CN111100841A

CN111100841A - 抗肥胖药物靶点ucp1的基因工程细胞株和高通量药物筛选模型的建立及应用

Info

Publication number: CN111100841A
Application number: CN201811248715.3A
Authority: CN
Inventors: 杜冠华; 强桂芬; 何萍; 刘俊成; 杨秀颖; 张莉; 侯碧玉; 徐春阳
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2018-10-25
Filing date: 2018-10-25
Publication date: 2020-05-05
Anticipated expiration: 2038-10-25
Also published as: CN111100841B

Abstract

本发明公开了一种构建抗肥胖药物靶点UCP1的基因工程细胞株的方法，同时公开了抗肥胖药物高通量筛选模型的建立及应用。主要涉及利用CRISPR/Cas9系统，设计两条独特的sgRNA，在细胞的UCP1基因N端ATG之后敲入luciferase‑T2A‑tdTomato‑WPRE‑pA，特别是将luciferase和tdTomato敲入永生化棕色脂肪细胞UCP1的基因位点，形成首株在UCP1启动子区域插入luciferase和tdTomato的稳转棕色脂肪细胞株，并将其应用于抗肥胖药物的高通量筛选、抗肥胖药物的评价、机体抗肥胖活性物质的评价以及UCP1检测试剂盒的开发。UCP1是特异性表达于棕色脂肪组织的解偶联蛋白，抵抗肥胖的新靶点，该稳转基因工程细胞株的构建对于应用报告基因和高内涵方法，灵敏、准确、高效地对化合物库进行高通量筛选，获得促进产热、降低体重的抗肥胖药物意义重大。

Description

抗肥胖药物靶点UCP1的基因工程细胞株和高通量药物筛选模型的建立及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种应用CRISPR/Cas9系统在细胞解偶联蛋白(uncoupling protein 1,UCP1)基因位点敲入luciferase-T2A-tdTomato-WPRE-pA，替换exon1和部分intron1，构建稳转细胞株，特别是将luciferase和tdTomato敲入永生化棕色脂肪细胞UCP1的基因位点的基因定向编辑方法与应用，并利用阳性克隆建立抗肥胖药物高通量筛选模型、评价抗肥胖药物、评价机体抗肥胖活性物质以及UCP1检测试剂盒的开发。

背景技术

在过去的二十年里，定点设计核酸酶的创新使得基因组编辑技术取得了巨大地进步，如锌指核酸酶(ZFN)和转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)。然而，设计、合成以及对特定基因位点的蛋白质验证的困难限制了这些方法的可行性。基因组编辑技术关键的突破是发现了一种叫做成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)的细菌免疫系统相关RNA分子，它能够指导CRISPR相关的9(Cas9)核酸酶靶向与向导RNA(gRNA)互补的DNA序列。这种gRNA易于编程，并且设计的gRNA与Cas9表达组件的简单转导就可以高度特异性和高效性在DNA中引入双链断裂(DSB)。CRISPR还具有比ZFN和TALEN更小的优势，因此，更容易将其封装到慢病毒结构中，具有较低的脱靶剪切风险，更容易创建，成本更低，并且表现出更高的效率。CRISPR/Cas9系统在许多哺乳动物培养细胞中取得了成功的结果。

随着全球肥胖人群的日益增加，肥胖已成为21世纪最大的公共健康挑战之一，据世界卫生组织(WHO)统计，全球肥胖发病率自1980年至今已增加2倍以上。肥胖是影响很多疾病的重大风险因素，如心血管疾病、糖尿病、高血脂和肿瘤等。鉴于此，美国医学会于2013年认定肥胖是一种疾病。增加锻炼，控制饮食等非药物治疗肥胖的方法往往依从性较差，而减肥药治疗则通过抑制食欲或肠道脂类吸收达到限制能量摄入进而减肥的目的，长期应用会出现抑郁、脂肪泻等副作用，一旦停药则出现明显的体重反弹。因此，寻找安全有效的减肥药是目前治疗肥胖症，进而减少代谢性疾病及其并发症的重中之重。

棕色脂肪活化或促白色脂肪“棕色化”是近年来提出的新概念，通过激活棕色脂肪或促进白色脂肪出现棕色脂肪的特征表现，从而显著促进机体的能量消耗，改善糖脂代谢，增加胰岛素敏感性，因此可能成为针对肥胖症及其相关代谢异常疾病治疗的新靶点。

UCP1是一种特异性表达于棕色脂肪组织的线粒体蛋白，它解偶联细胞呼吸和线粒体ATP合成，以热量的形式耗散能量。由于UCP1被认为是唯一负责棕色脂肪组织产热作用的“热基因”，因此当前研究认为UCP1的主要作用是调节棕色和米色脂肪的功能，UCP1激活具有抗肥胖作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效定点将外源基因luciferase和tdTomato敲入细胞UCP1基因位点的方法，特别是敲入永生化棕色脂肪细胞UCP1基因位点的方法。

本发明的另一目的在于应用上述稳转棕色脂肪细胞，提供一种抗肥胖药物高通量筛选模型的构建方法。

本发明的第三个目的在于提供一种抗肥胖药物评价方法。

本发明的第四个目的在于提供一种机体抗肥胖活性物质的评价方法。

本发明的第五个目的在于采用本发明所提及的技术筛选出的药物用于抗代谢性疾病治疗，不限于肥胖，还包括糖尿病、高脂血症、代谢综合症等疾病。

本发明的第六个目的在于提供一种用于检测UCP1的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种高效定点将外源基因luciferase和tdTomato敲入细胞UCP1基因位点的方法，其特征在于所述方法为：

(1)确定打靶策略，在分析UCP1基因结构编码序列(Coding sequences,CDS)后，设计在N端ATG之后敲入luciferase-T2A-tdTomato-WPRE-pA-loxP-Neo-loxP,替换exon1和部分intron1；

(2)靶序列的测序确认，设计引物，对靶细胞系靶位点序列进行PCR扩增并测序验证，以保证小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)识别序列与靶细胞系DNA序列完全一致，靶细胞系靶位点测序引物序列为如SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2所示；

