CN106367534A - 一种检测乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变的巢式pcr引物及巢式pcr方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及病毒基因突变检测技术领域，具体涉及一种检测乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变的巢式PCR引物及巢式PCR方法，该巢式PCR方法包括如下步骤：以第一对引物对待检测DNA进行第一轮PCR，得到第一轮PCR产物，进行50‑150倍稀释；以第二对引物对第一轮PCR稀释产物进行第二轮PCR，对第二轮PCR产物进行检测。本发明在长期进行HBV研究的基础上，对NCBI上乙肝病毒不同基因型的序列进行比对分析，对相关引物、反应体系进行优化后，探索出的一套特异、准确、操作简便的检测HBV表面抗原免疫逃逸突变的巢式PCR方法，可以用于分析HBV表面抗原免疫逃逸突变以及基因分型，实用性强，符合临床推广的要求。

Description

一种检测乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变的巢式PCR引 物及巢式PCR方法
技术领域
本发明涉及病毒基因突变检测技术领域，具体涉及一种检测乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变的巢式PCR引物及巢式PCR方法。
背景技术
乙型肝炎是世界上最常见的慢性病毒感染性疾病，据世界卫生组织估计，全世界超过3.5亿人感染乙肝病毒（HBV），主要发生在发展中国家。乙型肝炎病毒感染可引发一系列严重的肝脏疾病，包括急性和慢性肝炎，肝硬化和原发性肝癌。在2010年的全球疾病负担研究中发现，乙肝每年约导致78万人死亡，在导致死亡的疾病中排名前十。由于HBV相关的高发病率和死亡率，因此HBV感染已经成为一个很重要的公共卫生问题，同时也是一个社会持续关注的热点问题。
乙肝表面抗原（HBsAg）是乙肝病毒的主要诊断标志，由226个氨基酸序列组成，其氨基酸序列包含一个高度亲水性结构域，位于氨基酸99-169区域，为其主要亲水区（majorhydrophilic region；MHR）。中和作用主要是通过抗体识别乙肝表面抗原主要亲水区中的抗原表位来实现的。接种乙肝疫苗的主动免疫以及抗-HBs抗体免疫球蛋白的被动免疫均针对于该区域。HBsAg主要亲水区积累的突变，可以改变抗体对表面抗原蛋白的识别，进而影响中和抗体结合，使得一部分体内存在中和抗体的人群感染乙肝。表面抗原突变体在过去20多年已经得到广泛描述，其中包括许多氨基酸替换，主要发生在在“a”抗原决定簇（氨基酸124-147位点）内部，比如P120T，T126S，Q129H，G130N，S143L，D144A和G145A/R等较为常见的突变均是位于该区域。许多国家和地区已经报告发现了乙肝表面抗原的各种突变，产生了重要的临床和公共卫生问题。根据文献报道，乙肝表面抗原突变涉及氨基酸113-157区域多达30多个位点的突变，可以导致疫苗逃逸以及肝移植病人和新生儿中乙肝免疫球蛋白（HBIG）治疗失败，以及乙肝检测试剂盒的检测失败。
目前，传统基因突变诊断方法包括限制性片段长度多态性分析（RFLP），基因芯片法，荧光定量PCR等，这些方法存在耗时费力或所需设备和耗材昂贵等缺点，导致不能在临床大规模推广，应用受到限制。同时，乙肝表面抗原突变位点众多，且突变位点附近基因序列多变，上述方法根本无法全部涵盖这些位点。此外，HBV病毒基因型众多，在全球有至少八种基因型，而且不同基因型序列差异较大，且有特定的地理分布特征，如在中国为A-D四种基因型，其它基因型极少分布。因此，国外的检测方法在国内未必能够适用。因此有必要建立一种高效率、使用方便且适用中国人群HBV表面抗原基因突变检测的方法，以实现临床快速检测和大规模人群筛查。用本专利申请的巢式PCR的方法进行检测不仅能够覆盖中国人群的所有乙肝基因型（A-D四种基因型），还可以完全覆盖所有的突变位点。所扩增的序列不仅可以用来分析基因突变，还可以用来基因分型，且不需要贵重的专用仪器，对技术人员要求不高，只需要PCR实验室常规的设备即可，适用于在国内医院尤其是基层医院大范围推广使用。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种检测乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变的巢式PCR引物，该巢式PCR引物可以高特异、高灵敏度和高效的检测HBV表面抗原基因，其最低检测HBV DNA模板浓度可低至102IU/mL。
本发明的另一目的在于提供一种检测乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变的巢式PCR方法，该巢式PCR方法具有高度的特异性、灵敏度与准确性，所得到的PCR产物可直接送去测序，根据序列即可分析乙肝表面抗原免疫逃逸突变情况。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变的巢式PCR引物，所述巢式PCR引物由第一对引物和第二对引物组成，第一对引物包括正向引物SF1和反向引物SR1，第二对引物包括正向引物SF2和反向引物SR2，其序列分别为；
