CN111172229A - 脾脏多肽制品的生物活性的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种脾脏多肽制品的生物活性的测定方法。所述方法包括如下步骤：脱E受体胸腺T细胞悬液制备步骤：通过加热后离心，从动物胸腺制备脱E受体胸腺T细胞悬液；供试样品准备步骤：准备包含所述脾脏多肽制品的供试样品；混合步骤：将所述脱E受体胸腺T细胞悬液和所述供试样品混合；检测步骤：将得到的混合液离心重悬后用E玫瑰花结受体染色，并通过流式细胞仪检测所述供试样品恢复E受体功能的胸腺T细胞数量的比例。

Description

脾脏多肽制品的生物活性的测定方法
技术领域
本发明涉及生物活性检测领域。更详细地说，其涉及一种改进的脾脏多肽制品的生物活性的测定方法，从而提高脾脏多肽制品的检测数据可靠性，并加快检验速度，从而有效控制制品质量。
背景技术
脾脏多肽自20世纪50年代被发现后，已有很多学者对其生物学特性、免疫活性等进行了深入研究。脾脏多肽具有双向调节机体免疫功能、增强细胞免疫、刺激骨髓细胞增殖的作用，临床上可用于免疫系统紊乱引起的相关疾病。
作为一类脾脏多肽制品，脾氨肽口服溶液是用新鲜健康牛脾经匀浆、冻融、离心、超滤等步骤提取制得的脾氨肽溶液配制而成的口服溶液，其中含有分子量小于10KD的多肽和氨基酸类物质。
在脾氨肽口服溶液的制备中，检测产品中脾脏多肽的活性对于质量控制是至关重要的。原国家药品标准的生物活性测定方法为：T细胞活性测定法——脱E受体法(WS1-XG-042-2000-2003，附录一：T细胞活性测定法-脱E受体法。《国家药品标准》第十六册)。
该标准的检测原理是根据采用玫瑰花结试验检测恢复E受体活性的胸腺T细胞数量占比，从而反映多肽制品的生物活性。其主要操作过程包括：(1)脱E受体胸腺T细胞的制备；(2)绵羊红细胞悬液的制备；(3)供试品溶液的制备；(4)测定：求得供试品测定管E玫瑰花结百分率和对照管E玫瑰花结百分率，并根据如下计算公式求得样品活性：
样品活性＝供试品测定管E玫瑰花结百分率－对照管E玫瑰花结百分率
所述E玫瑰花结是指在一定的实验条件下，绵羊红细胞与存在于T淋巴细胞表面的针对绵羊红细胞的特异性受体(E玫瑰花结受体，又称CD2抗体，而几乎所有的成熟外周T细胞都表达CD2分子)结合，形成以T细胞为中心、四周环绕绵羊红细胞、状如玫瑰花的细胞团。
尽管上述T细胞活性测定法——脱E受体法可以用于脾脏多肽制品如脾氨肽口服溶液的活性测定，但是由于这种检测方法步骤较多，影响试验结果的因素也很多，在实践中存在一系列问题，一定程度上限制该方法的实践性。
具体而言，该标准是采用新鲜绵羊血红细胞与T细胞上的绵羊红细胞受体结合形成玫瑰花环的数量来检测的。然而，新鲜绵羊血取用不方便，而且绵羊的体质状态和季节变化对试验均会造成影响。另外，玫瑰花结是通过人工辨识和计数的，这对实验结果也形成了主观因素的影响，且使实验结果无法追踪。因此，已迫切需求提供一种简便快捷可靠的改进的T细胞活性测定法。
发明内容
本发明人经过深入的研究，发现通过采用流式细胞仪检测法对脾脏多肽制品如脾氨肽口服溶液进行活性测定，提高了脾脏多肽制品检测数据的可靠性、加快检验速度从而有效控制产品质量。由此实现了本发明。
本发明的一个目的在于提供一种脾脏多肽制品的生物活性测定方法，其包括如下步骤：
脱E受体胸腺T细胞悬液制备步骤：通过加热后离心，从动物胸腺制备脱E受体胸腺T细胞悬液；
供试样品准备步骤：准备包含所述脾脏多肽制品的供试样品；
混合步骤：将所述脱E受体胸腺T细胞悬液和所述供试样品混合；
检测步骤：将得到的混合液离心重悬后用E玫瑰花结受体染色，并通过流式细胞仪检测所述供试样品恢复E受体功能的胸腺T细胞数量的比例。
本发明的脾脏多肽制品的生物活性测定方法，所述加热后离心包括重复至少两次以下操作：将加入有Hank’s液的胸腺T细胞悬液在40～50℃恒温水浴保温20～40min，每隔5min振摇1次，再进行第一离心步骤，所述第一离心步骤为以1500转/分钟离心3～5min。
本发明的脾脏多肽制品的生物活性测定方法，所述检测步骤进一步包括将所述得到的混合液在染色之前在37℃下保温6至12小时、优选8至12小时、更优选10至12小时的步骤。在另一实施方案中，所述检测步骤进一步包括将所述得到的混合液在离心重悬后、染色之前在37℃下保温6至12小时优选8至12小时、更优选10至12小时的步骤。
