CN111167152A - 微型萃取分离-气相色谱法测定烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的方法 - Google Patents

微型萃取分离-气相色谱法测定烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种微型萃取分离‑气相色谱法测定烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的方法，属于分析化学技术领域。该方法包括如下步骤：将待测烟草样品粉碎后置于微波反应罐中，之后，向其中加入内标溶液和硫酸的甲醇溶液，微波反应后，过滤，得到滤液；内标为己二酸；取滤液与饱和氯化钠溶液混合后转入微萃取装置中，以二氯甲烷为萃取剂进行震荡萃取，静置分层后，取下层清液；将得到的下层清液进气相色谱分析，外标法定量。本发明方法和常规方法相比，其提取、衍生反应速度大大加快，仅10 min就可完成；衍生试剂和萃取有机溶剂的消耗量大大减小，操作简便、准确度高、重复性好，适用于大批量样品的分析，易于推广应用。

Description

微型萃取分离-气相色谱法测定烟草中的非挥发有机酸和脂 肪酸的方法
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种微型萃取分离-气相色谱法测定烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的方法。
背景技术
烟草中存在多种有机酸，一般认为烟叶中有机酸可分为挥发性和非挥发性（除氨基酸外）以及部分高级脂肪酸，相对含量较高的多为非挥发性有机酸中的二元酸和三元酸，以苹果酸、柠檬酸、草酸和丙二酸的含量相对较高(在烤烟中约占5%～18%)，烟草中非挥发性有机酸和脂肪酸对烟草品质有重要影响。故对于烟草中非挥发性有机酸、高级脂肪酸及其衍生物的测定已逐渐成为国内外烟草行业的质量控制内容。
对于非挥发性有机酸的分析检测，一般可以采用高效液相色谱、离子色谱、毛细管电泳等液相分离分析技术进行分析检测，但由于烟草中的化学成分过于复杂，采用液相分离和分析技术要求较高，前处理的条件和过程麻烦。另外，由于烟叶中有机酸部分是游离存在的，大部分是以碱金属盐或有机碱盐的形式存在，采用衍生化处理，再进行气相色谱分离分析的方法可以使检测的准确性更高，且采用此技术还可以对烟草中的高级脂肪酸进行分离分析。现阶段的对于非挥发有机酸和高级脂肪酸的衍生化方法主要分为硅烷化、甲酯化两大类。用硫酸-甲醇甲酯化的方法是最常用的方法，该方法是通过用硫酸-甲醇溶液使样品中的有机酸溶出，溶出的有机酸再和甲醇发生酯化反应生成甲酯，但该实验操作需将烟草样品加入硫酸-甲醇溶液中回流数小时，操作非常费时，而且有机溶剂消耗也很大。因此如何克服现有技术的不足是目前分析化学技术领域亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种微型萃取分离-气相色谱法测定烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的方法，该方法使衍生试剂和萃取有机溶剂的消耗量大大减小，操作简便，准确度高，重复性好，适用于大批量样品的分析。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
微型萃取分离-气相色谱法测定烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的方法，包括如下步骤：
步骤（1），样品前处理：
将待测烟草样品粉碎后置于微波反应罐中，之后，向其中加入内标溶液和硫酸的甲醇溶液，微波反应后，过滤，得到滤液；
所述的内标为己二酸；
步骤（2），微型萃取分离：
取步骤（1）得到的滤液与饱和氯化钠溶液混合后转入微萃取装置中，以二氯甲烷为萃取剂进行震荡萃取，静置分层后，取下层清液；
步骤（3），气相色谱分析及定量：
将步骤（2）得到的下层清液进气相色谱分析，外标法定量，得到烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的含量；
