CN113075309B - 膜保护固相微萃取装置及其在检测牛奶中雌二醇的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了膜保护固相微萃取装置及其在检测牛奶中雌二醇的应用，属于分析检测技术领域。本发明利用Nafion通过溶胶‑凝胶法快速制备基于COF‑LZU1的固相微萃取纤维；然后将纤维放入充满去离子水的透析膜内，构建得到膜保护固相微萃取装置。将该膜保护固相微萃取装置放入萃取液中进行固相微萃取，达到对雌二醇的分离富集效果；萃取完成后，将萃取纤维从透析膜内取出进行顶空衍生化。最后在GC进样口热解吸，将目标物从纤维上解脱进行GC定量分析，可实现对牛奶中痕量雌二醇的高灵敏度检测。

Description

膜保护固相微萃取装置及其在检测牛奶中雌二醇的应用

技术领域

本发明涉及膜保护固相微萃取装置及其在检测牛奶中雌二醇的应用，属于分析检测技术领域。

背景技术

随着人们对动物源性激素类药物残留危害性认知的逐渐增强，雌二醇(E2)所诱发的食品安全问题也越发凸显。20世纪80年代开始，许多国家和组织就已经通过立法来限制或禁止在动物性食品中使用甾类同化激素，欧盟自1988年禁止所有甾类同化激素用于促生长目的，制定了针对欧盟国家内部流通及外部输入的动物性食品的一整套严格的监管措施。现今，美国、欧盟、日本等发达国家和地区已形成完善的检测体系，而我国也在本世纪初开始建立国家兽药残留监控体系和兽药安全评价系统，但迄今为止雌激素类药物残留的检测和评价体系还不是十分完善。因此，动物性食品尤其是牛奶中E2的来源及含量的控制是至关重要的，建立一个快速、有效检测E2的方法势在必得。

为了对牛奶中E2含量进行监控，国内外均致力于检测技术的开发及净化提取方法的改进。牛奶中含有大量大分子蛋白质、脂肪等，牛奶体系基质极其复杂，对E2的分离、富集、提取造成很大的困难。尽管E2的检测技术已较为成熟，但对牛奶前处理方面仍面临诸多挑战，传统的方法包括现在的很多研究对E2的预处理方法都较为繁琐、耗时长、耗有机溶剂等。固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)是一种集取样、萃取、富集、进样于一体的萃取技术，具有操作简便、极少量溶剂、痕量物质萃取等优点被广泛应用于制药、生物、临床、环境和食品分析。SPME的关键因素是纤维涂层材料，它决定方法的灵敏度和选择性。然而，E2沸点高挥发性低，只能进行直接浸入式萃取，这样会使得市场上可获得的SPME纤维涂层如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、二乙烯苯(DVB)、聚乙二醇(PEG)和carbowax(CW)等受到损坏，对分析物的选择性有限、使用寿命短、热稳定性和化学稳定性差且容易断裂，使SPME的使用受限，这显然阻碍其更广泛的应用。因此，有必要研究制备高效、高稳定性的纤维涂层材料。

发明内容

为了解决上述问题，本发明开发了一种绿色环保的膜保护固相微萃取装置，在不消耗任何溶剂的前提下有效从牛奶样品中提取E2。该膜保护固相微萃取探针使用Nafion通过溶胶-凝胶法快速制备基于COF-LZU1的SPME纤维，在具有分子截留特性的透析膜保护下直接浸入萃取牛奶中的痕量E2；分析物可以通过透析膜扩散到达纤维涂层，而蛋白质等高分子量干扰被隔离在膜外。此外，由于E2沸点高、挥发性差，为了提高检测灵敏度，萃取完成后将纤维进行顶空衍生，最后GC-FID检测分析。

本发明涉及的COF-LZU1是由1,3,5-三甲醛苯和1,4-二氨基苯通过希夫碱反应构建而成的二维COF材料。COF-LZU1是一种新型多孔晶体材料，具有比表面积大、可调的孔隙结构、热稳定性和化学稳定性良好的优势，作为SPME新型涂层的替代品能有效萃取目标物，达到高效灵敏的作用。溶胶-凝胶法能够快速制备SPME纤维涂层，涂层厚度可控且能减少时间成本。

