CN111116738A

CN111116738A - 大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂h1的重组蛋白及其制备和应用

Info

Publication number: CN111116738A
Application number: CN202010105442.8A
Authority: CN
Inventors: 孙志宾; 马爱军; 朱春月
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2020-02-20
Filing date: 2020-02-20
Publication date: 2020-05-08
Anticipated expiration: 2040-02-20
Also published as: CN111116738B

Abstract

本发明涉及一种大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂H1的重组蛋白及其制备和应用，属于分子生物学技术领域，所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂H1基因的重组蛋白的氨基酸如SEQ ID NO.1所示。本发明利用体外重组表达技术获得了大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂H1蛋白SmSERPINH1，该蛋白具有显著的抗菌活性，在开发新的抗菌制剂、饲料添加剂等方面具有潜在的应用价值。

Description

大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂H1的重组蛋白及其制备和应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体说是一种大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂H1的重组蛋白及其制备和应用。

背景技术

SERPINH1又称作HPS47,即热休克蛋白47，是丝氨酸蛋白酶抑制剂H亚家族成员,一般为单一肽链蛋白质，由350-400个氨基酸残基组成，较多时可达到500个，广泛存在于动植物和微生物体内。基因本体(GO)分析发现,SERPINH1基因主要有胶原、mRNA结合、丝氨酸内肽酶抑制剂活性、非折叠蛋白质结合等功能,参与了软骨内软骨细胞骨形成、胶原蛋白生物合成、胶原原纤维构建、内肽酶活性负调节、蛋白质成熟、非折叠蛋白反应等生物过程。有研究发现,SERPINH1与多种纤维化疾病,以及硬皮病、炎症性肠病等自身免疫性疾病的发病相关,但其作用机制还不明确。具有广泛的生物学活性和作用，能调节生物体内许多重要的生命过程，如纤维蛋白溶解、氧化还原、细胞基质重建、血凝、肿瘤抑制、炎症反应和免疫应答等。

鱼类生活在水环境中，其与外界环境接触的皮肤、鳃、消化道等重要器官表面都覆着一层黏液。自然状态下鱼类分泌黏液是连续进行的，对鱼类呼吸、维持离子和渗透平衡、繁殖、排泄、防止微生物、毒物、污染物等过程非常重要。许多鱼类黏液除含有肽聚糖酶、溶菌酶等抑菌剂外，还含有其他免疫分子如免疫球蛋白、补体、干扰素、凝集素和卵黄生成素，这些成分构成鱼类抵御病原体入侵的第一道防线，为鱼类提供即时保护，防止鱼类受到病原体的侵害。黏膜组织中除含有大量的黏液细胞外，还含有各种免疫细胞和多种固有免疫成份，黏膜免疫是系统免疫的重要补充，因水环境中存在着各种不利因素，鱼类黏膜的防御机制相对于陆生生物更为复杂。研究鱼类的黏膜免疫机制，发掘功能基因，体外验证这些基因的生理功能和生物学作用，并探索其作用机制，为鱼类抗病遗传育种新标记的开发、新型鱼类疾病防治药物的研制、及环境友好型抗菌保鲜制剂的创制提供新的理论基础和研究方向。

发明内容

本发明目的在于提供一种大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂H1的重组蛋白及其制备和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂的重组蛋白，丝氨酸蛋白酶抑制剂H1(SmSERPINH1)基因的重组蛋白的氨基酸如SEQ ID NO.1所示。

大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂H1的重组蛋白制备方法：

(1)以大菱鲆SmSERPINH1成熟肽编码区为模板，采用带有酶切位点(BamH I、HindIII)的引物P1和P2进行PCR扩增，待用；

(2)将PCR扩增产物与pEASY-T1载体通过连接酶连接，转化，测序鉴定重组子；

(3)将连接入大菱鲆SmSERPINH1片段的pEASY-T1载体，以BamH I/Hind III酶切，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收SmSERPINH1目的片段，待用；

(4)将(3)中回收的SmSERPINH1目的片段与BamH I/Hind III酶切后的pET-28a载体通过连接酶链接，转化，测序鉴定重组子；

(5)将上述构建的载体转入E.coil transettea(DE3)表达菌株中进行诱导表达，而后纯化、浓缩，即得到具有氨基酸序列为SEQ ID NO.1的重组蛋白SmSERPINH1；

