CN111154481B - 用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于去泛素化酶荧光检测技术领域，具体涉及一种用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法。将介孔硅纳米颗粒分散在含有菲啰啉‑硅的二氯甲烷溶液中反应，得到介孔硅‑菲啰啉纳米颗粒；介孔硅‑菲啰啉纳米颗粒与TbCl3·6H2O在乙醇中混合，回流，加入1,3‑二苯基‑1,3‑丙二酮反应，得到纳米荧光探针前驱体；将纳米荧光探针前驱体悬浮在聚乙烯亚胺水溶液中进行聚乙烯亚胺涂覆，得到聚乙烯亚胺改性的纳米荧光探针前驱体；聚乙烯亚胺改性的纳米荧光探针前驱体分散在混合溶液中，搅拌，得到纳米荧光探针。本发明的制备过程简单，周期短；制得的纳米荧光探针对UCH‑L1的检测具有良好的灵敏度和选择性。

Description

用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法
技术领域
本发明属于去泛素化酶荧光检测技术领域，具体涉及一种用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法。
背景技术
泛素是一种由76个氨基酸组成的小蛋白。泛素化是泛素在一系列特异性酶的作用下特异性修饰靶蛋白的过程，调节蛋白质活性。在泛素化过程中，通过在泛素的C-末端和目标蛋白的内切酶之间形成等肽键而与目标蛋白结合。去泛素化酶能催化肽键的水解，从而调节靶蛋白的泛素化状态。所以泛素化可以通过去泛素化酶的作用来逆转。一大类去泛素化酶调节这种细胞过程，并且在癌症、传染病和神经退行性疾病等多种疾病中起着重要作用。因此实现去泛素化酶的高灵敏度检测对诸多疾病的预测和治疗具有重要的科学意义。
为了监测去泛素化酶的活性，研究者开发了诸多方法，如质谱、免疫印迹和光致发光。其中，发光检测因其灵敏度高、实验方便而被证明是一种强有力的手段。
基于镧系离子(Eu3+、Tb3+和其他配合物)的荧光探针在检测阳离子、阴离子和有机小分子方面表现出极好的灵敏度，它们有尖锐的发射带和较大的斯托克位移。然而，由于竞争配位作用，镧系元素探针的荧光在水中和生物溶剂中很容易熄灭。镧系元素传感系统的荧光强度也会受到配位环境的影响。限域效应可以改变稀土配合物的振动频率，影响能量传递的类型。因此，适当的限域条件可以防止荧光分子振动，使能量主要以荧光信号的形式发射。目前，介孔二氧化硅纳米颗粒易于控制尺寸限制，是构建增强荧光强度的受限环境的最佳材料。故如何构建限域环境下荧光增强的高选择性和灵敏度的纳米探针是本领域技术人员的研究热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法，制备方法简单，制备周期短，制得的纳米荧光探针稳定性好，使用方便，具有高选择性、较高的检测灵敏度和较好的准确性。
本发明所述的用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)将介孔硅纳米颗粒分散在含有菲啰啉-硅的二氯甲烷溶液中反应，得到介孔硅-菲啰啉纳米颗粒；
(2)介孔硅-菲啰啉纳米颗粒与TbCl3·6H2O在乙醇中混合，回流，加入1,3-二苯基-1,3-丙二酮反应，得到纳米荧光探针前驱体(MSN-Tb)；
(3)将纳米荧光探针前驱体悬浮在聚乙烯亚胺水溶液中进行聚乙烯亚胺涂覆，得到聚乙烯亚胺改性的纳米荧光探针前驱体(MSN-Tb-PEI)；
(4)聚乙烯亚胺改性的纳米荧光探针前驱体分散在混合溶液中，搅拌，得到纳米荧光探针(MSN-Tb-UbR)；
步骤(4)中所述的混合溶液的制备方法是将EDC和NHS溶解在含有标记有罗丹明B的泛素的磷酸缓冲液中，搅拌活化，得到混合溶液。
步骤(1)中所述的菲啰啉-硅的制备方法是1，10-菲啰啉-5-胺与异氰酸3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基酯在氯仿中搅拌，除去氯仿，将剩余的黄色粘性混合物搅拌反应后，加入冷己烷，得到浅黄色沉淀，然后将浅黄色沉淀溶解在甲醇中并过滤，除去甲醇，并加入冷己烷重新沉淀，得到菲啰啉-硅。