本发明的第一个目的是提供一种用于检测牛奶中雌二醇的膜保护固相微萃取装置，所述装置的制备方法包括如下步骤：

(1)用酸液腐蚀金属丝，然后将腐蚀后的金属丝置于Nafion溶液中静置，静置结束后、取出，再置于COF-LZU1粉末中，15s后，取出并固化，即得COF-LZU1修饰的SPME纤维；

(2)将透析膜一端封口，从另一端倒入去离子水；然后将步骤(1)所得的COF-LZU1修饰的SPME纤维置于装满去离子水的透析膜中，使透析膜和纤维形成一个同心圆柱体，即得膜保护固相微萃取装置。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中酸液为王水(硝酸：盐酸＝1：3，V:V)。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中腐蚀的时间为15min。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中酸液腐蚀金属丝的过程具体包括：利用酸液腐蚀金属丝，然后用超纯水清洗表面，依次用甲醇、丙酮、超纯水超声处理各15min，以除去表面杂质，并在室温下干燥，即得腐蚀后的金属丝。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中所述金属丝为不锈钢丝。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中Nafion溶液静置的时间为5s。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中COF-LZU1粉末中涂覆的时间为15s。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中透析膜的截留分子量为7000。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：

(1)溶胶-凝胶法制备基于COF-LZU1的不锈钢纤维：取17cm不锈钢丝的一端(约3cm)在新配置的王水(硝酸：盐酸＝1：3，V:V)中腐蚀15min，将腐蚀好的不锈钢丝先用超纯水清洗表面，依次用乙醇、丙酮、超纯水超声处理各15min，以除去表面杂质，并在室温下干燥；将COF-LZU1粉末与Nafion溶液(5％w/w)分别放入5ml的离心管中，使其在管中深度为3cm，将腐蚀过并干燥了的不锈钢丝放入Nafion溶液中5s，取出并迅速放入COF-LZU1粉末中，缓慢旋转，使其涂覆均匀，15s后取出；然后取出并放入120℃烘箱中固化20min，重复上述单元操作，直到得出所需厚度的COF-LZU1修饰的SPME纤维；

(2)膜保护固相微萃取装置制备：

透析膜在使用前，将其在90℃中水浴2h，除杂并使其软化，之后将透析膜截成所需长度的片段，一端封口，从另一端倒入去离子水；将所得COF-LZU1修饰的SPME纤维放入装满去离子水的透析膜中，使透析膜(截留分子量7000)和纤维形成一个同心圆柱体，即得膜保护固相微萃取装置。

本发明的第二个目的是将上述膜保护固相微萃取装置应用在牛奶中痕量雌二醇的检测中。

本发明还提供了一种牛奶中雌二醇的检测方法，所述方法包括如下步骤：

(1)样品前处理：将上述膜保护固相微萃取装置直接放置在已知浓度的雌二醇标准样品中进行萃取；萃取后，脱除膜保护固相微萃取装置中的膜保护，将COF-LZU1修饰的SPME纤维进行衍生化；

(2)将衍生化后的COF-LZU1修饰的SPME纤维置于气相进样口，进行气相色谱检测，获得相应峰面积数据；利用雌二醇标准样品的浓度与相应峰面积构建线性模型，即得标准曲线；

(3)参照步骤(1)的过程对待测样品进行前处理，然后按照步骤(2)的过程测得相应的峰面积数据，按照所得标准曲线，测得待测样品中雌二醇的浓度。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述萃取的时间为10-50min；优选30-50min。

在本发明的一种实施方式中，萃取的温度为20-60℃；优选50-60℃。

在本发明的一种实施方式中，萃取是在600-1400rpm搅拌速率下进行的；搅拌速率优选1200-1400rpm。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述衍生化包括如下过程：将萃取后的纤维悬挂在含衍生化试剂的进样瓶中进行顶空衍生反应。

在本发明的一种实施方式中，所述衍生化的温度为50-90℃；优选70-80℃。

在本发明的一种实施方式中，所述衍生化的时间为5-25min；优选15-20min。

在本发明的一种实施方式中，所述衍生化试剂为N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷。

在本发明的一种实施方式中，所述衍生化试剂的用量为5-25μL；优选15μL-25μL。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述气相色谱检测的条件：岛津GC系统(2010，Shimadzu，日本)用于实验定量检测。毛细管色谱柱为InerCap5(30m×0.32mm×0.25μm，GL Sciences，日本)。进样模式采用脉冲不分流进样，进样口温度为300℃，程序升温条件：起始温度为120℃并保持1min，30℃/min升温至280℃，保持4min；氢火焰离子检测器(FID)温度300℃。

