CN111175497A - 一种磁微粒化学发光法地高辛测定试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了生物化学相关技术领域的一种磁微粒化学发光法地高辛测定试剂盒及其使用方法,包括相互独立包装的荧光素地高辛鼠单克隆抗体、碱性磷酸酶标记地高辛衍生物、鼠抗荧光素单克隆抗体磁珠、校准品和质控品;采用磁微粒碱性磷酸酶酶促化学发光法在临床上检测血药浓度中的地高辛,具有方法简便、自动化强、时间短、试剂稳定时间长的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学相关技术领域,特别涉及一种磁微粒化学发光法地高辛测定试剂盒及其使用方法。
背景技术
地高辛属于洋地黄类药物,临床上主要用于充血性心力衰竭、控制心房颤动、心房扑通的心室率,是较常用的经典药物之一。但是此药物安全范围窄,个体差异大,治疗量与中毒量接近,合并用药不当可诱发或加重洋地黄中毒,临床上需要进行药物监测。近年来,随着治疗药物监测的开展,不良反应发生率已明显下降。但地高辛的合理使用仍存在一些值得重视的问题:一是电解质水平的监测,二是与药物相互作用的认识,三是积极进行治疗药物监测。
地高辛血药浓度常用检测方法主要包括放射免疫、酶联免疫吸附分析法、液相-质谱联用分析法、这些方法各有特点。放射免疫分析法主要优势在于价格低廉、方法简单、结果可信且灵敏度较高,但由于其放射性污染较大,标志物半衰期短,检测周期长等使得该方法下的地高辛测定结果在动态观察时可比性降低,较难用于临床的即时测定。液相-质谱联用分析法的检测结果较为准确,样品的预处理步骤较为简便,但所需孵育的时间较长,操作中人为干扰的因素占据大部分,酶的稳定性也会因温度、pH值等受到影响。液相-质谱联用分析法具有快速、准确等优点,其所需血量较小,高灵敏度及专属性,交叉反应发生率极低。但由于该类仪器价格较为昂贵,维护费用极高,检测成本大,因此其临床应用受到限制。因此,研发一种方法简便、自动化强、时间短、试剂稳定时间长的临床上检测血药浓度中的地高辛的方法,有着重要的技术价值。
发明内容
针对现有技术存在的需要一种方法简便、自动化强、时间短、试剂稳定时间长的临床上检测血药浓度中的地高辛的方法的技术问题,本发明提供一种磁微粒化学发光法地高辛测定试剂盒及其使用方法。
为实现上述目的,本发明的技术方案为:
一种磁微粒化学发光法地高辛测定试剂盒,包括相互独立包装的荧光素地高辛鼠单克隆抗体、碱性磷酸酶标记地高辛衍生物、鼠抗荧光素单克隆抗体磁珠、校准品和质控品;
所述荧光素地高辛鼠单克隆抗体通过包括以下步骤的操作制得:
Sa1:准确称取0.4~0.6mg地高辛鼠单克隆抗体;
Sa2:准确称取2.4~3.6mg荧光素,并用第一碳酸钠溶液进行溶解至终浓度为0.8~1.2mg/ml,制得荧光素溶液;
Sa3:在所述地高辛鼠单克隆抗体中加入20~24ul所述荧光素溶液,充分混匀后在2~8℃反应9~12h;
Sa4:用透析袋对Sa3制得的产物透析后,用抗试剂缓冲液将透析产物稀释,制得第一工作液即得;
所述抗试剂缓冲液可以为将10~20g的Na2PO3H·12H2O、1~2g的NaPO3H2·12H2O、1~5g的绵羊血清、3~10g的新生牛血清、1~5g的马血清加入1L纯化水中,充分搅拌至完全溶解,用HCl调节pH至5~6制得;
所述碱性磷酸酶标记地高辛衍生物通过包括以下步骤的操作制得:
Sb1:将地高辛衍生物用第二碳酸钠溶液进行透析,然后用2-IT活化剂进行活化;
Sb2:将碱性磷酸酶用SMCC进行活化;
Sb3:将活化后的抗原和鼠抗荧光素单克隆抗体分别与经过活化的碱性磷酸酶按照摩尔比1:1~1:1.5充分混合后在2~8℃下反应18~22h,制得抗体-碱磷酶;
Sb4:将所述抗体-碱磷酶用层析柱进行纯化,收集I峰和II峰进行混合;
Sb5:用所述抗试剂缓冲液将所述抗体-碱磷酶稀释,制得第二工作液即得;
所述鼠抗荧光素单克隆抗体磁珠通过包括以下步骤的操作制得:
Sc1:准确称取80~102mgNHS磁珠并定容到20mL;