所述引物P1和P2分别为P1：

5’—CGCGGATCCATGGAGGACAGGAAGCTGAG—3’；P2：

5’—CCCAAGCTTTAGCTCGTCGCGCATCTTGT—3’。

本发明还提供所述氨基酸序列为SEQ ID NO.1中的重组蛋白SmSERPINH1在抗菌制剂中的应用。

所述氨基酸序列为SEQ ID NO.1的重组蛋白SmSERPINH1在饲料添加剂中的应用。

本发明还提供含有所述氨基酸为SEQ ID NO.1序列重组蛋白的抗菌剂。

本发明还提供含有所述氨基酸为SEQ ID NO.1序列重组蛋白的饲料添加剂。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明利用体外重组表达技术获得了大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂H1蛋白SmSERPINH1，该蛋白具有显著的抗菌活性，在开发新的抗菌制剂、饲料添加剂等方面具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂H1基因重组蛋白抑制金黄色葡萄球菌生长的吸光度图。

具体实施方式

下面的通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例1大菱鲆SmSERPINH1基因编码区的体外原核重组表达，包括下列步骤：

1、克隆载体的构建

本发明中采用的克隆载体为北京全式金生物技术有限公司的pET28a(+)载体。通过PCR技术，使用带有酶切位点(BamH I、Hind III)的基因特异性引物P1和P2扩增大菱鲆SmSERPINH1基因除去信号肽的编码区片段。反应条件为:首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环:94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟，35个循环，最后72℃延伸5分钟，4℃保存。将PCR产物纯化回收。回收产物与pEASY-T1载体连接，转化后菌落PCR筛选并测序，提取阳性克隆质粒，完成克隆载体构建。

所述引物P1为5’—CGCGGATCCATGGAGGACAGGAAGCTGAG—3’；

引物P2为5’—CCCAAGCTTTAGCTCGTCGCGCATCTTGT—3’。

2、重组载体的构建

将连接入大菱鲆SmSERPINH1片段的pEASY-T1载体和pET-28a载体分别以BamH I/Hind III酶切，酶切产物纯化回收。将酶切回收的大菱鲆SmSERPINH1片段与酶切回收的pET-28a载体通过连接酶连接，转化后菌落PCR筛选并测序，提取阳性克隆质粒，完成重组载体构建。

3、重组蛋白的表达

以北京全式金生物技术有限公司的E.coil transettea(DE3)大肠杆菌为重组表达菌株，将上述构建的重组载体转化到宿主菌中，挑取单克隆，提取质粒，测序验证读码框正确。挑取单克隆，接种于5ml LB液体培养基中，37℃恒温震荡培养箱中培养12-16小时，过夜培养，然后将此培养液以体积比1:100的比例接种到200ml新的LB液体培养基中，转移到28℃、150rpm培养至菌液的OD600nm约为0.6时。加入IPTG，使终浓度达到0.5mmol/L，继续培养6小时。4℃，5000rpm离心10分钟，收集菌体，于-20℃冻存备用。取1mL菌液离心，弃去上清后，加入320ul的PBS缓冲液充分重悬菌体，然后在冰浴条件下进行超声波破碎。超声完成后，4℃12000rpm离心5分钟，分别收集上清和沉淀。收集得到的上清、沉淀(用PBS重悬)及超声破碎的菌液各取40ul，加入10ul 5×SDS Loading Buffer，99℃加热10分钟，3000rpm离心后放冰上冷却，SDS-PAGE检测表达产物，本发明所重组的蛋白大部分为可溶性蛋白。

3、重组蛋白的纯化

将上述所得可溶性蛋白采用北京全式金生物技术有限公司镍亲和层析树脂纯化获得了重组蛋白，用PBS缓冲液透析去除咪唑，用PEG2000浓缩蛋白。

具体步骤如下：

(1)得到的上清小心加入装填有镍离子螯合亲和层析树脂填料的柱子中，反复上样4次后，将柱子在4℃堵口静置30分钟，使目的蛋白和填料更好的结合；

(2)用30ml预冷的10mmol/L、20mmol/L的咪唑溶液清洗杂蛋白；

(3)用30ml预冷的30mmol/L咪唑溶液，洗脱目的蛋白，收集流出液，用SDS-PAGE检测融合蛋白的表达；

(4)选用截留分子量为8000-14000D的透析袋，将待透析的蛋白溶液加入透析袋中，放入预冷的PBS缓冲液中，辅以磁力搅拌器4℃透析，每12小时更换一次透析液，更换6-7次；

(5)透析结束后，将透析袋取出置于冰上，用PEG 20000白色薄片进行浓缩，每30min换一次PEG 20000，直至透析袋内液体体积为3-4ml，用0.22μm滤膜抽滤除菌，分装保存。即得到SEQ ID NO.1氨基酸所示的大菱鲆SmSERPINH1基因重组蛋白。

SEQ ID NO.1

MRATHVAALCLLALVASAEDRKLSSHAIALADNSANLAFSLYHNMAKA KETENILISPVVVASSLGMVALGGKASTASQVKAVLSADRLQDEHLHAGLSELLSEVSDAKTRNTTWKISSRLYGPSSVSFADDFVKSSKRHYNYDHSKVNIRDKRSAVNAINEWAAKSTGGKLPEVTKDVQNADGATIVNAMFFKPHWEEKFHEKMVDSRAFLVTRSFTVAVPMMHRTGLYDFYEDKENRIFVLSMPLGQKQASMVLIMPYHLESLERLEKLLTRKQVDTWLARAENRAVAISLPKISLEVSHNLQKHLAELGLTEAVDKAKADLSNISGKKDLYLSNVFHASALELDVEGNPYDTSIFGTERLRNPQLFYVDHPFVFLVKDNRTNSVLYIGRVVKPKGDK

MRDEL序列特征：

长度：405个氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

拓扑结构：包括44.44％的α螺旋、17.28％的β折叠、38.27％的无规则卷曲。

特性：相对分子质量为45.14kDa，理论等电点为8.82。

来源：大菱鲆

实施例2：大菱鲆SmSERPINH1原核重组蛋白的抗菌活性分析

抑制革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的实验：

按照1:100的比例将金黄色葡萄球菌株至LB培养基中，先培养菌液过夜，实验前稀释菌液至0.5个麦氏浊度。

预先在96孔板上设置菌液与样品六个体积比梯度，每个孔的总反应体积保持一致，设置与重组蛋白浓度相同大小的BSA作为阴性对照，氨苄青霉素作为阳性对照，培养10小时，每间隔1小时测OD600的吸光度值并观察结果(参见图1)。

大菱鲆SmSERPINH1原核重组蛋白的浓度为0.4mg/ml，氨苄青霉素素浓度为0.1mg/ml，菌液与样品的体积比分别为：6/1、5/2、4/3、3/4、2/5、1/6。大菱鲆SmSERPINH1原核重组蛋白作为实验组以字母JP代表。

抑菌率(％)＝(阳性对照OD值—试验OD值)/(阳性对照OD值—阴性对照OD值)x100％。

实验结果表明，在菌液与大菱鲆SmSERPINH1原核重组蛋白样品体积为2:5时对金黄色葡萄球菌存在抑菌作用效果较好，抑菌率为93.5％。

序列表

<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120> 大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂H1的重组蛋白及其制备和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 400

<212> PRT

<213> 大菱鲆(Scophthalmus maximus)

