CN108196055A - 磁微粒化学发光法测定地高辛含量的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

磁微粒化学发光法测定地高辛含量的试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明为磁微粒化学发光法测定地高辛含量的试剂盒及其检测方法，提供了一种地高辛抗原衍生物的制备方法，可以实现地高辛抗原与生物素或者酶间接地连接，在试剂盒中构建了生物素化地高辛抗原衍生物+抗体酶标试剂+校准品与酶标地高辛抗原衍生物+生物素化地高辛鼠单抗+校准品两个检测体系，可用于固相偶联，又能用于发光标记的地高辛衍生物，适用于对地高辛抗原进行生物素、酶标甚至蛋白等不同情况的偶联，这样不同企业在测试时可以更灵活的选取，并且只需要通过制备地高辛抗原衍生物这个中间体就能实现。应用该衍生物建立的不同检测体系测值与给值相关性都在0.96以上，两种测定体系相关性为0.9585。整个反应体系反应时间短，避免了放射性污染，延长了试剂效期，灵敏度高，测试结果准确，简化了实验操作流程。

Description

磁微粒化学发光法测定地高辛含量的试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种检测试剂盒，具体为一种磁微粒化学发光法测定地高辛含量的试剂盒及其检测方法。
背景技术
地高辛在治疗心力衰竭和控制快速心室率是临床首选的有效药物，但是有效血药浓度窄，基于“2008欧洲心脏学会关于急慢性心脏疾病诊断指南”中的相关内容，推荐的地高辛治疗浓度为0.6-1.2ng/ml，当地高辛浓度超过1.2ng/ml时，死亡风险上升。此外，治疗指数低、毒副作用大且个体差异大，给予常规剂量也可能导致中毒或达不到有效剂量，也使临床难以掌握地高辛用药剂量。故血清地高辛浓度检测是常用的一项治疗药物监测(TDM)，通过测定血液或其它体液中药物的浓度，获得有关药动学参数，从而实施给药方案个体化，在提高药物疗效的同时也减少了不良反应的发生。监测血药浓度可找出药物在治疗过程中的疗效及毒副作用的定量标准，以调整临床用药剂量和给药方案，保证病人用药的安全有效。
地高辛血药浓度常用检测方法主要包括液相-质谱联用分析法、放射免疫、酶联免疫吸附分析法、磁微粒化学发光免疫，这些方法各有特点。
液相-质谱联用分析法的检测结果较为准确，样品的预处理步骤较为简便，但所需孵育的时间较长，操作中人为干扰的因素占据大部分，酶的稳定性也会因温度、pH值等受到影响。液相-质谱联用分析法具有快速、准确等优点，其所需血量较小，高灵敏度及专属性，交叉反应发生率极低。但由于该类仪器价格较为昂贵，维护费用极高，检测成本大，因此其临床应用受到限制。
放射免疫分析法主要优势在于价格低廉、方法简单、结果可信且灵敏度较高，但由于其放射性污染较大，试剂有效期短，检测周期长等使得该方法下的地高辛测定结果在动态观察时可比性降低，较难用于临床的即时测定。
酶联免疫吸附分析法虽然试剂稳定，但是由于采用显色的方法进行判定，因此存在灵敏度低，线性范围窄等缺点，尤其是灵敏度低这个缺点，使其不适合进行对浓度较低的药物进行定量分析。
磁微粒化学发光法，不但有放免的优点，还有效避免了放免的缺点，例如可以通过对磁珠-抗体-抗原复合物的清洗降低样本中其他成分非特异性吸附的影响，有效提高灵敏度，其次，通过将样本的浓度信号转化为发光信号，其灵敏度能够达到或者超过放免的水平，而且试剂没有放射性污染，易于操作，反应时间短，检测结果准确。
通过上述比较，不难看出最适合对地高辛血药浓度进行监测的方法就是化学发光法。正因为如此，国内外针对此项目均为磁微粒化学发光法，这其中包括罗氏、雅培、西门子、新产业等，由于地高辛是小分子物质，如果要进行免疫检测就需要将地高辛或其衍生物用于固相或发光物的连接。根据说明书描述得知，罗氏是生物素偶联地高辛衍生物用于固相，雅培和西门子是吖啶酯标记地高辛或其衍生物用于发光，新产业是ABEI标记地高辛，上述均为直接发光体系。因此，开发地高辛检测试剂盒的关键在于合适的地高辛衍生物的制备。鉴于国内化学发光大多数采用碱性磷酸酶(ALP)或者辣根过氧化物酶(HRP)的发光系统(酶促化学发光)，而固相有些公司采用生物素-链霉素磁珠、FITC-抗FITC磁珠体系，有些公司采用磁珠直接包被的系统。在这种情况下，我们就需要地高辛衍生物上的基团既可以偶联生物素、FITC或者磁珠等用于磁微粒体系的固相偶联，又可以偶联酶(ALP或HRP)等用于发光标记，极大的提升了建立反应体系的灵活性。