所述的烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸包括乳酸、草酸、丙二酸、乙酰丙酸、苹果酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸、油酸、亚麻酸和硬脂酸。
进一步，优选的是，内标溶液为0.95-1.05mg/mL己二酸的甲醇溶液，硫酸的甲醇溶液体积百分浓度为9.5~10.5%。
进一步，优选的是，待测烟草样品质量、内标溶液体积、硫酸的甲醇溶液体积三者的比例为1g：0.95-1.05mL：45-55mL。
进一步，优选的是，微波反应条件为：压力为190-210 kPa，温度为145-155℃，功率为580-620W，时间为9-11min。
进一步，优选的是，过滤采用2.5μm的针头过滤器过滤。
进一步，优选的是，滤液与饱和氯化钠溶液的体积比为1：4.5-5.5。
进一步，优选的是，滤液与饱和氯化钠溶液的总体积：二氯甲烷的体积=6：4.5-5.5。
进一步，优选的是，气相色谱分析条件为：色谱柱：Agilent DB-560毛细管色谱柱，规格为60m×0.32mm×0.25μm）；柱流速：2.5 mL/min；进样口温度：230 ℃；载气：氮气，纯度≥99.999％；程序升温：120℃，保持2 min，然后以10℃/min的速度升温至l60℃，接着以20℃/min的速度升温至200℃，最后保持20 min；进样量：1.0μL，不分流进样；检测器温度：250℃。
进一步，优选的是，所述的微萃取装置包括外套管和与外套管相匹配的中空活塞柱；中空活塞柱可在外套管中上下活动，且中空活塞柱与外套管之间紧密接触；
中空活塞柱内从下到上依次为连通管、毛细管、柱腔；连通管的底部开口与外界连通。
外套管和中空活塞柱为两个分开的部件，萃取时将萃取剂和待萃取溶液装入外套管中，将中空活塞柱插入外套管中，中空活塞柱可在外套管中上下活动，且中空活塞柱与外套管之间紧密接触，通过把中空活塞柱向下推，在毛细管口处分层，然后吸出(或倒出)上层液，达到分离。
即使用时，液体从连通管的底部开口向上通过毛细管进入柱腔。
柱腔为中空活塞柱可以为一体成形，也可以为中空活塞柱两个组件紧密结合形成的；本发明对此不做限制。当设置为两个组件紧密结合形成（如两个组件上下螺纹连接），是考虑微萃取装置拆卸后洗涤，便于二次使用。
本发明同时保护上述微萃取装置。
本发明采用微波萃取可大大加快样品中待测成分的溶出，而且微波反应在高温高压的密封罐内进行，反应速度和常规条件相比大大加快。从而使得本发明利用硫酸的甲醇溶液为衍生试剂，在高压罐内用微波处理对烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸进行甲酯衍生化，其提取、衍生反应速度和常规条件相比大大加快，仅10min左右就可完成。为了减少有机溶剂消耗量，本发明采用微型液-液萃取装置从硫酸的甲醇溶液中萃取衍生后的有机酸酯，和常规方法相比，有机溶剂消耗大大降低，目前用该微型液-液萃取装置还未见报道过。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明采用微波反应衍生化、气相色谱法测定烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸，和常规方法相比，其提取、衍生反应速度大大加快，仅10 min就可完成。本发明还设计了微型萃取装置，采用微型萃取，使衍生试剂和萃取有机溶剂的消耗量大大减小，操作简便、准确度高、重复性好，适用于大批量样品的分析，实际样品分析结果满意。总之，本方法的建立为烟草样品中非挥发有机酸和脂肪酸的测定提供了新的方法，易于推广应用。
本发明方法用于烟草样品中有机酸和脂肪酸(乳酸、丙二酸、乙酰丙酸、草酸、苹果酸、柠檬酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸)的测定，检测限在0.20-0.36g/mL范围内，方法标准回收率在92%-108％之间，相对标准偏差在2.65-3.48%之间，结果令人满意。
附图说明
图1为微萃取装置的结构示意图；
其中，11、外套管；12、中空活塞柱；13、连通管；14、毛细管；15、柱腔；
