CN111172036A - 一种酸奶中菌体的分离方法及其在基因组dna抽提中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及乳品检测技术领域，特别是涉及一种酸奶中菌体的分离方法及其在基因组DNA抽提中的用途。本发明提供一种酸奶中菌体的分离方法，包括如下步骤：将酸奶样品离心，去除上清以提供第一沉淀物；将第一沉淀物水洗、离心，去除上清以提供第二沉淀物；将第二沉淀物与氢氧化钠反应，所得产物离心、去除上清以提供第三沉淀物；将第三沉淀物水洗、离心，去除上清以提供第四沉淀物；将第四沉淀物去除胶体，以提供菌体悬浮液；将菌体悬浮液离心，以提供菌体沉淀。本发明所提供的酸奶中菌体的分离方法以及利用上述分离方法对酸奶基因组DNA进行抽提的方法，可以获得较高质量的酸奶基因组DNA。
Description
技术领域
本发明涉及乳品检测技术领域，特别是涉及一种酸奶中菌体的分离方法及其在基因组DNA抽提中的用途。
背景技术
酸奶中含有蛋白、脂肪、胶体等物质，严重干扰菌体DNA抽提。常规离心分离方法，牛奶蛋白、胶体与菌体一起沉淀，难以被分离。用蛋白酶分解蛋白，时间较长，微生物容易生长发生变化，影响检测结果准确性。用淀粉酶、果胶酶等分解胶体，需要根据胶体的种类，选择不同的酶；但某种酸奶中的胶体组成是未知的，弄清其组成是很困难的。所以，如何简便快速分离出酸奶中菌体，是抽提酸奶基因组DNA关键步骤。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种酸奶中菌体的分离方法及其在基因组DNA抽提中的用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种酸奶中菌体的分离方法，包括如下步骤：
1)将酸奶样品离心，去除上清以提供第一沉淀物；
2)将步骤1)所提供的第一沉淀物水洗、离心，去除上清以提供第二沉淀物；
3)将步骤2)所提供的第二沉淀物与氢氧化钠反应，所得产物离心、去除上清以提供第三沉淀物；
4)将步骤3)所提供的第三沉淀物水洗、离心，去除上清以提供第四沉淀物；
5)将步骤4)所提供的第四沉淀物去除胶体，以提供菌体悬浮液；
6)将步骤5)所提供的菌体悬浮液离心，以提供菌体沉淀。
在本发明一些实施方式中，所述酸奶选自发酵乳。
在本发明一些实施方式中，所述步骤1)中，离心条件为3000-10000g，离心时间为3-15min。
在本发明一些实施方式中，所述步骤2)中，使用超纯水对第一沉淀物进行水洗。
在本发明一些实施方式中，所述步骤2)中，离心条件为3000-10000g，离心时间为3-15min。
在本发明一些实施方式中，所述步骤3)中，所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.5～1.5mol/L。
在本发明一些实施方式中，所述步骤3)中，氢氧化钠的使用量为每1g酸奶样品加入20-60mg的氢氧化钠。
在本发明一些实施方式中，所述步骤3)中，离心条件为3000-10000g，离心时间为3-15min。
在本发明一些实施方式中，所述步骤4)中，使用超纯水对第三沉淀物进行水洗。
在本发明一些实施方式中，所述步骤4)中，离心条件为3000-10000g，离心时间为3-15min。
在本发明一些实施方式中，所述步骤5)中，将步骤4)所提供的第四沉淀物去除胶体的具体方法包括：将第四沉淀物离心以去除胶体。
在本发明一些实施方式中，所述步骤5)中，离心条件为500-1200g，离心时间为3-6min。
在本发明一些实施方式中，所述步骤6)中，离心条件为3000-10000g，离心时间为3-15min。
本发明第二方面提供一种酸奶基因组DNA抽提方法，包括上述的酸奶中菌体的分离方法，还包括：
将菌体沉淀抽提菌体DNA。
附图说明
图1显示为本发明实施例1常温酸奶基因组DNA抽提电泳图结果示意图。
