一种同时检测多种添加剂含量的方法
技术领域
本申请涉及化学成分检测技术领域,具体而言,涉及一种同时检测多种添加剂含量的方法。
背景技术
甜味是哺乳动物最喜爱的味道之一,甜味剂能掩盖饲料原有的不良味道、改善畜禽味觉、促进饲料的消化吸收和利用、提高采食量和饮水量。目前许多试验表明,甜味剂应用于猪饲料中效果最明显,尤其是仔猪。因为仔猪断奶后健康生长的关键是有规律的采食增加。而良好的采食模式可减缓断奶后来自新环境、新次序和日粮的综合应激。仔猪可用天然甜味剂作调味剂,也可用糖精等人工合成甜味剂。现代畜牧业生产为了降低饲料成本,配合饲料中除了谷物类饲料外,还使用许多廉价适口性差的原料,如使用低价的能量或蛋白质饲料(如棉籽饼、菜籽饼、玉米胚芽饼等)、农副产品下脚料、食品轻工业的副产物、新开发的原料(如混合油、动物副产品)等,还添加了工业合成原料如维生素、无机盐、矿物质元素及各种药物等多种添加剂。这样就改变了谷物饲料的天然口味,有时还会有异味产生,从而影响了饲料的适口性。添加饲料用香味剂可掩盖饲料中不良气味。防腐剂是一类能抑制微生物活动,防止食品腐败变质的食品及饲料添加剂,但是对防腐剂的使用应当控制在合理的范围内,过量添加防腐剂会带来相应的副作用。抗氧化剂则是添加在油脂、食品、饲料等产品当中以防止其氧化的添加剂,但是过量添加抗氧化剂也会带来不利营养。因此,饲料中防腐剂和抗氧化剂在适当的浓度时可以达到最大的使用效果,过量添加会造成浪费和产生不利影响,因此应当将饲料中防腐剂和抗氧化剂含量控制在一个合理的范围内,这就对防腐剂及抗氧化剂的含量的检测提出了更高的要求。
目前对甜味剂、香味剂、防腐剂及抗氧化剂的检测方法是单独各种组分单独进行检测,例如,GB5009.28-2016《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》、GB/T 17814-2011《饲料中丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、乙氧喹和没食子酸丙酯》、NY/T 3136-2017《饲用调味剂中香兰素、乙基香兰素、肉桂醛、桃醛、乙酸异戊酯、γ-壬内酯、肉桂酸甲酯、大茴香脑的测定气相色谱法》、。而且原有检测苯甲酸、山梨酸和糖精钠的方法使用水提取待测物中的目标组分,在提取后还需要进行蛋白质沉淀的步骤,增加了操作的复杂性,同时也增加了操作时间,造成试剂的浪费。原有检测2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、没食子酸丙酯(PG)的方法使用乙腈提取,无法检测难溶于乙腈的苯甲酸及山梨酸。另外,为了实现对不同防腐剂和不同抗氧化剂进行检测,需要采用不同的检测系统。因此目前的检测方法不仅费时、费力、费试剂,增加了对环境的污染和检测的成本,而且无法对某些常见的抗氧化剂或防腐剂比如羟基苯甲酸甲酯进行检测。
发明内容
本申请实施例的目的在于提供一种同时检测多种添加剂含量的方法,能够同时检测多种香味剂、甜味剂、抗氧化剂及防腐剂,以提高检测的效率,节约试剂及时间成本。
第一方面,本申请实施例提供了一种同时检测多种添加剂含量的方法,其包括以下步骤:
将待测组分的标准品用盐酸甲醇水溶液配制混合标准溶液,待测组分包括香味剂、甜味剂、抗氧化剂及防腐剂;将待测样品用盐酸甲醇水溶液配制成待测溶液;
通过液相色谱法对混合标准溶液进行检测,绘制每种待测组分的浓度与峰面积之间的标准曲线;通过液相色谱法对待测溶液进行检测,得到每种待测组分的测定峰面积;
将每种待测组分的测定峰面积与对应的标准曲线进行比较,计算得到待测样品中每种待测组分的含量;
液相色谱法中,流动相A为醋酸-三乙胺水溶液,其中醋酸的质量浓度为0.3%-0.4%,三乙胺的质量浓度为0.05%-0.1%,流动相B为甲醇丙酮混合液,甲醇和丙酮的体积比例为1.5:1-2:1;采用梯度洗脱。