图2为采用本发明微萃取装置萃取时的示意图；其中（a）为萃取前的示意图；（b）为萃取后的示意图；
图3为烟草样品和标准溶液色谱图；其中a为烟草样品，b为有机酸和脂肪酸标样；其中，1为乳酸；2为草酸；3为丙二酸；4为乙酰丙酸；5为苹果酸；6为柠檬酸；7为棕榈酸；8为亚油酸；9为油酸＋亚麻酸；10为硬脂酸；IS为内标（己二酸）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组。应该理解，当我们称元件被“连接”到另一元件时，它可以直接连接到其他元件，或者也可以存在中间元件。
在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。术语“内”、“上”、“下”等指示的方位或状态关系为基于附图所示的方位或状态关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“连接”、“设有”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的普通技术人员而言，根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语（包括技术术语和科学术语）具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
实施例1
微型萃取分离-气相色谱法测定烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的方法，包括如下步骤：
步骤（1），样品前处理：
将待测烟草样品粉碎后置于微波反应罐中，之后，向其中加入内标溶液和硫酸的甲醇溶液，微波反应后，过滤，得到滤液；
所述的内标为己二酸；
步骤（2），微型萃取分离：
取步骤（1）得到的滤液与饱和氯化钠溶液混合后转入微萃取装置中，以二氯甲烷为萃取剂进行震荡萃取，静置分层后，取下层清液；
步骤（3），气相色谱分析及定量：
将步骤（2）得到的下层清液进气相色谱分析，外标法定量，得到烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的含量；
所述的烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸包括乳酸、草酸、丙二酸、乙酰丙酸、苹果酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸、油酸、亚麻酸和硬脂酸。
实施例2
微型萃取分离-气相色谱法测定烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的方法，包括如下步骤：
步骤（1），样品前处理：
将待测烟草样品粉碎后置于微波反应罐中，之后，向其中加入内标溶液和硫酸的甲醇溶液，微波反应后，过滤，得到滤液；
所述的内标为己二酸；
步骤（2），微型萃取分离：
取步骤（1）得到的滤液与饱和氯化钠溶液混合后转入微萃取装置中，以二氯甲烷为萃取剂进行震荡萃取，静置分层后，取下层清液；
步骤（3），气相色谱分析及定量：
将步骤（2）得到的下层清液进气相色谱分析，外标法定量，得到烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的含量；
所述的烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸包括乳酸、草酸、丙二酸、乙酰丙酸、苹果酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸、油酸、亚麻酸和硬脂酸。
内标溶液为0.95mg/mL己二酸的甲醇溶液，硫酸的甲醇溶液体积百分浓度为9.5%。
待测烟草样品质量、内标溶液体积、硫酸的甲醇溶液体积三者的比例为1g：0.95mL：45mL。
微波反应条件为：压力为190kPa，温度为145℃，功率为580W，时间为9min。
过滤采用2.5μm的针头过滤器过滤。
滤液与饱和氯化钠溶液的体积比为1：4.5。
滤液与饱和氯化钠溶液的总体积：二氯甲烷的体积=6：4.5。