有益效果：

通过溶胶-凝胶法快速制备了基于COF-LZU1涂层的SPME纤维，研究了从复杂牛奶样品中通过透析膜保护自制纤维提取E2。强的π-π共轭体系和大的比表面积使COF-LZU1制备的SPME纤维比裸不锈钢丝和商用纤维对E2具有更显著的富集效果。所制备COF-LZU1涂层的SPME纤维的使用寿命长，能重复使用160次。将制备的SPME纤维与GC-FID联用，并对影响因素进行优化，在衍生温度70℃、衍生体积15μL、衍生时间15min、萃取温度50℃、萃取时间30min、转速1200rpm的条件下，所建立方法的线性范围在5-800μg/L，气相色谱的响应峰面积与雌二醇的浓度呈线性正比关系，相关系数为0.9987，检出限和定量限分别为0.8μg/L(S/N＝3)、2.5μg/L(S/N＝10)。SPME纤维的重复性试验相对误差RSD为5.3％(n＝6)。且有良好的稳定性和回收率，不使用有机溶剂，简化了前处理步骤，具有显著优势。基于COF-LZU1的MP-SPME方法的建立拓展了COFs材料在食品预处理中的应用，对于基质复杂的液态食品样品分析具有实际应用价值。

附图说明

图1为溶胶-凝胶法制备基于COF-LZU1的不锈钢纤维示意图。

图2为膜保护固相微萃取装置示意图。

图3为COF-LZU1的SEM图(A、B)，XRD图(C)以及热重分析图(D)。

图4为COF-LZU1的FT-IR光谱图。

图5为腐蚀不锈钢纤维(放大倍数A 300×,B 5000×)和COF-LZU1修饰的不锈钢纤维(放大倍数A 300×,B 5000×)的扫描电镜图。

图6为COF-LZU1修饰的固相微萃取纤维的横截面扫描电镜图。

图7为萃取时间对E2富集效率的影响趋势图。

图8为搅拌速率对E2富集效率的影响趋势图。

图9为衍生温度对E2富集效率的影响趋势图。

图10为衍生时间对E2富集效率的影响趋势图。

图11为衍生试剂体积对E2富集效率的影响趋势图。

图12为萃取温度对E2富集效率的影响趋势图。

图13为MP-SPME-GC-FID方法标准曲线。

图14为基于COF-LZU1的固相微萃取纤维与商用纤维PDMS、PDMS/DVB以及裸SSW分别对E2富集效率的比较(左：峰面积图，右：色谱图)。

图15为纤维在没有膜保护下的循环使用次数(A,C)；纤维在有膜保护下的循环使用次数(B,D)。

图16为透析膜截留分子量对E2富集效率的影响趋势图(左：峰面积图，右：色谱图)。

具体实施方式

本发明涉及的试剂包括：

1,3,5-三甲醛苯(中国阿拉丁有限公司)；对苯二胺(中国阿拉丁有限公司)；1,4-二氧六环(中国阿拉丁有限公司)；实验用水为纯净水(娃哈哈集团有限公司)；N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷(BSTFA：TMCS＝99:1，BSTFA+1％)衍生化试剂、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃(中国阿拉丁有限公司)；不锈钢丝和5μL微量进样器(上海高鸽工贸有限公司)；硝酸、盐酸、冰醋酸(上海国药集团化学试剂有限公司)；分子量截止(MWCO)为7000Da的透析膜(北京亿博生物有限公司)；Nafion(5％w/w，美国Sigma-Aldrich公司)；甲醇为色谱级(赛默飞世尔科技有限公司)；雌二醇标准品用色谱级甲醇逐步稀释制备储备液和工作液。

本发明涉及的实验仪器包括：

X射线衍射仪(德国布鲁克AXS有限公司)；冷场发射扫描电子显微镜(日本株式会社日立高新技术)；Nicolet iS10傅里叶变换红外光谱仪(美国赛默飞公司)；5810R多功能台式离心机(德国艾本德公司)；KQ-100DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；AR522CN电子天平(奥豪斯仪器常州有限公司)；DF-101S集热式数显恒温磁力搅拌器(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司)；GC-2010Plus-FID气相色谱仪(日本岛津公司)；