本发明的脾脏多肽制品的生物活性测定方法，在所述混合步骤之后及所述检测步骤之前进一步包括将得到的混合液在37℃下保温1小时。
本发明的脾脏多肽制品的生物活性测定方法，在所述检测步骤中，在所述染色之后及所述流式细胞仪检测之前，所述测定方法还包括第二离心步骤，所述第二离心步骤优选为重复进行2～4次的1000～2000转/分钟离心3～5分钟，更优选为重复进行3次的1500转/分钟离心5分钟。
本发明的脾脏多肽制品的生物活性测定方法，所述E玫瑰花结受体为CD2单克隆抗体。
本发明的脾脏多肽制品的生物活性测定方法，所述供试样品的浓度为0.75mg/mL以上，优选1.0mg/mL以上。
本发明的脾脏多肽制品的生物活性测定方法，所述动物胸腺为猪胸腺。
本发明的脾脏多肽制品的生物活性测定方法，所述脾脏多肽制品为脾氨肽口服溶液。
本发明的另一目的在于前述生物活性测定方法用于脾脏多肽制品的活性测定的用途，优选地，所述脾脏多肽制品为脾氨肽口服溶液。
本发明意外的发现，将国家药品标准WS1-XG-042-2000-2004操作方法中的绵羊红细胞悬液的制备步骤和测定步骤替换为使用带有荧光标记的E玫瑰花结受体(如CD2抗体)直接与淋巴细胞中的T细胞结合并通过流式细胞仪检测荧光强度来反应样品是否可以促进脱E受体的T细胞恢复E受体活性，从而获得检测数据可靠、检验速度优异、质量可控的改进的生物活性测定方法。
附图说明
图1为细胞计数板放大后的方格网图示。其中，中央25×16计数区内位于正中及四角的5个大格是红细胞计数区域(共80小格，黑色区域)。16大格/角共四角是白细胞计数区域(共64小格，白色区域)，16大格/角的面积为1×1mm2，容积为0.1mm3(μL)。
具体实施方式
本发明公开了一种脾脏多肽制品的生物活性测定方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，以下实施例仅为本发明的示例性实施方案，本发明决不限于下述示例性实施方案。所附权利要求的范围符合最广泛的解释，从而涵盖全部这样的修改和等同的结构和功能。
本发明提供的脾脏多肽制品的生物活性测定方法中的常用试剂均可商购获得，其配制过程示例如下。
Hank’s液的配制：取氯化钠8.0g、氯化钾0.4g、碳酸氢钠0.35g、磷酸二氢钾0.06g、二水合磷酸氢二钠0.06g(无水磷酸氢二钠0.0477g)、葡萄糖1.0g，加入1000mL纯化水，混匀，用4％的碳酸氢钠溶液调节pH值到7.3-7.4，4℃保存备用。
阿氏液的配制：取氯化钠0.21g、柠檬酸0.0275g、柠檬酸钠0.383g、葡萄糖1.025g，加水溶解，定容至50mL容量瓶中，备用。取5-10mL阿氏液用滤膜过滤到100mL三角瓶中，备用。
淋巴细胞分离液：商品名：TBD猪外周血淋巴细胞分离液KIT；天津市灏洋生物制品科技有限责任公司制，4℃冰箱保存。
绵羊血：取绵羊静脉血5mL，加入备用的阿氏液中，摇匀，4℃冰箱保存。
固定液：取25％戊二醛溶液，3.5％碳酸氢钠溶液，Hank’s液依次按1:1:38比例混合。
姬姆萨染色液原液：取姬姆萨染料0.5g，加甘油33mL，55-60℃加热至姬姆萨染料溶解，冷至室温，加入33mL甲醇，室温放置24小时后，用滤纸过滤，滤液即为原液，密封室温保存。
染色液：取姬姆萨染色原液2mL，加Hank’s液6mL，摇匀，离心(1500转/分)10分钟，取上清液待用。
下文中，将结合具体实施例进一步详细地阐述本发明。
[实施例]
实施例1.T细胞来源的选择
(1)人外周血T细胞和猪胸腺T细胞
分别根据下列方法制备人外周血T细胞和猪胸腺T细胞。
人外周血T细胞制备：取一支50mL离心管，先加入与血液样本等量的淋巴细胞分离液，用吸管小心吸取血液样本加于分离液之液面上，500～1100g(最大离心力不超过1200g)离心20～30min。离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层。第二层为环状乳白色淋巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15mL离心管中，向所得离心管中加入适量Hank's液，混匀细胞，250g，离心10min，弃上清，再加入适量Hank's液重悬细胞，计数，使最终浓度为每1mL中1×107个细胞。
