CN111072680B - 二氢卟吩衍生物及其铁螯合物及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及二氢卟吩衍生物及其铁螯合物及其制备与应用。具体地，本发明公开了式(II)所示的二氢卟吩衍生物铁螯合物；本发明还公开了如式(I)所示的二氢卟吩衍生物或如式(II’)所示的二氢卟吩衍生物铁螯合物的分离制备方法，式中各基团定义详见说明书。本发明的制备方法可以获得纯度高、活性好的化合物。
Description
技术领域
本发明属于植物生长调节领域，具体地，涉及二氢卟吩衍生物及其铁螯合物及其制备与应用。
背景技术
植物生长过程中，微量生理活性物质与阳光、温度、水分等营养物质一样对植物的生长起着重要的作用，这些微量活性物，对调节植物的生长发育有着特殊的作用。各种内源微量活性物质常称之为植物激素，例如生长素、赤霉素、细胞分裂素等，而非内源性的外加活性物质则称之为植物生长调节剂。目前应用的植物生长调节剂多数为人工合成化合物，近年逐步发现部分产品对土壤和植物乃至食物链存在不同程度的不利影响。
因此，寻找自然源植物生长调节剂成为研究的重要方向，利用天然资源制备植物生长调节剂对于发展绿色农药、保护环境、实现农业可持续发展具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供二氢卟吩衍生物及其铁螯合物的制备方法。为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明第一方面提供了一种如式(II)所示的二氢卟吩衍生物铁螯合物，
式(II)中，Y和Z共同构成-C(＝O)OCH2-；X为氯离子、硫酸根离子、亚硫酸根离子、硝酸根离子、磷酸根离子、氢氧根离子、甲酸根离子、乙酸根离子或三氟乙酸根离子。
在另一优选中，所述式(II)所示的二氢卟吩衍生物铁螯合物为式C化合物；
式C：
本发明第二方面提供了式(II’)所示的二氢卟吩衍生物铁螯合物的制备方法，
式(II’)中，
Y为CH2COOH和Z为COOH；或者Y和Z共同构成-C(＝O)OCH2-；
X为氯离子、硫酸根离子、亚硫酸根离子、硝酸根离子、磷酸根离子、氢氧根离子、甲酸根离子、乙酸根离子或三氟乙酸根离子；
所述方法包括步骤：
(1)粗提：将蚕砂在乙醇中提取，收集提取液；然后将提取液pH调节至10～11后进行皂化反应；皂化反应结束后，除去非皂化物；收集下层皂化液并将其pH调节至3-5(优选4)后与三氯化铁进行配合反应，从而得到蚕砂提取物母药；
(2)初步分离：对步骤(1)得到的蚕砂提取物母药与有机溶剂混合，然后过滤，浓缩滤液，得到单体粗品；
(3)进一步分离：对步骤(2)得到的单体粗品通过如下反相制备HPLC方法进行分离，从而得到式(II’)所示的二氢卟吩衍生物铁螯合物；
所述反相制备HPLC方法为方法1或方法2：
方法1包括如下条件：
流动相A：水(0.05％氨水，v/v)
流动相B：乙腈
梯度：在0-30分钟内，流动相B的含量首先从10％上升至80％，然后再上升至90％；
流速：15mL/min；
方法2包括如下条件：
流动相A：水(0.1％甲酸，v/v)
流动相B：乙腈
梯度：在0-30分钟内，流动相B的含量首先从10％上升至80％，然后再上升至90％；
流速：15mL/min。
在另一优选例中，步骤(3)中，方法1的梯度如下：
0-28分钟，流动相B的含量为10％；
28-30分钟，流动相B的含量为80％；
30分钟后，流动相B的含量为90％。
在另一优选例中，步骤(3)中，方法2的梯度如下：
0-28分钟，流动相B的含量为10％；
28-30分钟，流动相B的含量为80％；
30分钟后，流动相B的含量为90％。
在另一优选中，所述式(II’)所示的二氢卟吩衍生物铁螯合物为式C化合物或式E化合物；
式C：
式E：
在另一优选例中，步骤(3)中，通过方法1进行分离时，收集保留时间为23.40±0.4min的制备液，从而得到式C化合物。