气相色谱分析条件为：色谱柱：Agilent DB-560毛细管色谱柱，规格为60m×0.32mm×0.25μm）；柱流速：2.5 mL/min；进样口温度：230 ℃；载气：氮气，纯度≥99.999％；程序升温：120℃，保持2 min，然后以10℃/min的速度升温至l60℃，接着以20℃/min的速度升温至200℃，最后保持20 min；进样量：1.0μL，不分流进样；检测器温度：250℃。
如图1所示，微萃取装置包括外套管11和与外套管相匹配的中空活塞柱12；中空活塞柱12可在外套管11中上下活动，且中空活塞柱12与外套管11之间紧密接触；
中空活塞柱12内从下到上依次为连通管13、毛细管14、柱腔15；连通管13的底部开口与外界连通。
萃取时将萃取剂和待萃取溶液装入外套管11中，插入中空活塞柱12，充分振荡，然后静置，把中空活塞柱12向下推，在毛细管口处分层，然后吸出(或倒出)上层液，达到分离。
实施例3
微型萃取分离-气相色谱法测定烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的方法，包括如下步骤：
步骤（1），样品前处理：
将待测烟草样品粉碎后置于微波反应罐中，之后，向其中加入内标溶液和硫酸的甲醇溶液，微波反应后，过滤，得到滤液；
所述的内标为己二酸；
步骤（2），微型萃取分离：
取步骤（1）得到的滤液与饱和氯化钠溶液混合后转入微萃取装置中，以二氯甲烷为萃取剂进行震荡萃取，静置分层后，取下层清液；
步骤（3），气相色谱分析及定量：
将步骤（2）得到的下层清液进气相色谱分析，外标法定量，得到烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的含量；
所述的烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸包括乳酸、草酸、丙二酸、乙酰丙酸、苹果酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸、油酸、亚麻酸和硬脂酸。
内标溶液为1.05mg/mL己二酸的甲醇溶液，硫酸的甲醇溶液体积百分浓度为10.5%。
待测烟草样品质量、内标溶液体积、硫酸的甲醇溶液体积三者的比例为1g：1.05mL：55mL。
微波反应条件为：压力为210kPa，温度为155℃，功率为620W，时间为11min。
过滤采用2.5μm的针头过滤器过滤。
滤液与饱和氯化钠溶液的体积比为1：5.5。
滤液与饱和氯化钠溶液的总体积：二氯甲烷的体积=6：5.5。
气相色谱分析条件为：色谱柱：Agilent DB-560毛细管色谱柱，规格为60m×0.32mm×0.25μm）；柱流速：2.5 mL/min；进样口温度：230 ℃；载气：氮气，纯度≥99.999％；程序升温：120℃，保持2 min，然后以10℃/min的速度升温至l60℃，接着以20℃/min的速度升温至200℃，最后保持20 min；进样量：1.0μL，不分流进样；检测器温度：250℃。
如图1所示，微萃取装置包括外套管11和与外套管相匹配的中空活塞柱12；中空活塞柱12可在外套管11中上下活动，且中空活塞柱12与外套管11之间紧密接触；
中空活塞柱12内从下到上依次为连通管13、毛细管14、柱腔15；连通管13的底部开口与外界连通。
萃取时将萃取剂和待萃取溶液装入外套管11中，插入中空活塞柱12，充分振荡，然后静置，把中空活塞柱12向下推，在毛细管口处分层，然后吸出(或倒出)上层液，达到分离。
实施例4
微型萃取分离-气相色谱法测定烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的方法，包括如下步骤：
步骤（1），样品前处理：
将待测烟草样品粉碎后置于微波反应罐中，之后，向其中加入内标溶液和硫酸的甲醇溶液，微波反应后，过滤，得到滤液；
所述的内标为己二酸；
步骤（2），微型萃取分离：
取步骤（1）得到的滤液与饱和氯化钠溶液混合后转入微萃取装置中，以二氯甲烷为萃取剂进行震荡萃取，静置分层后，取下层清液；
步骤（3），气相色谱分析及定量：
将步骤（2）得到的下层清液进气相色谱分析，外标法定量，得到烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的含量；
所述的烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸包括乳酸、草酸、丙二酸、乙酰丙酸、苹果酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸、油酸、亚麻酸和硬脂酸。
内标溶液为1mg/mL己二酸的甲醇溶液，硫酸的甲醇溶液体积百分浓度为10%。
待测烟草样品质量、内标溶液体积、硫酸的甲醇溶液体积三者的比例为1g：1mL：50mL。
微波反应条件为：压力为200 kPa，温度为150℃，功率为600W，时间为10min。
过滤采用2.5μm的针头过滤器过滤。
滤液与饱和氯化钠溶液的体积比为1：5。
滤液与饱和氯化钠溶液的总体积：二氯甲烷的体积=6：5。
气相色谱分析条件为：色谱柱：Agilent DB-560毛细管色谱柱，规格为60m×0.32mm×0.25μm）；柱流速：2.5 mL/min；进样口温度：230 ℃；载气：氮气，纯度≥99.999％；程序升温：120℃，保持2 min，然后以10℃/min的速度升温至l60℃，接着以20℃/min的速度升温至200℃，最后保持20 min；进样量：1.0μL，不分流进样；检测器温度：250℃。
如图1所示，微萃取装置包括外套管11和与外套管相匹配的中空活塞柱12；中空活塞柱12可在外套管11中上下活动，且中空活塞柱12与外套管11之间紧密接触；
中空活塞柱12内从下到上依次为连通管13、毛细管14、柱腔15；连通管13的底部开口与外界连通。
萃取时将萃取剂和待萃取溶液装入外套管11中，插入中空活塞柱12，充分振荡，然后静置，把中空活塞柱12向下推，在毛细管口处分层，然后吸出(或倒出)上层液，达到分离。优选，柱腔15容积为5mL；毛细管14内径为φ2.0mm；外套管11容积为10mL。
应用实例
１主要仪器和试剂
1.1 仪器和试剂
QP 5000气相色谱仪(日本岛津公司)，氢火焰离子化检测器 (FID)；Excel 微波化学工作平台，配聚四氟乙烯高压罐(上海屹尧微波化学技术有限公司)。
微萃取装置见图1，由外套管和带毛细管的中空活塞柱组成（外套管和带毛细管的中空活塞柱选择石英玻璃或者高分子树脂材料），萃取时，如图2所示，将萃取剂和待萃取溶液装入外套管中，插入中空活塞柱，充分振荡，然后静置，把中空活塞柱向下推，在毛细管口处分层，然后吸出(或倒出)上层液，达到分离。
二氯甲烷、甲醇(色谱纯，均为美国Fisher公司)；硫酸（优级纯，天津化学试剂厂）；乳酸、丙二酸、乙酰丙酸、己二酸、草酸、苹果酸、柠檬酸、棕榈酸、硬酯酸、亚油酸(纯度＞98%，购于瑞士Fluka公司)。
体积浓度为10％的硫酸的甲醇溶液：在冰冷却和搅拌条件下，将100mL的浓硫酸缓慢加入900mL甲醇溶液中，摇匀备用。
内标溶液：以己二酸为内标，浓度为1.0mg/mL，制备方法为称取100.0 mg己二酸，加入100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。
标准溶液：各种酸浓度分别为1.0mg/mL，准确称取乳酸、丙二酸、乙酰丙酸、草酸、苹果酸、柠檬酸、棕榈酸、硬酯酸、亚油酸各100.0mg于1000 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。
1.2样品前处理
准确称取0.10g已粉碎的烟草样品于25 mL的微波反应罐中，加入0.1 mL 己二酸内标溶液和5.0mL 10%（V/V）硫酸-甲醇溶液，旋紧罐盖，设定压力为200kPa，温度为150℃，在600W功率下，3s之内达到所设定的温度和压力，保持10 min。反应完后转移到5.0mL容量瓶中，用硫酸的甲醇溶液准确定容为5.0 mL，取0.2 mL的溶液用2.5μm的针头过滤器过滤，并用1.0mL的饱和氯化钠溶液洗涤针头过滤器，合并滤液和洗涤液转入微萃取管中，用1.0mL二氯甲烷充分震荡萃取2.0min，静置分层后，取下层清液1.0μL进样分析。
1.3 GC分析条件