猪胸腺T细胞制备：取新鲜猪胸腺，去脂肪并剪碎，加适量Hank’s液使成细胞悬液，经100目筛过滤，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液。用少量Hank’s液反复洗涤3次(操作同前)。加入少量Hank’s液打匀，将此溶液加入已具有1/3滤液量的分离液的离心管中，以每分钟2000转的速率离心20分钟，小心吸出中间层的胸腺T细胞，放入另一离心管中，加适量Hank’s液洗涤，摇匀，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液，洗涤一次后，在沉淀物中加入适量Hank’s液，混匀，计数，使最终浓度为每1mL中1×107个细胞。
(2)样品的制备
取1.5mL离心管4支，各加Hank’s液500μL，其中2支加入人外周血T细胞悬液50μL，另2支加入猪胸腺T细胞悬液50μL。37℃保温1小时。
(3)使用流式细胞法的活性测定
0时间点测定
取出4支离心管，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液。用200μL的PBS缓冲液重悬。取出1支加有人外周血T细胞悬液的离心管和1支加有猪胸腺T细胞悬液的离心管，另放，不做染色处理。使用CD2单克隆抗体对另外2支离心管内的细胞悬液进行染色，同时避光冰浴30分钟，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液，加入PBS缓冲液1mL重悬，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液，加入PBS缓冲液1mL重悬，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液，加入PBS缓冲液200μL重悬，用100目尼龙筛网过滤后，用流式细胞仪检测，结果总结于表1。
表1.不同来源的淋巴细胞与CD2抗体的相关性
Figure BDA0001864095000000061
从表1来看，从材料获取的便利性和T细胞与CD2抗体的结合能力的观点，后续实施例中选择猪胸腺作为检测中T细胞的来源。
实施例2.脱E受体胸腺T细胞的提取
对新鲜猪胸腺分别采用不同的脱E方法对T细胞进行脱E，按下述实验方法进行实验，重复3次，进行统计学分析。
一次脱E法：将用淋巴细胞分离液分离出的胸腺T细胞制成悬液，洗涤1次后，在沉淀物中加入适量的Hank's液混匀，在45℃恒温水浴保温30min，每隔5min振摇1次，以1500转/分钟离心3～5min，弃去上清液，再加入适量Hank's液，混匀后再次置45℃恒温水浴保温30min，取出后以1500转/分钟离心3～5min，弃去上清液，再加入适量Hank's液，混匀，计数，使最终浓度为每1mL中1×107个细胞。
两次脱E法：将用淋巴细胞分离液分离出的胸腺T细胞制成悬液，洗涤1次后，在沉淀物中加入适量的Hank's液混匀，在45℃恒温水浴保温30min，每隔5min振摇1次，以1500转/分钟离心3～5min，弃去上清液，再加入适量Hank's液，混匀后再次置45℃恒温水浴保温30min，每隔5min振摇1次。取出后以1500转/分钟离心3～5min，弃去上清液，再加入适量Hank's液，混匀，计数，使最终浓度为每1mL中1×107个细胞。
制备
取1.5mL离心管4支，加Hank’s液500μL，其中2支加入一次脱E受体胸腺T细胞悬液50μL，另2支加入两次脱E受体胸腺T细胞悬液50μL。37℃保温1小时。
0时间点测定
取出4支离心管，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液。用200μL的PBS缓冲液重悬。分别取出一次脱E法的细胞悬液和两次脱E法的细胞悬液各1支离心管，另放，不做染色处理。使用CD2单克隆抗体对剩下的2支离心管进行染色，同时避光冰浴30分钟，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液，加入PBS缓冲液1mL重悬，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液，加入PBS缓冲液1mL重悬，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液，加入PBS缓冲液200μL重悬，用100目尼龙筛网过滤后，用流式细胞仪检测，脱E后剩余未脱E受体的T细胞数量的结果总结于表2。
