剂包括但不限于多糖如金合欢胶、琼脂、藻酸、纤维素醚和羧甲基甲壳酯等；所述溶剂包括但不限于水、平衡的盐溶液等。
在一个实施方案中，所述药物制剂包括口服制剂与注射制剂。
在一个实施方案中，所述口服制剂为固体口服制剂、液体口服制剂，药剂学可接受的口服剂固体制剂包括，但不限于普通片剂、分散片、肠溶片、颗粒、胶囊、滴丸、散剂等，口服液体制剂有口服液、乳剂。
在一个实施方案中，所述注射剂包括，但不限于小水针、输液、冻干粉针等。
所述制剂可以根据本领域常规的工艺制备而成。
本发明还公开了如上所述的皂苷类化合物或其药学上可接受的盐或如尚所述的药物组合物用于制备抗肿瘤、抗炎、降脂和/或抗氧化药物的用途；
本发明的优点和效果：
本发明提供了一种分离自植物绞股蓝的如式I所示的新化合物，具有新颖的侧链结构；本发明通过生物活性测试实验表明上述化合物具有抗肿瘤、抗炎、降脂和/或抗氧化活性，可作为制备用于抗肿瘤、抗炎、降脂和/或抗氧化的药物，也可作为先导化合物继续进行修饰以得到具备更佳活性的化合物。。
附图说明
图1为绞股蓝提取流程图；
图2为绞股蓝提取物中正丁醇层提取流程图；
图3为Raw 264.7细胞对于绞股蓝中所分离的化合物进行毒性检测的结果；
图4为HepG-2细胞对于绞股蓝所分离的化合物进行毒性检测的结果；
图5为化合物对LPS刺激RAW 264.7细胞生成NO的影响；
图6为化合物对油酸诱导HepG-2细胞生成脂质结果。
具体实施方式
以下通过实施例，对本发明作进一步的具体说明，但这些实施例不对本发明有任何限制。
所选用的绞股蓝2016年10月采购于云南省，经天津中医药大学制药工程学院鉴定为绞股蓝(Gynostemmapentaphyllum(Thunb.)Makino)全草。
不同规格的玻璃层析柱，不同规格的薄层色谱展开槽。
显色剂：10％硫酸乙醇、5％浓硫酸香草醛、溴酚蓝显色剂、FeCl3显色剂依据《中草药有效成分提取分离》方法配制。
石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙腈、乙醇、正丁醇等试剂均为分析纯(购自天津市康科德科技有限公司)。
实施例1
如图1所示，绞股蓝5kg，60％乙醇室温浸泡提取三次，每周一次，滤过，减压浓缩得到提取物浸膏，加适量水混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取三次。合并萃取液减压浓缩得浸膏。取乙酸乙酯层(150g)和正丁醇层(310g)进行分离纯化。采用硅胶色谱柱(100-200目)，以二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱各得到10个馏分(Fr.1-10)，各个馏分经过反复柱层析、重结晶、制备高效液相等方法得到化合物30个。
实施例2
1)化合物GP-1：
3β,12β,20S-trihydroxy-24-hydroperoxydammar-25-ene-20-O-[β-D-glucopyranosyl(1→2)]-β-D-glucopyranoside。
Figure BDA0002375641440000061
白色粉末(甲醇)，HR-ESI-MS给出m/z 861.4809[M-H+HCOOH]-峰(Calcd for:861.4848)，确定分子量为816。结合1H-NMR和13C-NMR确定分子式为C42H72O15，10％硫酸-乙醇显紫色斑点，Liebermann-Burchard反应为阳性，Molish反应为阳性，提示其为三萜皂苷类化合物
1H-NMR(600MHz,pyridine-d5)给出2组糖端基氢信号：δH5.12(1H,d,J＝7.8Hz),5.80(1H,d,J＝7.8Hz)；7个甲基质子信号：δH0.97(3H,s),1.03(3H,s),1.62(3H,s),1.96(3H,s),1.25(3H,s),0.87(3H,s),0.93(3H,s)；1组烯键质子信号：δH5.23(1H,s),5.07(1H,m)。
13C-NMR(150MHz,pyridine-d5)和DEPT-135给出42个碳信号，2个糖端基碳信号：δ97.0(Glc'-1),105.1(Glc″-1)；1组烯碳信号：δ146.4(C-25)和113.6(C-26)；3个连氧次甲基信号：δ78.3(C-3)，71.0(C-12)和90.3(C-24)；1个连氧季碳信号：δ84.5(C-20)。以上数据推测化合物GP-1为一个达玛烷三萜的二糖苷，化合物GP-1的苷元部分与floralquinquenoside D的苷元的NMR的数据基本一致。酸水解经试剂衍生化后与糖标准品的衍生化产物的HPLC对照，表明化合物中存在D-葡萄糖。
HMBC谱显示：δH1.05(H3-18)和δC35.5(C-7),40.4(C-8),52.0(C-14)相关；δH0.93(H3-19)和δC50.6(C-9),39.7(C-1),56.6(C-5),37.7(C-10)相关；δH1.60(H3-21)和δC84.1(C-20),52.9(C-17),40.2(C-22)相关；δH1.62(H3-27)和δC138.4(C-24),81.9(C-25),25.8(C-26)相关；δH1.26(H3-28)和δC78.3(C-3),56.6(C-5),16.7(C-29),39.9(C-4)相关；δH0.96(H3-30)和δC40.4(C-8),52.0(C-14),31.0(C-15)相关，进一步验证化合物GP-2为达玛烷型三萜皂苷。
根据HMBC谱进一步推测糖的连接顺序：δH5.18(Glc'-1)和δC84.1(C-20)相关，证明Glc'连在苷元20位上；δH4.25(Glc'-2)和δC97.1(Glc'-1),δC105.9(Glc″-1)相关，δH5.67(Glc″-1)和δC81.5(Glc'-2)相关，证明Glc″连在Glc'的2位上。得出两糖连接方式为1→2连接。
2)化合物GP-2：
3β,12β,20S-trihydroxy-25-hydroperoxydammar-23-ene-20-O-[β-D-glucopyranosyl(1→2)]-β-D-glucopyranoside。
Figure BDA0002375641440000071
白色粉末(甲醇)，HR-ESI-MS给出m/z 861.4811[M-H+HCOOH]-峰(Calcd for:861.4848)，确定分子量为816。结合1H-NMR和13C-NMR确定分子式为C42H72O15，10％硫酸-乙醇显紫色斑点，Liebermann-Burchard反应为阳性，Molish反应为阳性，提示其为三萜皂苷类化合物。
1H-NMR(600MHz,pyridine-d5)给出2组糖端基氢信号：δH5.18(1H,d,J＝7.8Hz),5.67(1H,d,J＝7.8Hz)；8个甲基质子信号：δ0.93(3H,s),1.05(3H,s),1.60(3H,s),1.62(3H,s),1.62(3H,s),1.26(3H,s),0.95(3H,s),0.96(3H,s)；1组烯键质子信号：δ6.23(1H,m),6.02(1H,d,J＝15.8Hz)。
13C-NMR(150MHz,pyridine-d5)和DEPT-135给出42个碳信号，2个糖端基碳信号：δ97.1(Glc'-1),105.9(Glc″-1),1组烯碳信号：δ126.9(C-23)和138.4(C-24)；2个连氧次甲基信号：δ78.3(C-3)和71.2(C-12)；2个连氧季碳信号：δ84.1(C-20)和81.9(C-25)。以上数据推测化合物GP-2为一个达玛烷三萜的二糖苷，化合物GP-2的苷元部分与Floralginsenoside F的苷元的NMR的数据基本一致。酸水解经试剂衍生化后与糖标准品的衍生化产物的HPLC对照，表明化合物中存在D-葡萄糖。