在另一优选例中，步骤(3)中，通过方法2进行分离时，收集保留时间为16.27±0.4min的制备液，从而得到式E化合物。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述提取的温度为60±10℃。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述配合反应的温度为60±10℃。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述配合反应的时间为1-6小时
在另一优选例中，步骤(1)中，所述配合反应结束后，还包括除去乙醇、水洗和干燥的步骤。
在另一优选例中，步骤(1)中，皂化反应结束后，用石油醚除去非皂化物
在另一优选例中，步骤(2)中，所述有机溶剂为甲醇、丙酮、乙醇、乙腈中的一种或多种。
在另一优选例中，步骤(2)中，当式(II’)所示的二氢卟吩衍生物铁螯合物为式C化合物时，所述有机溶剂为丙酮。
在另一优选例中，步骤(2)中，当式(II’)所示的二氢卟吩衍生物铁螯合物为式C化合物时，步骤(1)得到的蚕砂提取物母药与有机溶剂的质量体积比为1:(10～20)(g/mL)；优选1:15(g/mL)。
在另一优选例中，步骤(2)中，当式(II’)所示的二氢卟吩衍生物铁螯合物为式E化合物时，所述有机溶剂为甲醇。
在另一优选例中，步骤(2)中，当式(II’)所示的二氢卟吩衍生物铁螯合物为式E化合物时，步骤(1’)得到的蚕砂提取物母药与有机溶剂的质量体积比为1：20-40(g/mL)；较佳地为1:30(g/mL)。
在另一优选例中，步骤(2)中，在浓缩滤液之后还包括硅胶法分离步骤：对滤液浓缩之后得到的残留物通过硅胶色谱法进行分离，洗脱剂为石油醚和丙酮，石油醚和丙酮的体积比为5/1～1/1，从而得到单体粗品。
本发明第三方面提供了如式(I)所示的二氢卟吩衍生物的制备方法，
式(I)中，Y为H或CH2COOH；Z为COOH；或Y和Z共同构成-C(＝O)OCH2-或-C(＝O)OCH(OH)-；
所述方法包括步骤：
(1’)粗提：将蚕砂在乙醇中提取，收集提取液；然后将提取液pH调节至10～11后进行皂化反应；皂化反应结束后，除去非皂化物；收集下层皂化液并将其pH调节至3-5(优选4)后与三氯化铁进行配合反应；从而得到蚕砂提取物母药；
(2’)初步分离：对步骤(1’)得到的蚕砂提取物母药与有机溶剂混合，然后过滤，浓缩滤液，得到单体粗品；
(3’)进一步分离：对步骤(2’)得到的单体粗品通过如下反相制备HPLC方法进行分离，从而得到式(I)所示的二氢卟吩衍生物；
所述反相制备HPLC方法为方法1’或方法2’：
方法1’：
流动相A：水(0.05％氨水，v/v)
流动相B：乙腈
梯度：在0-30分钟内，流动相B的含量首先从10％上升至80％，然后再上升至90％；
流速：15mL/min；
方法2’：
流动相A：水(0.1％甲酸，v/v)
流动相B：乙腈
梯度：在0-30分钟内，流动相B的含量首先从10％上升至80％，然后再上升至90％；
流速：15mL/min。
在另一优选例中，步骤(3’)中，方法1’的梯度如下：
0-28分钟，流动相B的含量为10％；
28-30分钟，流动相B的含量为80％；
30分钟后，流动相B的含量为90％。
在另一优选例中，步骤(3’)中，方法2’的梯度如下：
0-28分钟，流动相B的含量为10％；
28-30分钟，流动相B的含量为80％；
30分钟后，流动相B的含量为90％。
在另一优选例中，式(I)所示的二氢卟吩衍生物为式A化合物、式B化合物、式D化合物或式G化合物；
式A:
式B:
式G：
式D：
在另一优选例中，步骤(3’)中，通过方法1’进行分离时，收集保留时间为12.05±0.4min的制备液，从而得到式A化合物。
在另一优选例中，步骤(3’)中，通过方法1’进行分离时，收集保留时间为9.18±0.4min的制备液，从而得到式B化合物。
在另一优选例中，步骤(3’)中，通过方法1’进行分离时，收集保留时间为18.92±0.4min的制备液，从而得到式G化合物。
在另一优选例中，步骤(3’)中，通过方法2’进行分离时，收集保留时间为20.67±0.4min的制备液，从而得到式D化合物。
在另一优选例中，步骤(1’)中，所述提取的温度为60±10℃。