色谱柱：Agilent DB-560毛细管色谱柱，规格为60m×0.32mm×0.25μm）；柱流速：2.5mL/min；进样口温度：230 ℃；载气：氮气，纯度≥99.999％；程序升温：120℃，保持2 min，然后以10℃/min的速度升温至l60℃，接着以20℃/min的速度升温至200℃，最后保持20 min；进样量：1.0μL，不分流进样；检测器温度：250℃。该色谱条件下，有机酸和脂肪酸标样和烟草样品中的色谱图见图3。
2结果与分析
2.1 样品前处理
微波技术具有穿透力强、选择性高、加热效率高等特点。微波辐射（MWI）可以大大加快反应速度，反应时间以分、秒计。而且微波还能保证能量的快速传导和充分利用，用于植物样品提取时，可有效地提高待测成分的溶出速度。因此，本发明采用微波催化衍生的方法。同时，本发明做了对比试验，发现在设定600 W功率、压力200 kPa、温度为150℃的条件下，微波辅助反应10 min的提取和衍生化效果和室温反应24.0h、超声反应4h、水浴回流反应4.0h的衍生化效率相当，可保证有机酸和脂肪酸完全从样品中提取出并甲酯化完全，因此选定本发明中微波辅助反应时间为10 min。
本发明分别以二氯甲烷、乙醚、苯、甲苯、正己烷等作为萃取溶剂，进行实验，结果表明，正己烷和乙醚萃取转移率较低，其它相当。但苯和甲苯毒性大且溶剂峰会影响有机酸和脂肪酸的检测，故本法选用了二氯甲烷作为溶剂。
实验中发现，甲酯化后的反应液直接萃取分层不清，加不同体积的水或饱和氯化钠溶液后容易分层；而且加入饱和的氯化钠溶液还可降低萃取过程中的乳化现象，因此实验选择在0.2 mL的反应液中加入饱和氯化钠溶液1.0 mL后再萃取。
2.2气相色谱条件的选择
由于衍生化后的有机酸甲酯和脂肪酸甲酯用非极性柱有较好的分离效果，因此实验选择非极性柱，试验了DB-5、HP-5、SPB-5、CP-Sil 8 CB、OV-5等色谱柱对几种有机酸和脂肪酸的分离效果，结果表明以DB-5柱分离效果最好，因此本发明选用DB-5（60 m× 0.32 mm ×0.25 μm）毛细管色谱柱。
通过调整不同的升温程序，结果表明：120℃（保持2 min）10℃/min → l60℃，20℃/min→200℃（保持20 min）的升温程序分离效果好，除亚麻酸甲酯和油酸甲酯外其余成分均达到基线分离，而且时间短，因此实验选用该升温程序。
2.3工作曲线的绘制
分别取25、50、100、200、500 μL的标准溶液，加入微波反应罐中，按1.2所述甲酯化程序对其进行甲酯化后，用GC/FID分析，所得色谱图见图3。根据保留时间定性、内标法定量原理得到各种酸的回归方程及其相关参数，再将最小质量浓度的标准溶液逐级稀释，甲酯化后进样分析，计算当信噪比S/N=3时所对应的标准溶液的质量浓度以确定检出限，结果见表1。
另外，由于烟草中含有一定量的亚麻酸，而亚麻酸甲酯化后生成亚麻酸甲酯，其色谱峰响应时间与油酸甲酯接近，无法分开，因此本发明以油酸工作曲线计算这２种酸的重量。
表1 回归方程、相关系数和检测限
Figure DEST_PATH_IMAGE002
2.4 回收率实验
样品按前述样品前处理的方法处理后按选定色谱条件进样分析，测定时每样准确称取相同样品两份，其中一份为基准，另一份加入已知量的有机酸和脂肪酸标样(设0.05mg、0.2mg、0.5mg三个添加量)，按实验方法测定，按加标样品测出量减去未加标样品测出量再除以标准加入量计算回收率，结果见表2，方法回收率在92-108%之间，说明本发明方法回收率很高。
表2方法回收率
Figure DEST_PATH_IMAGE004
2.5 精密度实验
准确取相同的烟草样品7份，按上述样品前处理方法处理，在选定色谱条件下重复测定7次，得各有机酸和脂肪酸测定的精密度，方法RSD在2.65-3.48%之间，说明方法精密度良好。
表3 方法精密度
Figure DEST_PATH_IMAGE006
2.6 样品分析结果
用本发明测定了国内外65种卷烟中非挥发有机酸和脂肪酸含量，烤烟型卷烟的有机酸含量在6.26-10.3mg/g之间，平均含量为8.34mg/g；混合型卷烟的有机酸含量在8.14-14.5mg/g之间，平均含量为11.4mg/g。混合型卷烟有机酸含量高于烤烟型卷烟。卷烟有机酸含量和卷烟焦油量有一定负相关性。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.微型萃取分离-气相色谱法测定烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），样品前处理：