在上述的技术方案中,采用盐酸甲醇水溶液配制混合标准溶液或待测溶液能够将待测组分几乎全部提取出来并溶入溶液中。采用醋酸-三乙胺水溶液为水相,醋酸和三乙胺均为溶液,容易配制成流动相A,且无需调节pH,而采用甲醇丙酮混合液作为有机相流动相,与单纯的使用甲醇或者乙腈作为流动相相比,甲醇和丙酮两相混合结合缓冲溶液可以提供更为丰富的极性选择,能够提高各个组分的选择性。而且采用本申请同种液相色谱系统能够同时对不同待测组分进行检测,无需切换液相色谱系统。因此,本申请的检测方法能够同时检测多种香味剂、甜味剂、抗氧化剂及防腐剂,以提高检测的效率,节约试剂及时间成本。
可选的,待测组分包括丁基羟基茴香醚、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、叔丁基对苯二酚、没食子酸丙酯、山梨酸/山梨酸钾、苯甲酸/苯甲酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、乙氧基喹啉、糖精钠、乙基香兰素和苯乙酸甲酯。
在上述技术方案中,采用本申请的检测方法能够实现同时对待测样品中常规的抗氧化剂:丁基羟基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、没食子酸丙酯(PG)、乙氧基喹啉(EQ);常规的防腐剂:山梨酸/山梨酸钾、苯甲酸/苯甲酸钠、对羟基苯甲酸甲酯;甜味剂:糖精钠;香味剂:乙基香兰素、苯乙酸甲酯的含量测定,检测效率高。
可选的,盐酸甲醇水溶液中甲醇的质量浓度为60%-80%,盐酸的浓度为0.01mol/L-0.1mol/L。
在上述技术方案中,采用特定浓度的盐酸甲醇水溶液能够将待测样品中的待测组分几乎全部提取出来,从而保证对待测样品中待测组分含量检测的准确性。
可选的,配制混合标准溶液或待测溶液的方法包括以下步骤:
将标准品或待测样品用盐酸水溶液混合反应后加入甲醇超声定容;可选地,将标准品或待测样品和水溶液混合后采用水浴加热,加入盐酸溶液搅拌反应,再加入甲醇超声后用甲醇定容。
在上述技术方案中,将样品与盐酸水溶液在水浴中反应后加甲醇超声定容的方式能将样品中的待测组分几乎全部提取出来,具体的,采用盐酸水溶液与样品在水浴中反应可以使山梨酸钾、苯甲酸钠两种有机盐生成微溶于水、易溶于有机溶液的苯甲酸和山梨酸,而其他待测组分则不会受影响,并且其他的待测组分均为易溶于甲醇等有机溶剂的物质,反应后加入甲醇混合成盐酸甲醇水溶液可以使得全部的待测组分得到充分的提取。这种提取方法与单纯采用甲醇水溶液提取的方法相比具有更好的效果,申请人在探索过程中发现采用质量浓度60%以下的甲醇水溶液溶解某些组分的标准品时易出现溶解不完全或析出固体的情况,例如对羟基苯甲酸甲酯及乙氧基喹啉等,而采用质量浓度60%以上的甲醇水溶液在溶解山梨酸钾和苯甲酸钠方面效果不佳。本申请使用盐酸水溶液初步处理后加入甲醇的方式能够提高提取效率,得到待测组分溶解其中的混合溶液,再使用盐酸甲醇水溶液稀释一定倍数,便于进行液相色谱检测。
可选的,采用水浴加热的时间为0-20min。
在上述技术方案中,采用水浴加热的时间一般为0-20min,当待测样品中含有香味剂成分,则采用水浴加热的时间可以为0min,即不加热,直接搅拌反应60min以上。
可选的,超声的时间为10-30min。
在上述技术方案中,超声10-30min能使待测样品中的各待测组分都最大程度的提出出来,并溶入盐酸甲醇水溶液。
可选的,配制待测溶液的方法还包括以下步骤:定容后,离心、过滤,得到待测溶液;可选地,离心的转速为7000-11000r/min,离心时间为5-12min;过滤采用0.2-0.25μm滤膜。
在上述技术方案中,采用待测样品配制待测溶液时,使用盐酸甲醇水溶液将各待测组分都提取出来、溶解于盐酸甲醇水溶液后,需要离心、过滤去除待测样品中不能溶解的成分,也就是待测样品中不属于待测组分的成分,以减少这些成分对液相色谱检测的干扰。采用一定的转速和时间进行离心,能使溶液和不能溶解的成分分离;采用0.2-0.25μm滤膜过滤,能过滤去除不能溶解的成分。
可选的,按照所述待测样品的浓度为0.8-1.2g/100mL配制所述待测溶液。
