CN111118210A - 乙型肝炎病毒基因组突变检测方法及试剂盒和应用 - Google Patents
乙型肝炎病毒基因组突变检测方法及试剂盒和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111118210A CN111118210A CN201811291752.2A CN201811291752A CN111118210A CN 111118210 A CN111118210 A CN 111118210A CN 201811291752 A CN201811291752 A CN 201811291752A CN 111118210 A CN111118210 A CN 111118210A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pcr amplification
- nested pcr
- hbv
- seq
- dna sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及基因检测领域,具体涉及一种乙型肝炎病毒基因组突变检测方法及试剂盒和应用。本发明提供了一种巢氏PCR引物组合物,包括:第一巢氏PCR引物组,所述第一巢氏PCR引物组包括SEQ ID NO:1‑2所示的第一引物对和SEQ ID NO:3‑4所示的第二引物对;以及第二巢氏PCR引物组,所述第二巢氏PCR引物组包括SEQ ID NO:5‑6所示的第三引物对和SEQ ID NO:7‑8所示的第四引物对。以及由此提供了一种试剂盒和对乙型肝炎病毒基因组进行突变检测的方法。由此可以提高乙型肝炎病毒突变检测的灵敏度,并可检测到全面的位点突变信息。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域,具体涉及一种乙型肝炎病毒基因组突变检测方法及试剂盒和应用。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)感染是世界性问题,全球约有3.5亿人为慢性感染,我国的HBV感染者约为1.2亿,每年约有100万人死于HBV感染所致的肝硬化、肝衰竭及原发性肝癌。有效防治慢性乙型肝炎病毒是一项长期而又艰巨的任务。
HBV可在慢性持续性感染、机体免疫压力或抗病毒治疗药物作用过程中发生变异。近年来,随着越来越多的核苷酸类药物如拉米夫定(LAM)、阿德福韦酯(ADV)、替比夫定(LdT)和恩替卡韦(ETV)等在临床上的广泛应用,抗HBV的耐药问题日益突出,已成为当前制约慢性乙型肝炎患者长期抗病毒治疗的主要障碍。病毒耐药以基因变异为基础,继而出现病毒学突破,病毒反弹,生化学突破,从而导致治疗失败,甚至出现肝功能失代偿,重症肝炎或死亡。药物之间的交叉耐药、病毒的多重耐药也会给后续治疗的药物选择带来极大的困难。HBV耐药株带来的问题日益严重,在慢性乙型肝炎治疗过程中密切监测耐药突变,成为耐药管理的重要环节,也是保证抗HBV治疗胜利实施的重要措施。
目前应用于临床的、可全面反映基因耐药情况、有效指导临床药物选择的检测方法十分有限。针对HBV基因耐药突变检测的方法还需要进一步改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此,本发明的一个目的在于提出一种具有乙型肝炎病毒基因组突变检测方法及试剂盒和应用。利用本发明的方法以及本发明所提供的试剂盒建立起适合临床的全面检测HBV耐药突变的新技术,制定更加合理的抗病毒治疗方案,对可能耐药的患者进行相关的耐药方面的检测,及时调整治疗方案,无疑具有非常重要的临床意义。
本发明结合巢式聚合酶链式反应和全基因组测序技术用于乙肝病毒全基因组SNP分析,巢式PCR通过设计两套引物,采用两步法分段扩增HBV基因组,对两段目的产物进行拼接获得HBV的全基因组序列,为HBV全基因组检测提供了更高的灵敏度,然后进行Hiseq建库,基于Hiseq2500平台对HBV全基因组进行测序,通过生物信息分析,进行SNP分析。本发明为制定更加合理的抗病毒治疗方案,对可能耐药的患者进行相关的耐药方面的检测,及时调整治疗方案提供有效依据。
根据本发明的第一方面,本发明提供了一种巢氏PCR引物组合物,包括:第一巢氏PCR引物组,所述第一巢氏PCR引物组包括SEQ ID NO:1-2所示的第一引物对和SEQ ID NO:3-4所示的第二引物对;以及第二巢氏PCR引物组,所述第二巢氏PCR引物组包括SEQ ID NO:5-6所示的第三引物对和SEQ ID NO:7-8所示的第四引物对。
根据本发明的第二方面,本发明提供了一种试剂盒,所述试剂盒包含根据本发明第一方面所述的巢氏PCR引物组合物,其中,所述第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对均分开放置。
根据本发明的第三方面,本发明提供了一种获得DNA样本的HBV基因组序列的方法,包括以下步骤:利用第一巢氏PCR引物组对所述DNA样本进行第一巢氏PCR扩增,得到第一巢氏PCR扩增产物,其中所述第一巢氏PCR引物组包括SEQ ID NO:1-2所示的第一引物对和SEQ ID NO:3-4所示的第二引物对;利用第二巢氏PCR引物组对所述DNA样本进行第二巢氏PCR扩增,得到第二巢氏PCR扩增产物,其中所述第二巢氏PCR引物组包括SEQ ID NO:5-6所示的第三引物对和SEQ ID NO:7-8所示的第四引物对;将第一巢氏PCR扩增产物和第二巢氏PCR扩增产物混合,得到所述待测DNA样本的HBV基因组序列。