本发明涉及的COF-LZU1由如下方法合成制得：

参考文献(J.Am.Chem.Soc.2011,133,19816–19822)，COF-LZU1的制备过程如下所示：

将1,3,5-三甲醛苯(48mg)和1,4-二氨基苯(48mg)溶解于3.0mL 1,4-二恶烷中,并向混合物中滴加0.6mL 3.0moL/L乙酸溶液，然后置于120℃烘箱中，反应3天。结束后，将反应产物倒入离心管中，分别用N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃进行洗涤。最后，将产物在60℃的真空干燥箱中干燥12h，得到呈黄色粉末状的COF-LZU1材料。

COF-LZU1的表征：

通过SEM对COF-LZU1进行表征，结果如图3所示，从图3A可看出所合成的COF-LZU1表面呈现皱褶状，可增大比表面积，图3B则显示COF-LZU1是层层堆积形成条状结构，最后构成一种簇状结构的物质，与文献报道相符。通过X射线衍射(XRD)对COF-LZU1进行表征，结果如图3C所示，在5.0°处出现一个强的特征峰，说明合成了含有晶型的COF-LZU1材料。通过热重分析对COF-LZU1进行热稳定性的判定，结果如图3D所示，300℃时COF-LZU1失重率仍在90％以上，400℃时仍在85％以上，表面合成的COF-LZU1具有很好的热稳定性，可在GC-FID进样口进行热解吸。

通过FT-IR对COF-LZU1进行表征，获得COF-LZU1的化学组成与结构信息，如图4所示，COF-LZU1在1618cm^-1处表现出很强的C＝N拉伸，表明有亚胺键的存在，与此同时,存在于COF-LZU1中的醛基(1695cm^-1)和氨基(3415cm^-1)相比于初始的两个单体对苯二胺(PDA)和均苯三甲醛(TFB)减弱了很多,进一步证实了通过醛基与氨基缩合而成的亚胺键的形成。3400cm^-1左右出现的峰值说明有N-H键存在，而在1600cm^-1及1400cm^-1左右的峰值，说明存在HC＝O键和C＝N键，表征结果与文献报道相符。

实施例1膜保护固相微萃取装置的制备

(1)溶胶-凝胶法制备基于COF-LZU1的不锈钢纤维：取17cm不锈钢丝的一端(约3cm)在新配置的王水(硝酸：盐酸＝1：3，V:V)中腐蚀15min，将腐蚀好的不锈钢丝先用超纯水清洗表面，依次用甲醇、丙酮、超纯水超声处理各15min，以除去表面杂质，并在室温下干燥(图1)。将COF-LZU1粉末与Nafion溶液(5％w/w)分别放入5ml的离心管中，使其在管中深度为3cm；将腐蚀过并干燥过的不锈钢丝先放入Nafion溶液中浸泡5s，取出并迅速放入COF-LZU1粉末中，缓慢旋转，使其涂覆均匀，15s后取出；然后取出并放入120℃烘箱中固化20min。重复上述单元操作，直到得出所需厚度的COF-LZU1修饰的SPME纤维(以下简写为COF-LZU1/Nafion纤维)。使用前，COF-LZU1/Nafion纤维在280℃的GC进样口中去除杂质，直到获得稳定的基线。

使用SEM对COF-LZU1修饰的固相微萃取纤维以及制备过程中不锈钢丝的形貌进行表征。不锈钢纤维经过王水腐蚀后形成粗糙表面(图5A和B)，有利于材料的涂覆。经COF-LZU1修饰后，不锈钢丝表面形成均匀颗粒并显示出COF-LZU1的2D球状形貌(图5C和D)，表明COF-LZU1材料成功涂覆在不锈钢丝表面。扫描电镜横截面图像显示不锈钢丝上的COF-LZU1涂层厚度约7.1μm(图6)。

(2)膜保护固相微萃取装置制备：

将直径为1cm的透析膜(截留分子量7000)切成所需长度(4cm)的小片，在90℃中水浴2h，除杂并使其软化，然后用纯净水清洗。在室温下干燥后，一端密封，另一端插入一个小的中空橡胶塞去制备成一个中空透析膜，并向其中装满去离子水；然后将步骤(1)所得的COF-LZU1/Nafion纤维置于装满去离子水的透析膜中，使透析膜和纤维形成一个同心圆柱体，即得膜保护固相微萃取装置。