(3)Cas9/sgRNA设计，在5’端和3’端靶位点区域各设计5条sgRNA，sgRNA对应的靶向序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，UCP1-sgRNA1序列如SEQ ID NO.13所示、UCP1-sgRNA2序列如SEQ ID NO.14所示、UCP1-sgRNA3序列如SEQID NO.15所示、UCP1-sgRNA4序列如SEQ ID NO.16所示、UCP1-sgRNA5序列如SEQ ID NO.17所示、UCP1-sgRNA6序列如SEQ ID NO.18所示、UCP1-sgRNA7序列如SEQ ID NO.19所示、UCP1-sgRNA8序列如SEQ ID NO.20所示、UCP1-sgRNA9序列如SEQ ID NO.21所示、UCP1-sgRNA10序列如SEQ ID NO.22所示；

(4)Cas9/sgRNA质粒的构建，按照已设计sgRNA序列合成相应引物，通过GibsonAssembly的方式连入pCS-3G载体，连接产物转化后送样测序验证正确；

(5)Cas9/sgRNA的活性检测，综合考虑活性、特异性因素，选择使用的sgRNA为UCP1-sgRNA1和UCP1-sgRNA6，序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.18所示，pCS-sgRNA1与pCS-sgRNA6核苷酸序列如SEQ ID NO.23与SEQ ID NO.24所示。

(6)重组外源基因载体构建，合成LR-A片段，设计引物克隆RR片段，并将其与载体LScKO-4G连接为重组外源基因载体UCP1-LScKO-4G-Neo-LR-A-RR，经过酶切鉴定和测序，确认重组外源基因载体构建完成，外源基因RR片段的克隆引物序列如SEQ ID NO.25与SEQ IDNO.26所示，重组外源基因载体核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；

(7)阳性克隆筛选，Cas9/sgRNA质粒和重组外源基因载体转染靶细胞系，经过G418药物抗性筛选、细胞富集、再进行PCR筛选，首先筛选混合克隆，再进行连接PCR(JunctionPCR)筛选得到阳性克隆，筛选混合克隆PCR引物UCP1-L-GT-F序列如SEQ ID NO.28所示、WPRE-120R序列如SEQ ID NO.29所示、tdTomato-2371F序列如SEQ ID NO.30所示、UCP1-R-GT-R序列如SEQ ID NO.31所示，Junction PCR引物UCP1-L-GT-F序列如SEQ ID NO.32所示、WPRE-R2序列如SEQ ID NO.33所示、WPRE-F2序列如SEQ ID NO.34所示、UCP1-R-GT-R序列如SEQ ID NO.35所示；

进一步，所述靶细胞系为永生化棕色脂肪细胞系。

进一步，所述外源基因为luciferase-T2A-tdTomato-WPRE-pA基因。

进一步，所述靶标基因为UCP1基因。

本发明还提供一种应用上述稳转棕色脂肪细胞株构建的一种抗肥胖药物高通量筛选模型的构建方法，其特征在于所述方法为：

(1)采用UCP1启动子区域插入luciferase和tdTomato的稳转棕色脂肪细胞株，对其进行诱导分化，加阳性药刺激，优选有效作用浓度和有效作用时间，检测luciferase和tdTomato的活性。

(2)更进一步地，使用CL316,243和异丙肾上腺素(异丙肾上腺素)作为阳性药，CL316,243有效作用浓度为10μmol/L，异丙肾上腺素有效作用浓度为1μmol/L和3μmol/L，有效作用时间为24h或48h。

(3)更进一步地，检测luciferase和tdTomato活性的方法采用报告基因和高内涵方法。

本发明还提供了一种抗肥胖药物以及机体抗肥胖活性物质的评价方法，其特征在于所述方法为：

(1)采用UCP1启动子区域插入luciferase和tdTomato的稳转棕色脂肪细胞株；

(2)采用抗肥胖药物高通量筛选模型构建方法构建的luciferase和tdTomato检测体系。

(3)采用抗肥胖药物高通量筛选模型构建方法确定的CL316,243和异丙肾上腺素作为阳性药，并采用两种阳性药的有效作用浓度和有效作用时间。

本发明还提供了一种用于检测UCP1的试剂盒，其特征在于所述方法为：包括如下组成：

(2)采用抗肥胖药物高通量筛选模型构建方法构建的luciferase和tdTomato检测体系；

(3)UCP1标准品；

本发明的特点在于：

1、应用CRISPR/Cas9系统定点敲入外源基因

本发明采用CRISPR/Cas9系统将外源基因定点敲入细胞，相较于传统的采用质粒、逆转录病毒、慢病毒等进行瞬时转染/感染或构建稳转细胞株的方法，大大地减少了错配率，具有遗传稳定性。另外，相较于质粒转染后进行抗性筛选获得的稳转细胞株，应用CRISPR/Cas9系统构建的稳转细胞株无需应用抗生素进行抗性维持，不会因为抗生素与筛选药物发生反应影响筛选结果，因此更有利于用于高通量药物筛选工作。同时，棕色脂肪细胞永生化极为困难，极大地阻碍了科研及抗肥胖药物开发，本发明是在前期已建立的永生化棕色脂肪细胞株基础上所构建的稳转棕色脂肪细胞株，为这一问题提供了解决方法。