Sc2:准确称取2.4~3.6mg鼠抗荧光素单克隆抗体,投入Sc1制得的溶液中,充分混匀后在2~8℃下反应12~18h;
Sc3:用磁珠缓冲液将经过NHS磁珠Sc2稀释,制得第三工作液即得;
其中,磁珠缓冲液通过将12~12.12mg的Tris、5.6~5.82mg的NaCl和45~50g的甲基纤维醚加入到1L纯化水中,充分搅拌至完全溶解制备而成;
所述校准品通过包括以下步骤的操作制得:
Sd1:配制地高辛校准品缓冲液:向0.05M的pH=7.4的TRIS缓冲液中加入所述TRIS缓冲液重量0.5~5%的牛血清白蛋白和0~0.2%的防腐剂;
Sd2:将地高辛纯品用所述地高辛校准品缓冲液进行稀释,制得第四工作液即得。
优选的,所述第一碳酸钠溶液的浓度为0.2M,pH为9.0。
优选的,所述透析袋的截留分子量为5000。
优选的,所述第一工作液的浓度为0.5ug/ml、1ug/ml和3ug/ml。
优选的,所述第二碳酸钠溶液的浓度为0.1~0.2M,pH为8.0。
优选的,所述第二工作液的浓度为1ug/ml、3ug/ml、和5ug/ml。
优选的,Sc1中,在进行定容操作前先用0.2M的PBS进行将所述NHS磁珠清洗1~3遍。
优选的,所述第三工作液的浓度为1mg/ml。
优选的,所述第四工作液的浓度为0ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml和10ng/ml。
上述任一项所述的磁微粒化学发光法地高辛测定试剂盒的使用方法,包括以下步骤:
Se1:准确量取待测样本50ul、所述荧光素地高辛鼠单克隆抗体50ul和所述碱性磷酸酶标记地高辛衍生物50ul,充分混合后孵育15min;
Se2:向Se1制得的产物中加入所述鼠抗荧光素单克隆抗体磁珠50ul,孵育5min;
Se3:将Se2制得的产物磁分离2min,去除上清;
Se4:用洗液将Se3制得的产物洗涤3次,每次用300ul洗液;
Se5:用所述校准品将Se4制得的底物定容至200ul,测值。
本法采用磁微粒碱性磷酸酶酶促化学发光法在临床上检测血药浓度中的地高辛,具有方法简便、自动化强、时间短、试剂稳定时间长的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为体系1曲线拟合;
图2为体系2曲线拟合。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是,对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明,但并不构成对本发明的限定。此外,在以下说明中,省略了对公知结构、技术及操作的描述,以避免不必要地混淆本发明的概念。另外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
对于本技术方案中的“第一”、“第二”等,仅为对相同或相似结构,或者起相似功能的对应结构的称谓区分,不是对这些结构重要性的排列,也没有排序、或比较大小、或其他含义。
本发明中,未特别注明单位的比例与含量,固体组分为质量比例与含量,液体组分为体积比例与含量。
实施例1
一种磁微粒化学发光法地高辛测定试剂盒,包括相互独立包装的荧光素地高辛鼠单克隆抗体、碱性磷酸酶标记地高辛衍生物、鼠抗荧光素单克隆抗体磁珠、校准品和质控品;
荧光素地高辛鼠单克隆抗体通过包括以下步骤的操作制得:
Sa1:准确称取0.4mg地高辛鼠单克隆抗体;
Sa2:准确称取2.4mg荧光素,并用浓度为0.2M,pH为9.0的第一碳酸钠溶液进行溶解至终浓度为0.8mg/ml,制得荧光素溶液;
Sa3:在地高辛鼠单克隆抗体中加入20ul荧光素溶液,充分混匀后在2℃反应9h;
Sa4:用截留分子量为5000的透析袋对Sa3制得的产物透析后,用抗试剂缓冲液将透析产物稀释,制得浓度为0.5ug/ml、1ug/ml和3ug/ml的三种第一工作液即得;
碱性磷酸酶标记地高辛衍生物通过包括以下步骤的操作制得:
Sb1:将地高辛衍生物用浓度为0.1M,pH为8.0的第二碳酸钠溶液进行透析,然后用2-IT活化剂进行活化;
Sb2:将碱性磷酸酶用SMCC进行活化;