表2.不同T细胞脱E法对实验结果的影响
Figure BDA0001864095000000071
由于T细胞的脱E程度直接影响实验结果，所以本实施例中采用两次加热后离心的操作步骤(即，重复进行两次45℃恒温水浴及振摇的操作)。从表2的结果来看，采用二次脱E法，使得更多的T细胞被脱去，留下的T细胞数量更少，进一步提高了实验的准确性。
实施例3.检测步骤中实验温度和测定时间的选择
制备
取1.5mL离心管56支，其中14支各加Hank’s液500μL，加入两次脱E法获得的脱E受体胸腺T细胞悬液50μL，作为空白管。另42支加入供试品溶液(脾氨肽口服溶液，注册商标“京生”，北京第一生物化学药业有限公司制，批次：170307、170308、170309)每批14支各500μL，每管中各加两次脱E法获得的脱E受体胸腺T细胞悬液50μL，作为供试品管。37℃保温1小时。
供试品测定
取空白管7支、供试品管(批次：170307、170308、170309)各7支，放入冰箱4℃冷藏，取剩下的空白管7支、供试品管(批次：170307、170308、170309)各7支放37℃保温。
分别在2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时，取出4℃冷藏中的1支空白管，供试品管(批次：170307、170308、170309)各1支，同时取出37℃保温的1支空白管，供试品管(批次：170307、170308、170309)各1支，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液。用200μL的PBS缓冲液重悬。使用CD2单克隆抗体对其进行染色，避光冰浴30分钟，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液，加入PBS缓冲液1mL重悬，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液，加入PBS缓冲液1mL重悬，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液，加入PBS缓冲液200μL重悬，用100目尼龙筛网过滤后，用流式细胞仪检测供试品恢复E受体功能的胸腺T细胞数量结果占比％。结果总结于表3。
由表3可以看出，在37℃下保温4至12小时，在三个批次的脾氨肽口服溶液(170307、170308、170309)在37℃下保温时能够在6至12小时的检测时间内获得稳定的检测结果，重现性优异。
尽管不受理论的约束，但本发明的发明人推测，对于检测时间而言，当检测时间达到14小时时供试品溶液环境营养条件可能不足，已不支持细胞恢复E受体，导致细胞大量凋亡，使T细胞数量降低。对于检测温度而言，4℃为冷藏环境，不利于细胞活动，故T细胞恢复缓慢；随着温度的升高T细胞的恢复效果越来越好，达到37℃为人体温度适宜细胞活动，T细胞恢复E受体效果更佳。
表3.不同温度和不同测定时间的交叉实验确认最适实验温度和测定时间
Figure BDA0001864095000000091
实施例4.供试品浓度的选择
制备
取1.5mL离心管6支，其中1支各加Hank’s液500μL，加入脱E受体胸腺T细胞悬液5μL，作为空白管。另5支加浓度配好的供试品溶液(0.5mg/mL、0.75mg/mL、1.0mg/mL、1.25mg/mL、1.5mg/mL)各500μL，每管中各加脱E受体胸腺T细胞悬液50μL，作为供试品管。37℃保温1小时。
供试品测定
37℃保温12小时后取出空白管和供试品管，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液。用200μL的PBS缓冲液重悬。使用CD2单克隆抗体对其进行染色，避光冰浴30分钟，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液，加入PBS缓冲液1mL重悬，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液，加入PBS缓冲液1mL重悬，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液，加入PBS缓冲液200μL重悬，用100目尼龙筛网过滤后，用流式细胞仪检测供试品恢复E受体功能的胸腺T细胞数量结果占比(％)。结果总结于表4。