根据本发明的实施例,以上所述获得DNA样本的HBV基因组序列的方法可以进一步附加如下技术特征:
在本发明的一些实施例中,所述第一巢氏PCR扩增包括:利用第一引物对对所述DNA样本进行第一PCR扩增,得到第一PCR扩增产物,然后利用第二引物对对所述第一PCR扩增产物进行第二PCR扩增,得到所述第一巢氏PCR扩增产物;所述第二巢氏PCR扩增包括:利用第三引物对对所述DNA样本进行第三PCR扩增,得到第三PCR扩增产物,然后利用第四引物对对第三PCR扩增产物进行第四PCR扩增,得到第二巢氏PCR扩增产物。
根据本发明的第四方面,本发明提供了一种检测待测DNA样本的HBV基因突变的方法,包括以下步骤:利用本发明第三方面所述的方法,获得所述待测DNA样本的HBV基因组序列;基于所述待测DNA样本的HBV基因组序列进行文库构建,以便获得目的DNA文库;将所述目的DNA文库进行测序,以便获得测序结果;基于所述测序结果,确定所述待测DNA样本的HBV基因的突变信息。通过对待测DNA样本建库测序,然后基于测序结果,获得待测DNA样本中HBV基因的突变信息。
根据本发明的实施例,以上检测待测DNA样本的HBV基因耐药突变的方法可以进一步附加如下技术特征:
在本发明的一些实施例中,将所述待测DNA样本的HBV基因组序列依次进行DNA片段化、末端修复和添加碱基“A”、接头连接和PCR富集,以便实现所述文库构建。
在本发明的一些实施例中,将所述测序结果与HBV参照基因组进行比对,以便确定所述待测DNA样本的HBV基因的突变信息。
在本发明的一些实施例中,所述突变信息包括SNP位点突变、缺失突变、插入突变或者移码突变。
在本发明的一些实施例中,所述HBV参照基因组选自GenBank数据库、EMBL数据库或者DDBJ数据库中至少一种。
在本发明的一些实施例中,利用Hiseq2500平台进行所述测序。
在本发明的一些实施例中,所述方法还包括:在所述待测DNA样本中选择取自于表现为HBV耐药患者的待测DNA样本,确定其中的耐药突变,是按照如下方法实现的:
本发明所取得的有益效果为:本发明结合巢氏聚合酶链式反应和高通量测序技术用于乙肝病毒全基因组SNP分析,可提高检测灵敏度,并可检测到全面的位点突变信息,为制定更加合理的抗病毒治疗方案,对可能耐药的患者进行相关的耐药方面的检测,及时调整治疗方案提供有效依据。
附图说明
附图1是根据本发明的实施例提供的实验流程图。
附图2是根据本发明的实施例提供的步骤(3)PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。
附图3是根据本发明的实施例提供的步骤(5)PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。
附图4是根据本发明的实施例提供的文库质控合格文库的2100结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出,其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
本发明通过对HBV基因组序列进行分析,选择了利用巢氏PCR扩增的方法来获得样本中HBV基因组的信息,从而来确定HBV基因组的突变情况。
本发明中在对样本中的HBV基因组进行扩增中,所用到的巢氏PCR扩增引物是发明人创造性劳动的结果,表现在:巢氏PCR扩增需要借助于两对引物完成(外引物和内引物),第一轮扩增(即利用外引物)获得扩增产物,第二轮扩增(内引物)用来特异性的扩增位于第一轮扩增产物内的一段DNA片段。而非目的片段包含两对引物结合位点的可能性很小,因此巢氏PCR可以提高的提高灵敏度和特异性。相应地,借助于内外引物进行扩增获得目标片段,引物选择很关键。
在本发明的一种具体实施方式中,所述获得待测DNA样本的HBV基因组序列的方法,包括以下步骤:
将所述待测DNA样本分为两部分,然后利用第一巢氏PCR引物组将一部分待测DNA样本进行第一巢氏PCR,并利用第二巢氏PCR引物组将另一份待测DNA样本进行第二巢氏PCR,其中,所述第一巢氏PCR引物组由SEQ ID NO:1-2所示的第一引物对和SEQ ID NO:3-4所示的第二引物对组成,所述第二巢氏PCR引物组由SEQ ID NO:5-6所示的第三引物对和SEQ ID NO:7-8所示的第四引物对组成;以及
将第一巢氏PCR产物和第二巢氏PCR产物混合,以便得到所述待测DNA样本的HBV基因组序列。
其中所述第一引物对包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2,其序列信息如下:
HBV_seg1F1(SEQ ID NO:1):ACATAAGAGGACTCTTGGACT
HBV_seg1R1(SEQ ID NO:2):CTGAGCCTGAGGGCTCCAC
所述第二引物对包括SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4,其序列信息如下:
HBV_seg1F2(SEQ ID NO:3):CTCAGCAATGTCAACGACC