HMBC谱显示：δH1.05(H3-18)和δC35.5(C-7),40.4(C-8),52.0(C-14)相关；δH0.93(H3-19)和δC50.6(C-9),39.7(C-1),56.6(C-5),37.7(C-10)相关；δH1.60(H3-21)和δC84.1(C-20),52.9(C-17),40.2(C-22)相关；δH1.62(H3-27)和δC138.4(C-24),81.9(C-25),25.8(C-26)相关；δH1.26(H3-28)和δC78.3(C-3),56.6(C-5),16.7(C-29),39.9(C-4)相关；δH0.96(H3-30)和δC40.4(C-8),52.0(C-14),31.0(C-15)相关，进一步验证化合物GP-2为达玛烷型三萜皂苷。
根据HMBC谱进一步推测糖的连接顺序：δH5.18(Glc'-1)和δC84.1(C-20)相关，证明Glc'连在苷元20位上；δH4.25(Glc'-2)和δC97.1(Glc'-1),δC105.9(Glc″-1)相关，δH5.67(Glc″-1)和δC81.5(Glc'-2)相关，证明Glc″连在Glc'的2位上。得出两糖连接方式为1→2连接。
3)化合物GP-3：
2α,3β,12β,20S-tetrahydroxydammar-24-ene-20-O-[β-D-glucopyranosyl(1→2)]-β-D-glucopyranoside。
Figure BDA0002375641440000081
白色结晶(甲醇)，HR-ESI-MS给出m/z 845.4865[M-H+HCOOH]-峰(Calcd for:845.4899)，确定分子量为800。结合1H-NMR和13C-NMR确定分子式为C42H72O14，10％硫酸-乙醇显紫色斑点，Liebermann-Burchard反应为阳性，Molish反应为阳性，提示其为三萜皂苷类化合物。
1H-NMR(600MHz,pyridine-d5)给出2组糖端基氢信号：δH5.16(1H,d,J＝7.8Hz),5.65(1H,d,J＝7.8Hz)；8个甲基质子信号：δ0.96(3H,s),1.09(3H,s),1.64(3H,s),1.63(3H,s),1.66(3H,s),1.29(3H,s),0.94(3H,s),0.95(3H,s)；1个烯键质子信号δ5.26(1H,t,J＝7.0Hz)。
13C-NMR(150MHz,pyridine-d5)和DEPT-135给出42个碳信号；2个糖端基碳信号：δ97.1(Glc'-1),105.8(Glc″-1)；1组烯碳信号：δ126.3(C-24)和131.1(C-25)；3个连氧次甲基信号：δ69.1(C-2)，83.9(C-3)和71.0(C-12)；1个连氧季碳信号：δ84.4(C-20)。以上数据推测化合物GP-3为一个达玛烷三萜的二糖苷，化合物GP-3的苷元部分与Gypenoside LXXIV的苷元的NMR的数据基本一致。酸水解经试剂衍生化后与糖标准品的衍生化产物的HPLC对照，表明化合物中存在D-葡萄糖。
HMBC谱显示：δH0.96(H3-18)和δC35.3(C-7),40.4(C-8),51.9(C-14)相关；δH0.94(H3-19)和δC50.5(C-9),48.5(C-1),56.7(C-5),38.9(C-10)相关；δH1.64(H3-21)和δC84.4(C-20),53.1(C-17),36.6(C-22)相关；δH1.66(H3-27)和δC126.3(C-24),131.1(C-25),26.1(C-26)相关；δH1.29(H3-28)和δC83.9(C-3),56.7(C-5),17.7(C-29),40.2(C-4)相关；δH1.09(H3-29)和δC83.9(C-3),56.7(C-5),29.6(C-28),40.2(C-4)相关；δH0.95(H3-30)和δC40.4(C-8),51.9(C-14),31.1(C-15)相关；δC69.1(C-2)和δH3.43(H-3),2.50(H-1),1.37(H-1)相关；δH3.43(H-3)和δC17.7(C-29),29.6(C-28),69.1(C-2)相关，进一步验证化合物GP-3为达玛烷型三萜皂苷。δH5.76和δC31.2(C-11),71.0(C-12)相关可知C12位连有羟基。
根据HMBC谱进一步推测糖的连接顺序：δH5.16(Glc'-1)和δC84.4(C-20)相关，证明Glc'连在苷元20位上；δH4.24(Glc'-2)和δC97.1(Glc'-1),δC105.8(Glc″-1)相关，δH5.65(Glc″-1)和δC81.9(Glc'-2)相关，证明Glc″连在Glc'的2位上。得出两糖连接方式为1→2连接。
4)化合物GP-5：
3-O-[β-D-glucopyranosyl(1→2)]-β-D-glucopyranosyl-3β,12β,20(S)-trihydroxydammar-24-ene-20-O-[β-D-glucopyranosyl(1→2)]-β-D-glucopyranoside。
Figure BDA0002375641440000091
白色粉末(甲醇)，HR-ESI-MS给出m/z 1153.5916[M-H+HCOOH]-峰(Calcd for:1153.5947)，确定分子量为1108。结合1H-NMR和13C-NMR确定分子式为C54H92O23，10％硫酸-乙醇显紫色斑点，Liebermann-Burchard反应为阳性，Molish反应为阳性，提示其为三萜皂苷类化合物。
1H-NMR(600MHz,pyridine-d5)给出4组糖端基氢信号：δH4.93(1H,d,J＝7.6Hz),5.41(1H,d,J＝7.6Hz),5.16(1H,d,J＝7.7Hz),5.73(1H,d,J＝7.7Hz)；8个甲基质子信号：δ0.94(3H,s),0.78(3H,s),1.62(3H,s),1.61(3H,s),1.65(3H,s),1.32(3H,s),1.10(3H,s),1.00(3H,s)；1个烯键质子信号：δ5.23(1H,t,J＝7.0Hz)。
13C-NMR(150MHz,pyridine-d5)和DEPT-135给出54个碳信号，4个糖端基碳信号：δ105.2(Glc-1'),106.3(Glc-1″),105.5(Glc-1″″),97.2(Glc-1″′)；1组烯碳信号：δ126.3(C-24)和131.2(C-25)；2个连氧次甲基信号：δ89.1(C-3),71.1(C-12)；1个连氧季碳信号：84.4(C-20)。以上数据推测化合物GP-5为一个达玛烷型三萜的四糖苷，化合物GP-5与Ginsenoside Rb1的NMR的数据基本一致。酸水解经试剂衍生化后与糖标准品的衍生化产物的HPLC对照，表明化合物中存在D-葡萄糖。
HMBC谱显示：δH0.93(H3-18)和δC35.4(C-7),40.3(C-8),52.0(C-14)相关；δH0.78(H3-19)和δC50.4(C-9),39.3(C-1),56.6(C-5),37.3(C-10)相关；δH1.62(H3-21)和δC53.0(C-17),84.4(C-20),36.6(C-22)相关；δH1.65(H3-27)和δC126.3(C-24),131.2(C-25),26.1(C-26)相关；δH1.32(H3-28)和δC89.1(C-3),40.0(C-4),17.0(C-29),56.6(C-5)相关；δH1.10(H3-29)和δC89.1(C-3),40.0(C-4),28.5(C-28),56.6(C-5)相关；δH1.00(H3-30)和δC40.3(C-8),52.0(C-14),31.3(C-15)相关，进一步验证化合物GP-5为达玛烷型三萜皂苷。δH5.67(-OH)和δC30.9(C-11)相关，进一步可知C-12位连有-OH。