因此，发明一种既可用于固相偶联，又能用于发光标记的地高辛衍生物对开发地高辛试剂盒来说是关键。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有地高辛试剂盒不能既可用于固相偶联，又能用于发光标记的地高辛衍生物的缺陷，提供一种磁微粒化学发光法测定地高辛含量的试剂盒及其检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种磁微粒化学发光法测定人血清中地高辛含量的试剂盒，该试剂盒包括生物素化地高辛抗原衍生物、抗体酶标试剂、酶标地高辛抗原衍生物、生物素化地高辛鼠单抗和校准品；
所述试剂盒中主要组分按照如下制备方法制得：
一、地高辛抗原衍生物制备过程:
1)、将地高辛和琥珀酸酐分别用DMF缓冲液溶解，得到地高辛-DMF溶液和琥珀酸酐-DMF溶液；
2)、将地高辛-DMF溶液加入琥珀酸酐-DMF溶液中，65℃反应4～6h；加入三丁胺和氯甲酸异丁酯，室温反应20～40min，得到地高辛-琥珀酸酐的DMF溶液；加入赖氨酸溶液，室温反应2～4h；
3)、将反应物用水透析过夜，调节pH析出沉淀，将沉淀放置室温0.5～2h，然后在4℃放置2～4h，4℃离心10-15min，用Na2CO3缓冲液溶解沉淀配置成地高辛抗原衍生物的溶液；
二、生物素化地高辛抗原衍生物制备过程:
将生物素-NHS用DMSO进行溶解后按照地高辛抗原衍生物与生物素-NHS摩尔比为1:18～22加入步骤一所得的地高辛抗原衍生物，室温反应2h；用透析袋透析反应产物，将透析液稀释工作液浓度；
三、抗体酶标试剂制备过程：
将地高辛鼠单抗和碱性磷酸酶分别活化后，将二者混合2-8℃反应14～20h小时；将反应物用层析柱进行纯化，收集I峰II峰进行混合后用缓冲液将配置成工作液浓度；
四、酶标地高辛抗原衍生物制备过程：
将地高辛抗原衍生物和碱性磷酸酶分别活化后，将二者混合2-8℃反应14～20h小时；将反应物用层析柱进行纯化，收集I峰II峰进行混合后用缓冲液将配置成工作液浓度；
五、生物素化地高辛鼠单抗制备过程：
1)将生物素-NHS，用DMSO进行溶解得到DMSO溶解的生物素，加入地高辛鼠单抗，充分混匀后室温反应2h；透析后将透析液稀释至工作液浓度。
本发明的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)取样本15ul、生物素化地高辛抗原衍生物30ul和抗体酶标试30ul，孵育15min
2)向1)中加入磁珠30ul，孵育5min；
3)磁分离2min，去上清；
4)洗涤3次，每次300ul洗液；
5)加入底物200ul，测值。
本发明的试剂盒还可以采用以下步骤进行检测
1)取样本15ul、酶标地高辛抗原衍生物30ul和生物素化地高辛鼠单抗30ul，孵育15min
2)向1)中加入磁珠30ul，孵育5min；
3)磁分离2min，去上清；
4)洗涤3次，每次300ul洗液；
5)加入底物200ul，测值。
本发明的试剂盒提供了一种地高辛抗原衍生物的制备方法，通过制备地高辛抗原衍生物，可以根据需要灵活地将地高辛抗原与生物素或者酶间接地连接，解决了开发此项目的关键问题即偶联问题，可以方便地建立地高辛的磁微粒酶促化学发光体系。
通过构建了生物素化地高辛抗原衍生物+抗体酶标试剂+校准品与酶标地高辛抗原衍生物+生物素化地高辛鼠单抗+校准品两个检测体系，可用于固相偶联，又能用于发光标记的地高辛衍生物，适用于对地高辛抗原进行生物素、酶标甚至蛋白等不同情况的偶联，这样不同企业在测试时可以更灵活的选取，并且只需要通过制备地高辛抗原衍生物这个中间体就能实现，不同体系测值与给值相关性都在0.96以上，两种测定体系相关性为0.9585。
整个反应体系反应时间短，避免了放射性污染，延长了试剂效期，灵敏度高，测试结果准确，简化了实验操作流程。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