图2显示为本发明实施例2冷藏酸奶省去水洗步骤的PCR电泳检测结果示意图。
图3显示为本发明实施例2冷藏酸奶省去胶体去除步骤的PCR电泳检测结果示意图。
图4显示为本发明实施例3冷藏酸奶16S rRNA PCR电泳结果示意图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。
本发明发明人经过大量研究，提供了一种酸奶中菌体的分离方法，并进一步提供了利用上述分离方法对酸奶基因组DNA进行抽提的方法，本发明所提供的酸奶中菌体的分离方法可以快速分离出酸奶中菌体，具有操作简便、成本低、处理时间短等优点，在此基础上完成了本发明。
本发明第一方面提供一种酸奶中菌体的分离方法，包括如下步骤：
1)将酸奶样品离心，去除上清以提供第一沉淀物；
2)将步骤1)所提供的第一沉淀物水洗、离心，去除上清以提供第二沉淀物；
3)将步骤2)所提供的第二沉淀物与氢氧化钠反应，所得产物离心、去除上清以提供第三沉淀物；
4)将步骤3)所提供的第三沉淀物水洗、离心，去除上清以提供第四沉淀物；
5)将步骤4)所提供的第四沉淀物去除胶体，以提供菌体悬浮液；
6)将步骤5)所提供的菌体悬浮液离心，以提供菌体沉淀。
本发明所提供的酸奶中菌体的分离方法中，酸奶通常指发酵乳，即以生乳或乳粉为原料，经过杀菌处理(例如，巴氏杀菌)、发酵后所获得的pH值降低的乳制品，发酵过程中可以添加有益菌(例如，发酵剂)。具体可以是例如，发酵乳、风味发酵乳等；再例如，可以是常温酸奶、冷藏酸奶等；再例如，可以是符合GB 19302-2010相关标准的各种发酵乳。所述酸奶中通常可以包括嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌等菌体，当酸奶发生污染时，也可以进一步包括真菌等菌体，例如，酵母、霉菌等。
本发明所提供的酸奶中菌体的分离方法中，可以包括：将酸奶样品离心，去除上清以提供第一沉淀物。将酸奶样品离心，通常可以去除酸性水溶性蛋白，所提供的第一沉淀物通常为胶体、酸性不溶蛋白、脂肪、菌体等沉淀物。所述步骤1)中，具体的离心条件对于本领域技术人员来说是可以被调整的，例如，离心条件通常可以为3000-10000g、3000g-4500g、4500g-6000g、6000g-7500g、7500g-9000g、或9000g-10000g，再例如，离心时间通常可以为3-15min、3-5min、5-7min、7-9min、9-11min、11-13min、或13-15min。
本发明所提供的酸奶中菌体的分离方法中，还可以包括：将步骤1)所提供的第一沉淀物水洗、离心，去除上清以提供第二沉淀物。将第一沉淀物水洗、离心，通常可以去除酸性水溶性蛋白。所提供的第二沉淀物通常包括胶体、酸性不溶蛋白、脂肪、菌体等沉淀物。本领域技术人员可选择合适的方法对第一沉淀物进行洗涤，例如，可以使用超纯水等，洗涤的过程中，可以对沉淀物进行多次洗涤，以保证能够溶于酸、但不能溶于碱的蛋白部分被充分分离。所述步骤2)中，具体的离心条件对于本领域技术人员来说是可以被调整的，例如，离心条件通常可以为3000-10000g、3000g-4500g、4500g-6000g、6000g-7500g、7500g-9000g、或9000g-10000g，再例如，离心时间通常可以为3-15min、3-5min、5-7min、7-9min、9-11min、11-13min、或13-15min。
