CN106383181A - 柱前衍生‑高效液相色谱检测发酵液中缬氨酸含量的方法 - Google Patents

柱前衍生‑高效液相色谱检测发酵液中缬氨酸含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种柱前衍生‑高效液相色谱检测发酵液中缬氨酸含量的方法，包括以下步骤：制备缬氨酸标准品溶液和样品溶液、制备衍生溶液、采用高效液相色谱法进行检测、记录峰面积，采用外标法计算样品中缬氨酸的含量。本方法样品预处理步骤简单，衍生试剂浓度低，仅以正己烷除去干扰因素，反应液直接稀释过滤后进样，简化了衍生步骤，既节约时间，又降低费用；检测设备为通用型高效液相色谱仪和色谱柱，外标法定量，不需购买内标物和专用仪器，成本低，易推广。

Description

柱前衍生-高效液相色谱检测发酵液中缬氨酸含量的方法
技术领域
本发明属于成分检测领域，涉及检测缬氨酸含量的方法，具体的涉及柱前衍生-高效液相色谱检测发酵液中缬氨酸含量的方法。
背景技术
缬氨酸是人体必需氨基酸之一，具有促进身体正常生长、修复组织、调节血糖等多种生理功能，广泛应用于医药、食品调味剂或补充剂、动物饲料、化妆品原料等，尤其在医学研究治疗中的作用日益受到广泛重视。
缬氨酸的生产方法主要有化学合成和生物合成。化学合成法生产成本高，反应复杂，步骤多，且有许多副产物。而微生物发酵法生产缬氨酸具有原料成本低、条件温和、可大规模生产等优点，且发酵法生产的缬氨酸皆为L-型，无需旋光拆分，因此发酵法是一种非常理想的缬氨酸生产方法。但目前尚未找到测定发酵液样品中缬氨酸含量的文献报道，因此需要建立快速准确的缬氨酸定量检测方法，以满足缬氨酸发酵过程质量控制的需要。
传统的氨基酸分析是通过专门的氨基酸自动分析仪进行的，该仪器分析时间长、灵敏度低，且价格昂贵，局限性较大。近年来，柱前衍生-高效液相色谱法测定氨基酸的技术由于不需要专门的昂贵仪器，且避免了柱后衍生易污染、灵敏度低等缺点，已逐渐成为游离氨基酸的主要检测方法。常见的柱前衍生化试剂有邻苯二甲醛(OPA)、异硫氰酸苯酯(PITC)、氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)及丹酰氯(DANSYL-C1)。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供柱前衍生-高效液相色谱检测发酵液中缬氨酸含量的方法，以准确的检测出发酵液中缬氨酸的含量。
本发明为实现其目的采用的技术方案是，柱前衍生-高效液相色谱检测发酵液中缬氨酸含量的方法，包括以下步骤：
a、制备缬氨酸标准品溶液和样品溶液；
b、制备衍生溶液：将缬氨酸标准品溶液或样品溶液加入到具塞比色管中；再加入衍生试剂溶液，摇匀后静置反应1h；再加入正己烷，摇匀，静置分层；然后除去正己烷层，将缬氨酸标准品或样品层稀释5倍，微孔滤膜过滤，得到缬氨酸标准品衍生液或样品衍生液，待测；
其中缬氨酸标准品溶液或样品溶液与衍生试剂溶液的体积比为1:1，缬氨酸标准品溶液或样品溶液与正己烷的体积比为1:2；
c、采用高效液相色谱法进行检测：将缬氨酸标准品衍生液与样品衍生液分别注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：
流动相A：乙腈；
流动相B：乙酸钠溶液；
液相色谱仪：带紫外检测器，4.6*250mm C18色谱柱；
进样量：10-50μL；
柱温：30-40℃；
流速：1.0mL/min；
波长：254nm；
d、记录峰面积，采用外标法计算样品中缬氨酸的含量。
进一步地，所述缬氨酸标准品溶液的浓度为0.2-0.8mg/mL，所述缬氨酸样品溶液处理方法为：将缬氨酸样品于3000-5000r/min离心5-10min后取上清液，用纯化水稀释50-150倍，得到缬氨酸样品溶液。
进一步地，衍生试剂溶液为，异硫氰酸苯酯的乙腈溶液与三乙胺的乙腈溶液按体积比1:1比例混合；其中异硫氰酸苯酯的乙腈溶液中异硫氰酸苯酯与乙腈的体积比为1:99，三乙胺的乙腈溶液中三乙胺与乙腈的体积比为14:86。
进一步地，所述梯度洗脱程序为：
。
进一步地，所述样品为发酵液样品。
进一步地，所述滤膜孔径为0.45μm。
进一步地，所述流动相A乙腈的处理方法为：有机系微孔滤膜真空抽滤，超声15-30min；乙酸钠溶液的处理方法为：，用冰醋酸将浓度为8.2/mL的乙酸钠溶液调pH至6.20~6.70，混匀，过滤，超声15-30min。
进一步地，所述柱温为35℃。
进一步地，所述乙酸钠溶液调pH为6.50。
本发明的有益效果为：本方法样品预处理步骤简单，衍生试剂浓度低，仅以正己烷除去干扰因素，反应液直接稀释过滤后进样，简化了衍生步骤，既节约时间，又降低费用；检测设备为通用型高效液相色谱仪和色谱柱，外标法定量，不需购买内标物和专用仪器，成本低，易推广，通过优化流动相配制和洗脱条件，在较短时间内即可将缬氨酸与发酵培养基成分完全分离，加标回收率95-102%，精密度RSD≤1.5%，准确度高，重复性好，线性相关系数可达0.9999，灵敏度高。
本发明采用的异硫氰酸苯酯(PITC)衍生步骤简单、反应条件温和易控、生成产物单一、稳定，反应速度较快，且衍生副产物对HPLC测定无干扰。
附图说明
图1为实施例1的标准品高效液相色谱图。
图2为实施例2的发酵液样品色谱图。
图3为实施例1的缬氨酸标准品浓度与峰面积的线性关系图。
具体实施方式
下面以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：
1、试剂
2、仪器
液相色谱仪：Waters e2695
检测器：Waters 2489紫外检测器
色谱柱：Hubble C18 5μm 4.6*250mm
3、梯度洗脱程序：
4、按外标法计算出样品中缬氨酸的含量。
式中：A样：供试品溶液峰面积； A对：标准品溶液峰面积；
W对：标准品的称重，mg； V对：标准品定容体积，mL；
n：样品稀释倍数； P%：标准品百分含量，%。
具体实施例一：
色谱条件：
流动相A：乙腈，有机系微孔滤膜真空抽滤，超声15min；
流动相B：8.2g无水乙酸钠溶于1000mL水中，用冰醋酸调pH至6.50，混匀，水系微孔滤膜真空抽滤，超声20min。
进样量：10μL；
柱温：40℃；
流速：1.0mL/min；
波长：254nm
a、制备缬氨酸标准品溶液：精密称取缬氨酸标准品20mg，溶于50mL水中，摇匀；制备缬氨酸样品溶液：取发酵液样品于3000r/min离心10min后取上清液，用纯化水稀释100倍；
b、衍生试剂溶液配制（临用时现配）：异硫氰酸苯酯的乙腈溶液与三乙胺的乙腈溶液按体积比1:1比例混合；其中异硫氰酸苯酯的乙腈溶液中异硫氰酸苯酯与乙腈的体积比为1:99，三乙胺的乙腈溶液中三乙胺与乙腈的体积比为14:86；
c、制备衍生溶液：准确移取标准品溶液或样品稀释液2.0mL于10mL具塞比色管中，加衍生试剂溶液2.0mL，摇匀后静置反应1h，加4mL正己烷，摇匀，静置15min分层；用塑料滴管吸去正己烷层后，准确移取下层溶液2.0mL于10mL容量瓶中，加纯化水定容，摇匀，用0.45μm滤膜过滤后装小瓶待测；
d、系统适应性试验：打开液相色谱仪，平衡基线20min，将标准品衍生溶液平行进样3次，目标峰与前后杂质峰分离度R>4.6；
e、测定：将标准品衍生溶液和供试品的衍生溶液分别注入液相色谱仪，进行分离测定；标准品溶液平行进样3次，供试品溶液各进样1次，记录色谱图20min。
f、结果计算：按外标法计算出样品中缬氨酸的含量：
=8.48×10-8
样品中缬氨酸的=56.3mg/mL。
具体实施例二：
色谱条件：
流动相A：乙腈，有机系微孔滤膜真空抽滤，超声20min；
流动相B：7.6g无水乙酸钠溶于925mL水中，用冰醋酸调pH至6.50，混匀，水系微孔滤膜真空抽滤，超声20min。
进样量：50μL；
柱温：40℃；
流速：1.0mL/min；
波长：254nm
a、制备缬氨酸标准品溶液：精密称取缬氨酸标准品30mg，溶于50mL水中，摇匀；制备缬氨酸样品溶液：取发酵液样品于4000r/min离心8min后取上清液，用纯化水稀释50倍；
b、衍生试剂溶液配制（临用时现配）：异硫氰酸苯酯的乙腈溶液与三乙胺的乙腈溶液按体积比1:1比例混合；其中异硫氰酸苯酯的乙腈溶液中异硫氰酸苯酯与乙腈的体积比为1:99，三乙胺的乙腈溶液中三乙胺与乙腈的体积比为14:86；
c、制备衍生溶液：准确移取标准品溶液或样品稀释液2.0mL于10mL具塞比色管中，加衍生试剂溶液2.0mL，摇匀后静置反应1h，加4mL正己烷，摇匀，静置15min分层；用塑料滴管吸去正己烷层后，准确移取下层溶液2.0mL于10mL容量瓶中，加纯化水定容，摇匀，用0.45μm滤膜过滤后装小瓶待测；
d、系统适应性试验：打开液相色谱仪，平衡基线20min，将标准品衍生溶液平行进样3次，目标峰与前后杂质峰分离度R>4.0；
e、测定：将标准品衍生溶液和供试品的衍生溶液分别注入液相色谱仪，进行分离测定；标准品溶液平行进样3次，供试品溶液各进样1次，记录色谱图25min。
f、结果计算：按外标法计算出样品中缬氨酸的含量：
=4.2×10-3
样品中缬氨酸的=27.4mg/mL。
具体实施例三：
色谱条件：
流动相A：乙腈，有机系微孔滤膜真空抽滤，超声15min；
流动相B：7.6g无水乙酸钠溶于925mL水中，用冰醋酸调pH至6.50，混匀，水系微孔滤膜真空抽滤，超声25min。
进样量：20μL；
柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；
波长：254nm
a、制备缬氨酸标准品溶液：精密称取缬氨酸标准品10mg，溶于50mL水中，摇匀；制备缬氨酸样品溶液：取发酵液样品于5000r/min离心5min后取上清液，用纯化水稀释150倍；
b、衍生试剂溶液配制（临用时现配）：异硫氰酸苯酯的乙腈溶液与三乙胺的乙腈溶液按体积比1:1比例混合；其中异硫氰酸苯酯的乙腈溶液中异硫氰酸苯酯与乙腈的体积比为1:99，三乙胺的乙腈溶液中三乙胺与乙腈的体积比为14:86；
c、制备衍生溶液：准确移取标准品溶液或样品稀释液2.0mL于10mL具塞比色管中，加衍生试剂溶液2.0mL，摇匀后静置反应1h，加4mL正己烷，摇匀，静置15min分层；用塑料滴管吸去正己烷层后，准确移取下层溶液2.0mL于10mL容量瓶中，加纯化水定容，摇匀，用0.45μm滤膜过滤后装小瓶待测；
d、系统适应性试验：打开液相色谱仪，平衡基线20min，将标准品衍生溶液平行进样3次，目标峰与前后杂质峰分离度R>3.6；
e、测定：将标准品衍生溶液和供试品的衍生溶液分别注入液相色谱仪，进行分离测定；标准品溶液平行进样3次，供试品溶液各进样1次，记录色谱图23min。
f、结果计算：按外标法计算出样品中缬氨酸的含量：
=8.48×10-8
样品中缬氨酸的=51.7mg/mL。
具体实施例四：
色谱条件：
流动相A：乙腈，有机系微孔滤膜真空抽滤，超声25min；
流动相B：8.2g无水乙酸钠溶于1000mL水中，用冰醋酸调pH至6.50，混匀，水系微孔滤膜真空抽滤，超声20min。
进样量：15μL；
柱温：37℃；
流速：1.0mL/min；
波长：254nm
a、制备缬氨酸标准品溶液：精密称取缬氨酸标准品40mg，溶于50mL水中，摇匀；制备缬氨酸样品溶液：取发酵液样品于4500r/min离心6min后取上清液，用纯化水稀释75倍；
b、衍生试剂溶液配制（临用时现配）：异硫氰酸苯酯的乙腈溶液与三乙胺的乙腈溶液按体积比1:1比例混合；其中异硫氰酸苯酯的乙腈溶液中异硫氰酸苯酯与乙腈的体积比为1:99，三乙胺的乙腈溶液中三乙胺与乙腈的体积比为14:86；
c、制备衍生溶液：准确移取标准品溶液或样品稀释液2.0mL于10mL具塞比色管中，加衍生试剂溶液2.0mL，摇匀后静置反应1h，加4mL正己烷，摇匀，静置15min分层；用塑料滴管吸去正己烷层后，准确移取下层溶液2.0mL于10mL容量瓶中，加纯化水定容，摇匀，用0.45μm滤膜过滤后装小瓶待测；
d、系统适应性试验：打开液相色谱仪，平衡基线20min，将标准品衍生溶液平行进样3次，目标峰与前后杂质峰分离度R>3.5；
e、测定：将标准品衍生溶液和供试品的衍生溶液分别注入液相色谱仪，进行分离测定；标准品溶液平行进样3次，供试品溶液各进样1次，记录色谱图21min。
f、结果计算：按外标法计算出样品中缬氨酸的含量：
=8.49×10-8
样品中缬氨酸的=42.6mg/mL。
具体实施例五：
色谱条件：
流动相A：乙腈，有机系微孔滤膜真空抽滤，超声30min；
流动相B：7.6g无水乙酸钠溶于925mL水中，用冰醋酸调pH至6.50，混匀，水系微孔滤膜真空抽滤，超声30min。
进样量：30μL；
柱温：30℃；
流速：1.0mL/min；
波长：254nm
a、制备缬氨酸标准品溶液：精密称取缬氨酸标准品25mg，溶于50mL水中，摇匀；制备缬氨酸样品溶液：取发酵液样品于3500r/min离心7min后取上清液，用纯化水稀释120倍；
b、衍生试剂溶液配制（临用时现配）：异硫氰酸苯酯的乙腈溶液与三乙胺的乙腈溶液按体积比1:1比例混合；其中异硫氰酸苯酯的乙腈溶液中异硫氰酸苯酯与乙腈的体积比为1:99，三乙胺的乙腈溶液中三乙胺与乙腈的体积比为14:86；
c、制备衍生溶液：准确移取标准品溶液或样品稀释液2.0mL于10mL具塞比色管中，加衍生试剂溶液2.0mL，摇匀后静置反应1h，加4mL正己烷，摇匀，静置15min分层；用塑料滴管吸去正己烷层后，准确移取下层溶液2.0mL于10mL容量瓶中，加纯化水定容，摇匀，用0.45μm滤膜过滤后装小瓶待测；
d、系统适应性试验：打开液相色谱仪，平衡基线20min，将标准品衍生溶液平行进样3次，目标峰与前后杂质峰分离度R>7.6；
e、测定：将标准品衍生溶液和供试品的衍生溶液分别注入液相色谱仪，进行分离测定；标准品溶液平行进样3次，供试品溶液各进样1次，记录色谱图22min。
f、结果计算：按外标法计算出样品中缬氨酸的含量：
=8.47×10-8
样品中缬氨酸的=38.2mg/mL。
以实施例一为例：
（一）精密度实验：
取缬氨酸标准溶液平行处理和检测6次，主峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.18%，表明该方法的精密度较高。
（二）准确度实验：
取1批已测定含量的样品，分别按其含量的80%、100%、120%进行加标，每个加标水平平行实验3次，柱前衍生-高效液相色谱检测。分别计算加标回收率，结果如下表。样品的加标回收率为95.2%-99.8%，在95%～102%之间，准确度较高。
（三）线性关系实验：
如图3所示，以系列浓度的缬氨酸标准溶液衍生、进样所得峰面积对其浓度做曲线，并进行线性回归，得到线性回归方程：y=252.97x-0.7333；线性相关系数：R2=0.9999。表明该方法的线性关系良好。