实施例2膜保护固相微萃取装置在检测牛奶中雌二醇的应用

(1)样品前处理：

萃取过程：

配制5μg/L，10μg/L，20μg/L，50μg/L，100μg/L，300μg/L，500μg/L，800μg/L的E2标准工作液于棕色样品瓶中作为样品，将装满去离子水的透析膜保护固相微萃取装置(内含COF-LZU1/Nafion纤维)放入样品瓶中，然后将样品瓶放到集热式数显恒温磁力搅器中进行萃取：利用实施例1中所得膜保护固相微萃取装置对样品进行萃取富集；萃取环境为：在1200rpm搅拌速度、50℃环境下，萃取30min。

衍生化过程：

于2mL棕色进样小瓶中加入15μL N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷，并置于70℃的恒温水浴中；将萃取结束后的COF-LZU1/Nafion纤维放入恒温水浴后的棕色进样瓶中进行顶空衍生化，15min后，将纤维取出并放入GC-FID进样口进行热解吸。具体过程如图2所示。

(2)标准曲线构建：

为建立E2富集标准曲线，将经过的萃取富集处理的E2标准工作液进行气相色谱检测：

气相色谱(GC-FID)检测条件：岛津GC系统(2010，Shimadzu，日本)用于实验定量检测。毛细管色谱柱为InerCap5(30m×0.32mm×0.25μm，GL Sciences，日本)。进样模式采用脉冲不分流进样，进样口温度为300℃，程序升温条件：起始温度为120℃并保持1min，30℃/min升温至280℃，保持4min。氢火焰离子检测器(FID)温度300℃。

经系统自带的积峰软件进行处理，以峰面积对浓度作图制成标准曲线。

具体结果见图13和表1。其中，检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别以3倍、10倍信噪比(S/N)来计算；纤维萃取的重复性(日内、日间精密度)是利用单根纤维在同一天内萃取6次，在连续萃取三天得到；纤维萃取的重现性是在相同条件下制备3根SPME纤维，比较纤维间的精密度。

表1基于膜保护固相微萃取装置萃取检测E2的结果

由图13以及表1可知，在5-800μg/L范围内，线性回归方程为Y＝2149.80X+2761.22，相关系数R²＝0.9987，方法检出限(LOD，S/N＝3)和方法定量限(LOQ，S/N＝10)分别为0.8μg/L和2.5μg/L。

实施例3验证实验

储备液的制备：准确称取50mg的标准品，用甲醇定容至50mL的棕色容量瓶中，配制成1.0mg/mL标准储备液，储存在-20℃的冰箱中，备用。工作液的配制是由纯净水逐级稀释储备液至所需浓度，现配现用。

实际样品制备：牛奶购自本地超市，取5mL牛奶样品于10mL离心管中，在9000rpm下离心10min，去掉上层脂肪和下层蛋白质，取中间层液体用纯净水稀释2倍(1：2，V:V)，混匀后进行膜保护固相微萃取实验。

为了评估该方法在实际样品中的应用，COF-LZU1修饰的SPME纤维用于富集牛奶中的E2。实际样品采用标准加入法进行定量计算，对未加标样品和加标水平为10、30、100μg/L的加标样品进行测定(n＝3)，分别计算在不同牛奶样品中的加标回收率以及测定三次后的相对标准偏差，验证方法的准确性。分析结果如表2所示，7中牛奶样品中有3个均有检出，但检出量均低于定量限。实际样品加标回收试验结果表明，3个加标水平的回收率在77.27％～108.26％之间。

表2牛奶中雌二醇的测定及3种不同加标回收率结果(n＝3)

注：ND指未检出。

实施例4样品前处理优化

使用E2浓度为1μg.mL^-1，体积为10mL的样品液进行优化实验，考察萃取温度(20℃，30℃，40℃，50℃，60℃)，萃取时间(10min，20min，30min，40min，50min)，搅拌速率(600rpm，800rpm，1000rpm，1200rpm，1400rpm)，衍生体积(5μL，10μL，15μL，20μL，25μL)，衍生时间(5min，10min，15min，20min，25min)和衍生温度(50℃，60℃，70℃，80℃，90℃)对富集效率的影响。

萃取过程优化：

(a)萃取时间：

COF-LZU1/Nafion纤维对E2的吸附需要一定的时间达到平衡，实验探索了纤维在10-50min下对E2的萃取效率，如图7所示。在30min以内，E2的峰面积随时间的延长而增大，30min之后对E2的峰面积基本不再增加，表明COF-LZU1/SSW纤维对E2的吸附在30min时可达到平衡。因此，选择30min作为最佳萃取时间用于后续实验。

(b)搅拌速率：

对于直接浸入式SPME过程，纤维涂层和水相之间存在一层边界层，目标物在边界层内的扩散速率非常慢，从而增大了时间成本。通过搅拌的方式可以减小边界层的厚度，有助于提高目标物在样品和涂层之间的传质，大大缩短SPME的平衡时间。

实验考察了600-1400rpm搅拌速率下COF-LZU1/SSW纤维对E2的萃取效率。由图8可知，在低转速下(600rpm，800rpm)E2的峰面积随搅拌速率的增大而缓慢增大，当转速增大至1200rpm时，纤维对E2的萃取量急剧上升而达到最大值，这有赖于高转速促进了目标物E2向COF-LZU1涂层内的转移；当搅拌速率继续增大到1400rpm时，可观察到萃取体系处于不稳定状态，COF-LZU1/SSW纤维发生晃动现象，导致E2峰面积减小。因此，SPME体系的最佳搅拌速率为1200rpm。

(c)萃取温度

一般来说，较高的萃取温度可以增强分析物从萃取液到透析膜内再到SPME纤维涂层的传质，从而缩短达到吸附平衡所需的时间。本研究考察了20-60℃的萃取温度对E2萃取效率的影响。如图12所示，20℃到50℃时萃取效率呈上升趋势，随后随着萃取温度进一步升高至60℃时呈下降趋势。这是因为吸附是放热过程，温度升高会导致吸附在纤维上的分析物量减少。根据上述实验结果，实验选择萃取温度为50℃。

衍生化过程优化：

(d)衍生温度

雌二醇是一种带有活泼酚羟基的高极性化合物，挥发性差，为提高检测灵敏度，需要进行衍生化处理。衍生化温度是衍生反应的关键因素，温度过低，达不到反应所需温度，衍生效率会降低甚至不衍生，温度过高，会加速分子运动，使原本吸附在COF-LZU1/Nafion纤维上的衍生产物脱落出来，导致吸附E2的量降低。

实验考察了50-90℃对E2衍生效率的影响，由图9所示，70℃以前，E2的峰面积随温度的升高而增大，70℃时，E2的峰面积达到最大值，之后E2的峰面积随温度的升高呈下降趋势，说明吸附在COF-LZU1/Nafion纤维上的E2经衍生后在高温下从纤维中脱落出来。因此，选择70℃为最佳衍生温度。

(e)衍生时间

实验考察了5-25min的衍生时间对E2衍生效率的影响，由图10所示，15min以前，E2的峰面积随时间的延长而增大，15min时达到最大值，15min以后，E2的峰面积随时间的增长而急剧下降，说明衍生完成后，时间延长，会使衍生产物从COF-LZU1/SSW纤维上脱落出来。因此，选择15min为最佳衍生时间。

(f)衍生体积

实验考察了衍生试剂体积5-25μL对E2衍生效率的影响，如图11所示，15μL以前，E2峰面积随时间的延长而增大，15μL时达到最大值，15μL以后，E2峰面积随时间的增长而趋于稳定，说明衍生完全。因此，选择的衍生试剂体积为15μL。

实施例5探究纤维上修饰的COF材料对检测性能的影响

为了评价COF-LZU1纤维的富集性能，将自制的COF-LZU1修饰的固相微萃取纤维与商用PDMS纤维、PDMS/DVB纤维和王水腐蚀后的不锈钢丝在萃取相同浓度E2的条件下进行比较。商用PDMS纤维(30μm)与PDMS/DVB纤维(65μm)的最高承受温度分别为280℃、270℃，因此，在进行比较时解吸温度均设置为270℃，其他条件均一致。结果如图14所示，COF-LZU1纤维显示出较高的萃取性能，王水腐蚀后的裸SSW对E2的萃取效率最低，两种商用纤维的萃取效率均远远低于本申请使用的COF-LZU1纤维。申请人推测COF-LZU1优异的富集性能归因于COF-LZU1的大的比表面积提供充足的吸附位点，COF-LZU1与雌二醇中苯环之间的π-π作用、疏水作用、孔径效应以及范德华力等有利于富集，同时，COF-LZU1良好的热稳定性允许设置较高的解吸温度，对于E2这种极性较高不易挥发的分析物，较高的解吸温度有利于目标物在进样口的充分气化，从而增加高沸点物质的响应。

此外，还探究了不同吸附材料对E2的吸附效果，结果如表3所示。

表3不同吸附材料对E2吸附效果的比较

E2是一种具有苯环的甾醇类物质，其软件仿真模拟最大直径约为1.15nm，通过对比不同孔径的吸附材料对E2的吸附效果，如表3所示。与COF-LZU1孔径相邻的吸附材料，理论上孔径匹配，其萃取后的检出限及定量限(LOD、LOQ分别为2.52μg/L和10.76μg/L)却远高于本实验结果，说明在基于孔径匹配的条件下，COF-LZU1对E2的吸附效率更好。与其他孔径更大的多孔材料相比，使用COF-LZU1吸附E2后的检测结果在LOD、LOQ、线性范围等方面均表现出更优的效果，说明对于E2而已，孔径相对较大的吸附材料并不利于吸附E2。一方面大孔径的吸附材料除了吸附E2同时也能吸附更多的大分子物质，增大了空间位阻效应；另一方面，由于大的孔径使得单位面积内的π-π共轭密度没有COF-LZU1的高，因此与E2发生π-π共轭效应减弱，同理与E2发生的疏水相互作用力等其他力也会相对减弱。因此，COF-LZU1在一定程度上对E2是具有选择性吸附的作用。

实施例6探究有无膜保护下纤维的循环使用次数

在相同条件下自制的COF-LZU1/Nafion纤维分别在有透析膜和没有透析膜保护的情况下直接浸入萃取牛奶中的E2来考察膜的必要性以及纤维的循环使用次数。在没有透析膜保护的情况下，纤维仅使用3次就失去了富集能力并伴随着出现更多的杂峰，如图15(A,C)所示。主要原因是纤维直接暴露在牛奶样品中，吸附目标物的同时也吸附一些非挥发性的大分子物质，这些物质由于不能从纤维上完全解吸出来，从而改变涂层性能以及损害纤维使用寿命。此外，目标物在牛奶中的量很少并且由于空间位阻效应导致目标物与纤维的结合位点减少。然而，在有透析膜保护的情况下，如图15(B,D)所示，自制的COF-LZU1/Nafion纤维能重复使用160次之后其萃取性能才会有明显的下降，其萃取效率远远高于没有膜保护的纤维的萃取效率。

实施例7探究透析膜截留分子量

充分利用透析膜的固有优势，将其用于牛奶样品的预处理。一方面，避免了牛奶样品繁琐的前处理步骤，不消耗有机溶剂并降低了时间成本；另一方面，保护了固相微萃取纤维不受损害。

牛奶中富含各种蛋白质等大分子物质，其分子量也不尽相同，为探究这些物质与透析膜截留分子量大小之间的关系，选择7种不同截留分子量(MW3500,MW5000,MW7000,MW10000,MW12000,MW14000,MW100000)的透析膜进行实验。结果如图16所示，透析膜截留分子量为3500和5000时峰面积比较小，说明透析膜截留分子量过小，增大了目标物进入透析膜内的空间阻力，以致在相同时间内萃取未达到平衡。其对应的色谱图目标峰突出，没有杂质峰，说明分子量为MW3500、MW5000的透析膜能够截留住大部分大分子物质，只允许雌二醇等小分子进入透析膜内，使膜内的萃取液基质更少更利于SPME纤维对雌二醇进行萃取。当透析膜截留分子量为7000时，峰面积最大以及色谱图没有杂质峰，目标峰强度更高，说明该种透析膜(MW 7000)不但能够截留住大部分大分子物质，同时雌二醇也能充分快速的进入到透析膜内进行有效富集。透析膜截留分子量大于7000时，峰面积均有所下降，且对应的色谱图出现很多杂峰，影响目标物的定性与定量，说明透析膜截留分子量越大，允许进入膜内的大分子越多，导致雌二醇进入SPME纤维里的空间位阻变大，萃取量变少，同时也会吸附一些杂质，如此会降低纤维寿命甚至损坏纤维。因此，后续实验均选用截留分子量为7000的透析膜进行实验。

