CN104764830A - 牛奶中磺胺类抗生素残留的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食品安全检测技术领域，具体来说是一种牛奶中磺胺类抗生素残留的检测方法，步骤为：将无抗生素牛奶作为空白样品和待测样品分别加入离心试剂酸化乙腈按体积比为1:2混合，然后进行分离离心；离心后用1-10％的稀硫酸调节离心上清液pH值为3-5，加入浓度为0.5-1.5g/L的金属盐溶液与离心上清液均匀混合后静置反应10分钟；色谱测定，计算分离出的残留磺胺类抗生素对应的峰面积，根据标准曲线进行定量计算，得出残留的含量；本发明所需样品量及各种试剂的用量少，对环境危害小，检测过程速度，准确率高，操作简单、耗时短。
Description
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，具体来说是一种牛奶中磺胺类抗生素残留的检测方法。
背景技术
牛奶含有丰富的矿物质、钙、磷、铁、锌、铜、锰、钼。最难得的是，牛奶是人体钙的最佳来源，而且钙磷比例非常适当，利于钙的吸收。种类复杂，至少有100多种，主要成份有水、脂肪、磷脂、蛋白质、乳糖、无机盐等。
牛奶是老少皆宜的营养品，牛奶中若含有抗生素，对长期饮用者来说无疑是等于长期服用小剂量的抗生素，对抗生素有过敏体质的人服用残留抗生素的乳后会发生过敏反应。即使是正常饮用者，体内的某些条件性致病菌易产生耐药性，一旦患病再用同种抗生素治疗很难奏效。抗生素是奶牛场治疗乳房炎的常规药物，由于长期大量使用，使耐药菌株增加，一些乳房炎病例变得难以用常规方法治愈。这种情况又促使临诊兽医在治疗过程中加大抗生素的用量。此外，牛奶中抗生素残留会影响奶制品品质，如果用含抗生素的奶做酸奶或乳酪等，则残留在其中的抗生素会抑制细菌的发酵，使产量和质量降低。因此市场不允许出售抗生素残留过量的牛奶，同时也造成牛奶生产者的经济损失。
磺胺类抗生素具有对氨基苯磺酰胺结构，是一种人工合成的广谱抗菌药，通过阻止细菌利用对氨基苯甲酸合成叶酸而抑制细菌的生长繁殖，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有较好的抗菌活性，多用于对细菌感染性疾病的预防和治疗，在畜禽养殖业中扮演着非常重要的角色。磺胺类抗生素的广泛应用，保障了动物的健康，提高了畜禽生产力，促进了畜禽养殖业的发展。但药物在动物性食品中残留，对人类健康和公共卫生产生威胁；畜禽粪便中残留的兽药抗生素进入农田土壤后，不仅造成了土壤的污染，还对整个农业生态环境造成了危害。建立环境介质中磺胺类抗生素的检测分析方法是研究其环境行为和生态环境风险的基础。
食品中存在的磺胺类抗生素属于痕量物质，发达国家多采用高效液相色谱仪-质谱联用技术进行研究，但该方法成本相对较高，目前对残留兽用磺胺类抗生素的检测研究多在动物性食品领域，在我国的推广使用有一定局限性。
发明内容
为了克服上述现有技术的磺胺类抗生素检测方法成本高、步骤繁琐且多停留在动物性食品检测领域的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种牛奶中磺胺类抗生素的检测方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种牛奶中磺胺类抗生素残留的检测方法，步骤包括：
(1)将无抗生素牛奶作为空白样品和待测样品分别加入离心试剂酸化乙腈按体积比为1:2混合，然后进行离心分离；离心后用1-10％的稀硫酸调节离心上清液使其pH值为3-5，加入浓度为0.5-1.5g/L的金属盐溶液与离心上清液均匀混合后静置反应10分钟；
(2)色谱测定，测定的色谱条件为：色谱柱规格为Shim-pack VP-ODS，150×4.6mm，5μm；SPD-20A紫外检测器，检测波长270nm，柱温40℃，流动相：0.5v/v％乙酸溶液：乙腈：甲醇＝75:20:5(V:V)，流速1.2mL/min，进样量20μL；
(3)计算分离出的残留磺胺类抗生素对应的峰面积，根据标准曲线进行定量计算，得出残留的含量。
进一步的，所述磺胺类抗生素指磺胺甲基嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶和磺胺喹恶啉中的至少一种。
进一步的，步骤(1)中，所述离心条件是1000-2500r/min，离心条件为5-10min。
进一步的，步骤(1)中，所述金属盐溶液为硫酸铜溶液、硫酸锌溶液、硫酸锰溶液、硫酸镉溶液和醋酸铅溶液中的任意一种。
本发明的有益技术效果是：本发明利用磺胺类药物在高效液相色谱仪紫外检测器270nm波长下、荧光检测器激发波长405nm，发射波长495nm下检测效果最佳，通过对流动相及各组分配比、流速、温度等条件的优化组合，确定目标药物的最佳检测条件。本发明所需样品量及各种试剂的用量少，对环境危害小，检测过程速度，准确率高，操作简单、耗时短。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
一种牛奶中磺胺类抗生素残留的检测方法，步骤包括：
(1)将无抗生素牛奶作为空白样品和待测样品分别加入离心试剂酸化乙腈按体积比为1:2混合，然后进行离心分离；离心后用1-10％的稀硫酸调节离心上清液使其pH值为3-5，加入浓度为0.5-1.5g/L的金属盐溶液与离心上清液均匀混合后静置反应10分钟；
(2)所用仪器为日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪，色谱柱规格为Shim-pack VP-ODS(150×4.6mm，5μm)，SPD-20A紫外检测器，检测波长270nm(采用了磺胺类药物的最大吸收波长来测定，以提高灵敏度)，柱温40℃，流动相：0.5v/v％乙酸溶液：乙腈：甲醇＝75:20:5(V:V)，流速1.2mL/min，进样量20μL，LC Solution工作站。
(3)标准曲线的测定：精确称取4种药物，用甲醇溶解配制4种药物浓度均为100μg/mL的磺胺混合标准储备液，用流动相稀释，配制4种药物浓度均为0.05、0.10、0.50、1.00、2.00μg/mL的混合标准溶液，采用步骤(2)的条件进行测试，得到工作曲线。4种药物的线性关系、相关系数及检出限见表1。
表1紫外检测器下4种磺胺类药物线性关系、相关系数及检出限
| 药物 | 线性关系 | 相关系数 | 牛奶样 |
| 磺胺甲基嘧啶 | y＝25018x+204.7 | 0.99 | 0.83 |
| 磺胺氯哒嗪 | y＝18186x-17.2 | 0.99 | 1.12 |
| 磺胺邻二甲氧嘧啶 | y＝21723x-45.8 | 0.99 | 0.69 |
| 磺胺喹恶啉 | y＝16918x-141.7 | 0.99 | 1.85 |
HLB柱的活化：HLB柱使用前，先后用5mL甲醇、5mL纯水进行活化。
(4)牛奶样的测试：
把4种药物溶于处理后牛奶中得到混合牛奶样，制备两个牛奶样，单个牛奶样中4种药物的浓度相同，一号牛奶样中每种药物的浓度分别为0.5μg/L，二号牛奶样中每种药物的浓度分别为2μg/L。
将牛奶样摇晃均匀过滤后，准确量取500mL牛奶样，过活化后的HLB小柱，待柱子干燥30min后，用4mL甲醇洗脱HLB柱，收集洗脱液，于旋转蒸发仪浓缩至近干，再用N2吹干，以1mL甲醇定容待测，按照步骤(2)的条件进行测试，两个牛奶样分别测试。
对上述测试得到的曲线分析，对分离出的残留磺胺类抗生素面积进行积分，依据标准品制作的标准曲线进行定量计算，得出残留的含量，计算回收率，添加回收率见表2。
表2牛奶样中4种磺胺类药物的添加回收率
由上述检测结果可见，本发明方法检测效率高，一次可以分离4种磺胺类抗生素；分析物无主要干扰物干扰；分析速度快。一次色谱分离过程可在20min内完成，可以快速定量检测的需求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.牛奶中磺胺类抗生素残留的检测方法，其特征在于，步骤包括：
(1)将无抗生素牛奶作为空白样品和待测样品分别加入离心试剂酸化乙腈按体积比为1:2混合，然后进行离心分离；离心后用1-10％的稀硫酸调节离心上清液使其pH值为3-5，加入浓度为0.5-1.5g/L的金属盐溶液与离心上清液均匀混合后静置反应10分钟；
(2)色谱测定，测定的色谱条件为：色谱柱规格为Shim-pack VP-ODS，150×4.6mm，5μm；SPD-20A紫外检测器，检测波长270nm，柱温40℃，流动相：0.5v/v％乙酸溶液：乙腈：甲醇＝75:20:5(V:V)，流速1.2mL/min，进样量20μL；
(3)计算分离出的残留磺胺类抗生素对应的峰面积，根据标准曲线进行定量计算，得出残留的含量。
2.根据权利要求1所述牛奶中磺胺类抗生素残留的检测方法，其特征在于：所述磺胺类抗生素指磺胺甲基嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶和磺胺喹恶啉中的至少一种。
3.根据权利要求1所述牛奶中磺胺类抗生素残留的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述离心条件是1000-2500r/min，离心条件为5-10min。
4.根据权利要求1所述牛奶中磺胺类抗生素残留的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述金属盐溶液为硫酸铜溶液、硫酸锌溶液、硫酸锰溶液、硫酸镉溶液和醋酸铅溶液中的任意一种。
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