CN111157738A - 一种提高检测血清α1-酸性糖蛋白检测灵敏度的方法 - Google Patents

一种提高检测血清α1-酸性糖蛋白检测灵敏度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高检测血清α1‑酸性糖蛋白检测灵敏度的方法，血清α1‑酸性糖蛋白检测所用试剂盒为双试剂配制，其中试剂R2中含有羊抗人α1‑酸性糖蛋白抗体，在试剂R1中加入聚二乙醇‑4000包覆的Fe3O4磁流体，通过该聚二乙醇‑4000包覆的Fe3O4磁流体在静电吸附的作用下与羊抗人α1‑酸性糖蛋白抗体结合，从而使羊抗人α1‑酸性糖蛋白抗体在Fe3O4磁流体上形成凝集，提高了试剂的分析灵敏度。

Description

一种提高检测血清α1-酸性糖蛋白检测灵敏度的方法
技术领域
本发明属于医学免疫体外诊断试剂领域，具体是指一种运用聚二乙醇-4000 包覆的Fe3O4磁流体来提高检测血清α1-酸性糖蛋白检测灵敏度的方法。
背景技术
α1-酸性糖蛋白，早期称乳清类粘蛋白，分子量约40000，包括等分子的己糖、己糖胺和唾液酸，是一种非特异性急性时相反应蛋白，也是人类血清中含糖量最多(含糖约45％)、酸性最强(PH为2.7-3.5)糖蛋白。主要由肝脏巨噬细胞和粒细胞产生,癌细胞也可合成。他与C反应蛋白一起被认为是反映炎症活动急性状态的敏感指标。在某些疾病中,特别是自身免疫性疾病中,其值升高很大。
鉴于α1-酸性糖蛋白对炎症、感染反应早于体温及白细胞数的变化，其指标数据具有广泛临床应用：(1)α1-酸性糖蛋白含量升高：病理情况下，白介素1 刺激吞噬细胞释放出脂多聚糖，可促进α1-酸性糖蛋白的合成使血中水平升高，故α1-酸性糖蛋白是一种最稳定的早期呈阳性的急性时相反应物。如感染(炎症)、外伤、烧伤、手术、急性心肌梗死时α1-酸性糖蛋白含量升高。另外类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、克隆病、恶性肿瘤也增高，在癌转移时升高更明显。(2)α1-酸性糖蛋白浓度降低：肝细胞病变晚期、肾病综合症或其他原因所致尿中滤过的蛋白质量丢失、遗传因素和营养不良等疾病。
现有技术中常用的α1-酸性糖蛋白检测方法是放射免疫分析法、酶联免疫法。这些技术存在诸多不足，如需要特殊的设备，样本需要预处理，不能上全自动生化分析仪进行批量检测分析等。
发明内容
为解决现有技术存在的问题和不足，本发明的目的是提供一种提高检测血清α1-酸性糖蛋白检测灵敏度的方法。通过Fe3O4磁流体运用聚二乙醇-4000 包覆的Fe3O4磁流体，能够提高测定血清α1-酸性糖蛋白检测的灵敏度。
为实现上述目的，本发明的技术方案是一种运用聚二乙醇-4000包覆的 Fe3O4磁流体来提高检测血清α1-酸性糖蛋白检测灵敏度的方法，其特征在于：血清α1-酸性糖蛋白检测试剂盒为双试剂配制，其中试剂R2中含有羊抗人α1- 酸性糖蛋白抗体，在试剂R1中加入聚二乙醇-4000包覆的Fe3O4磁流体，通过该聚二乙醇-4000包覆的Fe3O4磁流体在静电吸附的作用下与羊抗人α1-酸性糖蛋白抗体结合，从而使羊抗人α1-酸性糖蛋白抗体在Fe3O4磁流体上形成凝集，提高了试剂的分析灵敏度。
本发明还提供一种如所述的方法所用的聚二乙醇-4000包覆的Fe3O4磁流体的制备方法，其特征在于：用共沉淀法制备Fe3O4磁流体，具体步骤为：称取 2.4gFeCl2.4H2O和3.4gFeCl3.6H2O溶于200ml蒸馏水中，加入聚二乙醇-4000，水浴加热至60℃，在电动搅拌的同时倾倒入NaOH溶液，至pH＝11，反应30min，使Fe3O4颗粒充分熟化，磁分离Fe3O4颗粒并用蒸馏水洗涤至中性，干燥，取包裹后的Fe3O4加入到蒸馏水中，超声分散10min，用稀HCl和稀NaOH调整pH 值，在制备过程中加入聚二乙醇-4000，最终得到聚二乙醇-4000包覆的Fe3O4磁流体。