根据HMBC谱进一步推测糖的连接顺序：δH4.97(Glc-1')和δC89.1(C-3)相关，δH5.41(Glc-1″)和δC83.6(Glc-2')相关，δH4.25(Glc-2')和δC105.2(Glc-1')相关，证明在苷元C-3位上有两个Glc以1→2连接；δH5.16(Glc-1″′)和δC84.4(C-20)相关，δH5.73(Glc-1″″)和δC81.2(Glc-2″′)相关，δH4.28(Glc-2″′)和δC97.2(Glc-1″′)相关，证明在苷元C-20位上有两个Glc以1→2连接。
5)化合物GP-6：：
3-O-{[β-D-[6-O-acetylglucopyranosyl](1→2)}-β-D-glucopyranosyl-3β,12β,20(S)-trihydroxydammar-24-ene-20-O-[β-D-glucopyranosyl(1→2)]-β-D-glucopyranoside。
Figure BDA0002375641440000101
白色结晶(甲醇)，HR-ESI-MS给出m/z 1195.7152[M-H+HCOOH]-峰(Calcd for:1195.7144)，确定分子量为1150。结合1H-NMR和13C-NMR确定分子式为C56H94O24，10％硫酸-乙醇显紫色斑点，Liebermann-Burchard反应为阳性，Molish反应为阳性，提示其为三萜皂苷类化合物。
1H-NMR(600MHz,pyridine-d5)给出4组糖端基氢信号：δH4.95(1H,d,J＝7.3Hz),5.29(1H,d,J＝7.9Hz),5.27(1H,d,J＝7.9Hz),5.40(1H,d,J＝7.5Hz)；8个甲基质子信号：δ0.98(3H,s),0.85(3H,s),1.66(3H,s),1.63(3H,s),1.67(3H,s),1.32(3H,s),1.11(3H,s),1.09(3H,s)；1个乙酰基质子信号：δ2.06(3H,s)；1个烯键质子信号：δ5.25(1H,m)。
13C-NMR(150MHz,pyridine-d5)和DEPT-135给出56个碳信号，4个糖端基碳信号：δ105.4(Glc-1'),107.1(Glc-1″″),106.3(Glc-1″),97.1(Glc-1″′)；1组烯碳信号：δ126.2(C-24)和131.2(C-25)；3个连氧次甲基信号：δ27.2(C-2),89.3(C-3),71.2(C-12)；1个连氧季碳信号：84.1(C-20)。以上数据推测化合物GP-6为一个连有乙酰基的达玛烷型三萜的四糖苷，化合物GP-6与6″-O-acetylginsenoside Rb1的NMR的数据基本一致。酸水解经试剂衍生化后与糖标准品的衍生化产物的HPLC对照，表明化合物中存在D-葡萄糖。
HMBC谱显示：δH0.98(H3-18)和δC35.4(C-7),40.3(C-8),52.0(C-14)相关；δH0.85(H3-19)和δC50.3(C-9),39.5(C-1),56.7(C-5),37.3(C-10)相关；δH1.66(H3-21)和δC53.6(C-17),84.1(C-20),36.3(C-22)相关；δH1.63(H3-26)和δC126.2(C-24),131.2(C-25),18.2(C-27)相关；δH1.32(H3-28)和δC89.3(C-3),40.1(C-4),17.0(C-29),56.7(C-5)相关；δH1.11(H3-29)和δC89.3(C-3),40.1(C-4),28.5(C-28),56.7(C-5)相关；δH1.09(H3-30)和δC40.3(C-8),52.0(C-14),31.3(C-15)相关，进一步验证化合物GP-6为达玛烷型三萜皂苷。δH2.06(CH3CO-)和δC171.3(CH3CO-)相关，进一步证明该三萜皂苷上存在一个乙酰基。
根据HMBC谱进一步推测糖的连接顺序：δH4.95(Glc-1')和δC89.3(C-3)相关，δH5.40(Glc-1″)和δC83.7(Glc-2')相关，δH4.26(Glc-2')和δC105.4(Glc-1')相关，证明在苷元C-3位上有两个Glc以1→2连接；δH5.27(Glc-1″′)和δC84.1(C-20)相关，δH4.10(Glc-2″′)和δC97.1(Glc-1″′)、107.1(Glc-1″″)相关，证明在苷元C-20位上有两个Glc以1→2连接。
6)化合物GP-7：
3-O-[β-glucopyranosyl(1→2)-β-glucopyranosyl]-20-O-[β-glucopyranosyl(1→2)-β-glucopyranosyl]-3β,12β,20(S)-trihydroxydammar-25-ene-24-one。
Figure BDA0002375641440000111
白色粉末(甲醇)，HR-ESI-MS给出m/z 1167.6416[M-H+HCOOH]-峰(Calcd for:1167.6374)，确定分子量为1122。结合1H-NMR和13C-NMR确定分子式为C54H90O24，10％硫酸-乙醇显紫色斑点，Liebermann-Burchard反应为阳性，Molish反应为阳性，提示其为三萜皂苷类化合物。
1H-NMR(600MHz,pyridine-d5)给出4组糖端基氢信号：δH4.90(1H,d,J＝7.7Hz),5.40(1H,d,J＝7.7Hz),5.10(1H,br s),5.82(1H,d,J＝7.8Hz)；7个甲基质子信号：δ0.93(3H,s),0.76(3H,s),1.54(3H,s),1.90(3H,s),1.31(3H,s),1.09(3H,s),0.96(3H,s)；1组烯键质子信号：δ6.34(1H,s),5.74(1H,s)。
13C-NMR(150MHz,pyridine-d5)和DEPT-135给出54个碳信号，4个糖端基碳信号：δ105.1(Glc-1'),106.3(Glc-1″),104.8(Glc-1″″),96.9(Glc-1″′)；1组烯碳信号：δ144.9(C-25)和125.2(C-27)；2个连氧次甲基信号：δ89.1(C-3),71.1(C-12)；1个连氧季碳信号：84.2(C-20)；1个羰基碳信号：202.6(C-24)。以上数据推测化合物GP-7为一个连有羰基的达玛烷型三萜的四糖苷，化合物GP-7与Notoginsenoside-B的NMR的数据基本一致。结合氢谱和碳谱并与文献对比可知，4个糖均为葡萄糖。
HMBC谱显示：δH0.93(H3-18)和δC35.3(C-7),40.3(C-8),52.0(C-14)相关；δH0.76(H3-19)和δC50.5(C-9),39.3(C-1),56.5(C-5),37.3(C-10)相关；δH1.54(H3-21)和δC53.3(C-17),84.2(C-20),29.9(C-22)相关；δH1.90(H3-26)和δC202.6(C-24),144.9(C-25),125.2(C-27)相关；δH1.31(H3-28)和δC89.1(C-3),40.0(C-4),17.0(C-29),56.5(C-5)相关；δH1.09(H3-29)和δC89.1(C-3),40.0(C-4),28.5(C-28),56.5(C-5)相关；δH0.96(H3-30)和δC40.3(C-8),52.0(C-14),30.7(C-15)相关，进一步验证化合物GP-7为达玛烷型三萜皂苷。δC202.6(CO-)和δH6.34(1H,s),5.74(1H,s)相关，进一步证明该三萜皂苷上存在一个羰基，且该羰基连在C-27位上。
7)化合物GP-8：
2α,3β,12β,20(S),25-pentahydroxydammar-23-ene-3-O-[β-glucopyranosyl]-20-O-[β-glucopyranosyl-(1→2)]-β-glucopyranoside。
Figure BDA0002375641440000121
白色粉末(甲醇)，HR-ESI-MS给出m/z 1023.5421[M-H+HCOOH]-峰(Calcd for:1023.5376，确定分子量为1023。结合1H-NMR和13C-NMR确定分子式为C48H82O20，10％硫酸-乙醇显紫色斑点，Liebermann-Burchard反应为阳性，Molish反应为阳性，提示其为三萜皂苷类化合物。
1H-NMR(600MHz,pyridine-d5)给出3组糖端基氢信号：δH5.02(1H,d,J＝7.8Hz),5.17(1H,d,J＝7.8Hz),5.60(1H,d,J＝7.8Hz)；8个甲基质子信号：δ0.90(3H,s),1.00(3H,s),1.62(3H,s),1.56(3H,s),1.56(3H,s),1.43(3H,s),1.09(3H,s),1.01(3H,s)；1组烯键质子信号：δ6.34(1H,m),5.95(1H,d,J＝15.6Hz)。
13C-NMR(150MHz,pyridine-d5)和DEPT-135给出48个碳信号，3个糖端基碳信号δ106.8(Glc-1'),106.0(Glc-1″′),97.0(Glc-1″)；1组烯碳信号δ123.2(C-23)和142.1(C-24)；3个连氧次甲基信号δ67.3(C-2),95.6(C-3),71.1(C-12)；2个连氧季碳信号：84.2(C-20),70.4(C-25)。以上数据推测化合物GP-8为一个三萜的三糖苷，化合物GP-8与gypenoside GC7的苷元的NMR数据基本一致。结合氢谱和碳谱并与文献对比可知，3个糖均为葡萄糖。
HMBC谱显示：δH0.90(H3-18)和δC35.2(C-7),40.4(C-8),52.0(C-14)相关；δH1.00(H3-19)和δC50.4(C-9),47.8(C-1),56.4(C-5),38.2(C-10)相关；δH1.62(H3-21)和δC53.1(C-17),84.2(C-20),39.8(C-22)相关；δH1.56(H3-26)和δC142.1(C-24),70.4(C-25),31.3(C-27)相关；δH1.43(H3-28)和δC95.6(C-3),41.2(C-4),18.3(C-29),56.4(C-5)相关；δH1.09(H3-29)和δC95.6(C-3),41.2(C-4),28.8(C-28),56.4(C-5)相关；δH1.01(H3-30)和δC40.4(C-8),52.0(C-14),31.0(C-15)相关，进一步验证化合物GP-8为达玛烷型三萜皂苷。
根据HMBC谱进一步推测糖的连接顺序：δH5.02(Glc-1')和δC95.6(C-3)相关，δH3.33(H-3)和δC106.8(Glc-1')相关，证明在苷元C-3位上连有1个Glc；δH5.17(Glc-1″)和δC84.2(C-20)相关，δH4.20(Glc-2″)和δC97.0(Glc-1″)相关，δH5.60(Glc-1″′)和δC82.2(Glc-2″)相关，证明在苷元C-20位上有两个Glc以1→2连接。
8)化合物GP-9：
3β,20(S)-dihydroxydammar-24-ene-3-O-[β-D-glucopyranosyl]-20-O-[β-D-glucopyranosyl(1→2)][β-D-glucopyranosyl(1→3)]-β-D-glucopyranoside。
Figure BDA0002375641440000131
白色粉末(甲醇)，HR-ESI-MS给出m/z 1137.6077[M-H+HCOOH]-峰(Calcd for:1137.6116，确定分子量为1092。结合1H-NMR和13C-NMR确定分子式为C54H92O22，10％硫酸-乙醇显紫色斑点，Liebermann-Burchard反应为阳性，Molish反应为阳性，提示其为三萜皂苷类化合物。
1H-NMR(600MHz,pyridine-d5)给出4组糖端基氢信号：δH4.96(1H,d,J＝7.6Hz),5.13(1H,d,J＝7.6Hz),5.38(1H,d,J＝7.6Hz),5.36(1H,d,J＝7.4Hz)；8个甲基质子信号：δ1.01(3H,s),0.83(3H,s),1.53(3H,s),1.71(3H,s),1.71(3H,s),1.31(3H,s),1.04(3H,s),1.13(3H,s)；1个烯键质子信号：δ5.36(1H,s)。
13C-NMR(150MHz,pyridine-d5)和DEPT-135给出54个碳信号，4个糖端基碳信号：δ105.4(Glc-1'),97.5(Glc-1″),106.3(Glc-1″′),106.4(Glc-1″″)；1组烯碳信号：δ126.7(C-24)和130.9(C-25)；1个连氧次甲基信号：δ89.4(C-3)；1个连氧季碳信号：83.5(C-20)。以上数据推测化合物GP-9为一个三萜的四糖苷，化合物GP-9与vina-ginsenoside-R3的苷元的NMR数据基本一致。结合氢谱和碳谱并与文献对比可知，4个糖均为葡萄糖。
HMBC谱显示：δH1.01(H3-18)和δC36.0(C-7),41.0(C-8),51.1(C-14)相关；δH0.83(H3-19)和δC51.3(C-9),39.7(C-1),56.8(C-5),37.3(C-10)相关；δH1.53(H3-21)和δC48.2(C-17),83.5(C-20),39.8(C-22)相关；δH1.71(H3-26)和δC126.7(C-24),130.9(C-25),18.4(C-27)相关；δH1.71(H3-27)和δC126.7(C-24),130.9(C-25),26.2(C-26)相关；δH1.31(H3-28)和δC89.4(C-3),40.1(C-4),17.0(C-29),56.8(C-5)相关；δH1.13(H3-29)和δC89.4(C-3),40.1(C-4),28.4(C-28),56.8(C-5)相关；δH1.04(H3-30)和δC41.0(C-8),51.1(C-14),31.8(C-15)相关；δH5.36(H-24)和δC18.4(C-27),26.2(C-26)相关，进一步验证化合物GP-9为达玛烷型三萜皂苷。
根据HMBC谱进一步推测糖的连接顺序：δH4.96(Glc-1')和δC89.4(C-3)相关，δH3.33(H-3)和δC105.4(Glc-1')相关，证明在苷元C-3位上连有1个Glc；δH5.14(Glc-1″)和δC83.5(C-20)相关，δH4.23(Glc-2″)和δC97.5(Glc-1″)、δC106.3(Glc-1″′)相关，δH5.36(Glc-1″″)和δC83.7(Glc-3″)相关，δC83.7(Glc-2″)和δH5.38(Glc-1″′),4.34(Glc-3″)证明在苷元C-20位上有3个Glc以1→2，1→3连接。
9)化合物GP-10：
(3β,12β,20S)-trihydroxydammar-24-ene-3-O-β-D-glucopyranosyl-20-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-β-glucopyranoside。
Figure BDA0002375641440000141
白色粉末(甲醇)，HR-ESI-MS给出m/z 1137.6040[M-H+HCOOH]-峰(Calcd for:1137.6057，确定分子量为1092。结合1H-NMR和13C-NMR确定分子式为C54H92O22，10％硫酸-乙醇显紫色斑点，Liebermann-Burchard反应为阳性，Molish反应为阳性，提示其为三萜皂苷类化合物。
1H-NMR(600MHz,pyridine-d5)给出4组糖端基氢信号：δH4.96(1H,d,J＝7.7Hz),5.17(1H,d,J＝7.7Hz),5.64(1H,d,J＝7.7Hz),6.56(1H,s)；9个甲基质子信号：δ1.18(3H,s),0.79(3H,s),1.61(3H,s),1.61(3H,s),1.64(3H,s),0.93(3H,s),1.28(3H,s),1.00(3H,s),1.71(3H,d,J＝6.2Hz)；1个烯键质子信号：δ5.23(1H,t)。
13C-NMR(150MHz,pyridine-d5)和DEPT-135给出54个碳信号，4个糖端基碳信号：δ105.7(Glc-1'),97.2(Glc-1″),105.8(Glc-1″′),102.1(Rha-1″″)；1组烯碳信号：δ126.4(C-24)和131.2(C-25)；2个连氧次甲基信号：δ89.1(C-3),71.2(C-12)；1个连氧季碳信号：84.4(C-20)。以上数据推测化合物GP-10为一个三萜的四糖苷，化合物GP-10与(3β,12β,20S)-trihydroxydammar-24-ene 3-O-β-D-glucopyranosyl-20-O-[α-rhamnopyranosyl-(1→2)][α-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-glucopyranoside的苷元的NMR数据基本一致。酸水解经试剂衍生化后与糖标准品的衍生化产物的HPLC对照，表明化合物中存在D-葡萄糖、L-鼠李糖。
HMBC谱显示：δH0.93(H3-18)和δC35.4(C-7),40.3(C-8),52.1(C-14)相关；δH0.79(H3-19)和δC50.4(C-9),39.7(C-1),56.9(C-5),37.3(C-10)相关；δH1.61(H3-21)和δC53.1(C-17),84.4(C-20),36.6(C-22)相关；δH1.61(H3-26)和δC126.4(C-24),131.2(C-25),18.2(C-27)相关；δH1.64(H3-27)和δCδC126.4(C-24),131.2(C-25),26.1(C-26)相关；δH1.18(H3-28)和δC89.1(C-3),40.0(C-4),28.4(C-29),56.9(C-5)相关；δH1.28(H3-29)和δC89.1(C-3),40.0(C-4),16.2(C-28),56.9(C-5)相关；δH1.00(H3-30)和δC40.3(C-8),52.1(C-14),31.0(C-15)相关；δH5.23(H-24)和δC18.2(C-27),26.1(C-26)相关，进一步验证化合物GP-10为达玛烷型三萜皂苷。
根据HMBC谱进一步推测糖的连接顺序：δH4.96(Glc-1')和δC89.1(C-3)相关，δH3.33(H-3)和δC105.7(Glc-1')相关，证明在苷元C-3位上连有1个Glc；δH5.17(Glc-1″)和δC84.4(C-20)相关，δH4.24(Glc-2″)和δC97.2(Glc-1″)、δC105.8(Glc-1″′)相关，δH5.64(Glc-1″′)和δC81.7(Glc-2″)相关，δH6.56(Rha-1″″)和δC78.3(Glc-2″′)相关，证明在苷元C-20位上有3个糖，Glc″与Glc″′以1→2连接，Glc″′与Rha″″以1→2连接。
10)化合物GP-11：
化合物GP-11结构为2α,3β,12β,20S-tetrahydroxydammar-24-ene-3-O-β-D-glucopyranosyl-20-O-[β-D-glucopyranosyl(1→2)]-β-D-glucopyranoside。
Figure BDA0002375641440000151
白色粉末(甲醇)，HR-ESI-MS给出m/z 1007.5445[M-H+HCOOH]-峰(Calcd for:1007.5427，确定分子量为962。结合1H-NMR和13C-NMR确定分子式为C48H82O19，10％硫酸-乙醇显紫色斑点，Liebermann-Burchard反应为阳性，Molish反应为阳性，提示其为三萜皂苷类化合物。
1H-NMR(600MHz,pyridine-d5)给出3组糖端基氢信号：δH4.98(1H,d,J＝7.8Hz),5.16(1H,br s),5.65(1H,d,J＝7.5Hz)；8个甲基质子信号：δ0.86(3H,s),0.93(3H,s),0.99(3H,s),1.05(3H,s),1.40(3H,s),1.63(3H,s),1.64(3H,s),1.61(3H,s)；1个烯键质子信号：δ5.23(1H,t)。
13C-NMR(150MHz,pyridine-d5)和DEPT-135给出48个碳信号，3个糖端基碳信号：δ106.8(Glc-1'),97.2(Glc-1″),105.8(Glc-1″′)；1组烯碳信号：δ126.3(C-24)和131.2(C-25)；3个连氧次甲基信号：δ67.3(C-2),95.6(C-3),71.0(C-12)；1个连氧季碳信号：84.4(C-20)。以上数据推测化合物GP-11为一个三萜的三糖苷，化合物GP-11与gypenoside XLVI的苷元的NMR数据基本一致。酸水解经试剂衍生化后与糖标准品的衍生化产物的HPLC对照，表明化合物中存在D-葡萄糖。
HMBC谱显示：δH0.93(H3-18)和δC35.3(C-7),40.4(C-8),51.9(C-14)相关；δH0.86(H3-19)和δC50.4(C-9),47.7(C-1),56.4(C-5),38.2(C-10)相关；δH1.63(H3-21)和δC53.1(C-17),84.4(C-20),36.6(C-22)相关；δH1.61(H3-26)和δC126.3(C-24),131.2(C-25),18.2(C-27)相关；δH1.63(H3-27)和δC126.3(C-24),131.2(C-25),26.1(C-26)相关；δH1.40(H3-28)和δC95.6(C-3),41.2(C-4),18.3(C-29),56.4(C-5)相关；δH1.05(H3-29)和δC95.6(C-3),41.2(C-4),28.8(C-28),56.4(C-5)相关；δH0.99(H3-30)和δC40.3(C-8),51.9(C-14),31.0(C-15)相关；δH5.23(H-24)和δC18.2(C-27),26.1(C-26)相关，进一步验证化合物GP-11为达玛烷型三萜皂苷。
根据HMBC谱进一步推测糖的连接顺序：δH4.98(Glc-1')和δC95.6(C-3)相关，δH3.28(H-3)和δC106.8(Glc-1')相关，证明在苷元C-3位上连有1个Glc；δH5.16(Glc-1″)和δC84.5(C-20)相关，δH4.23(Glc-2″)和δC97.2(Glc-1″)、δC105.8(Glc-1″′)相关，δH5.65(Glc-1″′)和δC81.8(Glc-2″)相关，证明在苷元C-20位上有2个糖，Glc″与Glc″′以1→2连接。
11)化合物GP-12：
3β,12β,20(S)-trihydroxydammar-24-ene-3-O-[β-Glucopyranosyl]-20-O-[β-glucopyranosyl(1→2)]-β-glucopyranoside。
Figure BDA0002375641440000161
白色粉末(甲醇)，HR-ESI-MS给出m/z 991.5416[M-H+HCOOH]-峰(Calcd for:991.5419，确定分子量为946。结合1H-NMR和13C-NMR确定分子式为C48H82O18，10％硫酸-乙醇显紫色斑点，Liebermann-Burchard反应为阳性，Molish反应为阳性，提示其为三萜皂苷类化合物。
1H-NMR(600MHz,pyridine-d5)给出3组糖端基氢信号：δH4.96(1H,d,J＝7.8Hz),5.16(1H,d,J＝7.8Hz),5.73(1H,d,J＝7.8Hz)；8个甲基质子信号：δ0.78(3H,s),0.93(3H,s),1.00(3H,s),1.00(3H,s),1.34(3H,s),1.60(3H,s),1.62(3H,s),1.63(3H,s)；1个烯键质子信号：δ5.21(1H,t)。
13C-NMR(150MHz,pyridine-d5)和DEPT-135给出48个碳信号，3个糖端基碳信号δ107.1(Glc-1'),97.2(Glc-1″),105.4(Glc-1″′)；1组烯碳信号δ126.3(C-24)和131.2(C-25)；2个连氧次甲基信号δ89.0(C-3),71.1(C-12)；1个连氧季碳信号：84.4(C-20)。以上数据推测化合物GP-12为一个三萜的三糖苷，化合物GP-12与ginsenoside Rd的苷元的NMR数据基本一致。结合氢谱和碳谱并与文献对比可知，3个糖均为葡萄糖。
HMBC谱显示：δH0.93(H3-18)和δC35.3(C-7),40.3(C-8),52.0(C-14)相关；δH0.78(H3-19)和δC50.4(C-9),39.3(C-1),56.6(C-5),37.3(C-10)相关；δH1.60(H3-21)和δC53.0(C-17),84.3(C-20),36.6(C-22)相关；δH1.62(H3-26)和δC126.3(C-24),131.2(C-25),18.1(C-27)相关；δH1.63(H3-27)和δC126.3(C-24),131.2(C-25),26.1(C-26)相关；δH1.34(H3-28)和δC89.0(C-3),40.0(C-4),17.2(C-29),56.6(C-5)相关；δH1.00(H3-29)和δC89.0(C-3),40.0(C-4),28.6(C-28),56.6(C-5)相关；δH1.00(H3-30)和δC40.3(C-8),52.0(C-14),30.9(C-15)相关；δH5.21(H-24)和δC18.1(C-27),26.1(C-26)相关，进一步验证化合物GP-12为达玛烷型三萜皂苷。
根据HMBC谱进一步推测糖的连接顺序：δH4.96(Glc-1')和δC89.0(C-3)相关，δH3.35(H-3)和δC107.1(Glc-1')相关，证明在苷元C-3位上连有1个Glc；δH5.16(Glc-1″)和δC84.4(C-20)相关，δH4.27(Glc-2″)和δC97.2(Glc-1″)、δC105.4(Glc-1″′)相关，δH5.73(Glc-1″′)和δC81.1(Glc-2″)相关，证明在苷元C-20位上有2个糖，Glc″与Glc″′以1→2连接。
12)化合物GP-13：
2α,3β,12β,20S-tetrahydroxydammar-24-ene-3-O-β-glucopyranosyl-20-O-[β-glucopyranosyl-(1→2)-β-glucopyranosyl]-(1→2)-β-glucopyranoside。
Figure BDA0002375641440000171
白色粉末(甲醇)，HR-ESI-MS给出m/z 1169.5951[M-H+HCOOH]-峰(Calcd for:1169.5955，确定分子量为1124。结合1H-NMR和13C-NMR确定分子式为C54H92O24，10％硫酸-乙醇显紫色斑点，Liebermann-Burchard反应为阳性，Molish反应为阳性，提示其为三萜皂苷类化合物。
1H-NMR(600MHz,pyridine-d5)给出4组糖端基氢信号：δH4.95(1H,J＝7.8Hz),5.65(1H,J＝7.8Hz),5.18(1H,d,J＝7.8Hz),5.52(1H,d,J＝7.8Hz)；8个甲基质子信号：δ0.88(3H,s),0.95(3H,s),0.99(3H,s),1.20(3H,s),1.34(3H,s),1.62(3H,s),1.62(3H,s),1.65(3H,s)；1个烯键质子信号：δ5.24(1H,t,J＝7.0Hz)。
13C-NMR(150MHz,pyridine-d5)和DEPT-135给出54个碳信号，4个糖端基碳信号：δ104.8(Glc-1'),105.8(Glc-1″′),97.2(Glc-1″),105.9(Glc-1″″)；1组烯碳信号：δ126.3(C-24)和131.2(C-25)；3个连氧次甲基信号：δ67.2(C-2),95.7(C-3),71.0(C-12)；1个连氧季碳信号：84.4(C-20)。以上数据推测化合物GP-13为一个三萜的四糖苷，化合物GP-13与2α,3β,12β,20S-tetrahydroxydammar-24-ene-3-O-β-sophoroisde-20-O-β-gentiobioside的苷元的NMR数据基本一致。结合氢谱和碳谱并与文献对比可知，4个糖均为葡萄糖。
HMBC谱显示：δH0.95(H3-18)和δC35.3(C-7),40.3(C-8),51.9(C-14)相关；δH0.88(H3-19)和δC50.4(C-9),47.8(C-1),56.4(C-5),38.2(C-10)相关；δH1.62(H3-21)和δC53.1(C-17),84.4(C-20),36.5(C-22)相关；δH1.62(H3-26)和δC126.3(C-24),131.2(C-25),18.2(C-27)相关；δH1.65(H3-27)和δC126.3(C-24),131.2(C-25),26.1(C-26)相关；δH1.34(H3-28)和δC95.7(C-3),41.3(C-4),18.0(C-29),56.4(C-5)相关；δH1.20(H3-29)和δC95.7(C-3),41.3(C-4),28.6(C-28),56.4(C-5)相关；δH0.99(H3-30)和δC40.3(C-8),51.9(C-14),31.0(C-15)相关；δH5.24(H-24)和δC18.2(C-27),26.1(C-26)相关，进一步验证化合物GP-13为达玛烷型三萜皂苷。
根据HMBC谱进一步推测糖的连接顺序：δH4.95(Glc-1')和δC95.7(C-3)相关，δH3.21(H-3)和δC104.8(Glc-1')相关，证明在苷元C-3位上连有1个Glc；δH5.18(Glc-1″)和δC84.4(C-20)相关，δH4.23(Glc-2″)和δC97.2(Glc-1″)、δC105.9(Glc-1″″)相关，δH5.65(Glc-1″′)和δC81.9(Glc-2″)相关，δH5.52(Glc-1″″)和δC82.6(Glc-2″′)相关，δH4.30(Glc-2″′)和δC105.8(Glc-1″′)相关，证明在苷元C-20位上有3个糖，Glc″与Glc″′以1→2连接，Glc″′与Glc″″以1→2连接。
13)化合物GP-14:
(3β,12β,20S)-trihydroxydammar-24-ene-3-O-β-D-glucopyranosyl-20-O-[α-rhamnopyranosyl-(1→2)][α-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-glucopyranoside。
Figure BDA0002375641440000181
1H-NMR(600MHz,pyridine-d5)给出4组糖端基氢信号：δH4.96(1H,br s),5.12(1H,d,J＝7.8Hz),5.33(1H,s),5.63(1H,d,J＝7.8Hz)；9个甲基质子信号：δ0.98(3H,s),0.81(3H,s),1.61(3H,s),1.68(3H,s),1.72(3H,s),1.35(3H,s),0.99(3H,s),0.91(3H,s),1.66(3H,d,J＝6.2Hz)；1个烯键质子信号：δ5.36(1H,t,J＝7.2Hz)。
13C-NMR(150MHz,pyridine-d5)和DEPT-135给出54个碳信号，4个糖端基碳信号：δ107.1(Glc-1'),97.1(Glc-1″),101.5(Rha-1″″),105.8(Glc-1″′)；1组烯碳信号：δ126.3(C-24)和131.4(C-25)；2个连氧次甲基信号：δ89.1(C-3),71.3(C-12)；1个连氧季碳信号：84.5(C-20)。以上数据推测化合物GP-14为一个三萜的四糖苷，化合物GP-14与(3β,12β,20S)-trihydroxydammar-24-ene 3-O-β-D-glucopyranosyl-20-O-[α-rhamnopyranosyl-(1→2)][α-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-glucopyranoside的苷元的NMR数据基本一致。
HMBC谱显示：δH0.93(H3-18)和δC35.3(C-7),40.3(C-8),51.9(C-14)相关；δH0.81(H3-19)和δC50.3(C-9),39.3(C-1),56.6(C-5),37.3(C-10)相关；δH1.61(H3-21)和δC53.2(C-17),84.5(C-20),36.7(C-22)相关；δH1.68(H3-26)和δC126.3(C-24),131.4(C-25),18.3(C-27)相关；δH1.72(H3-27)和δCδC126.3(C-24),131.4(C-25),26.1(C-26)相关；δH1.35(H3-28)和δC89.1(C-3),40.0(C-4),17.2(C-29),56.6(C-5)相关；δH0.99(H3-29)和δC89.1(C-3),40.0(C-4),28.6(C-28),56.6(C-5)相关；δH0.91(H3-30)和δC40.3(C-8),51.9(C-14),30.4(C-15)相关；δH5.35(H-24)和δC18.3(C-27),26.1(C-26)相关，进一步验证化合物GP-14为达玛烷型三萜皂苷。
根据HMBC谱进一步推测糖的连接顺序：δH4.97(Glc-1')和δC89.1(C-3)相关，δH3.38(H-3)和δC107.1(Glc-1')相关，证明在苷元C-3位上连有1个Glc；δH5.12(Glc-1″)和δC84.5(C-20)相关，δH4.17(Glc-2″)和δC97.1(Glc-1″)、δC105.8(Glc-1″′)相关，δH5.63(Glc-1″′)和δC81.8(Glc-2″)相关，δH5.33(Rha-1″″)和δC66.4(Glc-6″′)相关，δH4.51(Glc-6″′)和δC101.5(Rha-1″″)相关，证明在苷元C-20位上有3个糖，Glc″与Glc″′以1→2连接，Glc″′与Rha″″以1→6连接。
实施例3
绞股蓝中化合物对细胞毒性检测：
将绞股蓝中所分离得的到14个皂苷类化合物：GP-1至GP-3、GP-5至GP-13、GP15分别用DMSO溶解,配成浓度为1mg/mL储存液放于-20℃冰箱保存，使用前稀释到所需浓度。
DMEM(高糖)培养基(Hyclone,USA)；胎牛血清(PBS,Hyclone,USA)；双抗(100U/mL青霉素+10mg/mL链霉素)；Cell Counting Kit-8试剂盒购于Dojindo公司。
取DMEM/High Gluose基础培养基45mL,加入5mL胎牛血清(终浓度为10％)和500μL双抗溶液(青霉素终浓度为100U/mL,链霉素终浓度为0.1mg/mL),储存于4℃冰箱以备用。
称取0.2g KCl，8g NaCl，0.27g KH2PO4，1.42gNa2HPO4，加入超纯水并通过磁力搅拌器搅拌使其充分溶解，定容至1L，调节PH值在7.4左右，并用0.22μM滤膜过滤除菌，储存于4℃冰箱以备用。
小鼠巨噬细胞RAW 264.7和人肝癌细胞HepG-2(天津中医药大学滨海实验室)。
对小鼠巨噬细胞RAW 264.7和人肝癌细胞HepG-2分别用含有10％FBS，1％双抗的DMEM(高糖)培养基复苏传代后，接种于25cm2的培养瓶中，在37℃、5％CO2孵箱中培养。
当细胞贴壁生长至密度达到70％～80％时，按照1/3的比例传代，取对数生长期状态良好的细胞用细胞刮轻轻刮下，均匀的接种在96孔板中(边缘以PBS填充)，每孔100μL，约1×104个/孔。在在37℃、5％CO2孵箱中培养24小时。待细胞长到贴壁状态时，弃去培养基，分别加入相应浓度的绞股蓝化合物继续培养24小时。
药物处理方案：实验主要分为空白孔(不含细胞和药物的培养基，CCK-8)；对照孔(不含药物，含有细胞，CCK-8)；实验孔(含有细胞，药物，CCK-8)。给药24小时后，向每孔加入10μL CCK-8溶液(避光，注意避免生成气泡，以免影响OD值读数)，将培养板在孵箱内孵育1-2小时。使用酶标仪于波长450nm处检测OD值。
细胞存活率＝[(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)]×100％
用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒，Raw 264.7细胞对于绞股蓝中所分离的化合物进行毒性检测，结果见图3。
用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒，HepG-2细胞对于绞股蓝所分离的化合物进行毒性检测，结果见图4。
本实验采用CCK-8对所分离的化合物进行体外细胞毒性检测，结果显示对于Raw264.7细胞，GP-2和GP-4在浓度为100μg/mL时，具有细胞毒性，其他化合物可以在浓度为100μg/mL及以下时进行化合物的活性筛选；对于HepG-2细胞，GP-2、GP-3、GP-4、GP-6、GP-8、GP-11和GP-14在浓度为100μg/mL时，具有细胞毒性，其中GP-4、GP-8、GP-11和GP-14在浓度为50μg/mL时也具有细胞毒性。综上所述，其他化合物均可以在浓度为50μg/mL及以下时进行化合物的活性筛选。
实施例4
绞股蓝中所分离得的到9个化合物(GP-5、GP-6、GP-7、GP-8、GP-9、GP-10、GP-11、GP-12、GP-14)分别用DMSO溶解，储存液放与-20℃冰箱保存，使用前稀释到所需浓度。脂多糖(LPS,Sigma)，地塞米松磷酸钠(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：2392394)。
DMEM(高糖)培养基(Hyclone,USA)；胎牛血清(PBS,Hyclone,USA)；双抗(100U/mL青霉素+10mg/mL链霉素)；Griess Reagent System试剂盒购置于Promega公司(USA)。
小鼠巨噬细胞RAW 264.7(天津中医药大学滨海实验室)。