在上述技术方案中,按照待测样品浓度0.8-1.2g/100mL配制的待测溶液,采用液相色谱法对该浓度的待测溶液进行检测能够准确检测各待测组分的峰面积,从而得到各待测组分的含量比较精确。
可选的,标准曲线的绘制方法为:采用待测组分的标准品和盐酸甲醇水溶液分别配制每种待测组分对应的单标标准溶液,采用所有所述单标标准溶液混合配制待测组分浓度不同的多个混合标准溶液,通过液相色谱法对所有混合标准溶液进行检测,绘制每种待测组分的浓度与峰面积之间的标准曲线。
在上述技术方案中,先配制每种待测组分的单标标准溶液,再采用单标标准溶配制系列的混合标准溶液,系列的混合标准溶液中的特定待测组分的浓度不同,通过液相色谱法对该系列中的混合标准溶液进行检测能得到该特定待测组分的浓度和峰面积的之间的标准曲线。
可选的,通过液相色谱法检测得到待测溶液中各待测组分的保留时间,与所有待测组分的标准保留时间进行对比,确定待测溶液中各待测组分的成分。
在上述技术方案中,由于液相色谱法检测的每种待测组分的保留时间具有一定规律,因此可以通过待测溶液中各待测组分的保留时间得到各组分峰的归属。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案,下面将对本申请实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本申请的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为11种待测组分的标准品液相色谱图;
图2为其中5种待测组分的标准曲线图;
图3为其中2种待测组分的标准曲线图;
图4为其中1种待测组分的标准曲线图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本申请实施例的同时检测多种添加剂含量的方法进行具体说明。
本申请实施例提供了一种同时检测多种添加剂含量的方法,其包括以下步骤:
(1)采用待测组分的标准品和盐酸甲醇水溶液配制混合标准溶液,待测组分包括香味剂、甜味剂、抗氧化剂和防腐剂。
本申请实施例主要是对食品或饲料中的多种添加剂进行检测,而在食品和饲料中常规的抗氧化剂添加剂包括丁基羟基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、没食子酸丙酯(PG)和乙氧基喹啉(EQ),在食品和饲料中常规的防腐剂添加剂包括山梨酸/山梨酸钾、苯甲酸/苯甲酸钠和对羟基苯甲酸甲酯,在食品和饲料中常规的甜味剂添加剂包括糖精钠,在食品和饲料中常规的香味剂包括乙基香兰素及苯乙酸甲酯,因此待测组分包括上述多种添加剂种类中至少各一种。可选地,待测组分可以包括丁基羟基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、没食子酸丙酯(PG)、山梨酸/山梨酸钾、苯甲酸/苯甲酸钠、对羟基苯甲酸甲酯和乙氧基喹啉(EQ),实现同时对11种具体香味剂、甜味剂、抗氧化剂和防腐剂的含量检测。
需要说明的是,本实施例中的“/”表示“或”,比如山梨酸/山梨酸钾就是山梨酸或山梨酸钾,苯甲酸/苯甲酸钠就是苯甲酸或苯甲酸钠。
本实施例中配制混合标准溶液的目的是获取每种待测组分关于峰面积和含量之间的标准曲线,由于本申请是对混合在一起的多种待测组分进行检测,所以标准曲线也需要是检测包含所有待测组分的混合溶液。混合标准溶液的配制方法为:采用待测组分的标准品和甲醇水溶液分别配制每种待测组分对应的单标标准溶液,再采用所有单标标准溶液混合配制待测组分浓度不同的多个混合标准溶液。示例性地,可以取一定量的所有单标标准溶液,再稀释成不同倍数形成待测组分浓度不同的混合标准溶液;还可以取所有待测组分的单标标准溶液配制对应每种待测组分的若干组混合标准溶液,每组混合标准溶液中相对应的待测组分的浓度不同,其他待测组分的浓度相同,即通过取不同量的某种单标标准溶液与定量的其他单标标准溶液,能得到某种待测组分浓度不同的混合标准溶液。
本实施例中,盐酸甲醇水溶液中甲醇的质量浓度为60%-80%,盐酸的浓度为0.01mol/L-0.1mol/L。
本实施例中,配制混合标准溶液的方法包括以下步骤:
①将所有待测组分的标准品和盐酸水溶液混合反应,比如加热反应时间为0-20min,再加入甲醇超声,超声的时间为10-30min,得到混合溶液;
②将混合溶液加甲醇溶液定容。
可选地,配制系列的标准溶液的方法具体为:
①取某种抗氧化剂的标准品或某种防腐剂的标准品20-40mg(比如20mg、25mg、30mg、35mg、40mg)和盐酸水溶液混合,加热反应,加入甲醇超声溶解,使用甲醇定容,得到某种单标标准溶液;
②分别准确量取所有单标标准溶液各1-5mL混合,使用盐酸甲醇水溶液定容,得到混合溶液;
③根据相应的浓度,将混合溶液加盐酸甲醇水溶液定容,分别稀释不同倍数,得到系列的混合标准溶液。
(2)将待测样品用盐酸水溶液混合反应后加入甲醇超声定容配制成待测溶液,可选地,将待测样品与盐酸水溶液混合反应,比如加热反应0-20min,再加入甲醇超声,超声的时间为10-30min,用甲醇定容得到待测溶液。可选地,待测溶液中待测样品的浓度为0.8-1.2g/100mL,即按照待测样品浓度为0.8-1.2g/100mL的标准去配制待测溶液。
本实施例中,配制待测溶液的方法与配制混合标准溶液的方法大致相同,具体包括以下步骤:
①待测样品和盐酸水溶液混合反应,再加入甲醇超声,超声的时间可以为10-30min,得到混合溶液;
②将混合溶液加甲醇溶液定容;
③离心、过滤,离心的转速可以为7000-11000r/min,离心时间可以为5-12min;过滤可以采用0.2-0.25μm滤膜,得到待测溶液。
需要说明的是,配制得到的混合标准溶液中各待测组分的浓度与待测溶液中各待测组分的浓度均在同样量级的数值范围内,且是液相色谱法容易检测、且检测精度较高的浓度范围内。
(3)通过液相色谱法对每个混合标准溶液进行检测,得到所有待测组分的标准保留时间和对应不同浓度的峰面积,绘制每种待测组分的浓度与峰面积之间的标准曲线。
本实施例中,液相色谱法中,流动相A为醋酸-三乙胺水溶液,其中醋酸的质量浓度为0.3%-0.4%,三乙胺的质量浓度为0.05%-0.1%,流动相B为甲醇丙酮混合液,甲醇和丙酮的体积比例为1.5:1-2:1;采用梯度洗脱,具体可以为:0-3min,85%流动相A,15%流动相B;3-6min,83%-80%流动相A,17%-20%流动相B;6-21min,50%-85%流动相A,50%-15%流动相B;检测波长为240-280nm。
(4)通过液相色谱法对待测溶液进行检测,得到每种待测组分的保留时间和测定峰面积。本实施例中,检测混合标准溶液和检测待测溶液的液相色谱条件相同。
(5)将每种待测组分的测定峰面积与待测组分的标准曲线进行比较,计算得到待测样品中每种待测组分的含量。本实施例中,首先需要通过液相色谱法检测得到待测溶液中各待测组分的保留时间,与所有待测组分的标准保留时间进行对比,确定待测溶液中各待测组分的成分,再根据确定的待测组分的测定峰面积和相应的标准曲线比较得到待测样品中该待测组分的含量。
待测样品中每种待测组分的含量X的计算公式为:
X=(C×V×f)/(M×1000);
式中,C为通过比较待测组分的测定峰面积以及标准曲线得到的待测溶液中待测组分的含量;V为待测溶液定容体积;f为待测溶液稀释倍数;M为待测样品称样量。
本实施例的检测方法可以同时检测BHA、BHT、TBHQ、PG、山梨酸/山梨酸钾、苯甲酸/苯甲酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、乙氧基喹啉、糖精钠、乙基香兰素、苯乙酸甲酯的检测方法。该方法具有步骤简便,能节约检测的时间及成本,大大提高检测的效率的同时具有良好的重复性和回收率的优点。
以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例对待测饲料(市面销售的猪饲料)中的待测组分:多种添加剂含量进行检测,待测组分具体为BHA、BHT、TBHQ、PG、山梨酸、苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、糖精钠、乙基香兰素、苯乙酸甲酯、EQ。
一、采用的仪器及仪器条件如下:
1.仪器设备
高效液相色谱仪,带紫外检测器;电子天平(精确至0.1mg);实验室常规玻璃器皿;超声波清洗仪;0.22μm微孔过滤膜;溶剂过滤器;高速离心机。
2.色谱条件
色谱柱:Agilent Poroshell 120EC-C18(2.7μm,2.1mm×100mm);
柱温:45℃;
流动相:流动相A(0.3%醋酸+0.05%三乙胺);流动相B(甲醇:丙酮=2:1);梯度洗脱;
进样量:5μL;
梯度洗脱程序见表1
表1 梯度洗脱程序表
二、具体检测方法:
(1)配制待测溶液:准确称取浓缩饲料5g于100mL烧杯中,加入20mL纯水后加入2mL、1mol/L的盐酸水溶液,75℃水浴反应15min,取下,加入50mL甲醇超声30min,转移至100mL容量瓶中,使用甲醇定容至刻度,得到待测溶液。
(2)分别准确称取11种待测组分的标准品20-40mg于100mL烧杯中,20mL纯水后加入2mL、1mol/L的盐酸水溶液,75℃水浴反应15min,取下,加入50mL甲醇超声30min,转移至100mL容量瓶中,使用甲醇定容至刻度,得到11种待测组分的单标标准溶液。
将11种单标标准溶液分别各取1mL于100mL的容量瓶种混合,使用含有0.02mol/L盐酸的75%甲醇定容,得到混合标准中间液。
取混合标准中间液稀释2倍、5倍、10倍、20倍、50倍后既为系列的混合标准溶液。
(3)利用高效液相色谱对混合标准溶液进行检测,得到各混合标准溶液中各待测组分的保留时间及峰面积,利用高效液相色谱对混合标准中间液进行检测得到的色谱图即为11种待测组分的标准品液相色谱图,如图1所示,根据图1可以得知每种待测组分的标准保留时间。
根据每种待测组分的浓度与峰面积之间的对应数据绘制标准曲线,其中9种待测组分(BHA、BHT、PG、山梨酸、苯甲酸、糖精钠、乙基香兰素、EQ和苯乙酸甲酯)的标准曲线如图2-图4所示。
(4)利用高效液相色谱对待测溶液进行检测,得到每种待测组分的保留时间和测定峰面积。
(5)将待测溶液的各待测组分的保留时间和图1所示的标准品液相色谱图所示的标准保留时间进行对比,得到各个组分峰的归属,并将各待测组分的峰面积带入标准曲线对应的方程式,计算得到待测溶液(上机液)中相应的待测组分的含量C,再将C带入式(I)中计算确定待测饲料中各待测组分的含量X:
计算公式:
X=(C×V×f)/(M×1000) (I)
式中:
X——待测饲料中各待测组分的含量(mg/kg);
C——上机液中各待测组分的含量(ug/L);
V——待测溶液定容体积(mL);
f——待测溶液稀释倍数;
M——待测饲料称样量(g)。
将各数据代入式(I)中,可得待测饲料中各待测组分的含量,其结果如表2所示。
表2 待测饲料中各待测组分的计算结果表
对11种待测组分的标准品进行6次平行测定,得到11种化合物的保留时间与峰面积的重复性结果见表3和表4。
表3 11种化合物的保留时间的相对标准偏差结果
表4 11种化合物的峰面积的相对标准偏差结果
通过对6次测定结果的回收率来评价本申请检测方法的准确度,结果如表5所示。
表5 11种待测组分的加标实验结果
由表5可知,利用本申请的检测方法同时检测待测饲料中的BHA、BHT、TBHQ、PG、山梨酸、苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、乙氧基喹啉、糖精钠、乙基香兰素和苯乙酸甲酯共11种待测组分含量时,回收率范围高,证明本申请的检测方法具有很高的准确度。
综上所述,本申请实施例的同时检测多种添加剂含量的方法能够同时检测多种甜味剂、香味剂、防腐剂及抗氧化剂,以提高检测的效率,节约试剂及时间成本。
以上所述仅为本申请的实施例而已,并不用于限制本申请的保护范围,对于本领域的技术人员来说,本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。