在另一优选例中，步骤(1’)中，所述配合反应的温度为60±10℃。
在另一优选例中，步骤(1’)中，所述配合反应的时间为1-6小时
在另一优选例中，步骤(1’)中，所述配合反应结束后，还包括除去乙醇、水洗和干燥的步骤。
在另一优选例中，步骤(1’)中，皂化反应结束后，用石油醚除去非皂化物
在另一优选例中，步骤(2’)中，所述有机溶剂为甲醇、丙酮、乙醇、乙腈中的一种或多种。
在另一优选例中，步骤(2’)中，当式(I)所示的二氢卟吩衍生物为式A化合物时，所述有机溶剂为甲醇。
在另一优选例中，步骤(2’)中，当式(I)所示的二氢卟吩衍生物为式A化合物时，步骤(1’)得到的蚕砂提取物母药与有机溶剂的质量体积比为1：(7-9)(g/mL)；较佳地为6:50(g/mL)。
在另一优选例中，步骤(2’)中，当式(I)所示的二氢卟吩衍生物为式B化合物时，所述有机溶剂为甲醇。
在另一优选例中，步骤(2’)中，当式(I)所示的二氢卟吩衍生物为式B化合物时，步骤(1’)得到的蚕砂提取物母药与有机溶剂的质量体积比为1：(7-9)(g/mL)；较佳地为6:50(g/mL)。
在另一优选例中，步骤(2’)中，当式(I)所示的二氢卟吩衍生物为式G化合物时，所述有机溶剂为甲醇。
在另一优选例中，步骤(2’)中，当式(I)所示的二氢卟吩衍生物为式G化合物时，步骤(1’)得到的蚕砂提取物母药与有机溶剂的质量体积比为1：(14-18)(g/mL)；较佳地为6：100(g/mL)。
在另一优选例中，步骤(2’)中，当式(I)所示的二氢卟吩衍生物为式D化合物时，所述有机溶剂为甲醇。
在另一优选例中，步骤(2’)中，当式(I)所示的二氢卟吩衍生物为式D化合物时，步骤(1’)得到的蚕砂提取物母药与有机溶剂的质量体积比为1：20-40(g/mL)；较佳地为1:30(g/mL)。
在另一优选例中，步骤(2’)中，在浓缩滤液之后还包括硅胶法分离步骤：对滤液浓缩之后得到的残留物通过硅胶色谱法进行分离，洗脱剂为石油醚和丙酮，石油醚和丙酮的体积比为5/1～1/1，从而得到单体粗品。
在另一优选例中，在硅胶法分离步骤中，收集Rf值为0.6或保留时间为19.73±0.4min的馏分，从而得到单体A的粗品。
在另一优选例中，在硅胶法分离步骤中，收集Rf值为0.45或保留时间为11.30±0.4min的馏分，从而得到单体B的粗品。
在另一优选例中，在硅胶法分离步骤中，收集Rf值为0.5或保留时间为12.70±0.4min的馏分，从而得到单体G的粗品。
本发明第四方面提供了式(II)所示的二氢卟吩衍生物铁螯合物的用途，用作植物生长调节剂或用于制备用于调节植物生长的农用组合物；
式(II)中，Y和Z共同构成-C(＝O)OCH2-；X为氯离子、硫酸根离子、亚硫酸根离子、硝酸根离子、磷酸根离子、氢氧根离子、甲酸根离子、乙酸根离子或三氟乙酸根离子。
在另一优选中，所述式(II)所示的二氢卟吩衍生物铁螯合物为式C化合物；
式C：
在另一优选例中，所述植物生长包括植物根生长、植物茎生长、植物叶生长、植物花生长、植物果生长或植物种子萌发。
在另一优选例中，所述植物生长为植物种子萌发。
在另一优选例中，所述调节为促进。
在另一优选例中，所述植物为农作物。
在另一优选例中，所述农作物包括粮食作物、蔬菜作物等，例如为小麦、水稻、玉米、大豆或生菜。
在另一优选例中，所述式(II)所示的二氢卟吩衍生物铁螯合物的施加浓度为0.001ppm～10ppm；较佳地为0.02ppm～2ppm。
本发明的主要优点包括：
提供了一种结构新颖的式(II)所示二氢卟吩衍生物铁螯合物。
提供了从蚕砂中分离制备式(I)所示二氢卟吩衍生物或式(II’)所示二氢卟吩衍生物铁螯合物的方法。
提供了一种结构新颖的二氢卟吩衍生物铁螯合物及其在植物生长调节中的用途。
本发明中，用于植物生长调节中的二氢卟吩衍生物或其铁螯合物分离自蚕砂，来源天然且有效剂量低、用量少，因而更安全、更环保。另外，也提高了蚕砂的利用率，更有利于环境保护。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1：单体A的粗品纯度分析图。
图2：单体A的纯品纯度分析图。
图3：单体B的粗品纯度分析图。