（四）色谱图：
如图1所示，标准品C=0.4mg/mL的色谱图，主峰出峰时间t=8.108min；分离度R=4.0；对称因子1.05；理论塔板数N=22142；图2为发酵液样品液相色谱图，主峰出峰时间t=8.091min；分离度R=3.7；对称因子1.01；理论塔板数N=23876。

Claims (9)

1.柱前衍生-高效液相色谱检测发酵液中缬氨酸含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、制备缬氨酸标准品溶液和样品溶液；
b、制备衍生溶液：将缬氨酸标准品溶液或样品溶液加入到具塞比色管中；再加入衍生试剂溶液，摇匀后静置反应1h；再加入正己烷，摇匀，静置分层；然后除去正己烷层，将缬氨酸标准品或样品层稀释5倍，微孔滤膜过滤，得到缬氨酸标准品衍生液或样品衍生液，待测；
其中缬氨酸标准品溶液或样品溶液与衍生试剂溶液的体积比为1:1，缬氨酸标准品溶液或样品溶液与正己烷的体积比为1:2；
c、采用高效液相色谱法进行检测：将缬氨酸标准品衍生液与样品衍生液分别注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：
流动相A：乙腈；
流动相B：乙酸钠溶液；
液相色谱仪：带紫外检测器，4.6*250mm C18色谱柱；
进样量：10-50μL；
柱温：30-40℃；
流速：1.0mL/min；
波长：254nm；
d、记录峰面积，采用外标法计算样品中缬氨酸的含量。
2.根据权利要求1所述的柱前衍生-高效液相色谱检测发酵液中缬氨酸含量的方法，其特征在于：所述缬氨酸标准品溶液的浓度为0.2-0.8mg/mL，所述缬氨酸样品溶液处理方法为：将缬氨酸样品于3000-5000r/min离心5-10min后取上清液，用纯化水稀释50-150倍，得到缬氨酸样品溶液。
3.根据权利要求1所述的柱前衍生-高效液相色谱检测发酵液中缬氨酸含量的方法，其特征在于：衍生试剂溶液为，异硫氰酸苯酯的乙腈溶液与三乙胺的乙腈溶液按体积比1:1比例混合；其中异硫氰酸苯酯的乙腈溶液中异硫氰酸苯酯与乙腈的体积比为1:99，三乙胺的乙腈溶液中三乙胺与乙腈的体积比为14:86。
4.根据权利要求1所述的柱前衍生-高效液相色谱检测发酵液中缬氨酸含量的方法，其特征在于：所述梯度洗脱程序为：
。
5.根据权利要求1所述的柱前衍生-高效液相色谱检测发酵液中缬氨酸含量的方法，其特征在于：所述样品为发酵液样品。
6.根据权利要求1所述的柱前衍生-高效液相色谱检测发酵液中缬氨酸含量的方法，其特征在于：所述滤膜孔径为0.45μm。
7.根据权利要求1所述的柱前衍生-高效液相色谱检测发酵液中缬氨酸含量的方法，其特征在于：所述流动相A乙腈的处理方法为：有机系微孔滤膜真空抽滤，超声15-30min；乙酸钠溶液的处理方法为：，用冰醋酸将浓度为8.2/mL的乙酸钠溶液调pH至6.20~6.70，混匀，过滤，超声15-30min。
8.根据权利要求1所述的柱前衍生-高效液相色谱检测发酵液中缬氨酸含量的方法，其特征在于：所述柱温为35℃。
9.根据权利要求7所述的柱前衍生-高效液相色谱检测发酵液中缬氨酸含量的方法，其特征在于：所述乙酸钠溶液调pH为6.50。
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CN115267009A (zh) * 2022-08-26 2022-11-01 河北圣雪大成制药有限责任公司 一种应用hplc-elsd检测发酵液中前体缬氨酸的方法

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