一、地高辛抗原衍生物制备过程:
1)配制0.1M的HCl溶液；
2)分别配制PH＝9.0的0.01M的NaHCO3缓冲液和PH＝9.5的0.15M的NaHCO3缓冲液；
3)称量10mg的地高辛，并用DMF缓冲液溶解至10mg/mL，得到地高辛-DMF溶液；
4)称量琥珀酸酐50mg用10ml DMF溶解至5mg/mL，得到琥珀酸酐-DMF溶液；
5)称量赖氨酸20mg用1mL PH＝9.0的0.01M NaHCO3缓冲液溶解至20mg/mL；
6)取0.5mL地高辛-DMF溶液加入到10mL琥珀酸酐-DMF溶液中，65℃反应6h；
7)反应完毕后加入1.2mL三丁胺，0.65mL氯甲酸异丁酯，室温反应30min，得到地高辛-琥珀酸酐的DMF溶液；
8)将1mL浓度20mg/mL的赖氨酸溶液加入到地高辛-琥珀酸酐的DMF溶液中，室温反应3h；
9)将反应物用水透析过夜(透析分子量为500)；
10)将透析液用0.1M的HCl溶液调节PH至4.8-5.1，使溶液产生最多沉淀，将沉淀放置室温1h，然后在4℃放置3h；
11)将沉淀在4℃离心10-15min，用PH＝9.5的0.15M的Na2CO3缓冲液溶解沉淀至2mg/mL，即为地高辛抗原衍生物；
二、生物素化地高辛抗原衍生物制备过程:
1)量取0.5ml步骤一所得的地高辛抗原衍生物；
2)通过抗原分子量(927)和生物素-NHS分子量(587)进行计算，按照摩尔比1：20的投料量称量生物素(12.665mg)，称取12.665mg生物素-NHS，并用DMSO进行溶解至终浓度为30mg/mL，得到DMSO溶解的生物素；
3)将0.5ml步骤一所得的地高辛抗原衍生物加入到DMSO溶解的生物素中，充分混匀后室温反应2h；
4)用截留分子量为1000的透析袋透析步骤3)中的反应产物，透析缓冲液为PH＝9.0的0.1M的NaHCO3缓冲液；
5)用抗试剂缓冲液将透析液稀释至0.5ug/ml作为工作液使用；
三、抗体酶标试剂制备过程：
1)将地高辛鼠单抗用0.1*的PBS进行透析，然后用2IT进行活化，得到活化后的抗体；
2)将碱性磷酸酶用SMCC进行活化，得到活化后的碱性磷酸酶；
3)将活化后的抗体与活化后的碱性磷酸酶进行混合，2-8℃反应18小时；
4)将反应物用层析柱进行纯化，收集I峰II峰进行混合后用抗试剂缓冲液将混合液中的抗体-碱磷酶稀释至0.1ug/ml作为工作液；
四、酶标地高辛抗原衍生物制备过程：
1)将地高辛抗原衍生物用0.1*PBS进行透析，然后用2IT进行活化；
2)将碱性磷酸酶用SMCC进行活化，得到活化后的碱性磷酸酶；
3)将活化后的抗原与活化后的碱性磷酸酶进行混合，2-8℃反应18小时；
4)将反应物用层析柱进行纯化，收集I峰II峰进行混合后用抗试剂缓冲液将抗原-碱磷酶稀释至0.3ug/ml作为工作液；
五、生物素化地高辛鼠单抗制备过程：
1)量取0.5mg地高辛鼠单抗；
2)通过抗体分子量(150000)和生物素-NHS分子量(587)进行计算，按照摩尔比1：20的投料量，称量生物素称取1mg生物素-NHS，并用DMSO进行溶解至终浓度为20mg/mL，得到DMSO溶解的生物素；
3)在0.5mg地高辛鼠单抗中加入0.04mgDMSO溶解的生物素，充分混匀后室温反应2h；
4)用截留分子量为1000的透析袋透析步骤3)中的反应产物，透析缓冲液为PH＝9.0的0.1M的NaHCO3缓冲液；
5)用抗试剂缓冲液将透析液稀释至0.5ug/ml作为工作液使用；
六、校准品的制备过程；
1)配制地高辛校准品缓冲液：0.05M的PH＝7.4的PBS缓冲液中加入5％的BSA，0.1％防腐剂；
2)将地高辛抗原用校准品缓冲液进行稀释，依次为：5ng/mL、3ng/mL、2ng/mL、1ng/mL和0.5ng/mL，加上零浓度点共6个点。
采用本发明的试剂盒进行检测，包括以下步骤：
1)取样本15ul、生物素化地高辛抗原衍生物30ul和抗体酶标试30ul，孵育15min
2)向1)中加入磁珠30ul，孵育5min；
3)磁分离2min，去上清；
4)洗涤3次，每次300ul洗液；