图4：单体B的纯品纯度分析图。
图5：单体G的粗品纯度分析图。
图6：单体G的纯品纯度分析图。
图7：包含单体D和单体E的提取物粗品的纯度分析图。
图8：单体D的纯品纯度分析图。
图9：单体E的纯品纯度分析图。
图10：单体C的纯品纯度分析图。
具体实施方式
本发明人通过深入研究，从蚕砂中提取出了一系列具有优异植物生长调节作用的二氢卟吩衍生物及其铁螯合物，为植物生长调节领域提供了更广泛的应用，也进一步提高了蚕砂的利用率。
本发明的可用于调节植物生长的活性成分可以是如式(I)所示的二氢卟吩衍生物和/或如式(II’)所示的二氢卟吩衍生物铁螯合物和/或如式(II)所示的二氢卟吩衍生物铁螯合物。
在一优选例中，本发明所述的活性成分可以是单独的一种式(I)所示的二氢卟吩衍生物，也可以是多种式(I)所示的二氢卟吩衍生物的混合物。
在一优选例中，本发明所述的活性成分可以是单独的一种式(II’)所示的二氢卟吩衍生物的铁螯合物，也可以是多种式(II’)所示的二氢卟吩衍生物的铁螯合物的混合物。
在一优选例中，本发明所述的活性成分可以是一种或多种式(I)所示的二氢卟吩衍生物与一种或多种式(II’)所示的二氢卟吩衍生物铁螯合物的混合物。
本发明所述式(II)所示的二氢卟吩衍生物铁螯合物含有两个或两个以上的手性中心。因而该式(II)所示的二氢卟吩衍生物铁螯合物还包含其立体异构体(例如对映异构体或非对映异构体)或立体异构体的混合物(例如外消旋体或非对映异构体混合物或对映异构体和非对映异构体的混合物)。同理，本发明所述的式(II’)所示的二氢卟吩衍生物铁螯合物也包含其立体异构体(例如对映异构体或非对映异构体)或立体异构体的混合物(例如外消旋体或非对映异构体混合物或对映异构体和非对映异构体的混合物)。本发明所述的式(I)所示的二氢卟吩衍生物也包含其立体异构体(例如对映异构体或非对映异构体)或立体异构体的混合物(例如外消旋体或非对映异构体混合物或对映异构体和非对映异构体的混合物)。式(II)或式(II’)所示的二氢卟吩衍生物铁螯合物或式(I)所示的二氢卟吩衍生物的对映异构体或非对映异构体或这些立体异构体的混合物均在本发明的保护范围之内。
据此，本发明提供了一种用于调节植物生长的农用组合物。
本发明的农用组合物包含如上所述的活性成分以及农药学上可接受的载体或赋形剂。所述活性成分占所述农药组合物总重量的0.001％-99.999％，较佳地，0.01％-99.99％，更佳地，0.1-99.9％，更佳地，1％-99％或10％-90％。
本发明的农用组合物还可以包含另外的植物生长调节剂。所述的另外的植物生长调节剂可以是市售可得的或目前已经公开的植物生长调节剂中的一种或多种。例如，任何一种结构已知的二氢卟吩类化合物或它们的铁螯合物。
本发明的农用组合物可以被加工成生产为在实际应用中允许的农药剂型，例如乳油、悬浮剂、微乳剂、悬乳剂、拌种剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
本发明所述的农药学上可接受的载体或赋形剂本身不是必要的活性成分，且与活性成分成剂型后对活性成分的功效没有影响，并且在施药后对植物安全。所述的农药学上可接受的载体或赋形剂包括分散剂、润湿剂、乳化剂、防冻剂、增稠剂、消泡剂、防腐剂、稳定剂、染色剂、填料和溶剂等。
所述的分散剂可选自木质素磺酸盐、烷基酚聚氧乙烯醚、萘磺酸甲醛缩合物钠盐、脂肪胺聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯酯、甘油脂肪酸酯聚氧乙烯醚、聚羧酸盐、甲醛缩合物、烷基苯磺酸钙盐或烷基酚聚氧乙烯醚中的一种或几种。
所述的润湿剂选自十二烷基硫酸钠、烷基萘磺酸盐、拉开粉BX、聚氧乙烯醚、EO/PO嵌段聚醚、脂肪醇聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸盐、烷基磷酸钠、烷基萘磺酸盐或烷基酚聚氧乙烯基硫酸钠中的一种或几种。
所述的乳化剂选自十二烷基苯磺酸盐、烷基萘磺酸盐、烷基磺酸盐、烷基酚聚氧乙烯醚、苄基酚聚氧乙烯、苯乙基酚聚氧乙烯醚或脂肪胺聚氧乙烯醚中的一种或几种。