步骤(1)中所述的菲啰啉-硅的制备方法具体是0.5-1.5mmol 1，10-菲啰啉-5-胺与1.2-2.2mL异氰酸3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基酯在氯仿中搅拌1-60min，10-35℃下真空除去氯仿，将剩余的黄色粘性混合物在60-100℃下再搅拌10-48小时，反应后，向混合物中加入冷己烷，得到浅黄色沉淀，然后将沉淀物溶解在甲醇中并过滤，通过蒸发除去甲醇，并使用冷己烷重新沉淀产物(菲啰啉-硅)，将制备的菲啰啉-硅在40-80℃下真空干燥。
步骤(1)中所述的菲啰啉-硅与二氯甲烷的配比为2-10:10，菲啰啉-硅以mg计，二氯甲烷以mL计。
步骤(1)中所述的介孔硅纳米颗粒与菲啰啉-硅的质量比为200-700:2-10。
步骤(1)中所述的反应温度为50-100℃，反应时间为2-20h。
步骤(2)中所述的TbCl3·6H2O与菲啰啉-硅的质量比为2-20:2-10。
步骤(2)中所述的TbCl3·6H2O与乙醇的配比为2-20:5-50，TbCl3·6H2O以mg计，乙醇以mL计。
步骤(2)中所述的回流温度为60-100℃，回流时间为1-3h。
步骤(2)中所述的1,3-二苯基-1,3-丙二酮与菲啰啉-硅的质量比为10-80:2-10。
步骤(2)中所述的反应温度为60-100℃，反应时间为2-30h。
步骤(3)中所述的纳米荧光探针前驱体与聚乙烯亚胺(PEI)水溶液的配比为80-120:10-100，纳米荧光探针前驱体以mg计，聚乙烯亚胺水溶液以mL计。
步骤(3)中所述的聚乙烯亚胺水溶液的浓度为1-20wt％。
步骤(4)中所述的聚乙烯亚胺改性的纳米荧光探针前驱体与混合溶液的配比为5-100：8-12，聚乙烯亚胺改性的纳米荧光探针前驱体以mg计，混合溶液以mL计。
步骤(4)中所述的搅拌温度为20-30℃，搅拌时间为20-30小时。
步骤(4)中所述的混合溶液的制备方法具体是将0.05-0.3mmol EDC和0.1-0.4mmol NHS溶解在含有5-100μM标记有罗丹明B的泛素(Ub-R)的5-20mL磷酸缓冲液(pH7.4)中，在15-35℃下搅拌10-30分钟以活化Ub-R的羧基，得到混合溶液。
通过本发明所述的用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法制备得到的纳米荧光探针主要用于去泛素化酶(UCH-L1)的检测。
本发明制备得到的纳米荧光探针在545nm处的荧光较弱，580nm处的荧光较强，当加入UCH-L1反应后，545nm处的荧光增强，580nm处的荧光减弱。
本发明通过在负载Tb3+配合物的介孔二氧化硅纳米粒子表面修饰标记有罗丹明B的泛素(Ub-R)，得到纳米荧光探针(MSN-Tb-UbR)。纳米荧光探针被紫外激发时会发生从Tb3+向罗丹明B的荧光共振能量转移，加入UCH-L1后，荧光共振能量转移被切断，Tb3+的荧光增强，罗丹明B的荧光减弱，从而实现对UCH-L1的检测。
本发明所述的用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法，包括如下具体步骤：
(1)将菲啰啉-硅溶解在二氯甲烷中，制得溶液A；
(2)将介孔硅纳米颗粒分散在溶液A中，搅拌，氮气保护，50-100℃反应2-20h，过滤收集，乙醇漂洗，真空干燥，得到混合物B；
(3)将TbCl3·6H2O与混合物B在乙醇中混合，回流，得到混合物C；
(4)将1,3-二苯基-1,3-丙二酮与混合物C反应2-30h，冷却，过滤，沉淀，乙醇洗涤，真空干燥，得到混合物D；
(5)将混合物D悬浮在1-20wt％的聚乙烯亚胺水溶液中进行聚乙烯亚胺涂覆，室温下搅拌2-30h后，用去离子水冲洗，得到混合物E；
(6)将EDC和NHS溶解在含有标记有罗丹明B的泛素的磷酸缓冲液中，搅拌活化，得到混合溶液，然后将混合物E分散于混合溶液中，在20-30℃下搅拌20-30小时，产物通过离心机收集。
步骤(6)中标记有罗丹明B的泛素通过聚乙烯亚胺连接于硅胶基质表面。
步骤(6)中磷酸缓冲液的pH为7.4，得到的产物在12000rpm下离心机收集。
本发明的有益效果如下：