2、检测灵敏度高

本发明构建了UCP1启动子区域插入luciferase和tdTomato的稳转棕色脂肪细胞株，能够采用报告基因和高内涵的检测方法对化学发光和红色荧光进行双重灵敏、准确、高效的启动子活性检测。相较于传统的构建UCP1基因过表达稳转细胞株的方法，该方法极大地降低了药物筛选的假阳性率，有利于筛选获得棕色脂肪活化或促白色脂肪棕色化的活性化合物，为抗肥胖药物筛选提供高效、可靠的高通量筛选模型。同时，也有利于评价抗肥胖药物和机体抗肥胖活性物质以及开发UCP1检测试剂盒。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的将外源基因luciferase和tdTomato定点敲入到靶细胞UCP1基因位点的方法，主要采用CRISPR/Cas9系统将外源基因luciferase-T2A-tdTomato-WPRE-pA敲入靶细胞UCP1启动子区域，使外源基因特异性表达。这是首次利用CRISPR/Cas9系统特异性地将外源基因luciferase-T2A-tdTomato-WPRE-pA定点整合到靶细胞UCP1启动子区域，特别是将luciferase和tdTomato敲入永生化棕色脂肪细胞UCP1基因位点，使luciferase和tdTomato成功在UCP1基因位点特异性表达。应用本发明方法成功构建的永生化棕色脂肪细胞UCP1启动子区域敲入luciferase和tdTomato稳转棕色细胞株，并建立抗肥胖药物高通量筛选模型、抗肥胖药物和机体抗肥胖活性物质评价方法以及UCP1检测试剂盒，采用报告基因和高内涵双重灵敏、准确、高效的检测方法，有利于从化合物、天然产物与中草药中筛选获得棕色脂肪活化或促白色脂肪棕色化的活性化合物，并对其活性强度、选择性与作用机制进行评价，为治疗肥胖症等代谢性疾病的治疗药物研发提供高效的工具。

附图说明

图1为定点整合外源基因luciferase-T2A-tdTomato-WPRE-pA到脂肪细胞UCP1基因启动子区域的的打靶策略。注：Targeting vector：重组外源载体；CDS：编码序列；UTR：非翻译区；5‘-homologous arm：5’-同源臂；3‘-homologous arm：3’-同源臂；Neo：Neomycin·新霉素。

图2为实验中使用的DNA分子量标准(DNA ladder/marker)。

图3为靶标基因UCP1扩增的凝胶电泳图，泳道MSD为靶标基因UCP1的PCR扩增产物，泳道M为DNA Marker。

图4为pCS-3G质粒图谱。

图5为Cas9/sgRNA的活性检测结果图。注：Positive Control：阳性对照；sgRNA：小向导RNA；Relative Cas9/sgRNA activity：相对Cas9/sgRNA活性。

图6为重组外源基因载体UCP1-LScKO-4G-Neo-LR-A-RR构建模式图。

图7为外源基因3’端同源臂片段扩增的凝胶电泳图，泳道RR为3’端同源臂的扩增产物，泳道M为Marker。

图8为限制性内切酶酶切鉴定重组外源基因载体的凝胶电泳图，泳道CK为质粒对照，泳道M为Marker，泳道1代表所用限制性内切酶为ScaI+SmaI，泳道2代表所用限制性内切酶为SalI+EcoRV，泳道3代表所用限制性内切酶为NcoI。

图9为筛选混合克隆引物设计策略，包括野生型等位基因(wild type allele)和靶等位基因(targeted allele)。

图10为应用引物UCP1-L-GT-F/WPRE-120R筛选永生化棕色脂肪细胞混合克隆的凝胶电泳图，泳道M为Marker，泳道mix colonies为混合克隆，泳道WT为野生型基因型，泳道H₂O为水。

图11为应用引物tdTomato-2371F/UCP1-R-GT-R筛选永生化棕色脂肪细胞混合克隆的凝胶电泳图，泳道M为Marker，泳道mix colonies为混合克隆，泳道WT为野生型基因型，泳道H₂O为水。

图12为Junction PCR引物设计策略，包括wild type allele和targeted allele。

图13、图14为应用引物UCP1-L-GT-F/WPRE-R2进行Junction PCR的凝胶电泳图。

图15为应用引物WPRE-F2/UCP1-R-GT-R进行Junction PCR的凝胶电泳图。

图16、图17为应用引物UCP1-MSD-F2/UCP1-MSD-R2进行Junction PCR的凝胶电泳图。

图18为经过PCR和测序筛选得到的4个永生化棕色脂肪细胞阳性克隆结果图。注：Colony：克隆；KI：敲入；KI allele：敲入等位基因；Non-KI allele：非敲入等位基因；5‘-HR&Seq：5’-同源臂序列；KI element Seq：敲入原件序列；3‘-HR&Seq：3’-同源臂序列；Indel：插入/缺失；WT：野生型；Genotype：基因型；Mut：突变；None：无。

图19为采用报告基因方法检测永生化棕色脂肪细胞阳性克隆1-H6诱导前后Luciferase活性图。

图20为分别采用报告基因和检测荧光值的方法检测阳性药诱导24h后1-H6的Luciferase和tdTomato活性图。

图21为阳性药CL316,243和阳性药异丙肾上腺素有效作用浓度和有效作用时间筛选结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下述实施例中所用方法如无特殊说明均为常规方法。

pCS-3G及LScKO-4G购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司。所用引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

实施例1、靶向永生化棕色脂肪细胞UCP1基因位点的Cas9/sgRNA设计

1、UCP1序列的测序确认

不同细胞系，UCP1基因序列可能有所差异。为了保证所设计Cas9/sgRNA的效率，首先对永生化棕色脂肪细胞UCP1基因序列进行PCR扩增并测序验证，以保证sgRNA识别序列与永生化棕色脂肪细胞UCP1基因序列完全一致。

实验方法：(1)PCR引物如下所示：

(2)PCR反应体系如下所示：

(3)PCR反应条件如下所示：

Enzyme:KOD-FX

Program:Touchdown PCR

实验结果：对永生化棕色脂肪细胞DNA进行PCR及测序，结果证明永生化棕色脂肪细胞UCP1基因序列与Genebank和Ensembl所提供的UCP1基因序列完全一致。