对比例1现有检测牛奶中E2的方法比较

通过对牛奶中E2检测的文献调研，将文献报道方法与本文所建立的方法进行了比较，比较内容包括前处理方法、所用材料、消耗的溶剂、实际样品处理时间、检测技术、检测限、定量限、线性范围等，结果如表4所示。

表4现有方法测定牛奶中E2的结果

注：a：移液管尖端固相萃取；b：分散式液液微萃取；c：固相萃取；d：分散式固相萃取；e：膜保护固相微萃取。

根据表4可知，本申请方法对于牛奶样品的处理无需消耗溶剂，减少了溶剂的干扰，同时处理时间仅需离心10min，远远低于已报道文献方法的牛奶样品预处理时间，很大程度上降低了时间成本。此外，多数文献用高效液相色谱法对E2进行定性定量检测，本文通过顶空衍生结合GC-FID对E2进行检测，所建立方法检出限与定量限分别为0.8μg/L、2.5μg/L，与其他方法相当，且线性范围宽(5-800μg/L)。这可能是由于对牛奶样品预处理步骤少，极大程度减少了处理过程的损耗，其次是性能优良的COF-LZU1修饰的固相微萃取纤维对E2高效的富集作用。此外，对萃取后的E2进行衍生化，提高了检测灵敏度。该方法无有机溶剂消耗，遵循环境友好规则，且操作简便、装置简单，萃取过程中不需接触多余溶剂、器皿，发生污染的可能性小，检测结果可靠。

Claims (10)

1.膜保护固相微萃取装置在检测牛奶中痕量雌二醇中的应用，其特征在于，所述膜保护固相微萃取装置的制备方法包括如下步骤：

(1)用酸液腐蚀金属丝，然后将腐蚀后的金属丝置于nafion溶液中静置，静置后取出，再利用COF-LZU1粉末进行涂覆，固化，即得COF-LZU1修饰的SPME纤维；

(2)将透析膜一端封口，从另一端倒入去离子水；然后将步骤(1)所得的COF-LZU1修饰的SPME纤维置于装满去离子水的透析膜中，使透析膜和纤维形成一个同心圆柱体，即得膜保护固相微萃取装置；

所述步骤(1)中所述金属丝为不锈钢丝；酸液为王水。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中Nafion溶液静置的时间为5s。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中置于COF-LZU1粉末中时间为15s。

4.一种检测牛奶中雌二醇的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)样品前处理：将膜保护固相微萃取装置直接放置在已知浓度的雌二醇标准样品中进行萃取；萃取后，脱除膜保护固相微萃取装置中的膜保护，将COF-LZU1修饰的SPME纤维进行衍生化处理；

(2)将衍生化后的COF-LZU1修饰的SPME纤维置于气相进样口，进行气相色谱检测，获得相应峰面积数据；利用雌二醇标准样品的浓度与相应峰面积构建线性模型，即得标准曲线；

(3)参照步骤(1)的过程对待测样品进行前处理，然后按照步骤(2)的过程测得相应的峰面积数据，按照所得标准曲线，测得待测样品中雌二醇的浓度；

所述膜保护固相微萃取装置的制备方法包括如下步骤：

用酸液腐蚀金属丝，然后将腐蚀后的金属丝置于nafion溶液中静置，静置后取出，再利用COF-LZU1粉末进行涂覆，固化，即得COF-LZU1修饰的SPME纤维；

将透析膜一端封口，从另一端倒入去离子水；然后将所得的COF-LZU1修饰的SPME纤维置于装满去离子水的透析膜中，使透析膜和纤维形成一个同心圆柱体，即得膜保护固相微萃取装置；

所述金属丝为不锈钢丝；酸液为王水。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中Nafion溶液静置的时间为5s。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中置于COF-LZU1粉末中时间为15s。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述萃取的时间为10-50min；温度为20-60℃。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述衍生化包括如下过程：将萃取后的纤维悬挂在含衍生化试剂的进样瓶中进行顶空衍生反应。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，衍生化试剂为N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷；所述衍生化试剂的用量为5-25μL。

10.根据权利要求4-9任一项所述的方法，其特征在于，所述衍生化的温度为50-90℃；时间为5-25min。

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