Sb3:将活化后的抗原和鼠抗荧光素单克隆抗体分别与经过活化的碱性磷酸酶按照摩尔比1:1充分混合后在2℃下反应18h,制得抗体-碱磷酶;
Sb4:将抗体-碱磷酶用层析柱进行纯化,收集I峰和II峰进行混合;
Sb5:用抗试剂缓冲液将抗体-碱磷酶稀释,制得浓度为1ug/ml、3ug/ml、和5ug/ml的三种第二工作液即得;
鼠抗荧光素单克隆抗体磁珠通过包括以下步骤的操作制得:
Sc1:准确称取80mgNHS磁珠,先用0.2M的PBS进行将NHS磁珠清洗1遍,再定容到20mL;
Sc2:准确称取2.4mg鼠抗荧光素单克隆抗体,投入Sc1制得的溶液中,充分混匀后在2℃下反应12h;
Sc3:用磁珠缓冲液将经过NHS磁珠Sc2稀释,制得浓度为1mg/ml的第三工作液即得;
校准品通过包括以下步骤的操作制得:
Sd1:配制地高辛校准品缓冲液:向TRIS缓冲液中加入TRIS缓冲液重量0.5%的牛血清白蛋白;
Sd2:将地高辛纯品用地高辛校准品缓冲液进行稀释,制得浓度为0ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml和10ng/ml的六种第四工作液即得。
实施例2
一种磁微粒化学发光法地高辛测定试剂盒,包括相互独立包装的荧光素地高辛鼠单克隆抗体、碱性磷酸酶标记地高辛衍生物、鼠抗荧光素单克隆抗体磁珠、校准品和质控品;
荧光素地高辛鼠单克隆抗体通过包括以下步骤的操作制得:
Sa1:准确称取0.5mg地高辛鼠单克隆抗体;
Sa2:准确称取3mg荧光素,并用浓度为0.2M,pH为9.0的第一碳酸钠溶液进行溶解至终浓度为1mg/ml,制得荧光素溶液;
Sa3:在地高辛鼠单克隆抗体中加入22ul荧光素溶液,充分混匀后在4℃反应10h;
Sa4:用截留分子量为5000的透析袋对Sa3制得的产物透析后,用抗试剂缓冲液将透析产物稀释,制得浓度为0.5ug/ml、1ug/ml和3ug/ml的三种第一工作液即得;
碱性磷酸酶标记地高辛衍生物通过包括以下步骤的操作制得:
Sb1:将地高辛衍生物用浓度为0.15M,pH为8.0第二碳酸钠溶液进行透析,然后用2-IT活化剂进行活化;
Sb2:将碱性磷酸酶用SMCC进行活化;
Sb3:将活化后的抗原和鼠抗荧光素单克隆抗体分别与经过活化的碱性磷酸酶按照摩尔比1:1.3充分混合后在4℃下反应20h,制得抗体-碱磷酶;
Sb4:将抗体-碱磷酶用层析柱进行纯化,收集I峰和II峰进行混合;
Sb5:用抗试剂缓冲液将抗体-碱磷酶稀释,制得浓度为1ug/ml、3ug/ml、和5ug/ml的三种第二工作液即得;
鼠抗荧光素单克隆抗体磁珠通过包括以下步骤的操作制得:
Sc1:准确称取90mgNHS磁珠,先用0.2M的PBS进行将NHS磁珠清洗2遍,再定容到20mL;
Sc2:准确称取3mg鼠抗荧光素单克隆抗体,投入Sc1制得的溶液中,充分混匀后在4℃下反应15h;
Sc3:用磁珠缓冲液将经过NHS磁珠Sc2稀释,制得浓度为1mg/ml的第三工作液即得;
校准品通过包括以下步骤的操作制得:
Sd1:配制地高辛校准品缓冲液:向TRIS缓冲液中加入TRIS缓冲液重量2.5%的牛血清白蛋白和0.1%的防腐剂;
Sd2:将地高辛纯品用地高辛校准品缓冲液进行稀释,制得浓度为0ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml和10ng/ml的六种第四工作液即得。
实施例3
一种磁微粒化学发光法地高辛测定试剂盒,包括相互独立包装的荧光素地高辛鼠单克隆抗体、碱性磷酸酶标记地高辛衍生物、鼠抗荧光素单克隆抗体磁珠、校准品和质控品;
荧光素地高辛鼠单克隆抗体通过包括以下步骤的操作制得:
Sa1:准确称取0.6mg地高辛鼠单克隆抗体;
Sa2:准确称取3.6mg荧光素,并用浓度为0.2M,pH为9.0的第一碳酸钠溶液进行溶解至终浓度为1.2mg/ml,制得荧光素溶液;
Sa3:在地高辛鼠单克隆抗体中加入24ul荧光素溶液,充分混匀后在8℃反应12h;
Sa4:用截留分子量为5000的透析袋对Sa3制得的产物透析后,用抗试剂缓冲液将透析产物稀释,制得浓度为0.5ug/ml、1ug/ml和3ug/ml的三种第一工作液即得;