2、体外Cas9/sgRNA质粒构建与制备

实验方法：(1)sgRNA序列如下所示：

UCP1-sgRNA1GGATATCATCACCTTCCCGC(SEQ ID NO.13)；

UCP1-sgRNA6GGCTGAAGAACCGCTGTTGAT(SEQ ID NO.18)。

(2)Cas9/sgRNA质粒的构建

按照已设计sgRNA序列合成相应引物，通过Gibson Assembly的方式连入pCS-3G载体，连接产物转化后送样测序。

实验结果：测序结果显示Cas9/sgRNA质粒序列正确，序列如SEQ ID NO.23与SEQID NO.24所示。

实施例2、重组外源基因载体的构建与制备

合成5’端同源臂(5’-homologous arm,LR)以及敲进片段luciferase-T2A-tdTomato-WPRE-pA(A)，克隆3’端同源臂(3’-homologous arm,RR)片段，并将LR-A和RR片段与载体LScKO-4G连接为重组外源基因载体UCP1-LScKO-4G-Neo-LR-A-RR，经过酶切鉴定和测序，确认重组外源基因载体构建完成。

1、外源基因克隆

实验方法：(1)UCP1-LR-A采用直接合成的方法进行制备

(2)UCP1-RR采用PCR方法进行制备，引物序列如下所示：

(3)采用酶切连接方法，将LR-A(EcoRI+XhoI)和RR(NotI+NheI)片段与载体LScKO-4G连接为重组外源基因载体UCP1-LScKO-4G-Neo-LR-A-RR。

实验结果：外源基因RR片段扩增的凝胶电泳图如图7所示。

2、限制性酶切分析

实验方法：(1)限制性酶切策略如下所示：

①Restriction enzyme:ScaI+SmaI

Expected products:6504bp+2541bp+1813bp+790bp

②Restriction enzyme:SalI+EcoRV

Expected products:8123bp+2201bp+1324bp

③Restriction enzyme:NcoI

Expected products:8487bp+1864bp+726bp+571bp

实验结果：(1)重组外源基因载体构建模式图如图6所示。

(2)重组外源基因载体的限制性内切酶酶切鉴定结果如图8所示。经过酶切鉴定和测序，确认重组外源基因载体构建完成。

(3)重组外源基因载体序列如SEQ ID NO.27所示。

实施例3、阳性克隆筛选

1、细胞转染

实验方法：UCP1-sgRNA1、UCP1-sgRNA6和重组外源基因载体电转永生化棕色脂肪细胞，电转方法参见neon转染说明书。

2、药物筛选

实验方法：转染后24h，加600μg/mL G418进行药物筛选，7天后，进行富集，获得混合克隆。

3、PCR筛选混合克隆

实验方法：通过PCR方法筛选混合克隆，具体流程如下：

(1)PCR筛选混合克隆引物设计策略：

详见图9。

(2)PCR筛选引物序列如下所示：

(3)PCR反应体系如下所示：

Reaction component	Volume(μL)	Final concentration
			ddH2O	19	—
2×KOD FX buffer	10	1×
			2mM dNTPs	4	0.4mM each
10μM Primer-F	0.6	0.3μM
			10μM Primer-R	0.6	0.3μM
DMSO	1	5％
			1U/μL KOD FX DNA polymerase	0.4	0.02U/μL
Template DNA	1.5	5-10*ng/μL

(4)PCR反应条件如下所示：

Enzyme:KOD-FX

Program:Touchdown PCR

实验结果：(1)应用引物UCP1-L-GT-F/WPRE-120R筛选永生化棕色脂肪细胞混合克隆的结果见图10。

(2)应用引物tdTomato-2371F/UCP1-R-GT-R筛选永生化棕色脂肪细胞混合克隆的结果见图11。

4、PCR筛选阳性克隆

实验方法：通过Junction PCR进行长片段检测，鉴定正确重组。具体流程如下：

(1)Junction PCR引物设计策略：

详见图12。

(2)Junction PCR引物序列如下所示：

(3)Junction PCR反应体系如下所示：

(4)Junction PCR反应条件如下所示：

Enzyme:KOD-FX

Program:Touchdown PCR

实验结果：(1)应用引物UCP1-L-GT-F/WPRE-R2进行Junction PCR的结果如图13、图14所示。

(2)应用引物WPRE-F2/UCP1-R-GT-R进行Junction PCR的结果如图15所示。

(3)应用引物UCP1-MSD-F2/UCP1-MSD-R2进行Junction PCR的结果如图16、图17所示。

(4)经过PCR和测序筛选得到的4个永生化棕色脂肪细胞阳性克隆，如图18所示。

实施例4、抗肥胖药物高通量筛选模型的构建及应用

肥胖是由体内过剩的能量在白色脂肪组织(white adipose tissue，WAT)中过度堆积所引发的慢性代谢性疾病。它是影响很多疾病的重大风险因素，如心血管疾病、糖尿病、高血脂和肿瘤等。增加锻炼，控制饮食等非药物治疗肥胖的方法往往依从性较差，而减肥药治疗则通过抑制食欲或肠道脂类吸收达到限制能量摄入进而减肥的目的，长期应用会出现抑郁、脂肪泻等副作用。因此，寻找安全有效的减肥药是目前治疗肥胖症，进而减少代谢性疾病及其并发症的重中之重。

国外研究表明，有功能的棕色脂肪组织(brown adipose tissue，BAT)在成人中的发现及其产热功能的确认将人们的视线重新转向具有强大燃烧脂肪、抵抗肥胖的棕色脂肪，其产热功能源于富含大量线粒体且特异性高表达线粒体膜蛋白—UCP1。白色脂肪作为储存热量的脂肪，在特定条件下也可向棕色脂肪转化，具有棕色脂肪样的产热功能，即“白色脂肪棕色化(Browning)”，这是近年来肥胖研究中提出的新概念。Kajimura教授认为，只要寻找到增加脂肪组织中UCP1的药物，将会是增加全身产热和能量消耗的安全途径，从而达到减少体内脂肪、抵抗肥胖的目的。鉴于目前尚无商业化的产热激动剂体内外筛选模型，构建产热功能调节靶点激动剂的高通量筛选模型对于寻找肥胖症治疗药物具有非常重要的意义，为肥胖症等代谢性疾病的治疗提供帮助。

1、诱导分化对抗肥胖药物高通量筛选模型的影响

实验方法：将阳性克隆1-H6种于96孔板中，进行诱导分化，Day6时用荧光素酶报告基因试剂盒检测诱导分化的脂肪细胞和未诱导分化的前脂肪细胞Luciferase活性。