表4.供试品浓度的选择
Figure BDA0001864095000000101
基于表4的结果，在活性检测方法中采用1.0mg/mL作为供试品浓度。
实施例5.与原活性检测方法检测结果的比较
(1)原活性检测方法：
供试品溶液制备：将脾氨肽口服溶液(注册商标“京生”，北京第一生物化学药业有限公司制，批次：170307、170308、170309)各自稀释成每1mL中含有1mg多肽的溶液，加入氯化钠0.8g、氯化钾0.04g、碳酸氢钠0.035g、磷酸二氢钾0.006g、二水合磷酸氢二钠0.006g(无水磷酸氢二钠0.00477g)、葡萄糖0.1g，定容至100mL容量瓶，并用4％的碳酸氢钠溶液调节pH值至7.30左右。
取新鲜猪胸腺(淡黄色的块状物)，去脂肪并剪碎，加适量Hank’s液使成细胞悬液，先过一层纱布，再经100目筛过滤(用尼龙筛网)，胶头滴管打匀。离心(1500转/分)5分钟，弃去上清液，反复三次，加入少量Hank’s液打匀(10-15mL)。将此溶液加至已加有1/3滤液量的分离液的离心管中(一般为3mL)，离心(2000转/分)20分钟，小心吸出中间层的胸腺T细胞，放入另一离心管中，加适量Hank’s液洗涤，摇匀，离心(1500转/分)5分钟，弃去上清液，洗涤一次后，在沉淀物中加入适量Hank’s液洗涤，混匀。置45℃恒温水浴中保温30分钟(5分钟摇匀一次)，取出，离心(1500转/分)5分钟，弃去上清液，再加入适量Hank’s液，混匀后，置45℃恒温水浴中保温30分钟(5分钟摇匀一次)，取出，离心(1500转/分)5分钟，弃去上清液，最后用Hank’s液适量稀释并计数，使最终浓度成为每1mL中含3×106～5×106个细胞的细胞悬液。
胸腺T细胞悬液计数：1.计数区域：如图1所示，使用25×16计数板在16大格/角(共计四角)中计数(共64小格)；2.计算方法：原液T细胞个数/mL＝64小格中细胞总数/4×104×稀释倍数
取准备好的绵羊静脉血，用尼龙筛网过滤，用适量Hank’s液洗涤，离心(1500转/分)5分钟，弃去上清液，三次，加适量Hank’s液稀释并计数，使最终浓度为脱E受体胸腺T细胞悬液浓度的20倍。(一般为8×107个细胞/mL)
绵羊红细胞悬液计数：1.计数区域：如图1所示，使用25×16计数板在中央25×16计数区域内计数，四个对角加中间5大格(共80小格)；2.计算方法：原液血红细胞个数/mL＝5大格中细胞总数/80×400×104×稀释倍数。
测定：取3支小试管加0.1mL Hank’s液，作为空白管，再取3支小试管加0.1mL供试液，作为供试品管，每管脱E受体胸腺T细胞悬液0.2mL，摇匀，37℃恒温水浴保温1小时后，加入绵羊红细胞悬液0.2mL，摇匀，以800转/分钟离心5分钟，共离心三次后吸弃上清液，每管中加入固定液1滴(50微升)，轻轻摇匀，静置10分钟，加染色液2滴(100微升)并摇匀，再静置15分钟，放入4℃冰箱约12小时后，计数。
(2)新活性检测方法：
制备：取1.5mL离心管10支，其中1支各加Hank’s液500μL，加入脱E受体胸腺T细胞悬液50μL，作为空白管。另9支加供试品溶液(批次：170307、170308、170309)每批各3支500μL，每管中各加脱E受体胸腺T细胞悬液50μL，作为供试品管。37℃保温1小时。
供试品测定：37℃保温12小时后取出空白管和供试品管，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液。用200μL的PBS缓冲液重悬。使用CD2单克隆抗体对其进行染色，避光冰浴30分钟，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液，加入PBS缓冲液1mL重悬，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液，加入PBS缓冲液1mL重悬，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液，加入PBS缓冲液20μL重悬，用100目尼龙筛网过滤后，用流式细胞仪检测供试品恢复E受体功能的胸腺T细胞数量结果占比(％)。结果总结于表5。
表5.各活性检测方法的结果
原方法实验结果％：
Figure BDA0001864095000000121
新方法实验结果％：
Figure BDA0001864095000000122