所述的增稠剂选自黄原胶、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基淀粉、甲基纤维素、硅酸镁铝或聚乙烯醇中的一种或几种。
所述的防冻剂选自乙二醇、丙二醇或丙三醇中的一种或几种。
所述的消泡剂选自硅油、硅酮类化合物、磷酸三丁酯、C10～20饱和脂肪酸类化合物或聚醚类消泡剂中的一种或几种。
所述的防腐剂选自甲醛、水杨酸苯酯、对羟基苯甲酸丁酯或山梨酸钾。
所述的稳定剂选自亚磷酸三苯酯、环氧氯苯烷、环氧大豆油或硅酸镁铝。
所述的染色剂选自偶氮颜料、氧化钛或氧化铁。
所述的填料选自高岭土、硅藻土、膨润土、白炭黑、凹凸棒土、淀粉、改性淀粉或轻质碳酸钙中的一种或多种。
所述的溶剂选自水(蒸馏水或去离子水)、乙醇、丙酮、环己酮、二甲基酰胺、二甲基亚砜、植物油及其改性植物油中的一种或几种。
本发明还提供了一种植物生长调节方法，所述方法包括步骤：给对有需要调节生长的植物或该植物生长的环境施加本发明的活性成分或本发明的农用组合物，从而调节该植物的生长。
本发明所述的有需要调节生长的植物可以是任何一种植物，例如，大豆、玉米、水稻、小麦等农作物。
本发明所述的植物生长的环境包括水环境或土壤环境。
本发明所述的植物生长调节方法中，可以在施加本发明活性成分或本发明农用组合物的之前或同时或之后施加另外的植物生长调节剂。所述的另外的植物生长调节剂可以是市售可得的或目前已经公开的植物生长调节剂中的一种或多种。例如，任何一种结构已知的二氢卟吩类化合物或它们的铁螯合物。
本发明所述的植物生长调节方法中，在施加本发明的活性成分或本发明农用组合物之前，可以将该活性成分或农药组合物配制成浓度为0.001ppm～10ppm(优选，0.01～5ppm或0.01～2ppm)的溶液。
本发明所述的植物生长调节方法中，本发明的活性成分或本发明农用组合物的施加方法可以按照通常的植物生长调节剂的用法使用，例如，配制成水溶液进行浸种、喷洒、灌溉等本领域常用的方法使用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
NMR仪器：Bruker AVANCE III 400MHzUltraShield-PlusTMDigital NMRSpectrometer；NMR溶剂：DMSO。
纯度分析方法为酸性方法或碱性方法。
酸性方法：
仪器：AgilentLCMS
色谱柱：AgilentC18
流动相A：水(0.1％TFA，v/v)
流动相B：乙腈
梯度：
时间(min) A％ B％
0.00 90 0
10.00 20 100
流速：1mL/min；
检测波长：254nm，220nm，ELSD
碱性方法：
仪器：WatersLC串联QDaMs；
色谱柱：WatersXBridgeC18,150×4.6mm,3.5μm
流动相：A：水(0.05％氨水，v/v)
流动相B：乙腈
梯度：
流速：1mL/min；
检测波长：392nm
实施例1蚕砂提取物-母药F的制备
100.0g蚕砂为原料，加乙醇600ml水浴回流提取2h，提取温度60℃。然后将提取液减压浓缩至原体积1/3，加入质量分数10％氢氧化钠调节pH至10～11进行皂化反应。使用石油醚进行萃取除杂，除去非皂化物，收集下层皂化液，加入质量分数5％盐酸调节pH至4，加入三氯化铁10g，加热60℃反应3小时，反应完成后抽去乙醇，剩余物经过水洗，干燥研磨后得母药F，2.5g，得率约2.5％。
接下来，对实施例1制得的母药F进行了分离纯化，分别制得了单体A、单体B、单体C、单体D、单体G、单体E。
实施例2蚕砂提取物-单体A的制备
单体A：
步骤1：初步分离
将实施例1制得的母药F 6.0g加入50mL甲醇中,超声5min，过滤，保留滤液。在40℃下将滤液减压浓缩，得3.5g提取物。用硅胶色谱法纯化(石油醚/丙酮：5/1～1/1)，收集(TLC丙酮/石油醚1/1Rf值为0.6)馏分，得160mg单体A的粗品，其保留时间19.73min，纯度65％，如图1所示。
步骤2：进一步分离
将上述单体A的粗品进行反相制备HPLC分离方法来纯化。发明人尝试了多种分离方法(例如30-90碱性方法和10-80碱性方法)，最终选取了如下所述的10-80碱性方法。