实验结果：诱导分化后，1-H6的Luciferase活性明显高于前脂肪细胞，如图19所示。为了提高抗肥胖药物高通量筛选模型的敏感性，确定采用诱导分化后的阳性克隆进行抗肥胖药物高通量筛选工作。

2、Luciferase和tdTomato的活性检测

实验方法：将阳性克隆1-H6种于96孔板中，进行诱导分化，Day6加阳性药CL316,243诱导，24h后分别采用报告基因和高内涵方法检测Luciferase和tdTomato的活性。

实验结果：阳性药CL316,243诱导后，Luciferase和tdTomato的活性与正常对照组相比均有明显升高，如图20所示，证明抗肥胖药物高通量筛选模型建立成功，能够用于产热功能调节靶点激动剂的高通量筛选工作。

3、阳性药有效作用浓度和有效作用时间的确定

实验方法：将阳性克隆1-H6种于96孔板中，进行诱导分化，Day6分别加阳性药CL316,243(β3受体激动剂)以及阳性药异丙肾上腺素(β受体激动剂)进行诱导，分别于24h和48h后检测Luciferase活性。

实验结果：CL316,243有效作用浓度为10μmol/L，有效作用时间为24h和48h。异丙肾上腺素有效作用浓度为1μmol/L和3μmol/L，有效作用时间为24h和48h。如图21所示。CL316,243和异丙肾上腺素均可作为抗肥胖药物高通量筛选模型的阳性药使用。

序列表

<110> 中国医学科学院药物研究所

<120> 抗肥胖药物靶点UCP1的基因工程细胞株和高通量药物筛选模型的建立及应用

<160> 35

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 1

gcatcaagct tggtaccgat gcaatctggg cttaacgggt 40

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 2

acttaatcgt ggaggatgat cagagcccct aaaagcagga 40

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 3

agatatcatc accttcccgc tgg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 4

ggaaggtgat gatatctgcc agg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 5

cggactttgg cagtgtccag cgg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 6

tgccaggcaa gctgaaactc cgg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 7

agccggagtt tcagcttgcc tgg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 8

gctgaagaac cgctgttgat ggg 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 9

aggacaccat tgccttatga agg 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 10

cgccaggcct gtaaactctg agg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 11

ccgtgcccca aatcaaagaa agg 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 12

caatggtgtc ctgagcatgt ggg 23

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 13

ggatatcatc accttcccgc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 14

ggaaggtgat gatatctgcc 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 15

ggcggacttt ggcagtgtcc ag 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 16

ggtgccaggc aagctgaaac tc 22

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 17

ggagccggag tttcagcttg cc 22

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 18

ggctgaagaa ccgctgttga t 21

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 19

ggacaccatt gccttatga 19

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 20

ggccaggcct gtaaactctg 20

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 21

ggtgccccaa atcaaagaa 19

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 22

ggcaatggtg tcctgagcat gt 22

<210> 23

<211> 8467

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 23

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg gatatcatca ccttcccgcg ttttagagct agaaatagca agttaaaata 300

aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt tgtttttagc 360

gcgtgcgcca attctgcaga caaatggctc tagaggtacc cgttacataa cttacggtaa 420

atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata gtaacgccaa 480

tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 540

tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 600

ccgcctggca ttgtgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 660

acgtattagt catcgctatt accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc 720

ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg 780

cagcgatggg ggcggggggg gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg 840

ggcggggcgg ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa 900

agtttccttt tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc 960

gggcgggagt cgctgcgacg ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc 1020