碱性磷酸酶标记地高辛衍生物通过包括以下步骤的操作制得:
Sb1:将地高辛衍生物用浓度为0.2M,pH为8.0第二碳酸钠溶液进行透析,然后用2-IT活化剂进行活化;
Sb2:将碱性磷酸酶用SMCC进行活化;
Sb3:将活化后的抗原和鼠抗荧光素单克隆抗体分别与经过活化的碱性磷酸酶按照摩尔比1:1.5充分混合后在8℃下反应22h,制得抗体-碱磷酶;
Sb4:将抗体-碱磷酶用层析柱进行纯化,收集I峰和II峰进行混合;
Sb5:用抗试剂缓冲液将抗体-碱磷酶稀释,制得浓度为1ug/ml、3ug/ml、和5ug/ml的三种第二工作液即得;
鼠抗荧光素单克隆抗体磁珠通过包括以下步骤的操作制得:
Sc1:准确称取102mgNHS磁珠,先用0.2M的PBS进行将NHS磁珠清洗3遍,再定容到20mL;
Sc2:准确称取3.6mg鼠抗荧光素单克隆抗体,投入Sc1制得的溶液中,充分混匀后在8℃下反应18h;
Sc3:用磁珠缓冲液将经过NHS磁珠Sc2稀释,制得浓度为1mg/ml的第三工作液即得;
校准品通过包括以下步骤的操作制得:
Sd1:配制地高辛校准品缓冲液:向TRIS缓冲液中加入TRIS缓冲液重量5%的牛血清白蛋白和0.2%的防腐剂;
Sd2:将地高辛纯品用地高辛校准品缓冲液进行稀释,制得浓度为0ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml和10ng/ml的六种第四工作液即得。
这种地高辛化学发光免疫检测试剂盒的制备方法简单方便,制得的地高辛化学发光免疫检测试剂盒的检测灵敏度较高,具有良好的应用前景。
实施例4
实施例1~3任一例制备的磁微粒化学发光法地高辛测定试剂盒的使用方法,本实施例中以实施例2制备的试剂盒为例,用它来测定地高辛,包括以下步骤:
Se1:准确量取待测样本50ul、荧光素地高辛鼠单克隆抗体50ul和碱性磷酸酶标记地高辛衍生物50ul,充分混合后孵育15min;
Se2:向Se1制得的产物中加入鼠抗荧光素单克隆抗体磁珠50ul,孵育5min;
Se3:将Se2制得的产物磁分离2min,去除上清;
Se4:用洗液将Se3制得的产物洗涤3次,每次用300ul洗液;
Se5:用校准品将Se4制得的底物定容至200ul,测值。
本发明同时用荧光素标记的地高辛鼠单克隆抗体-鼠抗荧光素单克隆抗体磁珠(体系1,曲线拟合如图1所示),地高辛鼠单克隆抗体包被磁珠(体系2,曲线拟合如图2所示),分别用两个体系对0ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml和10ng/ml的地高辛样品做检测,同时测试同一组样本,并与给值进行比对,数据如下表所示:
表1.不同体系下测值与给值对比以及测值之间对比
由结果可以看出,不同体系测值与给值相关性都在0.95以上,说明相关性良好,且不同体系之间测值相关性大于0.95,说明2种体系测值一致。
因此,本发明的技术方案完全可行。
以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明,但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言,在不脱离本发明原理和精神的情况下,在没有做出创造性劳动前提下,对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型,仍落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种磁微粒化学发光法地高辛测定试剂盒,其特征在于:包括相互独立包装的荧光素地高辛鼠单克隆抗体、碱性磷酸酶标记地高辛衍生物、鼠抗荧光素单克隆抗体磁珠、校准品和质控品;
所述荧光素地高辛鼠单克隆抗体通过包括以下步骤的操作制得:
Sa1:准确称取0.4~0.6mg地高辛鼠单克隆抗体;
Sa2:准确称取2.4~3.6mg荧光素,并用第一碳酸钠溶液进行溶解至终浓度为0.8~1.2mg/ml,制得荧光素溶液;
Sa3:在所述地高辛鼠单克隆抗体中加入20~24ul所述荧光素溶液,充分混匀后在2~8℃反应9~12h;