HBV_seg1R2(SEQ ID NO:4):TTGAAGTCCCAATCTGGATT
所述第三引物对包括SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6,其序列信息如下:
HBV_seg2F1(SEQ ID NO:5):ACACGTAGCGCCTCATTTT
HBV_seg2R1(SEQ ID NO:6):AATTTATGCCTACAGCCTCC
所述第三引物对包括SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8,其序列信息如下:
HBV_seg2F2(SEQ ID NO:7):CCATATTCTTGGGAACAAGA
HBV_seg2R2(SEQ ID NO:8):AACACACAGTCTTTGAAGTA
在本发明的一种具体实施方式中,所述第一巢氏PCR包括:利用第一引物对将一部分待测DNA样本进行第一PCR扩增,得到第一PCR扩增产物,然后利用第二引物对将第一PCR扩增产物进行第二PCR扩增;
所述第二巢氏PCR包括:利用第三引物对将另一部分待测DNA样本进行第三PCR扩增,得到第三PCR扩增产物,然后利用第四引物对将第三PCR扩增产物进行第四PCR扩增。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
其中实施例中所用的仪器信息如下:
表一:检测用于乙肝病毒全基因组SNP分析的检测方法所需设备仪器
表二:检测乙肝病毒BCP区及PreC区位点突变所需试剂
实施例1
参照图1所示,按照如下方法获得HBV测序信息:
(1)HBV样本DNA提取:采用TIANamp Virus DNA/RNA Kit DP315提取试剂盒,按照《TIANamp Virus DNA/RNA Kit DP315》说明书的记载,进行样本核酸提取;
(2)样品DNA进行分段PCR扩增:扩增引物(引物可通过英潍捷基(上海)贸易有限公司订购)如下:
Seg1区
HBV_seg1F1(SEQ ID NO:1):ACATAAGAGGACTCTTGGACT
HBV_seg1R1(SEQ ID NO:2):CTGAGCCTGAGGGCTCCAC
Seg2区
HBV_seg2F1(SEQ ID NO:5):ACACGTAGCGCCTCATTTT
HBV_seg2R1(SEQ ID NO:6):AATTTATGCCTACAGCCTCC
扩增试剂及程序如表所示:
(3)配制1.5%的琼脂糖凝胶,电压设置180V,时间设置40minutes,取3ul扩增模板进行琼脂糖凝胶电泳,电泳停止放入凝胶成像仪中采集图像,若目的片段清晰目测浓度在20ng/ul则进行步骤(6),若目的片段条带较暗或者没有则进行步骤(4),见附图2;
其中039样本为第一步PCR合格样本,可进行步骤(6)及后续实验;044样本需进行巢式PCR,进行步骤(4)及后续实验;
(4)巢式PCR扩增,扩增引物(引物可通过英潍捷基(上海)贸易有限公司订购)如下:
Seg1区
HBV_seg1F2(SEQ ID NO:3):CTCAGCAATGTCAACGACC
HBV_seg1R2(SEQ ID NO:4):TTGAAGTCCCAATCTGGATT
Seg2区
HBV_seg2F2(SEQ ID NO:7):CCATATTCTTGGGAACAAGA
HBV_seg2R2(SEQ ID NO:8):AACACACAGTCTTTGAAGTA
扩增试剂及程序如表所示:
(5)配制1.5%的琼脂糖凝胶,电压设置180V,时间设置40minutes,取3ul扩增模板进行琼脂糖凝胶电泳,电泳停止放入凝胶成像仪中采集图像,见附图3;其中044样本为巢式PCR扩增后合格样本,可进行步骤(6)及后续实验。
(6)采用QIAquick PCR Purification Kit试剂盒对扩增产物进行纯化,按照QIAquick PCR Purification Kit说明进行操作;
(7)采用Qubit dsDNA HS Assay kit 2.0Fluorometer试剂盒对扩增样本进行定量,将Seg1和Seg2 PCR产物进行等浓度混合(混合后浓度500ng~1μg);
(9)片段化DNA的末端修复
按照以下反应体系进行片段化DNA的末端修复。之后置于舒适型恒温混匀仪上20℃温育30min。反应结束后的末端修复产物用1.5倍体积的Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化;
(10)末端加“A”
根据以下反应体系在末端修复产物的3’端加“A”,用于后续Adapter连接。之后置于舒适型恒温混匀仪上37℃温育30min。
(11)“Adapter”接头连接
根据以下反应体系进行DNA片段两端的“Adapter”连接,后置于恒温温育仪中16℃过夜连接。加接头产物用1.5倍体积的Agencourt AMPure XP磁珠纯化。
(12)PCR扩增
按照以下反应体系进行加接头的目的产物的富集,并加入Index用于区分不同样本。PCR产物采用1.5倍体积的Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化;
(13)文库质控:用Agilent 2100 Bioanalyzer检测文库产量,用QPCR定量文库浓度。2100检测结果见附图4;其中所示样本为2100质控合格样本。