从表5的结果来看，原方法玫瑰花结个数为人工计数，对于结果的重复性、精确性都非常依赖于操作人员的经验。此外，即使是同样的样品，换做不同的人员操作，结果或将有一定程度的偏差。
新方法的计数采用机器进行，则可排除经验不足或者人员更换所带来的不必要的误差，所以采用机器计数的方法结果更加可靠、重复性更高、差异较少、SD偏差值更小。此外，机器计数可以精确到小数点后两位，结果的精确度更高，所以得到的试验结果更加精确。同时，用机器计数更加的便捷，提高工作效率，减少不必要的人员培训成本。
6.可重复性检验
制备：取1.5mL离心管19支，其中1支各加Hank’s液500μL，加入脱E受体胸腺T细胞悬液50μL，作为空白管。另18支加供试品溶液(脾氨肽口服溶液，注册商标“京生”，北京第一生物化学药业有限公司制，批次：170307、170308、170309)每批6支500μL，每管中各加脱E受体胸腺T细胞悬液50μL，作为供试品管。37℃保温1小时。
供试品测定：37℃保温12小时后取出空白管和供试品管，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液。用200μL的PBS缓冲液重悬。使用CD2单克隆抗体对其进行染色，避光冰浴30分钟，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液，加入PBS缓冲液1mL重悬，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液，加入PBS缓冲液1mL重悬，以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液，加入PBS缓冲液200μL重悬，用100目尼龙筛网过滤后，用流式细胞仪检测供试品恢复E受体功能的胸腺T细胞数量结果占比％。
表6.可重复性检验
Figure BDA0001864095000000131
如表6所示，重复性实验结果表明，此实验方法结果重现性好，误差小，可避免由于人为的因素对实验结果造成的影响。

Claims (10)

1.一种脾脏多肽制品的生物活性的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
脱E受体胸腺T细胞悬液制备步骤：通过加热后离心，从动物胸腺制备脱E受体胸腺T细胞悬液；
供试样品准备步骤：准备包含所述脾脏多肽制品的供试样品；
混合步骤：将所述脱E受体胸腺T细胞悬液和所述供试样品混合；
检测步骤：将得到的混合液离心重悬后用E玫瑰花结受体染色，并通过流式细胞仪检测所述供试样品恢复E受体功能的胸腺T细胞数量的比例。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述加热后离心包括重复至少两次以下操作：将加入有Hank’s液的胸腺T细胞悬液在40～50℃恒温水浴保温20～40min，每隔5min振摇1次，再进行第一离心步骤，所述第一离心步骤为以1500转/分钟离心3～5min。
3.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，所述检测步骤进一步包括将所述得到的混合液在染色之前在37℃下保温6至12小时。
4.根据权利要求1至3任一项所述的测定方法，其特征在于，在所述混合步骤之后及所述检测步骤之前进一步包括将得到的混合液在37℃下保温1小时的步骤。
5.根据权利要求1至4任一项所述的测定方法，其特征在于，在所述检测步骤中，在所述染色之后及所述流式细胞仪检测之前，所述测定方法还包括第二离心步骤，所述第二离心步骤优选为重复进行2～4次的1000～2000转/分钟离心3～5分钟。
6.根据权利要求1至5任一项所述的测定方法，其特征在于，所述E玫瑰花结受体为CD2单克隆抗体。
7.根据权利要求1至6任一项所述的测定方法，其特征在于，所述供试样品的浓度为0.75mg/mL以上。
8.根据权利要求1至7任一项所述的测定方法，其特征在于，所述动物胸腺为猪胸腺。
9.根据权利要求1至8任一项所述的测定方法，其特征在于，所述脾脏多肽制品为脾氨肽口服溶液。
10.根据权利要求1至9任一项所述的测定方法用于脾脏多肽制品的活性测定的用途，优选地，所述脾脏多肽制品为脾氨肽口服溶液。
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