采用30-90碱性方法，杂质峰拖尾延伸到单体A的主峰中心，单体A与杂质无法有效切分。
30-90碱性方法条件如下：
仪器：Waters LC串联QDa Ms
色谱柱：Waters XBridge C18,150×19mm,5μm
流动相A：水(0.05％氨水，v/v)
流动相B：乙腈
梯度：
时间(min) A％ B％
0.00 40 30
30.00 10 90
流速：15mL/min；
检测波长：392nm
而采用10-80碱性方法，单体A的主峰虽未与杂质基线分离，但杂质无前沿峰，通过提高阈值可以将杂质峰切掉。
10-80碱性方法条件如下：
仪器：Waters LC串联QDa Ms
色谱柱：Waters XBridge C18,150×19mm,5μm
流动相A：水(0.05％氨水，v/v)
流动相B：乙腈
梯度：
流速：15mL/min；
检测波长：392nm
最终收集保留时间为12.05min组分的制备液，将制备液浓缩冻干后，得到3mg产品，经质谱和NMR分析确定该产品为单体A，纯度为97.39％，如图2所示。1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.39(s,1H),9.20(s,1H),8.92(s,1H),7.98(dd,J1＝17.6Hz,J2＝11.6Hz,1H),6.77(dd,J1＝36.8Hz,J2＝14.8Hz,2H),6.23(d,J＝17.6Hz,1H),5.05(d,J＝11.6Hz,1H),4.56(q,J＝7.2Hz,1H),4.38(d,J＝10.0Hz,1H),3.61(s,3H),3.43-3.37(m,2H),3.34(s,3H),2.95(s,3H),2.69-2.60(m,1H),2.35-2.28(m,1H),2.24-2.21(m,1H),1.76-1.60(m,4H),1.46(t,J＝7.6Hz,3H).ESI-MS：m/z＝551.2([M+H]+),m/z＝573.2([M+Na]+)。
实施例3蚕砂提取物-单体B的制备
单体B：
步骤1：初步分离
将实施例1制得的母药F 6.0g加入50mL甲醇中,超声5min，过滤，保留滤液。在40℃下将滤液减压浓缩，得3.5g提取物。用硅胶色谱法纯化(石油醚/丙酮：5/1～1/1)，收集(TLC丙酮/石油醚1/1Rf值为0.45)馏分，得90mg单体B的粗品，其保留时间11.30min，纯度32％，如图3。
步骤2：进一步分离
将上述单体B的粗品进行反相制备HPLC分离方法来纯化。发明人尝试了多种分离方法(例如60-90碱性方法、10-30碱性方法和10-80碱性方法)，最终选取了如上所述的10-80碱性方法。
采用60-90碱性方法，单体B的峰与其他成分的峰重叠，且峰形过宽(大于5min)。
60-90碱性方法条件如下：
仪器：Waters LC串联QDa Ms
色谱柱：Waters XBridge C18,150×19mm,5μm
流动相A：水(0.05％氨水，v/v)
流动相B：乙腈
梯度：
流速：15mL/min；
检测波长：392nm
采用10-30碱性方法，单体B的峰与其他成分的峰没有完全基线分离。
10-30碱性方法条件如下：
仪器：Waters LC串联QDa Ms
色谱柱：Waters XBridge C18,150×19mm,5μm
流动相A：水(0.05％氨水，v/v)
流动相B：乙腈
梯度：
流速：15mL/min；
检测波长：392nm
而采用10-80碱性方法(方法同实施例2)，其他成分的峰与单体B的基线几乎完全分离。最终收集保留时间为9.18min的制备液，将制备液浓缩冻干后，得到2.5mg产品，经质谱和NMR分析确定该产品为单体B，纯度为95.57％，如图4所示。