(14)样本质控合格后,进行Hiseq2500上机测序,获得下机数据,下机数据过滤与HBV基因组比较,进行各个区域的分析,检测SNP位点及HBV分型。给出报告。
在本发明的描述中,需要理解的是,术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系,仅是为了便于描述本发明和简化描述,而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作,因此不能理解为对本发明的限制。
此外,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中,“多个”的含义是至少两个,例如两个,三个等,除非另有明确具体的限定。
在本发明中,除非另有明确的规定和限定,术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解,例如,可以是固定连接,也可以是可拆卸连接,或成一体;可以是机械连接,也可以是电连接或彼此可通讯;可以是直接相连,也可以通过中间媒介间接相连,可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系,除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言,可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本发明中,除非另有明确的规定和限定,第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触,或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且,第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方,或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方,或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大基因股份有限公司
天津华大医学检验所有限公司
<120> 乙型肝炎病毒基因组突变检测方法及试剂盒和应用
<130> PIDC3170476
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
acataagagg actcttggac t 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
ctgagcctga gggctccac 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
ctcagcaatg tcaacgacc 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
ttgaagtccc aatctggatt 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
acacgtagcg cctcatttt 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
aatttatgcc tacagcctcc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
ccatattctt gggaacaaga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
aacacacagt ctttgaagta 20
Claims (10)
1.一种巢氏PCR引物组合物,其特征在于,包括:
第一巢氏PCR引物组,所述第一巢氏PCR引物组包括SEQ ID NO:1-2所示的第一引物对和SEQ ID NO:3-4所示的第二引物对;以及
第二巢氏PCR引物组,所述第二巢氏PCR引物组包括SEQ ID NO:5-6所示的第三引物对和SEQ ID NO:7-8所示的第四引物对。
2.一种试剂盒,其特征在于,包含权利要求1所述的巢氏PCR引物组合物,其中,所述第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对均分开放置。
3.一种获得DNA样本的HBV基因组序列的方法,其特征在于,包括以下步骤:
利用第一巢氏PCR引物组对所述DNA样本进行第一巢氏PCR扩增,得到第一巢氏PCR扩增产物,其中所述第一巢氏PCR引物组包括SEQ ID NO:1-2所示的第一引物对和SEQ ID NO:3-4所示的第二引物对;
利用第二巢氏PCR引物组对所述DNA样本进行第二巢氏PCR扩增,得到第二巢氏PCR扩增产物,其中所述第二巢氏PCR引物组包括SEQ ID NO:5-6所示的第三引物对和SEQ ID NO:7-8所示的第四引物对;
将第一巢氏PCR扩增产物和第二巢氏PCR扩增产物混合,得到所述待测DNA样本的HBV基因组序列。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,