DMEM培养基配制方法为常规方法，如前所述；PBS缓冲液配制方法为常规方法，如前所述。
小鼠巨噬细胞RAW 264.7用含有10％FBS，1％双抗的DMEM(高糖)培养基复苏传代后，接种于25cm2培养瓶中，在37℃、5％CO2培养箱中培养。
取对数生长期的细胞，将细胞用细胞刮轻轻刮下，均匀的接种于24孔培养板中，每孔500μL，约5×105个/孔。在37℃、5％CO2培养箱中培养12小时。
待细胞长到贴壁状态时，弃去培养基，分别加入不同浓度的绞股蓝中所分离得到的单体化合物和地塞米松磷酸钠继续培养1小时。待培养2小时后，每孔加入100μL LPS(注意LPS终浓度为500ng/mL)对细胞刺激24小时。
药物处理方案：实验分为空白对照组；阴性药物对照组(LPS组)；阳性药物对照组(地塞米松磷酸钠)；实验组(不同浓度单体化合物)。
待孵育24小时后，取上清液于1.5mL炮弹管中，1000r/min离心10min，取上清液于96孔培养板中，每孔50μL，平行3个复孔。
亚硝酸盐含量检验：
(1)吸取50μL Sulfanilamide Solution反应液于每孔中(避光操作)，孵育5-10分钟。
(2)吸取50μL NED反应液于每孔中(避光操作)，孵育5-10分钟。
(3)30分钟内进行OD值检测，检测波长为548nm。
(4)将OD值带入标准曲线：y＝0.0072x+0.0557(R2＝0.9995)，计算出亚硝酸盐的含量。
组间比较采用SPSS 17.0软件进行显著性差异检验(P＜0.05认为有显著性差异)，采用GraphPad Prism软件做统计图。
采用Griess Reagent System试剂盒对绞股蓝中所分离的9个化合物进行NO抑制活性筛选，以地塞米松磷酸钠作为阳性对照药，化合物对LPS刺激RAW 264.7细胞生成NO的影响的测试结果具体见图5(与LPS组比较，*P＜0.05，**P＜0.01)，结果显示化合物GP-5、GP-8、GP-10、GP-11具有显著的NO抑制活性，GP-7、GP-9和GP-12在一定给药浓度下具有NO抑制活性。
实施例5
绞股蓝中所分离得的到11个化合物(GP-1、GP-2、GP-3、GP-5、GP-6、GP-7、GP-9、GP-10、GP-12、GP-13、GP-17)分别用DMSO溶解，储存液放与-20℃冰箱保存，使用前稀释到所需浓度。
DMEM(高糖)培养基(Hyclone,USA)；胎牛血清(PBS,Hyclone,USA)；双抗(100U/mL青霉素+10mg/mL链霉素)。
人肝癌细胞HepG-2(天津中医药大学滨海实验室)。
人肝癌细胞HepG-2用含有10％FBS，1％双抗的DMEM(高糖)培养基复苏传代后，接种于25cm2培养瓶中，在37℃、5％CO2培养箱中培养。
取对数生长期的细胞，将细胞用细胞刮轻轻刮下，均匀的接种于6孔培养板中，每孔500μL，约2.5×105个/孔。在37℃、5％CO2培养箱中培养24小时。
待细胞长到贴壁状态时，弃去培养基，分别加入不同浓度的绞股蓝中所分离得到的单体化合物，同时加入0.5mmol/L的油酸继续培养24小时。药物处理方案：实验分为空白对照组；阴性药物对照组(油酸组)；实验组(不同浓度单体化合物)。
待孵育24小时后，弃去培养基，用PBS漂洗3次，每孔加入4％多聚甲醛1ml固定30min，固定结束后，弃去固定液，用PBS漂洗3次，每孔加入60％异丙醇溶液1ml浸润10s，浸润后，弃去原有液体，加入稀释后的油红O染液，避光染色1h，终止染色，PBS漂洗3次，镜下观察油脂染色情况。
油红O属于偶氮染料，是一种脂溶性染料，能够在脂肪内高度溶解，可以特异性的使中性脂类着色，油红O与脂类结合后，呈小脂滴状，染色结果成橘黄至红色，视脂质浓度而定。采用油红O染色法对绞股蓝中所分离的11个化合物进行降脂活性筛选，以阴性组作为对照组，其测试结果具体见图6，通过对比油脂染色深浅及范围大小，初步判定以下11个化合物除GP-2外均具有显著的降脂活性，其中GP-10降脂药效最好。
上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种皂苷类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，具有如式(I)所示结构：
Figure FDA0002375641430000011
式(I)中：
R1为单糖残基或低聚糖残基中的任意一种；
R2为H、OH、任选取代的C1-C8烷硫基、任选取代的C1-C8烷氧基、任选取代的C1-C14烯基中的任一种；
R3为H、OH、单糖残基或低聚糖残基、低聚糖酯残基中的任一种；
R4为H、OH、任选取代的C1-C4烷基中的任一种；
R5为H、OH、任选取代的C1-C4烷基中的任一种。
2.如权利要求1所述的皂苷类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，式(I)中，所述的单糖残基为葡萄糖、鼠李糖或阿拉伯糖中任一种去氢或去羟基的残基；所述低聚糖残基为葡萄糖、鼠李糖或阿拉伯糖中任一种或任两种共聚形成的基团；所述低聚糖酯残基为葡萄糖、鼠李糖或阿拉伯糖中任一种或任两种共聚、酯化后形成的基团；优选的，单糖残基为-Glc、-Rha或-Ara，低聚糖残基为-Glc-Glc、-Glc-Glc-Glc或-Glc-Glc-Rha。
3.如权利要求1-2任一项所述的皂苷类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，式(I)中，R1为-Glc、-Glc-Glc、-Glc-Glc-Glc、-Glc-(Glc)2或-Glc-Glc-Rha中的任一种，R3为H、-Glc、-Glc-Glc、-Glc-Glc-OAc。
4.如权利要求1所述的皂苷类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，式(I)中，R2为未取代的或由-OOH、-OH、O＝取代的碳原子数为6的烯基；R4为H、OH中的任一种；R5为H、OH中的任一种。
5.如权利要求4所述的皂苷类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，式(I)中，
R2为
Figure FDA0002375641430000021
6.如权利要求1-5中任一项所述的皂苷类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，式(Ⅰ)具体为以下化合物中的任一种：
Figure FDA0002375641430000022
Figure FDA0002375641430000031
7.一种如权利要求1所述的皂苷类化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，用溶剂对绞股蓝进行提取，将得到的提取物用柱层析方法分离，经洗脱、后处理得到所述皂苷类化合物或其药学上可接受的盐。
8.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1-6任一项所述的皂苷类化合物或其药学上可接受的盐中的至少一种；
优选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为口服制剂或注射剂；优选的，所述口服制剂选自普通片剂、分散片、肠溶片、颗粒、胶囊、滴丸、散剂、口服液或乳剂，所述注射剂为小水针剂、输液剂或冻干粉针。
10.如权利要求1-6所述的皂苷类化合物或其药学上可接受的盐或如权利要求8-9任一项所述的药物组合物用于制备抗肿瘤、抗炎、降脂和/或抗氧化药物的用途。
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