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.16(brs,2H),9.80(s,0.5H),9.75(s,0.5H),9.54(s,0.5H),9.46(s,0.5H),9.05(s,0.5H),8.96(s,0.5H),8.43(s,1H),8.24-8.14(m,1H),8.05-7.95(m,1H),6.38(d,J＝14.4Hz,1H),6.17(d,J＝9.2Hz,1H),4.78-4.69(m,0.5H),4.67-4.57(m,1H),4.55-4.46(m,0.5H),3.81(s,1.5H),3.77(s,1.5H),3.73-3.63(m,2H),3.44(s,3H),3.17(s,3H),2.80-2.60(m,1H),2.49-2.37(m,1H),2.25-2.02(m,1H),2.00-1.88(m,1H),1.68(d,J＝4.8Hz,3H),1.60(t,J＝6.0Hz,3H).ESI-MS：m/z＝567.4([M+H]+),m/z＝549.4([M-OH]+)。
实施例4蚕砂提取物-单体G的制备
单体G：
步骤1：初步分离
将实施例1制得的母药F 6.0g加入100mL甲醇中,超声5min，过滤，保留滤液。在40℃下将滤液减压浓缩，得3.5g提取物。用硅胶色谱法纯化(石油醚/丙酮：5/1～1/1)，收集(TLC丙酮/石油醚1/1Rf值为0.5)馏分，得145mg单体G的粗品。其保留时间12.70min，纯度72％，纯度如图5。
步骤2：进一步分离
将上述单体G的粗品进行反相制备HPLC分离方法来纯化。发明人尝试了多种分离方法(例如60-90碱性方法、10-30碱性方法和10-80碱性方法)，最终选取了如上所述的10-80碱性方法。
采用60-90碱性方法(方法同实施例3)，单体G的出峰时间靠后，与其他成分基线未分离。
采用10-30碱性方法(方法同实施例3)，单体G的主峰与其他成分的峰重叠面积较大，无法用提高阈值的方法切纯。
而采用10-80碱性方法(方法同实施例2)，单体G与其他成分的基线分离。最终收集保留时间为18.92min的制备液，将制备液浓缩冻干后，得到5mg产品，经质谱和NMR分析确定该产品为单体G，纯度为99％，如图6所示。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.88(s,1H),9.81(s,1H),9.68(s,1H),9.03(s,1H),8.28(dd,J1＝14.0Hz,J2＝9.2Hz,1H),6.42(d,J＝14.0Hz,1H),6.18(d,J＝9.2Hz,1H),4.62-4.60(m,1H),4.48-4.46(m,1H),3.80(s,3H),3.79-3.67(m,2H),3.49(s,3H),3.27(s,3H),2.70-2.60(m,2H),2.55-2.35(m,1H),2.23-2.12(m,1H),1.87(d,J＝5.6Hz,3H),1.65(t,J＝6.0Hz,3H),-1.97(brs,2H).ESI-MS：m/z＝539.3([M+H]+)。
实施例5蚕砂提取物-单体C的制备
单体C：
步骤1：初步分离
将2g实施例1制得的母药F在30mL丙酮中室温搅拌过夜，过滤，滤液浓缩得850mg提取物。
步骤2：进一步分离
将上述提取物进行反相制备HPLC分离方法来纯化。发明人尝试了多种分离方法(例如10-80酸性方法和10-80碱性方法)，最终选取了如下所述的10-80酸性方法。
采用10-80酸性方法，单体C与其他成分相互重叠，且峰形较宽，难以分纯。
10-80酸性方法条件如下：
仪器：Waters LC串联QDa Ms
色谱柱：Waters XBridge C18,150×19mm,5μm
流动相A：水(0.1％甲酸，v/v)
流动相B：乙腈
梯度：
流速：15mL/min；
检测波长：392nm
采用10-80碱性方法(方法同实施例2)，单体C比较孤立，与其他主要成分完全分离，通过提高阈值的方法切除小杂质。最终收集保留时间为23.40min的制备液，将制备液浓缩冻干后，得到4mg产品。经质谱和NMR分析确定该产品为单体C，纯度为93％(如图10所示)，ESI-MS：m/z＝604.1([M+H]+)。
实施例6蚕砂提取物-单体D和单体E的制备
取1g实施例1制备得到的母药F，用30mL甲醇室温搅拌30min提取，过滤，母液浓缩得600mg提取物粗品。该粗品的纯度分析图如图7所示。
采用10-80酸性方法(方法同实施例5)对上述提取物粗品进行分离。
收集20.67min组分得到单体D 3mg，纯度91％(如图8)；ESI-MS：m/z＝597.5([M+H]+)，m/z＝553.4([M+H-CO2]+)。
收集16.27min组分得到单体E 3mg，纯度98％(如图9)；ESI-MS：m/z＝650.4([M+H]+)。
实施例7玉米种子萌发实验
1.试验药剂及其配制方法：
采用上述实施例制备的单体C：
单体C：
称取10毫克单体C，放入10毫升容量瓶中用DMSO溶解，待完全溶解后定容。从定容后的单体溶液中，取出1毫升，放入50毫升容量瓶中，混匀后定容。
取三个100毫升烧杯分别加蒸馏水90毫升。从定容的50毫升定容瓶中取10毫升，加入到第一个烧杯中，混匀；然后从第一个烧杯中取出10毫升溶液，加入到第二个烧杯中，混匀；然后从第二个烧杯中取出10毫升溶液加入到第三个烧杯中，混匀，即分别配制好单体C的三个浓度梯度(2ppm、0.2ppm、0.02ppm)的溶液。
2.实验设计与处理
在实验室内，采用同一品种玉米(花糯)，进行种子萌发实验。挑选籽粒大小均匀的玉米种子，将种子置于质量分数29％的双氧水中浸泡5分钟，杀菌消毒，然后将其放于烧杯中用蒸馏水浸种8小时，每组50粒种子。用单体C分别用0.02ppm，0.2ppm，2ppm三个浓度对种子进行处理，对照组清水(CK)处理，每个处理对应放入10毫升溶液。每个浓度重复3次，将处理后的种子均匀置于放有2层滤纸的培养皿中(9cm×1.5cm)中，种子之间保持一定距离，将培养皿放入恒温箱中25℃保温催芽处理，期间定时加入蒸馏水保持滤纸湿润。
3.调查内容及方法
3.1萌发标准：采用目测，以胚芽长度约至种子长的1/2为发芽标准，处理48小时后统计各培养皿中的种子发芽率。
3.2计算方法：
萌发率计算：
4.实验结果与分析
实验结果如下表所示。
从上表结果可以看出，与清水对照组比较，单体C在各个浓度上对玉米的萌发率基本上均大于清水对照。可见，本发明分离制备的二氢卟吩衍生物或其铁螯合物具有优异的植物生长促进作用，尤其是在较低浓度下可以发挥更好的功效，更有利于减少活性成分的用量，在植物代谢和环境保护方面具有突出的效果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (4)
1.一种如式(II)所示的二氢卟吩衍生物铁螯合物，
式(II)中，Y和Z共同构成-C(＝O)OCH2-；X为氯离子。
2.式(II’)所示的二氢卟吩衍生物铁螯合物的制备方法，其特征在于，
式(II’)中，
Y和Z共同构成-C(＝O)OCH2-；
X为氯离子；
所述方法包括步骤：
(1)粗提：将蚕砂在乙醇中提取，收集提取液；然后将提取液pH调节至10～11后进行皂化反应；皂化反应结束后，除去非皂化物；收集下层皂化液并将其pH调节至3-5后与三氯化铁进行配合反应，从而得到蚕砂提取物母药；
(2)初步分离：对步骤(1)得到的蚕砂提取物母药与有机溶剂混合，然后过滤，浓缩滤液，得到单体粗品；
(3)进一步分离：对步骤(2)得到的单体粗品通过如下反相制备HPLC方法进行分离，从而得到式(II’)所示的二氢卟吩衍生物铁螯合物；
所述反相制备HPLC方法为方法1：
方法1包括如下条件：
流动相A：含有体积百分数为0.05％氨水的水；
流动相B：乙腈；
梯度：在0-30分钟内，流动相B的含量首先从10％上升至80％，然后再上升至90％；
流速：15mL/min。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，
方法1的梯度如下：
0-28分钟，流动相B的含量为10％；
28-30分钟，流动相B的含量为80％；
30分钟后，流动相B的含量为90％。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
步骤(3)中，通过方法1进行分离时，收集保留时间为23.40±0.4min的制备液，从而得到式C化合物；
式C：
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