所述第一巢氏PCR扩增包括:利用第一引物对对所述DNA样本进行第一PCR扩增,得到第一PCR扩增产物,然后利用第二引物对对所述第一PCR扩增产物进行第二PCR扩增,得到所述第一巢氏PCR扩增产物;
所述第二巢氏PCR扩增包括:利用第三引物对对所述DNA样本进行第三PCR扩增,得到第三PCR扩增产物,然后利用第四引物对对第三PCR扩增产物进行第四PCR扩增,得到第二巢氏PCR扩增产物。
5.一种检测待测DNA样本的HBV基因突变的方法,其特征在于,包括以下步骤:
利用权利要求3或4所述的方法,获得所述待测DNA样本的HBV基因组序列;
基于所述待测DNA样本的HBV基因组序列进行文库构建,以便获得目的DNA文库;
将所述目的DNA文库进行测序,以便获得测序结果;
基于所述测序结果,确定所述待测DNA样本的HBV基因的突变信息。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,将所述待测DNA样本的HBV基因组序列依次进行DNA片段化、末端修复和添加碱基“A”、接头连接和PCR富集,以便实现所述文库构建。
7.根据权利要求5或6所述的方法,其特征在于,将所述测序结果与HBV参照基因组进行比对,以便确定所述待测DNA样本的HBV基因的突变信息;
任选地,所述突变信息包括SNP位点突变、缺失突变、插入突变或者移码突变。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述HBV参照基因组选自GenBank数据库、EMBL数据库或者DDBJ数据库中至少一种。
9.根据权利要求5~8中任一项所述的方法,其特征在于,利用Hiseq2500平台进行所述测序。
10.根据权利要求5~9中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法还包括:在所述待测DNA样本中选择取自于表现为HBV耐药患者的待测DNA样本,确定其中的耐药突变。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811291752.2A CN111118210A (zh) | 2018-10-31 | 2018-10-31 | 乙型肝炎病毒基因组突变检测方法及试剂盒和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811291752.2A CN111118210A (zh) | 2018-10-31 | 2018-10-31 | 乙型肝炎病毒基因组突变检测方法及试剂盒和应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111118210A true CN111118210A (zh) | 2020-05-08 |
Family
ID=70494515
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811291752.2A Pending CN111118210A (zh) | 2018-10-31 | 2018-10-31 | 乙型肝炎病毒基因组突变检测方法及试剂盒和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111118210A (zh) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2480382A1 (en) * | 2002-03-29 | 2003-10-09 | Innogenetics N.V. | Hbv drug resistance detection methods |
CN101698891A (zh) * | 2009-09-10 | 2010-04-28 | 中国人民解放军第三○二医院 | 一种乙型肝炎病毒多位点基因耐药突变检测方法 |
US20120141977A1 (en) * | 2009-05-04 | 2012-06-07 | Peking University People's Hospital | Hepatitis b virus mutation strain with resistance to adefovir dipivoxil and the uses thereof |
CN105316403A (zh) * | 2015-05-12 | 2016-02-10 | 深圳市瀚海基因生物科技有限公司 | 一种基于下一代测序技术检测hbv耐药突变位点的引物、方法及应用 |
CN106367534A (zh) * | 2016-09-07 | 2017-02-01 | 东莞市儿童医院 | 一种检测乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变的巢式pcr引物及巢式pcr方法 |
-
2018
- 2018-10-31 CN CN201811291752.2A patent/CN111118210A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2480382A1 (en) * | 2002-03-29 | 2003-10-09 | Innogenetics N.V. | Hbv drug resistance detection methods |