cgcccgcccc ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct 1080

tctcctccgg gctgtaatta gctgagcaag aggtaagggt ttaagggatg gttggttggt 1140

ggggtattaa tgtttaatta cctggagcac ctgcctgaaa tcactttttt tcaggttgga 1200

ccggtgccac catggactat aaggaccacg acggagacta caaggatcat gatattgatt 1260

acaaagacga tgacgataag atggccccaa agaagaagcg gaaggtcggt atccacggag 1320

tcccagcagc cgacaagaag tacagcatcg gcctggacat cggcaccaac tctgtgggct 1380

gggccgtgat caccgacgag tacaaggtgc ccagcaagaa attcaaggtg ctgggcaaca 1440

ccgaccggca cagcatcaag aagaacctga tcggagccct gctgttcgac agcggcgaaa 1500

cagccgaggc cacccggctg aagagaaccg ccagaagaag atacaccaga cggaagaacc 1560

ggatctgcta tctgcaagag atcttcagca acgagatggc caaggtggac gacagcttct 1620

tccacagact ggaagagtcc ttcctggtgg aagaggataa gaagcacgag cggcacccca 1680

tcttcggcaa catcgtggac gaggtggcct accacgagaa gtaccccacc atctaccacc 1740

tgagaaagaa actggtggac agcaccgaca aggccgacct gcggctgatc tatctggccc 1800

tggcccacat gatcaagttc cggggccact tcctgatcga gggcgacctg aaccccgaca 1860

acagcgacgt ggacaagctg ttcatccagc tggtgcagac ctacaaccag ctgttcgagg 1920

aaaaccccat caacgccagc ggcgtggacg ccaaggccat cctgtctgcc agactgagca 1980

agagcagacg gctggaaaat ctgatcgccc agctgcccgg cgagaagaag aatggcctgt 2040

tcggaaacct gattgccctg agcctgggcc tgacccccaa cttcaagagc aacttcgacc 2100

tggccgagga tgccaaactg cagctgagca aggacaccta cgacgacgac ctggacaacc 2160

tgctggccca gatcggcgac cagtacgccg acctgtttct ggccgccaag aacctgtccg 2220

acgccatcct gctgagcgac atcctgagag tgaacaccga gatcaccaag gcccccctga 2280

gcgcctctat gatcaagaga tacgacgagc accaccagga cctgaccctg ctgaaagctc 2340

tcgtgcggca gcagctgcct gagaagtaca aagagatttt cttcgaccag agcaagaacg 2400

gctacgccgg ctacattgac ggcggagcca gccaggaaga gttctacaag ttcatcaagc 2460

ccatcctgga aaagatggac ggcaccgagg aactgctcgt gaagctgaac agagaggacc 2520

tgctgcggaa gcagcggacc ttcgacaacg gcagcatccc ccaccagatc cacctgggag 2580

agctgcacgc cattctgcgg cggcaggaag atttttaccc attcctgaag gacaaccggg 2640

aaaagatcga gaagatcctg accttccgca tcccctacta cgtgggccct ctggccaggg 2700

gaaacagcag attcgcctgg atgaccagaa agagcgagga aaccatcacc ccctggaact 2760

tcgaggaagt ggtggacaag ggcgcttccg cccagagctt catcgagcgg atgaccaact 2820

tcgataagaa cctgcccaac gagaaggtgc tgcccaagca cagcctgctg tacgagtact 2880

tcaccgtgta taacgagctg accaaagtga aatacgtgac cgagggaatg agaaagcccg 2940

ccttcctgag cggcgagcag aaaaaggcca tcgtggacct gctgttcaag accaaccgga 3000

aagtgaccgt gaagcagctg aaagaggact acttcaagaa aatcgagtgc ttcgactccg 3060

tggaaatctc cggcgtggaa gatcggttca acgcctccct gggcacatac cacgatctgc 3120

tgaaaattat caaggacaag gacttcctgg acaatgagga aaacgaggac attctggaag 3180

atatcgtgct gaccctgaca ctgtttgagg acagagagat gatcgaggaa cggctgaaaa 3240

cctatgccca cctgttcgac gacaaagtga tgaagcagct gaagcggcgg agatacaccg 3300

gctggggcag gctgagccgg aagctgatca acggcatccg ggacaagcag tccggcaaga 3360

caatcctgga tttcctgaag tccgacggct tcgccaacag aaacttcatg cagctgatcc 3420

acgacgacag cctgaccttt aaagaggaca tccagaaagc ccaggtgtcc ggccagggcg 3480

atagcctgca cgagcacatt gccaatctgg ccggcagccc cgccattaag aagggcatcc 3540

tgcagacagt gaaggtggtg gacgagctcg tgaaagtgat gggccggcac aagcccgaga 3600

acatcgtgat cgaaatggcc agagagaacc agaccaccca gaagggacag aagaacagcc 3660

gcgagagaat gaagcggatc gaagagggca tcaaagagct gggcagccag atcctgaaag 3720

aacaccccgt ggaaaacacc cagctgcaga acgagaagct gtacctgtac tacctgcaga 3780

atgggcggga tatgtacgtg gaccaggaac tggacatcaa ccggctgtcc gactacgatg 3840

tggaccatat cgtgcctcag agctttctga aggacgactc catcgacaac aaggtgctga 3900

ccagaagcga caagaaccgg ggcaagagcg acaacgtgcc ctccgaagag gtcgtgaaga 3960

agatgaagaa ctactggcgg cagctgctga acgccaagct gattacccag agaaagttcg 4020

acaatctgac caaggccgag agaggcggcc tgagcgaact ggataaggcc ggcttcatca 4080

agagacagct ggtggaaacc cggcagatca caaagcacgt ggcacagatc ctggactccc 4140

ggatgaacac taagtacgac gagaatgaca agctgatccg ggaagtgaaa gtgatcaccc 4200

tgaagtccaa gctggtgtcc gatttccgga aggatttcca gttttacaaa gtgcgcgaga 4260

tcaacaacta ccaccacgcc cacgacgcct acctgaacgc cgtcgtggga accgccctga 4320

tcaaaaagta ccctaagctg gaaagcgagt tcgtgtacgg cgactacaag gtgtacgacg 4380

tgcggaagat gatcgccaag agcgagcagg aaatcggcaa ggctaccgcc aagtacttct 4440

tctacagcaa catcatgaac tttttcaaga ccgagattac cctggccaac ggcgagatcc 4500

ggaagcggcc tctgatcgag acaaacggcg aaaccgggga gatcgtgtgg gataagggcc 4560

gggattttgc caccgtgcgg aaagtgctga gcatgcccca agtgaatatc gtgaaaaaga 4620

ccgaggtgca gacaggcggc ttcagcaaag agtctatcct gcccaagagg aacagcgata 4680

agctgatcgc cagaaagaag gactgggacc ctaagaagta cggcggcttc gacagcccca 4740

ccgtggccta ttctgtgctg gtggtggcca aagtggaaaa gggcaagtcc aagaaactga 4800

agagtgtgaa agagctgctg gggatcacca tcatggaaag aagcagcttc gagaagaatc 4860

ccatcgactt tctggaagcc aagggctaca aagaagtgaa aaaggacctg atcatcaagc 4920

tgcctaagta ctccctgttc gagctggaaa acggccggaa gagaatgctg gcctctgccg 4980

gcgaactgca gaagggaaac gaactggccc tgccctccaa atatgtgaac ttcctgtacc 5040

tggccagcca ctatgagaag ctgaagggct cccccgagga taatgagcag aaacagctgt 5100

ttgtggaaca gcacaagcac tacctggacg agatcatcga gcagatcagc gagttctcca 5160

agagagtgat cctggccgac gctaatctgg acaaagtgct gtccgcctac aacaagcacc 5220

gggataagcc catcagagag caggccgaga atatcatcca cctgtttacc ctgaccaatc 5280

tgggagcccc tgccgccttc aagtactttg acaccaccat cgaccggaag aggtacacca 5340

gcaccaaaga ggtgctggac gccaccctga tccaccagag catcaccggc ctgtacgaga 5400

cacggatcga cctgtctcag ctgggaggcg acaaaaggcc ggcggccacg aaaaaggccg 5460

gccaggcaaa aaagaaaaag taagaattcc tagagctcgc tgatcagcct cgactgtgcc 5520

ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg 5580

tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag 5640

gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga 5700

gaatagcagg catgctgggg agcggccgca ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc 5760

ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg 5820

ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg ggcgcctgat 5880

gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgtc aaagcaacca 5940

tagtacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg 6000

accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc 6060

gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga 6120

tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt tgggtgatgg ttcacgtagt 6180

gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat 6240

agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcgggcta ttcttttgat 6300

ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa 6360

tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt tatggtgcac tctcagtaca 6420

atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg 6480

ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg 6540

agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc 6600

gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt 6660

ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca 6720

aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg 6780

aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc 6840

cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg 6900

ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt 6960

cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta 7020

ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat 7080

gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga 7140

gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca 7200

acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact 7260

cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc 7320

acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact 7380

ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt 7440

ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt 7500

ggaagccgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt 7560

atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata 7620

ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag 7680

attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 7740

ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 7800

aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 7860

aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 7920

ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg 7980

tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 8040

ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 8100

cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 8160

agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 8220

gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 8280

ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 8340

tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 8400

tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 8460

cacatgt 8467

<210> 24

<211> 8468

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 24

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg gctgaagaac cgctgttgat gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 300

aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttgtttttag 360

cgcgtgcgcc aattctgcag acaaatggct ctagaggtac ccgttacata acttacggta 420

aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat agtaacgcca 480

atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca 540

gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg 600

cccgcctggc attgtgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc 660

tacgtattag tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc 720

cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt 780

gcagcgatgg gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag 840

gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga 900

aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg 960

cgggcgggag tcgctgcgac gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg 1020

ccgcccgccc cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc 1080

ttctcctccg ggctgtaatt agctgagcaa gaggtaaggg tttaagggat ggttggttgg 1140

tggggtatta atgtttaatt acctggagca cctgcctgaa atcacttttt ttcaggttgg 1200

accggtgcca ccatggacta taaggaccac gacggagact acaaggatca tgatattgat 1260

tacaaagacg atgacgataa gatggcccca aagaagaagc ggaaggtcgg tatccacgga 1320

gtcccagcag ccgacaagaa gtacagcatc ggcctggaca tcggcaccaa ctctgtgggc 1380

tgggccgtga tcaccgacga gtacaaggtg cccagcaaga aattcaaggt gctgggcaac 1440

accgaccggc acagcatcaa gaagaacctg atcggagccc tgctgttcga cagcggcgaa 1500

acagccgagg ccacccggct gaagagaacc gccagaagaa gatacaccag acggaagaac 1560

cggatctgct atctgcaaga gatcttcagc aacgagatgg ccaaggtgga cgacagcttc 1620

ttccacagac tggaagagtc cttcctggtg gaagaggata agaagcacga gcggcacccc 1680

atcttcggca acatcgtgga cgaggtggcc taccacgaga agtaccccac catctaccac 1740

ctgagaaaga aactggtgga cagcaccgac aaggccgacc tgcggctgat ctatctggcc 1800

ctggcccaca tgatcaagtt ccggggccac ttcctgatcg agggcgacct gaaccccgac 1860

aacagcgacg tggacaagct gttcatccag ctggtgcaga cctacaacca gctgttcgag 1920

gaaaacccca tcaacgccag cggcgtggac gccaaggcca tcctgtctgc cagactgagc 1980

aagagcagac ggctggaaaa tctgatcgcc cagctgcccg gcgagaagaa gaatggcctg 2040

ttcggaaacc tgattgccct gagcctgggc ctgaccccca acttcaagag caacttcgac 2100

ctggccgagg atgccaaact gcagctgagc aaggacacct acgacgacga cctggacaac 2160

ctgctggccc agatcggcga ccagtacgcc gacctgtttc tggccgccaa gaacctgtcc 2220

gacgccatcc tgctgagcga catcctgaga gtgaacaccg agatcaccaa ggcccccctg 2280

agcgcctcta tgatcaagag atacgacgag caccaccagg acctgaccct gctgaaagct 2340

ctcgtgcggc agcagctgcc tgagaagtac aaagagattt tcttcgacca gagcaagaac 2400

ggctacgccg gctacattga cggcggagcc agccaggaag agttctacaa gttcatcaag 2460

cccatcctgg aaaagatgga cggcaccgag gaactgctcg tgaagctgaa cagagaggac 2520

ctgctgcgga agcagcggac cttcgacaac ggcagcatcc cccaccagat ccacctggga 2580

gagctgcacg ccattctgcg gcggcaggaa gatttttacc cattcctgaa ggacaaccgg 2640

gaaaagatcg agaagatcct gaccttccgc atcccctact acgtgggccc tctggccagg 2700

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ggctggggca ggctgagccg gaagctgatc aacggcatcc gggacaagca gtccggcaag 3360

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cacgacgaca gcctgacctt taaagaggac atccagaaag cccaggtgtc cggccagggc 3480

gatagcctgc acgagcacat tgccaatctg gccggcagcc ccgccattaa gaagggcatc 3540

ctgcagacag tgaaggtggt ggacgagctc gtgaaagtga tgggccggca caagcccgag 3600

aacatcgtga tcgaaatggc cagagagaac cagaccaccc agaagggaca gaagaacagc 3660

cgcgagagaa tgaagcggat cgaagagggc atcaaagagc tgggcagcca gatcctgaaa 3720

gaacaccccg tggaaaacac ccagctgcag aacgagaagc tgtacctgta ctacctgcag 3780

aatgggcggg atatgtacgt ggaccaggaa ctggacatca accggctgtc cgactacgat 3840

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gacaatctga ccaaggccga gagaggcggc ctgagcgaac tggataaggc cggcttcatc 4080

aagagacagc tggtggaaac ccggcagatc acaaagcacg tggcacagat cctggactcc 4140

cggatgaaca ctaagtacga cgagaatgac aagctgatcc gggaagtgaa agtgatcacc 4200

ctgaagtcca agctggtgtc cgatttccgg aaggatttcc agttttacaa agtgcgcgag 4260

atcaacaact accaccacgc ccacgacgcc tacctgaacg ccgtcgtggg aaccgccctg 4320

atcaaaaagt accctaagct ggaaagcgag ttcgtgtacg gcgactacaa ggtgtacgac 4380

gtgcggaaga tgatcgccaa gagcgagcag gaaatcggca aggctaccgc caagtacttc 4440

ttctacagca acatcatgaa ctttttcaag accgagatta ccctggccaa cggcgagatc 4500

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<212> DNA

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<212> DNA

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ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 9780

aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 9840

ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 9900

aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 9960

gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 10020

tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 10080

tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 10140

gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 10200

cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 10260

cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 10320

agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 10380

caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 10440

ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc 10500

aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag 10560

tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc 10620

agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac 10680

gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc 10740

accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg 10800

tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag 10860

tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc 10920

acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac 10980

atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag 11040

aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac 11100

tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg 11160

agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc 11220

gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact 11280

ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg 11340

atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa 11400

tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt 11460

tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg 11520

tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga 11580

cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc 11640

ctttcgtc 11648

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 28

ctgtttgggg gtttattcta gcctc 25

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 29

acgggaagca atagcatgat ac 22

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 30

ccaccacctg ttcctgtacg 20

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 31

tgaacccaag gccaagtgtt ctac 24

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 32

ctgtttgggg gtttattcta gcctc 25

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 33

atccaggtgg caacacaggc 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 34

tgcactgtgt ttgctgacgc 20

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 35

tgaacccaag gccaagtgtt ctac 24

Claims

1.一种利用CRISPR-Cas9系统构建UCP1启动子区域敲入荧光素酶luciferase和红色荧光蛋白tdTomato稳转细胞株的方法，其特征在于，所述方法为：(1)确定打靶策略，在分析靶基因UCP1基因结构后，设计在UCP1基因N端ATG之后敲入luciferase-T2A-tdTomato-WPRE-pA-loxP-Neo-loxP,替换exon1和部分intron1；(2)靶序列的测序确认，设计靶位点测序引物，对靶细胞系的靶位点序列进行PCR扩增并测序验证，以保证sgRNA识别序列与靶细胞系DNA序列完全一致；(3)Cas9/sgRNA设计，基于sgRNA的设计原则，在5’端和3’端靶位点区域各设计5条sgRNA；(4)Cas9/sgRNA质粒的构建，按照已设计sgRNA序列合成相应引物，通过Gibson Assembly的方式连入pCS-3G载体，连接产物转化后送样测序验证正确；(5)Cas9/sgRNA的活性检测，综合考虑活性、特异性因素选择UCP1-sgRNA1和UCP1-sgRNA6进行下一步实验；(6)重组外源基因载体构建，合成LR-A片段，设计引物克隆RR片段，并将LR-A片段及RR片段与载体LScKO-4G连接为重组外源基因载体UCP1-LScKO-4G-Neo-LR-A-RR，经过酶切鉴定和测序，确认重组外源基因载体构建完成；(7)阳性克隆筛选，UCP1-sgRNA1、UCP1-sgRNA6和重组外源基因载体转染靶细胞系，经过G418药物抗性筛选、细胞富集、PCR筛选，得到阳性克隆。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶细胞系为永生化棕色脂肪细胞系。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源基因为luciferase-T2A-tdTomato-WPRE-pA基因。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶标基因为UCP1基因。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶位点测序引物序列如SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2所示。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，sgRNA对应的靶向序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，UCP1-sgRNA1序列如SEQ ID NO.13所示、UCP1-sgRNA2序列如SEQ ID NO.14所示、UCP1-sgRNA3序列如SEQ ID NO.15所示、UCP1-sgRNA4序列如SEQ ID NO.16所示、UCP1-sgRNA5序列如SEQ ID NO.17所示、UCP1-sgRNA6序列如SEQ ID NO.18所示、UCP1-sgRNA7序列如SEQ ID NO.19所示、UCP1-sgRNA8序列如SEQID NO.20所示、UCP1-sgRNA9序列如SEQ ID NO.21所示、UCP1-sgRNA10序列如SEQ ID NO.22所示。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，Cas9/sgRNA质粒载体为pCS-3G载体。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，选择使用的sgRNA为UCP1-sgRNA1和UCP1-sgRNA6，序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.18所示，pCS-sgRNA1与pCS-sgRNA6核苷酸序列如SEQ ID NO.23与SEQ ID NO.24所示。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，重组外源基因的质粒载体为LScKO-4G。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，外源基因RR片段的克隆引物序列如SEQ IDNO.25与SEQ ID NO.26所示，重组外源基因载体核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，限制性酶切分析所用的限制性核酸内切酶分别为Scal、Smal、Sall、EcoRV或Ncol。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，筛选混合克隆PCR引物UCP1-L-GT-F序列如SEQ ID NO.28所示、WPRE-120R序列如SEQ ID NO.29所示、tdTomato-2371F序列如SEQ IDNO.30所示、UCP1-R-GT-R序列如SEQ ID NO.31所示。

14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，Junction PCR引物UCP1-L-GT-F序列如SEQID NO.32所示、WPRE-R2序列如SEQ ID NO.33所示、WPRE-F2序列如SEQ ID NO.34所示、UCP1-R-GT-R序列如SEQ ID NO.35所示。

15.一种抗肥胖药物高通量筛选模型的建立及应用方法，其特征在于，所述方法为：采用权利要求1-14所述的构建方法构建的UCP1启动子区域插入luciferase和tdTomato的稳转棕色脂肪细胞株，对其进行诱导分化，加阳性药刺激，确定有效作用浓度和有效作用时间，检测luciferase和tdTomato的活性。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，使用CL316,243和异丙肾上腺素作为阳性药，CL316,243有效作用浓度为10μmol/L，异丙肾上腺素有效作用浓度为1μmol/L和3μmol/L，有效作用时间为24h或48h。

17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，检测luciferase和tdTomato活性的方法采用报告基因和高内涵方法。

18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所构建的抗肥胖药物高通量筛选模型用于促进产热、降低体重的抗肥胖药物的筛选、抗肥胖药物的评价、机体抗肥胖活性物质的评价以及UCP1检测试剂盒的开发。