正向引物SF1：5'-TCACCATATTCTTGGGAACAAGA-3'
反向引物SR1：5'-GGGTTGCGTCAGCAAACA-3'
正向引物SF2：5'-CCTGCTGGTGGCTCCAGTTC-3'
反向引物SR2：5'-ATACCCARAGACAAAAGAAAATTGGT-3'。
本发明提供的用于检测乙肝表面抗原免疫逃逸突变的巢式PCR的引物，第一对引物中的上游引物SF1选择HBV基因组nt2817-2839保守区域；下游引物SR1主要部分选择nt1181-1198保守区域。第一对引物将扩增出1597bp大小的片段。第二对引物中的上游引物SF2选择nt56-75位保守区域；下游引物SR2选择nt802-827位保守区域。第二对引物将扩增出772bp大小的片段。其中，基因组参考序列的NCBI检索号为AF100309.1（B基因型），AB033554.1（B基因型），X04615.1（C基因型），AY123041.1（C基因型）。
本发明的两对引物可以高特异、高灵敏度和高效的检测HBV表面抗原基因，其最低检测HBV DNA模板浓度可低至102IU/mL。
本发明的另一目的通过下述技术方案实现：一种用于非治疗目的采用上述所述的巢式PCR引物检测乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变的巢式PCR方法，其包括如下步骤：
（1）以第一对引物对待检测DNA进行第一轮PCR，得到第一轮PCR产物，进行50-150倍稀释，得到第一轮PCR稀释产物；
（2）以第二对引物对第一轮PCR稀释产物进行第二轮PCR，得到第二轮PCR产物；
（3）对第二轮PCR产物进行检测。
优选的，所述步骤（1）中，待检测DNA是从待检血清或血浆中提取DNA而得。采用常规的提取方法提取DNA即可。如取适量(50-200μL)待检血清或血浆，用“消化、酚-氯仿抽提、乙醇沉淀法”或市售病毒DNA提取试剂盒等方法提取病毒DNA。
优选的，所述步骤（1）中，待检测DNA的浓度为102IU/mL以上。本发明的低检测HBVDNA模板浓度可低至102IU/mL，灵敏度高。
优选的，所述步骤（1）中，第一轮PCR的反应体系的体积为10-25μL。
优选的，所述步骤（1）中，第一轮PCR的反应体系为：KOD FX 0.5U、dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 12.5μL、10pmol/μL的引物各0.75μL和待检测DNA 1-2μL，双蒸水补齐至25μL。
经多次试验，采用25μL的第一轮PCR的反应体系，并限定其中各成分的含量，为第二轮PCR提供稳定的模板，使得最终结果稳定。
优选的，所述步骤（1）中，第一轮PCR的反应程序为：1）、94℃预变性2min；2）、98℃变性10s，56℃退火30s，68℃延伸100s，共40个循环；3）、72℃后延伸5min。
经多次试验，第一轮PCR的程序优化扩增条件，扩增特异性强，为第二轮PCR提供稳定的模板。
优选的，所述步骤（2）中，第二轮PCR的反应体系的体积为25-50μL。
优选的，所述步骤（2）中，第二轮 PCR的反应体系为：KOD FX 1U、dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 25μL、10pmol/μL的引物各1.5μL和第一轮 PCR 稀释产物 1-2μL，双蒸水补齐至50μL。
经多次试验，采用50μL的第二轮PCR的反应体系，并限定其中各成分的含量，最终得到的条带清晰，结果稳定。
优选的，所述步骤（2）中，第二轮PCR的反应程序为：1）、94℃预变性2min；2）、98℃变性10s，58℃退火30s，68℃延伸1min，共40个循环；3）、72℃后延伸5min。
经多次试验，第二轮PCR的程序也优化扩增条件，扩增特异性强，最终扩增产物稳定。进一步地，对所述第二轮PCR产物采用琼脂糖凝胶水平电泳进行检测。第一轮PCR扩增使用SF1/SR1引物组合，其产物片段大小为1597bp；第二轮PCR扩增分别使用SF2/SR2引物组合，其产物片段大小分别为772bp。
本发明的有益效果在于：本发明的巢式PCR引物可以高特异、高灵敏度和高效的检测HBV表面抗原基因，其最低检测HBV DNA模板浓度可低至102IU/mL。
本发明的该巢式PCR方法具有高度的特异性、灵敏度与准确性，所得到的PCR产物可直接送去测序，根据序列即可分析乙肝表面抗原免疫逃逸突变情况。
本发明提供的高敏感性巢式PCR方法，是在长期实践的基础上，在对HBV不同基因型表面抗原序列比对的基础上自行设计引物，探索出本发明的高特异性、高灵敏性和高效的检测方法，其最低检测HBVDNA模板浓度可达102IU/mL。
本发明限定了第一轮PCR的反应体系和反应程序，同时还限定了第二轮PCR的反应体系和反应程序，最终得到的条带清晰，结果稳定。
本发明通过选用特定的巢式PCR引物，采用巢式PCR方法，优化PCR反应体系和反应程序，扩增HBV表面抗原具有高敏感性，与其它方法比较无非特异性扩增出现，显示高度扩增特异性。
本发明在长期进行HBV研究的基础上，对NCBI上乙肝病毒不同基因型的序列进行比对分析，对相关引物、反应体系进行优化后，探索出的一套特异、准确、操作简便的检测HBV表面抗原免疫逃逸突变的巢式PCR方法，可以用于分析HBV表面抗原免疫逃逸突变以及基因分型，实用性强，符合临床推广的要求。
附图说明
图1是本发明实施例1的电泳图。
图2是本发明实施例1的测序图。
图3是本发明实施例2的电泳图。
图4是本发明实施例2的测序图。
图5是本发明实施例3的电泳图。
图6是本发明实施例3的测序图。
图7是本发明实施例4的电泳图。
图8是本发明实施例4的测序图。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图1-8对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。实施例中未注明具体条件的，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商的，均为可以通过市售获得的常规产品。
实施例1
一种检测乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变的巢式PCR引物，所述巢式PCR引物由第一对引物和第二对引物组成，第一对引物包括正向引物SF1和反向引物SR1，第二对引物包括正向引物SF2和反向引物SR2，其序列分别为；
正向引物SF1：5'-TCACCATATTCTTGGGAACAAGA-3'(nt2817-2839)
反向引物SR1：5'-GGGTTGCGTCAGCAAACA-3'(nt56-75)
正向引物SF2：5'-CCTGCTGGTGGCTCCAGTTC-3'(nt1181-1198)
反向引物SR2：5'-ATACCCARAGACAAAAGAAAATTGGT-3'(nt802-827)。
每个模板DNA均采用以下PCR反应体系和PCR反应程序进行：
一种用于非治疗目的采用上述所述的巢式PCR引物检测乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变的巢式PCR方法，包括如下步骤：
（1）以第一对引物对待检测DNA进行第一轮PCR，得到第一轮PCR产物，进行50-150倍稀释，得到第一轮PCR稀释产物；
（2）以第二对引物对第一轮PCR稀释产物进行第二轮PCR，得到第二轮PCR产物；
（3）对第二轮PCR产物进行检测即可进一步分析表面抗原基因突变以及基因分型。
所述步骤（1）中，待检测DNA是从待检血清或血浆中提取DNA而得。
所述步骤（1）中，待检测DNA的浓度为5.38×104IU/mL。
所述步骤（1）中，第一轮PCR的反应体系的体积为10-25μL。第一轮PCR的反应体系的体积可以为10-25μL中的任意体积，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。本实施例中，第一轮PCR的反应体系的体积优选为25μL。具体的，第一轮PCR的反应体系为：KOD FX 0.5U、dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX12.5μL、10pmol/μL的引物各0.75μL和待检测DNA 1-2μL，双蒸水补齐至25μL。
所述步骤（1）中，第一轮PCR的反应程序为：1）、94℃预变性2min；2）、98℃变性10s，56℃退火30s，68℃延伸100s，共40个循环；3）、72℃后延伸5min。
所述步骤（2）中，第二轮PCR的反应体系的体积为25-50μL。第二轮PCR的反应体系的体积可以为25-50μL中的任意体积，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。本实施例中，第二轮PCR的反应体系的体积优选为50μL。具体的，第二轮PCR的反应体系为：KOD FX 1U、dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 25μL、10pmol/μL的引物各1.5μL和第一轮 PCR 稀释产物 1-2μL，双蒸水补齐至50μL。
所述步骤（2）中，第二轮PCR的反应程序为：1）、94℃预变性2min；2）、98℃变性10s，58℃退火30s，68℃延伸1min，共40个循环；3）、72℃后延伸5min。
所述步骤（3）中，检测采用电泳检测，将第二轮PCR产物通过琼脂糖电泳配合凝胶成像系统观察结果。其中，检测的第二轮PCR产物加样量为4μL，其过程按照仪器标准操作程序进行。选择DL2,000marker（TAKARA公司）作为对照，电泳结束后分析电泳图像，第二轮PCR产物送去Invitrogen公司测序。
实施例2
本实施例与上述实施例1的不同之处在于：所述步骤（1）中，待检测DNA的浓度为3.84×103IU/mL。
实施例3
本实施例与上述实施例1的不同之处在于：所述步骤（1）中，待检测DNA的浓度为6.35×103IU/mL。
实施例4
本实施例与上述实施例1的不同之处在于：所述步骤（1）中，待检测DNA的浓度为1.54×102IU/mL。
实施例1-4的电泳图像如图1、3、5和7所示，实施例1-4的测序图如2、4、6、8所示。在电泳图1、3、5和7中，样本浓度分别为5.38×104、3.84×103、6.35×103和1.54×102IU/mL（此为临床用荧光定量试剂盒的检测结果），泳道1为DNA marker,泳道2为样本。在测序图2、4、6和8中，箭头所指碱基即HBV表面抗原逃逸突变碱基。样本基因型分别为B、B、C和C。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变的巢式PCR引物，其特征在于：所述巢式PCR引物由第一对引物和第二对引物组成，第一对引物包括正向引物SF1和反向引物SR1，第二对引物包括正向引物SF2和反向引物SR2，其序列分别为；
正向引物SF1：5'-TCACCATATTCTTGGGAACAAGA-3'
反向引物SR1：5'-GGGTTGCGTCAGCAAACA-3'
正向引物SF2：5'-CCTGCTGGTGGCTCCAGTTC-3'
反向引物SR2：5'-ATACCCARAGACAAAAGAAAATTGGT-3'。
2.一种用于非治疗目的采用权利要求1所述的巢式PCR引物检测乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变的巢式PCR方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）以第一对引物对待检测DNA进行第一轮PCR，得到第一轮PCR产物，进行50-150倍稀释，得到第一轮PCR稀释产物；
（2）以第二对引物对第一轮PCR稀释产物进行第二轮PCR，得到第二轮PCR产物；
（3）对第二轮PCR产物进行检测。
3.根据权利要求2所述的一种检测乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变的巢式PCR方法，其特征在于：所述步骤（1）中，待检测DNA是从待检血清或血浆中提取DNA而得。
4.根据权利要求2所述的一种检测乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变的巢式PCR方法，其特征在于：所述步骤（1）中，待检测DNA的浓度为102IU/mL以上。
5.根据权利要求2所述的一种检测乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变的巢式PCR方法，其特征在于：所述步骤（1）中，第一轮PCR的反应体系的体积为10-25μL。
6.根据权利要求2所述的一种检测乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变的巢式PCR方法，其特征在于：所述步骤（1）中，第一轮 PCR 的反应体系为：KOD FX 0.5U、dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 12.5μL、10pmol/μL的引物各0.75μL和待检测DNA 1-2μL，双蒸水补齐至25μL。
7.根据权利要求2所述的一种检测乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变的巢式PCR方法，其特征在于：所述步骤（1）中，第一轮PCR的反应程序为：1）、94℃预变性2min；2）、98℃变性10s，56℃退火30s，68℃延伸100s，共40个循环；3）、72℃后延伸5min。
8.根据权利要求2所述的一种检测乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变的巢式PCR方法，其特征在于：所述步骤（2）中，第二轮PCR的反应体系的体积为25-50μL。
9.根据权利要求2所述的一种检测乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变的巢式PCR方法，其特征在于：所述步骤（2）中，第二轮 PCR的反应体系为：KOD FX 1U、dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 25μL、10pmol/μL的引物各1.5μL和第一轮 PCR稀释产物 1-2μL，双蒸水补齐至50μL。
10.根据权利要求2所述的一种检测乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变的巢式PCR方法，其特征在于：所述步骤（2）中，第二轮PCR的反应程序为：1）、94℃预变性2min；2）、98℃变性10s，58℃退火30s，68℃延伸1min，共40个循环；3）、72℃后延伸5min。
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