<400> 1

Met Arg Ala Thr His Val Ala Ala Leu Cys Leu Leu Ala Leu Val Ala

1 5 10 15

Ser Ala Glu Asp Arg Lys Leu Ser Ser His Ala Ile Ala Leu Ala Asp

20 25 30

Asn Ser Ala Asn Leu Ala Phe Ser Leu Tyr His Asn Met Ala Lys Ala

35 40 45

Lys Glu Thr Glu Asn Ile Leu Ile Ser Pro Val Val Val Ala Ser Ser

50 55 60

Leu Gly Met Val Ala Leu Gly Gly Lys Ala Ser Thr Ala Ser Gln Val

65 70 75 80

Lys Ala Val Leu Ser Ala Asp Arg Leu Gln Asp Glu His Leu His Ala

85 90 95

Gly Leu Ser Glu Leu Leu Ser Glu Val Ser Asp Ala Lys Thr Arg Asn

100 105 110

Thr Thr Trp Lys Ile Ser Ser Arg Leu Tyr Gly Pro Ser Ser Val Ser

115 120 125

Phe Ala Asp Asp Phe Val Lys Ser Ser Lys Arg His Tyr Asn Tyr Asp

130 135 140

His Ser Lys Val Asn Ile Arg Asp Lys Arg Ser Ala Val Asn Ala Ile

145 150 155 160

Asn Glu Trp Ala Ala Lys Ser Thr Gly Gly Lys Leu Pro Glu Val Thr

165 170 175

Lys Asp Val Gln Asn Ala Asp Gly Ala Thr Ile Val Asn Ala Met Phe

180 185 190

Phe Lys Pro His Trp Glu Glu Lys Phe His Glu Lys Met Val Asp Ser

195 200 205

Arg Ala Phe Leu Val Thr Arg Ser Phe Thr Val Ala Val Pro Met Met

210 215 220

His Arg Thr Gly Leu Tyr Asp Phe Tyr Glu Asp Lys Glu Asn Arg Ile

225 230 235 240

Phe Val Leu Ser Met Pro Leu Gly Gln Lys Gln Ala Ser Met Val Leu

245 250 255

Ile Met Pro Tyr His Leu Glu Ser Leu Glu Arg Leu Glu Lys Leu Leu

260 265 270

Thr Arg Lys Gln Val Asp Thr Trp Leu Ala Arg Ala Glu Asn Arg Ala

275 280 285

Val Ala Ile Ser Leu Pro Lys Ile Ser Leu Glu Val Ser His Asn Leu

290 295 300

Gln Lys His Leu Ala Glu Leu Gly Leu Thr Glu Ala Val Asp Lys Ala

305 310 315 320

Lys Ala Asp Leu Ser Asn Ile Ser Gly Lys Lys Asp Leu Tyr Leu Ser

325 330 335

Asn Val Phe His Ala Ser Ala Leu Glu Leu Asp Val Glu Gly Asn Pro

340 345 350

Tyr Asp Thr Ser Ile Phe Gly Thr Glu Arg Leu Arg Asn Pro Gln Leu

355 360 365

Phe Tyr Val Asp His Pro Phe Val Phe Leu Val Lys Asp Asn Arg Thr

370 375 380

Asn Ser Val Leu Tyr Ile Gly Arg Val Val Lys Pro Lys Gly Asp Lys

385 390 395 400

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcggatcca tggaggacag gaagctgag 29

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccaagcttt agctcgtcgc gcatcttgt 29

Claims

1.一种大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂的重组蛋白，其特征在于所述丝氨酸蛋白酶抑制剂H1基因的重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述一种大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂H1的重组蛋白的制备方法：

(1)以大菱鲆SmSERPINH1成熟肽编码区为模板，采用带有酶切位点BamH I、Hind III的引物P1和P2进行PCR扩增，待用；

(4)将步骤(3)中回收的SmSERPINH1目的片段与BamH I/Hind III酶切后的pET-28a载体通过连接酶链接，转化，测序鉴定重组子；

(5)将上述构建的载体转入E.coil transettea(DE3)表达菌株中进行诱导表达，而后纯化、浓缩，即得到氨基酸序列为SEQ ID NO.1的重组蛋白SmSERPINH1；

所述引物P1和P2分别为P1：

5’—CGCGGATCCATGGAGGACAGGAAGCTGAG—3’；P2：

5’—CCCAAGCTTTAGCTCGTCGCGCATCTTGT—3’。

3.权利要求1所述氨基酸序列为SEQ ID NO.1的重组蛋白SmSERPINH1在抗菌制剂中的应用。

4.权利要求1所述氨基酸序列为SEQ ID NO.1的重组蛋白SmSERPINH1在饲料添加剂中的应用。

5.含有权利要求1所述氨基酸为SEQ ID NO.1的重组蛋白的抗菌剂。

6.含有权利要求1所述氨基酸为SEQ ID NO.1的重组蛋白的饲料添加剂。