本发明所提供的酸奶中菌体的分离方法中，还可以包括：将步骤2)所提供的第二沉淀物与氢氧化钠反应，所得产物离心、去除上清以提供第三沉淀物。将第二沉淀物与氢氧化钠反应，通常可以去除碱溶性蛋白和脂肪，所提供的第三沉淀物通常包括胶体、脂肪、极少量的菌体等沉淀物。所述步骤3)中，所加入的氢氧化钠的量通常取决于酸奶样品的称取量，例如，氢氧化钠的使用量可以为每1g酸奶样品加入20～60mg、20～30mg、30～40mg、40～50mg、或50～60mg的氢氧化钠。通常来说，可以将氢氧化钠溶于适量的水，形成氢氧化钠水溶液，将步骤2)所提供的第二沉淀物与氢氧化钠水溶液混合以进行反应。具体所使用的氢氧化钠水溶液的浓度以及第二沉淀物与氢氧化钠的反应时间对于本领域技术人员来说是可以被调整的，例如，所述氢氧化钠水溶液的浓度可以为0.5～1.5mol/L、0.5～0.7mol/L、0.7～0.9mol/L、0.9～1.1mol/L、1.1～1.3mol/L、或1.3～1.5mol/L，再例如，可以将第二沉淀物与氢氧化钠水溶液充分混合，静置3～5min、5～10min、或10～15min。所述步骤3)中，具体的离心条件对于本领域技术人员来说是可以被调整的，例如，离心条件通常可以为3000-10000g、3000g-4500g、4500g-6000g、6000g-7500g、7500g-9000g、或9000g-10000g，再例如，离心时间通常可以为3-15min、3-5min、5-7min、7-9min、9-11min、11-13min、或13-15min。
本发明所提供的酸奶中菌体的分离方法中，还可以包括：将步骤3)所提供的第三沉淀物水洗、离心，去除上清以提供第四沉淀物。将第三沉淀物水洗、离心通常，通常可以去除氢氧化钠、残余的脂肪等，所提供的第四沉淀物通常包括菌体与胶体。本领域技术人员可选择合适的方法对第三沉淀物进行洗涤，例如，可以使用超纯水等，洗涤的过程中，可以对沉淀物进行多次洗涤，以保证能够充分地将第四沉淀物与其他物质分离。所述步骤4)中，具体的离心条件对于本领域技术人员来说是可以被调整的，例如，离心条件通常可以为3000-10000g、3000g-4500g、4500g-6000g、6000g-7500g、7500g-9000g、或9000g-10000g，再例如，离心时间通常可以为3-15min、3-5min、5-7min、7-9min、9-11min、11-13min、或13-15min。
本发明所提供的酸奶中菌体的分离方法中，还可以包括：将步骤4)所提供的第四沉淀物去除胶体，以提供菌体悬浮液。将第四沉淀物去除胶体，可以将第四沉淀物中的菌体有效地从胶体中分离出来，使其处于悬浮液中，以便于后续基因组DNA的抽提。所述步骤5)中，去除第四沉淀物中胶体的方法通常可以是低速离心，例如，离心条件为500-1200g、500-600g、600-700g、700-800g、800-900g、900-1000g、1000-1100g、或1100-1200g，离心时间为3-6min、3-4min、4-5min、或5-6min。
本发明所提供的酸奶中菌体的分离方法中，还可以包括：将步骤5)所提供的菌体悬浮液离心，以提供菌体沉淀。将菌体悬浮液进行离心，即可将菌体悬浮液中包括的菌体进行沉淀，以获得高纯度的菌体。所述步骤6)中，具体的离心条件对于本领域技术人员来说是可以被调整的，例如，离心条件通常可以为3000-10000g、3000g-4500g、4500g-6000g、6000g-7500g、7500g-9000g、或9000g-10000g，再例如，离心时间通常可以为3-15min、3-5min、5-7min、7-9min、9-11min、11-13min、或13-15min。
本发明第二方面提供一种酸奶基因组DNA抽提方法，包括本发明第一方面提供的酸奶中菌体的分离方法，还包括：将菌体沉淀抽提菌体DNA。合适的对菌体沉淀进行DNA抽提的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是CTAB方法、玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法、异硫氰酸胍法、碱裂解法、酶法等。
本发明所提供的酸奶中菌体的分离方法以及利用上述分离方法对酸奶基因组DNA进行抽提的方法，可以获得较高质量的酸奶基因组DNA，且不受牛奶蛋白、胶体的干扰。所述方法操作简便、费用低、时间短，具有十分广阔的应用前景。