将待测烟草样品粉碎后置于微波反应罐中，之后，向其中加入内标溶液和硫酸的甲醇溶液，微波反应后，过滤，得到滤液；
所述的内标为己二酸；
步骤（2），微型萃取分离：
取步骤（1）得到的滤液与饱和氯化钠溶液混合后转入微萃取装置中，以二氯甲烷为萃取剂进行震荡萃取，静置分层后，取下层清液；
步骤（3），气相色谱分析及定量：
将步骤（2）得到的下层清液进气相色谱分析，外标法定量，得到烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的含量；
所述的烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸包括乳酸、草酸、丙二酸、乙酰丙酸、苹果酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸、油酸、亚麻酸和硬脂酸。
2.根据权利要求1所述的微型萃取分离-气相色谱法测定烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的方法，其特征在于，内标溶液为0.95-1.05mg/mL己二酸的甲醇溶液，硫酸的甲醇溶液体积百分浓度为9.5~10.5%。
3.根据权利要求1所述的微型萃取分离-气相色谱法测定烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的方法，其特征在于，待测烟草样品质量、内标溶液体积、硫酸的甲醇溶液体积三者的比例为1g：0.95-1.05mL：45-55mL。
4.根据权利要求1所述的微型萃取分离-气相色谱法测定烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的方法，其特征在于，微波反应条件为：压力为190-210 kPa，温度为145-155℃，功率为580-620W，时间为9-11min。
5.根据权利要求1所述的微型萃取分离-气相色谱法测定烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的方法，其特征在于，过滤采用2.5μm的针头过滤器过滤。
6.根据权利要求1所述的微型萃取分离-气相色谱法测定烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的方法，其特征在于，滤液与饱和氯化钠溶液的体积比为1：4.5-5.5。
7.根据权利要求1所述的微型萃取分离-气相色谱法测定烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的方法，其特征在于，滤液与饱和氯化钠溶液的总体积：二氯甲烷的体积=6：4.5-5.5。
8.根据权利要求1所述的微型萃取分离-气相色谱法测定烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的方法，其特征在于，气相色谱分析条件为：色谱柱：Agilent DB-560毛细管色谱柱，规格为60m×0.32mm×0.25μm）；柱流速：2.5 mL/min；进样口温度：230 ℃；载气：氮气，纯度≥99.999％；程序升温：120℃，保持2 min，然后以10℃/min的速度升温至l60℃，接着以20℃/min的速度升温至200℃，最后保持20 min；进样量：1.0μL，不分流进样；检测器温度：250℃。
9.根据权利要求1所述的微型萃取分离-气相色谱法测定烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸的方法，其特征在于，所述的微萃取装置包括外套管和与外套管相匹配的中空活塞柱；中空活塞柱可在外套管中上下活动，且中空活塞柱与外套管之间紧密接触；
中空活塞柱内从下到上依次为连通管、毛细管、柱腔；连通管的底部开口与外界连通。
10.如权利要求9所述的微萃取装置。
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