5)加入底物200ul，测值。
或者采用以下步骤进行检测：
1)取样本15ul、酶标地高辛抗原衍生物30ul和生物素化地高辛鼠单抗30ul，孵育15min
2)向1)中加入磁珠30ul，孵育5min；
3)磁分离2min，去上清；
4)洗涤3次，每次300ul洗液；
5)加入底物200ul，测值。
为了检验这2种体系下对样本测值的差异，我们在这2种体系下分别测试了同一组样本，并与给值进行了比对，数据如下表所示：
表1不同体系下测值与给值对比以及测值之间对比
由表1可以看出，不同体系测值与给值相关性都在0.96以上，两种测定体系相关性为0.9585。因此，本发明的技术方案完全可行，且灵活性更大。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种磁微粒化学发光法测定人血清中地高辛含量的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括生物素化地高辛抗原衍生物、抗体酶标试剂、酶标地高辛抗原衍生物、生物素化地高辛鼠单抗和校准品；
所述试剂盒中主要组分按照如下制备方法制得：
一、地高辛抗原衍生物制备过程:
1)、将地高辛和琥珀酸酐分别用DMF缓冲液溶解，得到地高辛-DMF溶液和琥珀酸酐-DMF溶液；
2)、将地高辛-DMF溶液加入琥珀酸酐-DMF溶液中，65℃反应4～6h；加入三丁胺和氯甲酸异丁酯，室温反应20～40min，得到地高辛-琥珀酸酐的DMF溶液；加入赖氨酸溶液，室温反应2～4h；
3)、将反应物用水透析过夜，调节pH析出沉淀，将沉淀放置室温0.5～2h，然后在4℃放置2～4h，4℃离心10-15min，用Na2CO3缓冲液溶解沉淀配置成地高辛抗原衍生物的溶液；
二、生物素化地高辛抗原衍生物制备过程:
将生物素-NHS用DMSO进行溶解后，按照地高辛抗原衍生物与生物素-NHS摩尔比为1:18～22加入步骤一所得的地高辛抗原衍生物，室温反应2h；用透析袋透析反应产物，将透析液稀释至工作液浓度；
三、抗体酶标试剂制备过程：
将地高辛鼠单抗和碱性磷酸酶分别活化后，将二者混合2-8℃反应14～20h小时；将反应物用层析柱进行纯化，收集I峰II峰进行混合后用缓冲液将配置成工作液浓度；
四、酶标地高辛抗原衍生物制备过程：
将地高辛抗原衍生物和碱性磷酸酶分别活化后，将二者混合2-8℃反应14～20h小时；将反应物用层析柱进行纯化，收集I峰II峰进行混合后用缓冲液将配置成工作液浓度；
五、生物素化地高辛鼠单抗制备过程：
1)将生物素-NHS，用DMSO进行溶解得到DMSO溶解的生物素，加入地高辛鼠单抗，充分混匀后室温反应2h；透析后将透析液稀释至工作液浓度。
2.如权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤三中地高辛鼠单采用0.1*的PBS进行透析，然后用2IT进行活化，得到活化后的抗体；所述步骤四中地高辛抗原衍生物采用0.1*的PBS进行透析，然后用2IT进行活化，得到活化后的抗体。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤三和四中的碱性磷酸酶用SMCC进行活化，得到活化后的碱性磷酸酶。
4.一种如权利要求1所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取样本15ul、生物素化地高辛抗原衍生物30ul和抗体酶标试30ul，孵育15min；
2)向1)中加入磁珠30ul，孵育5min；
3)磁分离2min，去上清；
4)洗涤3次，每次300ul洗液；
5)加入底物200ul，测值。
5.一种如权利要求1所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取样本15ul、酶标地高辛抗原衍生物30ul和生物素化地高辛鼠单抗30ul，孵育15min
2)向1)中加入磁珠30ul，孵育5min；
3)磁分离2min，去上清；
4)洗涤3次，每次300ul洗液；
5)加入底物200ul，测值。
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