进一步设置是聚二乙醇-4000包覆盖的Fe3O4磁流体包裹后粒径为11.5nm。
本发明试剂R1内聚二乙醇-4000包覆的Fe3O4磁流体含量为1.0mg/ml。
本发明试剂R1体系内pH值范围为3.40-3.90。
本发明的优点在于本发明中通过在试剂R1中加入聚乙二醇-4000包覆的磁性纳米颗粒，利用聚乙二醇-4000进行磁性粒子的表面修饰，提高了磁性粒子的稳定性，还能提高了其在酸性基底溶液中的分散性和靶向性，可有效避免纳米粒子的团聚及氧化，在静电吸附的作用下与羊抗人α1-酸性糖蛋白抗体结合，从而使抗体在磁性纳米颗粒上形成凝集，大大的提高了试剂的分析灵敏度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
图1为本发明试剂与对照组试剂测量结果相关曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
本发明的实施例和实验数据通过应用到检测试剂盒，来说明其效果。
实施例1组
试剂R1成分如下：
缓冲液 15-25mmol/L
聚二乙醇-4000包覆盖的Fe3O4磁流体 1.0mg/ml
试剂R2成分如下：
Figure BDA0002343132390000031
本实施例试剂R1与试剂R2的体积比为2.6～4.8：1，优选为3:1。
本实施例试剂R1和实际R2中的缓冲液均为PH值为6.8磷酸盐缓冲液，试剂R2中的稳定剂为海藻糖α和甘油，试剂R2中的表面活性剂为SDS、硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠中的一种或其组合，防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、三氯叔丁醇中的一种或其组合。
本发明的聚二乙醇-4000包覆的Fe3O4磁流体的制备方法是用共沉淀法制备 Fe3O4磁流体，具体步骤为：称取2.4gFeCl2.4H2O和3.4gFeCl3.6H2O溶于200ml 蒸馏水中，加入聚二乙醇-4000，水浴加热至60℃，在电动搅拌的同时倾倒入 NaOH溶液，至pH＝11，反应30min，使Fe3O4颗粒充分熟化，磁分离Fe3O4颗粒并用蒸馏水洗涤至中性，干燥，取包裹后的Fe3O4加入到蒸馏水中，超声分散 10min，用稀HCl和稀NaOH调整pH值，在制备过程中加入聚二乙醇-4000，最终得到聚二乙醇-4000包覆的Fe3O4磁流体。
所制备的聚二乙醇-4000包覆盖的Fe3O4磁流体包裹后粒径为11.5nm。
本发明中通过在试剂R1中加入聚乙二醇-4000包覆的磁性纳米颗粒，利用聚乙二醇-4000进行磁性粒子的表面修饰，提高了磁性粒子的稳定性，还能提高了其在酸性基底溶液中的分散性和靶向性，可有效避免纳米粒子的团聚及氧化，在静电吸附的作用下与羊抗人α1-酸性糖蛋白抗体结合，从而使抗体在磁性纳米颗粒上形成凝集，大大的提高了试剂的分析灵敏度。
准确度验证试验：
将本发明检测试剂盒作为常规方法实验组，市场上获得认可的一种准确度好、稳定性高的α1-酸性糖蛋白检测试剂盒作为选定参考测量程序对照组进行检测，对40个临床血清样本进行检测，检测结果如表一所示获得了两种试剂盒的相关性曲线(如图1所示)，结果表明，两组试剂盒的相关系数为0.9989，说明两者相关性比较好。证明本发明添加及更改的组分对其准确性不会造成影响。
表一：本发明试剂盒与对照组试剂盒临床血清样本测量结果
Figure BDA0002343132390000041
Figure BDA0002343132390000051
稳定性测定实验：
开瓶稳定性：在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存试剂盒，检测本发明试剂盒及对照组试剂盒的稳定性。每月1号分别用两组试剂盒测定同一混合血清样本，测定三次取平均值。检测数据如表二所示。
表二：本发明试剂盒与对照组试剂盒每月稳定性数据
Figure BDA0002343132390000052
实验结果显示，本发明试剂盒在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存15个月稳定，而对照组试剂盒在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存 12个月稳定性较本发明试剂盒低，说明本发明试剂盒更换缓冲液稳定性增强。
线性相关性验证试验：
选取α1-酸性糖蛋白含量为350mg/dl的高值样本，用生理盐水进行系列稀释，配制6个不同浓度的样本，浓度依次为350mg/dl、280mg/dl、210mg/dl、140mg/ dl、70mg/dl、0mg/dl。分别用本发明试剂盒及对照组试剂盒进行检测，每个浓度的样本分别测定三次，分别取平均值，检测结果如表三所示。
表三：本发明试剂盒与对照组试剂盒各浓度样本检测结果
理论浓度(mg/dl) 实验组(mg/dl) 对照组(mg/dl)
0 0.11 0.31
70 59.87 71.42
140 142.12 143.66
210 209.45 209.42
280 277.61 278.12
350 354.82 355.16
相关系数R 0.9997 0.9996
如上表所示，本发明试剂盒与对照组试剂盒检测结果相关系数均大于0.990，且本发明试剂盒检测结果的相关系数略大于对照组试剂盒检测结果的相关系数，这表明本发明试剂盒具有更好的线性相关性。
本发明中通过在试剂盒内试剂R1中加入聚乙二醇-4000包覆的磁性纳米颗粒，利用聚乙二醇-4000进行磁性粒子的表面修饰，提高了磁性粒子的稳定性，还能提高了其在酸性基底溶液中的分散性和靶向性，可有效避免纳米粒子的团聚及氧化，在静电吸附的作用下与羊抗人α1-酸性糖蛋白抗体结合，从而使抗体在磁性纳米颗粒上形成凝集，大大的提高了试剂盒的分析灵敏度。综上所述，本发明提供的α1-酸性糖蛋白检测试剂盒的稳定性，线性范围较好，试剂的准确度也较好。因此，本发明提供的α1-酸性糖蛋白检测试剂盒有利于在市场中进一步的推广使用。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (3)

1.一种提高检测血清α1-酸性糖蛋白检测灵敏度的方法，其特征在于：血清α1-酸性糖蛋白检测所用试剂盒为双试剂配制，其中试剂R2中含有羊抗人α1-酸性糖蛋白抗体，在试剂R1中加入聚二乙醇-4000包覆的Fe3O4磁流体，通过该聚二乙醇-4000包覆的Fe3O4磁流体在静电吸附的作用下与羊抗人α1-酸性糖蛋白抗体结合，从而使羊抗人α1-酸性糖蛋白抗体在Fe3O4磁流体上形成凝集，提高了试剂的分析灵敏度。
2.一种如权利要求1所述的方法所用的聚二乙醇-4000包覆的Fe3O4磁流体的制备方法，其特征在于：用共沉淀法制备Fe3O4磁流体，具体步骤为：称取2.4gFeCl2.4H2O和3.4gFeCl3.6H2O溶于200ml蒸馏水中，加入聚二乙醇-4000，水浴加热至60℃，在电动搅拌的同时倾倒入NaOH溶液，至pH＝11，反应30min，使Fe3O4颗粒充分熟化，磁分离Fe3O4颗粒并用蒸馏水洗涤至中性，干燥，取包裹后的Fe3O4加入到蒸馏水中，超声分散10min，用稀HCl和稀NaOH调整pH值，在制备过程中加入聚二乙醇-4000，最终得到聚二乙醇-4000包覆的Fe3O4磁流体。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：聚二乙醇-4000包覆盖的Fe3O4磁流体包裹后粒径为11.5nm。
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