下面通过实施例对本申请的发明予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。
实施例1
常温酸奶基因组DNA抽提：
1)称取常温酸奶10g，6000g离心5min，弃上清。
2)再加入20mLMilli-Q超纯水，洗涤沉淀，4000g离心5min，离心去除上清。
3)沉淀加入0.2mol/mL氢氧化钠溶液20mL，充分震荡混匀，溶解蛋白。4000g离心5min，离心后用枪头搅动粘在管壁上方的脂肪，倒去上清，去除蛋白和脂肪。
4)洗涤沉淀2次：加入20mLMilli-Q超纯水，震荡混匀，6000g离心5min，用枪头搅动粘在管壁上方的脂肪，弃上清，进一步去除蛋白和脂肪。
5)沉淀加入20mL Mill-QMilli-Q超纯水，震荡混匀，1000g低速离心5min，去除胶体沉淀，保留上清菌体悬浮液。
6)再6000g高速离心5min，弃上清，获得菌体沉淀。
加入DNA抽提试剂(细菌基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司)，抽提菌体基因组DNA。常温酸奶基因组DNA抽提电泳图结果如图1所示，图中编号“M”为DL2,000DNA Marker，泳道编号“1～7”分别对应光明的莫斯利安、蒙牛的纯甑、伊利的安慕希、新希望的天香、君乐宝的开啡尔酸奶、法国的贝乐蒂、德国卓德酸奶7个不同种类的常温酸奶样品。由图1可知，所选择的7个不同种类的常温酸奶样品都能抽提出基因组DNA。可见，本申请所提供的酸奶基因组DNA抽提方法具有良好的通用性。
实施例2
冷藏酸奶真菌污染检测：
称取冷藏酸奶10g，分别省去水洗(整个步骤2)或者离心去除胶体(整个步骤5)步骤，其它操作同实施例1。获得的菌体沉淀，加入基因组DNA抽提试剂，抽提菌体基因组DNA。
用真菌26S rRNA通用引物(NL-1F：GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG；NL-4R：GGTCCGTGTTTCAAGACGG)进行PCR扩增。PCR体系为50μL包括：模板20ng，引物终浓度0.5μmol/L 5U Taq DNA聚合酶(TaKaRa EX Taq(Takara Biotechnology(Dalian)Co.,Ltd.)。PCR程序为：95℃，5min；30个循环：95℃30s，50℃30s，72℃1min；72℃，5min。扩增产物通过凝胶电泳检测，结果如图2、图3所示。
如图2所示为冷藏酸奶省去水洗步骤的PCR电泳检测结果，图中编号“M”为DL2,000DNA Marker，泳道编号“1”、“2”为正常抽提样品(即参照实施例1中的方法进行抽提)，泳道编号“3”、“4”为省去离心去除胶体步骤样品。
如图3所示为冷藏酸奶省去胶体去除步骤的PCR电泳检测结果，图中编号“M”为DL2,000DNA Marker，泳道编号“1”、“2”为正常抽提样品(即参照实施例1中的方法进行抽提)，泳道编号“3-5”为省去水洗步骤样品。
由图2和图3可知，省去水洗或者省去离心去除胶体步骤，获得的沉淀物较多，干扰真菌因组DNA抽提，PCR扩增没有目标条带。可见，抽提方法中的水洗、离心去除胶体等步骤是不可或缺、且经过优化，缺少任一步骤都会影响检测结果。
实施例3
冷藏酸奶16S rRNA扩增分析：
1)称取某品牌常温酸奶1g，6000g离心5min，弃上清。
2)加入1mL Milli-Q超纯水，洗涤沉淀，6000g离心5min，弃上清。
3)沉淀加入0.2mol/mL氢氧化钠溶液1mL，充分震荡混匀，溶解蛋白，10000g离心10min，离心后用枪头搅动粘在管壁上方的脂肪，倒去上清，去除脂肪与蛋白。
4)洗涤沉淀2次：加入1mL Milli-Q超纯水，震荡混匀，6000g离心5min，用枪头搅动粘在管壁上方的脂肪，弃上清，进一步去除蛋白和脂肪。