Sa4:用透析袋对Sa3制得的产物透析后,用抗试剂缓冲液将透析产物稀释,制得第一工作液即得;
所述碱性磷酸酶标记地高辛衍生物通过包括以下步骤的操作制得:
Sb1:将地高辛衍生物用第二碳酸钠溶液进行透析,然后用2-IT活化剂进行活化;
Sb2:将碱性磷酸酶用SMCC进行活化;
Sb3:将活化后的抗原和鼠抗荧光素单克隆抗体分别与经过活化的碱性磷酸酶按照摩尔比1:1~1:1.5充分混合后在2~8℃下反应18~22h,制得抗体-碱磷酶;
Sb4:将所述抗体-碱磷酶用层析柱进行纯化,收集I峰和II峰进行混合;
Sb5:用所述抗试剂缓冲液将所述抗体-碱磷酶稀释,制得第二工作液即得;
所述鼠抗荧光素单克隆抗体磁珠通过包括以下步骤的操作制得:
Sc1:准确称取80~102mgNHS磁珠并定容到20mL;
Sc2:准确称取2.4~3.6mg鼠抗荧光素单克隆抗体,投入Sc1制得的溶液中,充分混匀后在2~8℃下反应12~18h;
Sc3:用磁珠缓冲液将经过NHS磁珠Sc2稀释,制得第三工作液即得;
所述校准品通过包括以下步骤的操作制得:
Sd1:配制地高辛校准品缓冲液:向TRIS缓冲液中加入所述TRIS缓冲液重量0.5~5%的牛血清白蛋白和0~0.2%的防腐剂;
Sd2:将地高辛纯品用所述地高辛校准品缓冲液进行稀释,制得第四工作液即得。
2.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光法地高辛测定试剂盒,其特征在于:所述第一碳酸钠溶液的浓度为0.2M,pH为9.0。
3.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光法地高辛测定试剂盒,其特征在于:所述透析袋的截留分子量为5000。
4.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光法地高辛测定试剂盒,其特征在于:所述第一工作液的浓度为0.5ug/ml、1ug/ml和3ug/ml。
5.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光法地高辛测定试剂盒,其特征在于:所述第二碳酸钠溶液的浓度为0.1~0.2M,pH为8.0。
6.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光法地高辛测定试剂盒,其特征在于:所述第二工作液的浓度为1ug/ml、3ug/ml、和5ug/ml。
7.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光法地高辛测定试剂盒,其特征在于:Sc1中,在进行定容操作前先用0.2M的PBS进行将所述NHS磁珠清洗1~3遍。
8.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光法地高辛测定试剂盒,其特征在于:所述第三工作液的浓度为1mg/ml。
9.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光法地高辛测定试剂盒,其特征在于:所述第四工作液的浓度为0ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml和10ng/ml。
10.如权利要求1~9任一项所述的磁微粒化学发光法地高辛测定试剂盒的使用方法,其特征在于:包括以下步骤:
Se1:准确量取待测样本50ul、所述荧光素地高辛鼠单克隆抗体50ul和所述碱性磷酸酶标记地高辛衍生物50ul,充分混合后孵育15min;
Se2:向Se1制得的产物中加入所述鼠抗荧光素单克隆抗体磁珠50ul,孵育5min;
Se3:将Se2制得的产物磁分离2min,去除上清;
Se4:用洗液将Se3制得的产物洗涤3次,每次用300ul洗液;
Se5:用所述校准品将Se4制得的底物定容至200ul,测值。
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