本发明纳米荧光探针对UCH-L1的识别是基于介孔硅上PEI与泛素之间的肽键对UCH-L1的响应。在没有UCH-L1的环境中，该纳米荧光探针在545nm处的荧光较弱，580nm处的荧光较强；当处在UCH-L1环境中时，肽键会被去泛素化酶水解，阻断Tb3+与罗丹明B之间的共振能量转移，导致545nm处的荧光增强，580nm处的荧光减弱。
本发明克服现有去泛素化酶检测技术选择性差、灵敏度低、操作繁琐耗时等不足，将装载铽的介孔硅纳米荧光探针应用于去泛素化酶检测的领域，利用纳米荧光探针中限域环境条件下的Tb3+和罗丹明B之间的共振能量转移机制，提供一种快捷、准确性好、特异性高的去泛素化酶检测方法。
本发明的制备过程简单，周期短；易于控制Tb3+的限域环境，防止荧光分子振动，使能量主要以荧光信号的形式发射；制得的纳米荧光探针对UCH-L1的检测具有良好的灵敏度和选择性。
(1)本发明的纳米荧光探针制备方法简单，制备周期短，不需要严格的合成条件。
(2)本发明的纳米荧光探针稳定性好，使用方便。
(3)本发明的纳米荧光探针对UCH-L1有良好的选择性，血清中的其它物质对其荧光信号无明显影响。
(4)基于共振能量转移的纳米荧光探针作为比率型荧光探针，具有较高的检测灵敏度和较好的准确性。
附图说明
图1是本发明的纳米荧光探针用于检测去泛素化酶的原理图；
图中，280nm是指280nm激发波长下激发该纳米粒，红色发射是指罗丹明B在280nm紫外激发波长下呈现的颜色，绿色发射是指纳米荧光探针前驱体中铽离子在280nm紫外激发波长下呈现的颜色。
图2是介孔硅的透射电镜图。
图3是实施例1-3和对比例1的纳米荧光探针前驱体在280nm激发下得到的荧光发射谱图。
图4是实施例4中纳米荧光探针检测不同浓度UCH-L1的荧光光谱图。
图5是实施例4中F545/F585的发射强度比与磷酸缓冲液(pH 7.4)中UCH-L1浓度的线性关系图。
图6是实施例5中纳米荧光探针对UCH-L1的选择性检测图。
图7是实施例6中F545/F585的发射强度比与含有HSA的磷酸缓冲液(pH 7.4)中UCH-L1浓度的线性关系图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
(1)1.02mmol 1，10-菲啰啉-5-胺与1.7mL异氰酸3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基酯在氯仿中搅拌30min，25℃下真空除去氯仿，将剩余的黄色粘性混合物在80℃下再搅拌20小时，反应后，向混合物中加入冷己烷，得到浅黄色沉淀，然后将沉淀物溶解在甲醇中并过滤，通过蒸发除去甲醇，并使用冷己烷重新沉淀产物菲啰啉-硅，将制备的菲啰啉-硅在60℃下真空干燥。
(2)将500mg介孔硅纳米颗粒分散在10mL含有2mg菲啰啉-硅的二氯甲烷溶液中，该反应在氮气保护下90℃搅拌12小时进行，反应结束后，通过过滤收集制备的介孔硅-菲啰啉纳米颗粒，用乙醇冲洗并在50℃下真空干燥。
(3)将制备的介孔硅-菲啰啉纳米颗粒与20mg TbCl3·6H2O在50mL乙醇中混合，并在氮气保护下于80℃回流2h，得到悬浮液；然后将40mg 1，3-二苯基-1，3-丙二酮加入到悬浮液中，并使反应再进行24小时，冷却后过滤，将沉淀物用乙醇洗涤，并真空干燥，得到纳米荧光探针前驱体(MSN-Tb1)。纳米荧光探针前驱体在280nm激发波长下，测得相应的发射谱图，见图3。
(4)通过将100mg的介孔硅中负载Tb3+的纳米荧光探针前驱体悬浮在100mL 10wt％的聚乙烯亚胺水溶液中来进行聚乙烯亚胺涂覆，涂覆后的混合物室温搅拌24小时，聚乙烯亚胺吸附后，将聚乙烯亚胺改性的纳米荧光探针前驱体(MSN-Tb1-PEI)用去离子水洗涤。
(5)将0.1mmol EDC和0.25mmol NHS溶解在含有50μM标记有罗丹明B的泛素的10mL磷酸缓冲液(pH 7.4)中，在25℃下搅拌20分钟以活化Ub-R的羧基，得到混合溶液；50mg聚乙烯亚胺改性的纳米荧光探针前驱体分散在10ml混合溶液中，并在25℃下搅拌24小时，12000rpm离心收集，得到纳米荧光探针(MSN-Tb1-UbR)。
实施例2
(1)1.02mmol 1，10-菲啰啉-5-胺与1.7mL异氰酸3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基酯在氯仿中搅拌30min，25℃下真空除去氯仿，将剩余的黄色粘性混合物在80℃下再搅拌20小时，反应后，向混合物中加入冷己烷，得到浅黄色沉淀，然后将沉淀物溶解在甲醇中并过滤，通过蒸发除去甲醇，并使用冷己烷重新沉淀产物菲啰啉-硅，将制备的菲啰啉-硅在60℃下真空干燥。
(2)将500mg介孔硅纳米颗粒分散在10mL含有8mg菲啰啉-硅的二氯甲烷溶液中，该反应在氮气保护下90℃搅拌12小时进行，反应结束后，通过过滤收集制备的介孔硅-菲啰啉纳米颗粒，用乙醇冲洗并在50℃下真空干燥。
(3)将制备的介孔硅-菲啰啉纳米颗粒与20mg TbCl3·6H2O在50mL乙醇中混合，并在氮气保护下于80℃回流2h，得到悬浮液；然后将40mg 1，3-二苯基-1，3-丙二酮加入到悬浮液中，并使反应再进行24小时，冷却后过滤，将沉淀物用乙醇洗涤，并真空干燥，得到纳米荧光探针前驱体(MSN-Tb2)。纳米荧光探针前驱体在280nm激发波长下，测得相应的发射谱图，见图3。
(4)通过将100mg的介孔硅中负载Tb3+的纳米荧光探针前驱体悬浮在100mL 10wt％的聚乙烯亚胺水溶液中来进行聚乙烯亚胺涂覆，涂覆后的混合物室温搅拌24小时，聚乙烯亚胺吸附后，将聚乙烯亚胺改性的纳米荧光探针前驱体(MSN-Tb2-PEI)用去离子水洗涤。
(5)将0.1mmol EDC和0.25mmol NHS溶解在含有50μM标记有罗丹明B的泛素的10mL磷酸缓冲液(pH 7.4)中，在25℃下搅拌20分钟以活化Ub-R的羧基，得到混合溶液；50mg聚乙烯亚胺改性的纳米荧光探针前驱体分散在10ml混合溶液中，并在25℃下搅拌24小时，12000rpm离心收集，得到纳米荧光探针(MSN-Tb2-UbR)。
实施例3
(1)1.02mmol 1，10-菲啰啉-5-胺与1.7mL异氰酸3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基酯在氯仿中搅拌30min，25℃下真空除去氯仿，将剩余的黄色粘性混合物在80℃下再搅拌20小时，反应后，向混合物中加入冷己烷，得到浅黄色沉淀，然后将沉淀物溶解在甲醇中并过滤，通过蒸发除去甲醇，并使用冷己烷重新沉淀产物菲啰啉-硅，将制备的菲啰啉-硅在60℃下真空干燥。
(2)将500mg介孔硅纳米颗粒分散在10mL含有10mg菲啰啉-硅的二氯甲烷溶液中，该反应在氮气保护下90℃搅拌12小时进行，反应结束后，通过过滤收集制备的介孔硅-菲啰啉纳米颗粒，用乙醇冲洗并在50℃下真空干燥。
(3)将制备的介孔硅-菲啰啉纳米颗粒与20mg TbCl3·6H2O在50mL乙醇中混合，并在氮气保护下于80℃回流2h，得到悬浮液；然后将40mg 1，3-二苯基-1，3-丙二酮加入到悬浮液中，并使反应再进行24小时，冷却后过滤，将沉淀物用乙醇洗涤，并真空干燥，得到纳米荧光探针前驱体(MSN-Tb3)。纳米荧光探针前驱体在280nm激发波长下，测得相应的发射谱图，见图3。
(4)通过将100mg的介孔硅中负载Tb3+的纳米荧光探针前驱体悬浮在100mL 10wt％的聚乙烯亚胺水溶液中来进行聚乙烯亚胺涂覆，涂覆后的混合物室温搅拌24小时，聚乙烯亚胺吸附后，将聚乙烯亚胺改性的纳米荧光探针前驱体(MSN-Tb3-PEI)用去离子水洗涤。
(5)将0.1mmol EDC和0.25mmol NHS溶解在含有50μM标记有罗丹明B的泛素的10mL磷酸缓冲液(pH 7.4)中，在25℃下搅拌20分钟以活化Ub-R的羧基，得到混合溶液；50mg聚乙烯亚胺改性的纳米荧光探针前驱体分散在10ml混合溶液中，并在25℃下搅拌24小时，12000rpm离心收集，得到纳米荧光探针(MSN-Tb3-UbR)。
实施例4
使用实施例2制得的纳米荧光探针对UCH-L1进行荧光响应实验
分别取0nM，5nM，10nM，20nM，40nM，60nM的UCH-L1与MSN-Tb-UbR(5mg·mL-1)在室温下孵育30分钟。280nm波长激发条件下，记录混合物的荧光光谱。荧光光谱图和所得线性结果见图4和图5。
从图4和图5可以看出：在0-60nM该纳米荧光探针对UCH-L1的检测呈现较好的线性结果，在该范围内能实现对UCH-L1的定量检测，并且实际操作中的最低检测限低至5nM。
实施例5
使用实施例2制得的荧光探针对UCH-L1及生物环境中的其他物质进行荧光响应实验
评价本发明方法的特异性：从图6可以看出，在添加UCH-L1，人血清白蛋白(HSA)，谷胱甘肽(GSH)，葡萄糖氧化酶(GOx)，腺苷三磷酸(ATP)，半光氨酸(Cys)之后，MSN-Tb-UbR材料仅对于UCH-L1显示出较大的F545/F585值，相比之下，其他几种物质的F545/F585值较小。说明只有UCH-L1可以明显的使F545/F585值增大。该结果表明，本发明用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针具有高度的特异性和良好的选择性。图6中的control指不添加任何待测物质的对照组。
实施例6
使用实施例2制得的荧光探针对模拟生物环境中的UCH-L1进行荧光响应实验
为了模拟生物环境，在含有32mg·mL-1HSA的磷酸缓冲液(pH7.4)中测试了UCH-L1的活性。如图7所示，结果证明F545/F585的发射强度比与UCH-L1浓度(5-60nM)呈线性关系，说明在该线性范围内，所制备的纳米荧光探针可以实现对UCH-L1的定量检测，检测限低至5nM。
对比例1
(1)1.02mmol 1，10-菲啰啉-5-胺与1.7mL异氰酸3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基酯在氯仿中搅拌30min，25℃下真空除去氯仿，将剩余的黄色粘性混合物在80℃下再搅拌20小时，反应后，向混合物中加入冷己烷，得到浅黄色沉淀，然后将沉淀物溶解在甲醇中并过滤，通过蒸发除去甲醇，并使用冷己烷重新沉淀产物菲啰啉-硅，将制备的菲啰啉-硅在60℃下真空干燥。
(2)将菲啰啉-硅、TbCl3·6H2O和1,3-二苯基-1,3-丙二酮(摩尔比为1：1：3)在乙醇中室温混合，制备得到纳米荧光探针前驱体(Phen-Tb)。纳米荧光探针前驱体在280nm激发波长下，测得相应的发射谱图，见图3。
(3)通过将100mg纳米荧光探针前驱体悬浮在100mL 10wt％的聚乙烯亚胺水溶液中来进行聚乙烯亚胺涂覆，涂覆后的混合物室温搅拌24小时，聚乙烯亚胺吸附后，将聚乙烯亚胺改性的纳米荧光探针前驱体(Phen-Tb-PEI)用去离子水洗涤。
(4)将0.1mmol EDC和0.25mmol NHS溶解在含有50μM标记有罗丹明B的泛素的10mL磷酸缓冲液(pH 7.4)中，在25℃下搅拌20分钟以活化Ub-R的羧基，得到混合溶液；50mg聚乙烯亚胺改性的纳米荧光探针前驱体分散在10ml混合溶液中，并在25℃下搅拌24小时，12000rpm离心收集，得到纳米荧光探针(Phen-Tb-UbR)。
图3是实施例1-3和对比例1的纳米荧光探针前驱体在280nm激发下得到的荧光发射谱图。从图3中可以看出，MSN-Tb1、MSN-Tb2和MSN-Tb3的荧光强度比Phen-Tb强，所以用MSN-Tb1、MSN-Tb2和MSN-Tb3制备得到的纳米荧光探针比用Phen-Tb制备得到的纳米荧光探针的响应性更好、灵敏度更高。

Claims (10)

1.一种用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将介孔硅纳米颗粒分散在含有菲啰啉-硅的二氯甲烷溶液中反应，得到介孔硅-菲啰啉纳米颗粒；
(2)介孔硅-菲啰啉纳米颗粒与TbCl3·6H2O在乙醇中混合，回流，加入1,3-二苯基-1,3-丙二酮反应，得到纳米荧光探针前驱体；
(3)将纳米荧光探针前驱体悬浮在聚乙烯亚胺水溶液中进行聚乙烯亚胺涂覆，得到聚乙烯亚胺改性的纳米荧光探针前驱体；
(4)聚乙烯亚胺改性的纳米荧光探针前驱体分散在混合溶液中，搅拌，得到纳米荧光探针；
步骤(4)中所述的混合溶液的制备方法是将EDC和NHS溶解在含有标记有罗丹明B的泛素的磷酸缓冲液中，搅拌活化，得到混合溶液。
2.根据权利要求1所述的用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的菲啰啉-硅的制备方法是1，10-菲啰啉-5-胺与异氰酸3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基酯在氯仿中搅拌，除去氯仿，将剩余的黄色粘性混合物搅拌反应后，加入冷己烷，得到浅黄色沉淀，然后将浅黄色沉淀溶解在甲醇中并过滤，除去甲醇，并加入冷己烷重新沉淀，得到菲啰啉-硅。
3.根据权利要求1所述的用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的菲啰啉-硅与二氯甲烷的配比为2-10:10，菲啰啉-硅以mg计，二氯甲烷以mL计；介孔硅纳米颗粒与菲啰啉-硅的质量比为200-700:2-10。
4.根据权利要求1所述的用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的反应温度为50-100℃，反应时间为2-20h。
5.根据权利要求1所述的用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的TbCl3·6H2O与菲啰啉-硅的质量比为2-20:2-10。
6.根据权利要求1所述的用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的TbCl3·6H2O与乙醇的配比为2-20:5-50，TbCl3·6H2O以mg计，乙醇以mL计。
7.根据权利要求1所述的用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的回流温度为60-100℃，回流时间为1-3h；反应温度为60-100℃，反应时间为2-30h。
8.根据权利要求1所述的用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的1,3-二苯基-1,3-丙二酮与菲啰啉-硅的质量比为10-80:2-10。
9.根据权利要求1所述的用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的纳米荧光探针前驱体与聚乙烯亚胺水溶液的配比为80-120:10-100，纳米荧光探针前驱体以mg计，聚乙烯亚胺水溶液以mL计。
10.根据权利要求1所述的用于检测去泛素化酶的纳米荧光探针的制备方法，其特征在于步骤(4)中所述的搅拌温度为20-30℃，搅拌时间为20-30小时。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991007403A1 (fr) * 1989-11-14 1991-05-30 Pierre Fabre Medicament NOUVEAUX DERIVES DE BENZO [b] PHENANTHROLINES-1,7 LEUR PREPARATION ET LEUR APPLICATION EN THERAPEUTIQUE
CN103468247A (zh) * 2013-09-18 2013-12-25 贵州大学 分子钳型菲啰啉-苯并唑类荧光试剂及其制备方法和应用
CN109776534A (zh) * 2019-02-01 2019-05-21 山东理工大学 比例传感型锌离子荧光探针及其制备方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991007403A1 (fr) * 1989-11-14 1991-05-30 Pierre Fabre Medicament NOUVEAUX DERIVES DE BENZO [b] PHENANTHROLINES-1,7 LEUR PREPARATION ET LEUR APPLICATION EN THERAPEUTIQUE
CN103468247A (zh) * 2013-09-18 2013-12-25 贵州大学 分子钳型菲啰啉-苯并唑类荧光试剂及其制备方法和应用
CN109776534A (zh) * 2019-02-01 2019-05-21 山东理工大学 比例传感型锌离子荧光探针及其制备方法和应用

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