5)沉淀再加入1mLMilli-Q超纯水，震荡混匀；1000g离心5min，去除胶体沉淀，保留上清菌悬液。
6)6000g离心5min，弃上清，获得菌体沉淀。
加入基因组DNA抽提试剂，抽提菌体DNA。
用16S rRNA通用用引物Eu27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1490R：TACGGTTACCTTGTTACGACTT进行PCR扩增。PCR体系为50μL包括：模板20ng，引物终浓度0.5μmol/L 5U Taq DNA聚合酶(TaKaRa EX Taq(Takara Biotechnology(Dalian)Co.,Ltd.)。PCR程序为：95℃，5min；30个循环：95℃30s，50℃30s，72℃1min；72℃，5min。PCR电泳结果如图4所示，图中编号“M”为DL2,000DNA Marker，泳道编号“1～6”分别对应光明的莫斯利安、蒙牛的纯甑、伊利的安慕希、新希望的天香、君乐宝的开啡尔酸奶、法国的贝乐蒂6个不同种类的常温酸奶样品。由图4可知，6个样品抽提的基因组DNA都可以扩增出16S rRNA。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种酸奶中菌体的分离方法，包括如下步骤：
1)将酸奶样品离心，去除上清以提供第一沉淀物；
2)将步骤1)所提供的第一沉淀物水洗、离心，去除上清以提供第二沉淀物；
3)将步骤2)所提供的第二沉淀物与氢氧化钠反应，所得产物离心、去除上清以提供第三沉淀物；
4)将步骤3)所提供的第三沉淀物水洗、离心，去除上清以提供第四沉淀物；
5)将步骤4)所提供的第四沉淀物去除胶体，以提供菌体悬浮液；
6)将步骤5)所提供的菌体悬浮液离心，以提供菌体沉淀。
2.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述酸奶选自发酵乳。
3.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤1)中，离心条件为3000-10000g，离心时间为3-15min。
4.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤2)中，使用超纯水对第一沉淀物进行水洗；
和/或，所述步骤2)中，离心条件为3000-10000g，离心时间为3-15min。
5.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.5～1.5mol/L；
和/或，所述步骤3)中，氢氧化钠的使用量为每1g酸奶样品加入20-60mg的氢氧化钠；
和/或，所述步骤3)中，离心条件为3000-10000g，离心时间为3-15min。
6.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤4)中，使用超纯水对第三沉淀物进行水洗；
和/或，所述步骤4)中，离心条件为3000-10000g，离心时间为3-15min。
7.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤5)中，将步骤4)所提供的第四沉淀物去除胶体的具体方法包括：将第四沉淀物离心以去除胶体。
8.如权利要求7所述的分离方法，其特征在于，所述步骤5)中，离心条件为500-1200g，离心时间为3-6min。
9.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤6)中，离心条件为3000-10000g，离心时间为3-15min。
10.一种酸奶基因组DNA抽提方法，包括如权利要求1～9任一权利要求所述的酸奶中菌体的分离方法，还包括：
将菌体沉淀抽提菌体DNA。
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