US20120141977A1 (en) * | 2009-05-04 | 2012-06-07 | Peking University People's Hospital | Hepatitis b virus mutation strain with resistance to adefovir dipivoxil and the uses thereof |
CN101698891A (zh) * | 2009-09-10 | 2010-04-28 | 中国人民解放军第三○二医院 | 一种乙型肝炎病毒多位点基因耐药突变检测方法 |
CN105316403A (zh) * | 2015-05-12 | 2016-02-10 | 深圳市瀚海基因生物科技有限公司 | 一种基于下一代测序技术检测hbv耐药突变位点的引物、方法及应用 |
CN106367534A (zh) * | 2016-09-07 | 2017-02-01 | 东莞市儿童医院 | 一种检测乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变的巢式pcr引物及巢式pcr方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
XIANJUN WANG等: "Integrating nested PCR with high-throughput sequencing to characterize mutations of HBV genome in low viral load samples", 《MEDICINE (BALTIMORE)》 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104805206B (zh) | 检测tert基因启动子突变的试剂盒及其检测方法 | |
JP7204004B2 (ja) | 肺癌の複数遺伝子突然変異を一括検出する試薬キット | |
TWI647236B (zh) | 用於結核分枝桿菌之基因型鑑定的引子、單核苷酸多態性標記及方法 | |
US20220098642A1 (en) | Quantitative amplicon sequencing for multiplexed copy number variation detection and allele ratio quantitation | |
CN111575380A (zh) | 多基因检测用的探针库、杂交试剂盒和多基因检测的方法 | |
CN107513578A (zh) | 一种用于肺癌驱动基因及易感基因早筛的核酸质谱检测方法 | |
CN110846408A (zh) | 用于检测ttn基因突变的引物组合及其应用 | |
Tranah et al. | Multiple displacement amplification prior to single nucleotide polymorphism genotyping in epidemiologic studies | |
CN110846409A (zh) | 用于检测tnni3k基因突变的引物组合及其应用 | |
CN109686404B (zh) | 检测样本混淆的方法及装置 | |
Rybicka et al. | Current molecular methods for the detection of hepatitis B virus quasispecies | |
CN110791813B (zh) | 对单链dna进行处理的方法及应用 | |
US20200308576A1 (en) | Novel method for generating circular single-stranded dna libraries | |
EP2522741B1 (en) | Genotyping method | |
CN117467762A (zh) | 一种乳腺癌基因检测的探针组合物和试剂盒 | |
CN111118210A (zh) | 乙型肝炎病毒基因组突变检测方法及试剂盒和应用 | |
CN115418394A (zh) | 用于检测cho细胞基因组dna的组合物、试剂盒及方法 | |
CN108330213B (zh) | 一种同时进行hbv dna定量、基因分型及rt区突变检测方法 | |
CN114085926A (zh) | Abcb1基因c3435t的snp位点多态性的引物和探针、试剂盒及检测方法 | |
CN102586472B (zh) | 一种检测乙型肝炎病毒dna序列的方法及试剂盒 | |
CN116445596B (zh) | 一种用于人类基因分型的产品、方法及其用途 | |
CN112538538B (zh) | 用于脓肿分枝杆菌检测的试剂盒及系统 | |
CN112538540B (zh) | 用于堪萨斯分枝杆菌检测的试剂盒及系统 | |
CN117965814B (zh) | 一种乙肝病毒基因耐药突变位点的单管巢氏pcr扩增引物及其应用 | |
CN112538541B (zh) | 用于胞内分枝杆菌检测的试剂盒及系统 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |