CN111067896A - Ampk激动剂a769662在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用 - Google Patents

Ampk激动剂a769662在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用 Download PDF

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方剑玉
李海利
郭小参
王克领
郎利敏
朱文豪
许峰
王治方
张青娴
张立宪
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Abstract

本发明属于医药应用领域，具体涉及AMPK激动剂A769662在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用。本发明发现AMPK激动剂A769662能够有效抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的复制，可以显著减轻临床症状，降低发病率和死亡率，减少猪只组织的病毒载量，为后续研发治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物奠定基础。

Description

AMPK激动剂A769662在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征药物中 的应用
技术领域
本发明属于医药应用领域，具体涉及AMPK激动剂A769662在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的接触性传染病，该病毒属于单股正链有囊膜的RNA病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属。基因组全长15.4 kb，包括10个开放性阅读框（ORFs）。PRRSV主要感染猪体内的猪肺泡巨噬细胞，主要临床症状为妊娠母猪怀孕后期流产，产死胎、弱胎、木乃伊胎等，并可引起仔猪、育肥猪等各个年龄段猪的呼吸道症状，病猪死亡率升高。目前该病已成为危害世界养猪业的重要疫病之一，给我国养猪业也带来了重大的经济损失。该病首次于1987年在美国出现，迅速在全球蔓延，由于不同PRRSV毒株之间易发生重组、变异，因此，目前我国猪群呈现多个毒株并存现象，PRRSV流行毒株复杂多变，目前的疫苗均无法提供有效的免疫保护，而且目前也没有很好的抗病毒药物。因此，研究PRRSV的复制机制，明确病毒复制与宿主免疫系统和能量代谢之间的关系，寻找新的抗病毒药物作用靶点，探索新的病毒防控策略至关重要。
AMPK即AMP依赖的蛋白激酶（Adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activatedprotein kinase，AMPK），是生物能量代谢途径的关键分子，尤其是脂质代谢，AMP：ATP比例上调可激活AMPK信号通路，抑制消耗ATP的合成代谢。AMPK是异源三聚体蛋白，由α（63KD）、β（30KD）、γ（37-63KD）3个亚单位组成。α亚单位起催化作用，而β和γ在维持三聚体稳定性和作用底物特异性方面起重要作用。AMPK可通过调控细胞内脂质合成分解代谢酶活性调节胆固醇、脂肪酸等的合成。
AMPK激动剂A769662是一种有效的AMPK激活剂，在原代大鼠肝细胞中，可以抑制脂肪酸的合成；在小鼠中，AMPK激动剂A769662以30mg/kg的剂量给药可以减少FAS、G6Pase和PEPCK的表达，降低40%的血浆葡萄糖水平，减少体重的增加。但目前未发现AMPK激动剂A769662在治疗猪繁殖与呼吸综合征方面具有什么效果，因此本发明拟研究AMPK在PRRSV复制中的作用，明确PRRSV激活AMPK的信号通路，阐明AMPK影响PRRSV复制的机制，发现细胞内新的药物靶点，为开发抗PRRSV新药，寻找更有效的防控策略奠定基础。
发明内容
针对目前的疫苗对PRRSV还无法产生有效的免疫保护，且没有很好的抗PRRSV病毒药物的缺陷和问题，本发明发现AMPK激动剂A769662具有抗PRRSV病毒复制的作用，并提供一种AMPK激动剂A769662在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征药物中的新用途。
本发明解决其技术问题所采用的方案是： AMPK激动剂A769662在制备用于治疗猪繁殖与呼吸障碍综合征的药物中的应用。
上述的AMPK激动剂A769662在制备用于治疗猪繁殖与呼吸障碍综合征的药物中的应用，所述用于治疗猪繁殖与呼吸障碍综合征药物是以AMPK激动剂A769662为原料药，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药物制剂。
上述的AMPK激动剂A769662在制备用于治疗猪繁殖与呼吸障碍综合征的药物中的应用，所述药物制剂为口服制剂或注射剂。
上述的AMPK激动剂A769662在制备用于治疗猪繁殖与呼吸障碍综合征的药物中的应用，所述口服制剂中AMPK激动剂A769662的含量为5-8mg/kg。
上述的AMPK激动剂A769662在制备用于治疗猪繁殖与呼吸障碍综合征的药物中的应用，所述注射剂中AMPK激动剂A769662的含量为0.01mg/mL。
本发明的有益效果：本发明制备的药物经体外细胞毒性实验，验证对macr-145细胞无明显的毒副作用，具有良好的抑制PRRSV复制的作用；对靶动物进行攻毒实验，证明在猪体内连续用药1周后攻毒，可显著减轻其临床症状，降低其发病率和死亡率，提高猪只保护率,可减少其组织中的病毒载量；为后续研发治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物奠定基础。
附图说明
图1为AMPK激动剂对Marc-145细胞毒性实验结果。
图2为AMPK抑制剂对Marc-145细胞毒性实验结果。
图3为三种激动剂对PRRSV的复制效果图。
图4为AMPK激动剂A769662以剂量依赖关系抑制PRRSV复制结果。
图5为AMPK激动剂A769662对PRRSV吸附的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
实施例1：本实施例提供AMPK激动剂A769662的应用，主要是用于制备含有AMPK激动剂A769662的治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物，该药物为口服液，是将AMPK激动剂A769662溶解于无菌水中，加入红糖、葡萄糖或其他药学上可接受的辅料制成口服液，每千克口服液中含有5-8mg的AMPK激动剂A769662。
使用方法：按照口服液：饮用水为1:1000的比例兑水，给猪饮用。
实施例2：本实施例提供一种含有AMPK激动剂A769662的治疗猪繁殖与呼吸综合征的粉剂，将AMPK激动剂A769662按照常规方法加入辅料（淀粉、糊精等）制成粉剂，每千克粉剂中含有5-8mg的AMPK激动剂A769662。
使用方法：按照粉剂：饲料为1:1000的比例混匀，给猪喂食。
实施例3：本实施例提供一种以AMPK激动剂A769662无菌粉为原药，用1-2.5ml注射用无菌水或无菌生理盐水溶解稀释后制成注射液，每支注射剂中含有0.01-0.025mg的AMPK激动剂A769662。
使用方法：腹腔注射，每日一支。
实施例4：AMPK激动剂和抑制剂的体外试验
一、AMPK激动剂和抑制剂对Marc-145细胞的毒性试验
1、细胞、毒株和试剂
Marc-145细胞由本实验保存；PRRSV Hn07-1毒株由河南农业科学院免疫学重点实验室分离保存； AMPK-P、β-ACTIN抗体购自Cell Signaling Technology生物公司，PRRSV N单抗由河南农业科学院免疫学重点实验室制备；NC膜购自PALL生物公司，ECL显色液购自北京索莱宝生物工程有限公司；激动剂Compound C、Metformin、A769662均购自selleck生物公司，AICAR购自碧云天生物技术工程公司；CellTiter96@AQueous one solution cellproliferation assay 购自Promega生物公司。
2、AMPK激动剂和抑制对Marc-145细胞的毒性试验
将Marc-145细胞接种96孔板，待长成单层后，加入使用浓度的AMPK激动剂AICAR、Metformin、A769662和使用浓度抑制剂Compound C；24 h后，将20μL的CellTiter 96®AQueous 单溶液试剂直接加入到96细胞板培养孔中，孵育1-4小时；在96孔板读板仪上记录490nm的吸光率，结果见图1和图2。
由图1和图2结果可以看出，AMPK激动剂和抑制剂对Marc-145无明显细胞毒性。
二、AMPK激动剂对PRRSV复制效果影响
将Marc-145细胞铺12孔板，待长成单层后，分别加入AICAR（1mM）、A769662(100μM)、Metformin(10mM)三种激动剂，作用1 h后接种MOI=1 PRRSV Hn07-1毒株，将培养板放入37℃培养，1 h后更换含有三种激动的2％DMEM细胞维持液，培养24 h后，收集细胞采用western-blot和荧光定量PCR方法检测激动对PRRSV病毒的复制情况，结果如图3所示。由图3可以看出，AMPK激动剂A769662对PRRSV的复制具有显著的抑制效果。
三、剂量依赖关系验证
进一步检测AMPK激动剂A769662对PRRSV的复制是否具有剂量依赖关系，待Marc-145细胞长成单层后，接种不同剂量的A769662，作用1 h后，集中PRRSV Hn07-1毒株（MOI=1），1 h后更换含有激动剂的2％的DMEM细胞维持液，24 h收集细胞，分别采用western-blot和荧光定量PCR的方法进行检测，结果如图4所示。由图4可以看出，A769662激动剂抑制病毒复制呈剂量依赖关系。
四、AMPK激动剂A769662对PRRSV吸附的影响
将Marc-145细胞铺24孔板，每孔5×105个细胞，待细胞长成单层，加入AMPK激动剂A769662，同时设置空白对照；感染1 h后加入PRRSV BB0907病毒液（MOI=1），4℃培养1 h，使病毒吸附不入胞，用PBS缓冲液清洗细胞单层三次；收集细胞，提取RNA，采用荧光定量PCR方法检测A769662对病毒吸附的影响，结果见图5。由图5可知，AMPK激动剂A769662对PRRSV吸附无影响。
实施例5：AMPK激动剂A769662的靶动物疗效试验
由于猪呼吸繁殖障碍综合征病毒不断发生变异和基因重组，目前市场并没有效果较好的疫苗或抗病毒药物，在实施例4中已经证明AMPK激动剂A769662在体外实验中具有较好的抗病毒效果，为了验证本发明药物的临床试验疗效，本实施例以杜长大仔猪作为试验动物进行了靶动物疗效试验，进一步考察药物的疗效和毒副作用。
一、试验动物、试验分组及处理
试验猪选用200头断奶仔猪，由河南某原种猪场提供，仔猪品种为杜长大猪，断奶日龄为出生25d-35d(平均30d)，猪只健康状况良好。
将体重相近、健康仔猪20头（公母各半），按照性别、体重、窝别对等分配原则随机分为4组：试验组（A组、B组、C组）和D组（空白对照组），每组5头。其中试验组（A组、B组、C组）于平均31日龄开始，分别以实施例1、实施例2和实施例3制得的药物给药；空白对照组（D组）不添加任何药物。连续用药一周，于平均日龄37d时进行PRRSV攻毒，试验分组及处理详见表1。
Figure 394523DEST_PATH_IMAGE001
试验猪管理：试验猪于哺乳期（22d）进行公猪去势，平均日龄30d时断奶，转栏（由产仔房转入保育舍），分组；整个试验期猪只在保育舍饲养，保育舍采用高床全漏粪网床养殖模式，每栏养殖6～7头。试验猪同一单元饲养，同一饲养员管理，各种饲养管理条件和环境相同；各种操作按照常规进行：上午和下午各清圈1次，保持猪舍干燥卫生、空气清新、环境温湿度适宜；试验猪自由采食，自由饮水，试验组与对照组饲料配方相同，40 d更换保育猪后期料。
二、攻毒效果检测
平均日龄37d对试验组和对照组仔猪进行PRRSV攻毒实验，攻毒后观察实验猪发病情况，包括体表外观、呼吸、体温和体重情况，记录发病和死亡数量。根据农业部公布的发病标准，判定攻毒猪是否发病。标准为：临床症状，连续3日体温在41℃以上，精神食欲下降，出现眼结膜炎，气喘等呼吸道症状；病理变化：剖检观察，猪肺组织呈红褐色花斑状，淋巴结肿大，肺泡隔增宽；抗原检测，检测肺脏、脾脏和淋巴结，能检测到大量的抗原；攻毒结果见表2。
Figure 908681DEST_PATH_IMAGE002
采集实验猪的血液、肺脏、脾脏、淋巴结，用RT-PCR方法检测脏器组织中PRRSV。
结果：A组血液、肺脏和脾脏中无病毒核酸检出，淋巴结仍有存在；B血液、肺脏和脾脏中无病毒核酸检出，淋巴结仍有存在；C组血液、肺脏、脾脏和淋巴结中均未检出；D组血液、肺脏、脾脏和淋巴结中均存在核酸。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不限制本发明，凡在本发明的精神和原则范围内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种AMPK激动剂A769662在制备用于治疗猪繁殖与呼吸障碍综合征的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述用于治疗猪繁殖与呼吸障碍综合征药物是以AMPK激动剂A769662为原料药，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药物制剂。
3.根据权利要求2所述的应用，所述药物制剂为口服制剂或注射剂。
4.根据权利要求3所述的应用，所述口服制剂中AMPK激动剂A769662的含量为5-8mg/kg。
5.根据权利要求3所述的应用，所述注射剂中AMPK激动剂A769662的含量为0.01mg/mL。
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