CN111183975A - 一种高存活率的石斑鱼类精子冷冻液配方 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种高存活率的石斑鱼类精子冷冻液配方，该配方包括以下成分：26～30g葡萄糖、5～8g NaCl、0.2～0.3g NaHCO3、0.14～0.18g KCl、0.11～0.13g CaCl2·2H2O、0.01～0.02g NaH2PO4、0.1～0.2g MgCl2·6H2O、0.05～0.08g甘氨酸和0.11～0.15g斜生栅藻提取物。采用本发明冷冻液，石斑鱼精子活率达到83％以上，最高达92％，与鲜精相当；精子平均直线运动速度为44um/s以上，最高达65um/s，与鲜精相当。本发明冷冻液不仅调节精子细胞渗透压和pH，避免了冷冻过程中的结晶和精子收缩，而且进一步对精子细胞膜起到保护作用，对石斑鱼精子具有显著的保存效果。

Description

一种高存活率的石斑鱼类精子冷冻液配方
技术领域
本发明涉及低温冷冻生物学领域，特别涉及一种高存活率的石斑鱼类精子冷冻液配方。
背景技术
在石斑鱼人工繁殖过程中，常常遇到雌雄亲鱼性腺发育不同步，导致成熟卵子无精子授精的情况，因此，研究石斑鱼精子的冻存技术在石斑鱼养殖过程中具有重要的意义。精液冷冻保存的原理是精子在一定抗冻剂的保护下于低温保存，精子活动被抑制，能量消耗减少，一旦恢复到适宜环境中，精子就可恢复活力。目前鱼类常见的冷冻液是以MPRS或ELRS3作稀释液，稀释液中加DMSO制成冷冻液。然而由于不同鱼类精子细胞的细胞液、渗透压、pH等生理特性不同，因此，不同鱼类精液对冷冻液的要求不同。经试验发现目前的MPRS或ELRS3配方不适用于石斑鱼，其对石斑鱼的冷冻保存效果有限。因此，研究一种专门适用于石斑鱼的精子冷冻液配方是目前亟需解决的问题。
发明内容
鉴以此鉴于现有技术的不足，本发明提供一种高存活率的石斑鱼类精子冷冻液配方。
本发明的技术方案是：
一种高存活率的石斑鱼类精子冷冻液配方，每升精子冷冻液中包括以下成分：26～30g葡萄糖、5～8g NaCl、0.2～0.3g NaHCO3、0.14～0.18g KCl、0.11～0.13g CaCl2·2H2O、0.01～0.02g NaH2PO4、0.1～0.2g MgCl2·6H2O、0.05～0.08g甘氨酸和0.11～0.15g斜生栅藻提取物。
优选的，每升精子冷冻液中包括以下成分：28g葡萄糖、7g NaCl、0.2g NaHCO3、0.16g KCl、0.12g CaCl2·2H2O、0.01g NaH2PO4、0.1g MgCl2·6H2O、0.06g甘氨酸和0.13g斜生栅藻提取物。
本发明所述斜生栅藻提取物为：
挑取藻细胞，接种至培养基中，初始藻液OD600＝0.2，于温度25℃，光照2500lx，光周期14：10(L/D)条件下震荡培养3天；取藻液于5000rpm离心5min，弃上清，取沉淀加pH7.2磷酸盐缓冲液补齐体积，然后于90℃加热30min，8000rpm离心，取上清过滤，滤液减压干燥至提及减少80％，冷藏备用。优选的，所述培养基为：硝酸钠0.25g/L，磷酸二氢钾0.120g/L，磷酸二氢钾0.10g/L，氯化钙0.025g/L，氯化钠0.022g/L，硫酸镁0.025g/L，硫酸锌0.20mg/L，三氯化铁0.008g/L，氯化锰1.2mg/L，钼酸钠0.2mg/L，硫酸铜0.1mg/L，余量是水。
本发明所述冷冻液配方用于冷冻龙胆石斑鱼精液，可明显保持精子活力。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
采用本发明冷冻液，石斑鱼精子活率达到83％以上，最高达92％，与鲜精相当；精子平均直线运动速度为44um/s以上，最高达65um/s，与鲜精相当，无显著差异。本发明冷冻液不仅调节精子细胞渗透压和pH，避免了冷冻过程中的结晶和精子收缩，而且进一步对精子细胞膜起到保护作用，对石斑鱼精子具有显著的保存效果。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明所述的培养基1：
硝酸钠0.25g/L，磷酸二氢钾0.120g/L，磷酸二氢钾0.10g/L，氯化钙0.025g/L，氯化钠0.022g/L，硫酸镁0.025g/L，硫酸锌0.20mg/L，三氯化铁0.008g/L，氯化锰1.2mg/L，钼酸钠0.2mg/L，硫酸铜0.1mg/L，余量是水。
本发明所述的培养基2：
硝酸钠60mg/L，磷酸二氢钠5.0mg/L，三氯化铁3.0mg/L，硫酸锌0.02mg/L，硫酸铜0.01mg/L，氯化钴0.01mg/L，维生素B1 0.1mg/L，维生素B12 0.005mg/L，钼酸钠0.005mg/L，生物素0.0005mg/L，依地酸二钠4.0mg/，余量是水。
本发明中，斜生栅藻(Scenedesmus Obliquus)提取物的制备方法为：
挑取藻细胞，接种至配置好的培养基中，初始藻液OD600＝0.2，于温度25℃，光照2500lx，光周期14：10(L/D)条件下震荡培养3天。取藻液于5000rpm离心5min，弃上清，取沉淀加pH7.2磷酸盐缓冲液补齐体积，然后于90℃加热30min，8000rpm离心，取上清过滤，滤液减压干燥至提及减少80％，冷藏备用。
本发明中，石斑鱼类精子冷冻液配方的使用方法：
(1)对采精和冻存器具进行高压灭菌消毒；稀释液用去离子水配好后进行灭菌处理，4℃备用；稀释液与DMSO混合配制成含20％(V/V)DMSO的冷冻液。
(2)亲鱼选择：选择良种或原种的亲鱼作为采集的对象，要求亲鱼形态正常，生长良好，无疾病，达到性成熟，轻压腹部有精液流出即可采精。
(3)精子采集：擦干成熟雄鱼腹部及生殖孔附近水分，轻压腹部排除粪便和尿液，用干净和干燥的吸管收集排出的精液，置于干净、干燥的离心管中，操作和运输过程中置于冰上，避免阳光直射，利用显微镜检查，快速运动精子在80％以上的精液可用于冷冻保存；
(4)精子的稀释与平衡：采精后尽快加入冷冻稀释液，将精液与4℃预冷的冷冻液按体积比1:1比例混合，4℃平衡5min后转移到冷冻管冷冻，冰上操作；
(5)精子的分装与冷冻：将平衡好的精液稀释液以于冻存管，按照三步降温法(液氮面上6cm 10min，液氮面上5min，投入液氮)进行冷冻处理；
(6)冷冻精液的解冻激活：冻存管从液氮罐中取出，在37℃～42℃水浴中快速解冻，使用海水激活冻精；
(7)冷冻精子用于受精时，精子解冻后尽快受精，将冻存精子放在液氮中带到受精现场，待卵挤好后，用37～42℃温水解冻马上受精。
实施例1
一种高存活率的石斑鱼类精子冷冻液配方，每升精子冷冻液中包括以下成分：28g葡萄糖、7g NaCl、0.2g NaHCO3、0.16g KCl、0.12g CaCl2·2H2O、0.01g NaH2PO4、0.1gMgCl2·6H2O、0.06g甘氨酸和0.13g斜生栅藻提取物。
实施例2
一种高存活率的石斑鱼类精子冷冻液配方，每升精子冷冻液中包括以下成分：26g葡萄糖、5g NaCl、0.2g NaHCO3、0.14g KCl、0.11g CaCl2·2H2O、0.01g NaH2PO4、0.2gMgCl2·6H2O、0.08g甘氨酸和0.11g斜生栅藻提取物。
实施例3
一种高存活率的石斑鱼类精子冷冻液配方，每升精子冷冻液中包括以下成分：30g葡萄糖、8g NaCl、0.3g NaHCO3、0.18g KCl、0.13g CaCl2·2H2O、0.02g NaH2PO4、0.1gMgCl2·6H2O、0.05g甘氨酸和0.15g斜生栅藻提取物。
实施例1-3斜生栅藻均使用培养基1培养。
实施例4
本实施例与实施例1的区别是：斜生栅藻使用培养基2培养。
对比例1
对比例与实施例1的区别是:
一种石斑鱼类精子冷冻液配方，每升精子冷冻液中包括以下成分：28g葡萄糖、7gNaCl、0.2g NaHCO3、0.16g KCl、0.12g CaCl2·2H2O、0.01g NaH2PO4、0.1g MgCl2·6H2O、0.12g甘氨酸和0.05g斜生栅藻提取物。
对比例2
对比例与实施例1的区别是:
一种石斑鱼类精子冷冻液配方(常规配方)，每升精子冷冻液中包括以下成分：11g葡萄糖、3.53g NaCl、0.25g NaHCO3、0.39g KCl、0.17g CaCl2·2H2O、0.22g NaH2PO4、0.23gMgCl2·6H2O。
实验例：
以新鲜龙胆石斑鱼精液为受试对象,精子冻存72h后解冻激活,采用计算机辅助精子分析系统CASA检测精子激活后20s的精子活率和精子平均直线运动速度，并用软件SPSS22.0进行数据处理。结果见表1
表1
活率(％) 精子平均直线运动速度(um/s)
实施例1 92<sup>a</sup> 65<sup>a</sup>
实施例2 90<sup>a</sup> 52<sup>b</sup>
实施例3 90<sup>a</sup> 53<sup>b</sup>
实施例4 83<sup>b</sup> 44<sup>c</sup>
对比例1 73<sup>c</sup> 32<sup>d</sup>
对比例2 55<sup>d</sup> 21<sup>e</sup>
鲜精 91<sup>a</sup> 66<sup>a</sup>
n＝6，同一列不同字母代表显著差异(P<0.05)。
精子经不同冷冻液保存后，精子的结构损伤程度和能量耗损情况有所不同，因此解冻激活后精子的活率和运动速度不同。表1结果显示，采用本发明冷冻液，精子活率达到83％以上，最高达92％，与鲜精相当；精子平均直线运动速度为44um/s以上，最高达65um/s，与鲜精相当，无显著差异。而使用对比例1、对比例2冷冻液时，精子活率仅为73％和55％，显著低于本发明，精子平均直线运动速度仅为32um/s和24um/s，显著低于本发明。可见，本发明冷冻液对石斑鱼精子具有显著的保存效果，不影响精子活力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种高存活率的石斑鱼类精子冷冻液配方，其特征在于，每升精子冷冻液中包括以下成分：26～30g葡萄糖、5～8g NaCl、0.2～0.3g NaHCO3、0.14～0.18g KCl、0.11～0.13gCaCl2·2H2O、0.01～0.02g NaH2PO4、0.1～0.2g MgCl2·6H2O、0.05～0.08g甘氨酸和0.11～0.15g斜生栅藻提取物。
2.根据权利要求1所述的高存活率的石斑鱼类精子冷冻液配方，其特征在于，每升精子冷冻液中包括以下成分：28g葡萄糖、7g NaCl、0.2g NaHCO3、0.16g KCl、0.12g CaCl2·2H2O、0.01g NaH2PO4、0.1g MgCl2·6H2O、0.06g甘氨酸和0.13g斜生栅藻提取物。
3.根据权利要求1所述的高存活率的石斑鱼类精子冷冻液配方，其特征在于，所述斜生栅藻提取物为：
挑取藻细胞，接种至培养基中，初始藻液OD600＝0.2，于温度25℃，光照2500lx，光周期14：10(L/D)条件下震荡培养3天；取藻液于5000rpm离心5min，弃上清，取沉淀加pH7.2磷酸盐缓冲液补齐体积，然后于90℃加热30min，8000rpm离心，取上清过滤，滤液减压干燥至提及减少80％，冷藏备用。
4.根据权利要求3所述的高存活率的石斑鱼类精子冷冻液配方，其特征在于，所述培养基为：硝酸钠0.25g/L，磷酸二氢钾0.120g/L，磷酸二氢钾0.10g/L，氯化钙0.025g/L，氯化钠0.022g/L，硫酸镁0.025g/L，硫酸锌0.20mg/L，三氯化铁0.008g/L，氯化锰1.2mg/L，钼酸钠0.2mg/L，硫酸铜0.1mg/L，余量是水。
5.根据权利要求1所述的高存活率的石斑鱼类精子冷冻液配方，其特征在于，所述石斑鱼为龙胆石斑鱼。
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