发明内容
解决的技术问题:针对目前生物样品中C型利钠肽定量研究方法的不足以及传统荧光分子印迹聚合物合成的缺点,本发明提供了一种比率荧光分子印迹聚合物及其制备方法和应用。从而实现生物样品中CNP的快速灵敏检测。
技术方案:一种比率荧光分子印迹聚合物的制备方法,由以下步骤制得:通过一步法在二氧化硅纳米粒子表面溶胶-凝胶聚合印迹,以C型利钠肽(CNP)为模板分子、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)为功能单体、正硅酸四乙酯(TEOS)为交联剂、同时接枝两种APTES修饰的荧光纳米材料碳点(CDs)和硝基苯并恶唑(NBD),洗脱模板分子,得到比率荧光分子印迹聚合物纳米粒子。
优选的,具体制备方法为:(1). 氨基化二氧化硅的制备:按比例,将15 mL质量浓度为25%氨水加到250 mL无水乙醇中,室温下搅拌均匀,30 min后加入2.5 mL TEOS,反应12 h,再加入1.25 mL TEOS和0.1 mL APTES;12 h后,产物离心分离,乙醇和去离子水洗至中性,然后分散至10 mL超纯水中,得到溶液A,4 ℃保存,所述氨基化二氧化硅的尺寸为100~150 nm;(2). APTES修饰CDs的制备:按比例,将0.4 g柠檬酸钠加入8 mL超纯水中搅拌溶解,再加入APTES,转移至反应釜中200 ℃反应2 h;反应液用500 KDa的透析袋透析12 h后,氮吹仪吹至5 mL,得到APTES-CDs,置于4 ℃避光保存;所述柠檬酸盐的质量与APTES的体积之比为1:3~1:6 g/mL;(3). APTES修饰NBD的制备:取洁净干燥的两口烧瓶,装干燥管,用锡纸包好;在避光条件下,取NBD-Cl置于三口烧瓶中,依次加入APTES,无水乙醇,通30 min氮气,冰浴搅拌24 h,得到APTES-NBD,装入试剂瓶内,密封避光保存备用;所述NBD-Cl与APTES的摩尔比为1:30~1:50;(4). 比率荧光分子印迹聚合物的制备:按比例,将溶液A离心除去上清液,加入25 mL PBS,超声分散后,加入CNP、APTES-CDs以及APTES-NBD,搅拌1.5h后,加入TEOS和质量浓度为25%氨水,搅拌过夜;反应结束后离心除去上清液,用超纯水洗涤,除去未反应完的单体,再将10% (v/v) HAc-10% (w/v) SDS溶液反复超声洗涤,直至上清液紫外检测不到模板分子为止,最后用超纯水洗去多余的HAc和SDS,将产物4 ℃冷冻干燥12 h,得到比率荧光分子印迹聚合物。
优选的,上述溶液A的体积为1~5mL;CNP的质量为5~15 mg;APTES-CDs与APTES-NBD的体积比为1:2~1:5;TEOS的体积为100~300 μL;TEOS与氨水的体积比为1:1~1:3。
上述制备方法制得的比率荧光分子印迹聚合物。
上述比率荧光分子印迹聚合物在制备C型利钠肽特异性识别产品中的应用。
有益效果:本发明所制备的比率荧光分子印迹聚合物,与传统的分子印迹聚合物相比较,采用了比率荧光分析和表面分子印迹技术,通过一步法优化了比率荧光分子印迹聚合物的制备,耗时少,工艺简单。本发明合成的比率荧光分子印迹聚合物对印迹分子具有高度的亲和力和选择性,且制备成本低廉,工艺稳定,能耗小,可以对生物样品中C型利钠肽进行高效的分离和检测,可望解决生物标志物难以分离、检测的难题。
具体实施方式
实施例1:
(1). 氨基化二氧化硅的制备:15 mL氨水加到250 mL无水乙醇中,室温下搅拌均匀,30 min后加入2.5 mL TEOS,反应12 h,再加入1.25 mL TEOS和0.1 mL APTES。12 h后,产物离心分离,乙醇和去离子水洗至中性,然后分散至10 mL超纯水中,得到溶液A,4 ℃保存。
(2). APTES修饰CDs的制备:将0.4 g柠檬酸钠加入8 mL超纯水中搅拌溶解,再加入1.5 mL APTES,转移至反应釜中200 ℃反应2 h。反应液用500 KDa的透析袋透析12 h后,氮吹仪吹至5 mL,得到APTES-CDs,置于4 ℃避光保存。
(3). APTES修饰NBD的制备:取洁净干燥的两口烧瓶,装干燥管,用锡纸包好。在避光条件下,取11.8 mg NBD-Cl置于三口烧瓶中,依次加入500 μL APTES,10 mL无水乙醇,通30 min氮气,冰浴搅拌24 h,得到APTES-NBD,装入试剂瓶内,密封避光保存备用。
(4). 比率荧光分子印迹聚合物的制备:将3 mL溶液A离心除去上清液,加入25 mLPBS,超声分散后,加入5 mg CNP、200μL APTES-CDs以及600μL APTES-NBD,搅拌1.5 h后,加入100μL TEOS和200μL氨水,搅拌过夜。反应结束后离心除去上清液,用超纯水洗涤,除去未反应完的单体,再将10% (v/v) HAc-10% (w/v) SDS溶液反复超声洗涤,直至上清液紫外检测不到模板分子为止,最后用超纯水洗去多余的HAc和SDS,将产物4 ℃冷冻干燥12 h,得到比率荧光分子印迹聚合物。
实施例2:
(1). 氨基化二氧化硅的制备:15 mL氨水加到250 mL无水乙醇中,室温下搅拌均匀,30 min后加入2.5 mL TEOS,反应12 h,再加入1.25 mL TEOS和0.1 mL APTES。12 h后,产物离心分离,乙醇和去离子水洗至中性,然后分散至10 mL超纯水中,得到溶液A,4 ℃保存。
(2). APTES修饰CDs的制备:将0.4 g柠檬酸钠加入8 mL超纯水中搅拌溶解,再加入2.4 mL APTES,转移至反应釜中200 ℃反应2 h。反应液用500 KDa的透析袋透析12 h后,氮吹仪吹至5 mL,得到APTES-CDs,置于4 ℃避光保存。
(3). APTES修饰NBD的制备:取洁净干燥的两口烧瓶,装干燥管,用锡纸包好。在避光条件下,取11.8 mg NBD-Cl置于三口烧瓶中,依次加入650 μL APTES,10 mL无水乙醇,通30 min氮气,冰浴搅拌24 h,得到APTES-NBD,装入试剂瓶内,密封避光保存备用。
(4). 比率荧光分子印迹聚合物的制备:将5 mL溶液A离心除去上清液,加入25 mLPBS,超声分散后,加入15 mg CNP、200μL APTES-CDs以及400μL APTES-NBD,搅拌1.5 h后,加入200μL TEOS和300μL氨水,搅拌过夜。反应结束后离心除去上清液,用超纯水洗涤,除去未反应完的单体,再将10% (v/v) HAc-10% (w/v) SDS溶液反复超声洗涤,直至上清液紫外检测不到模板分子为止,最后用超纯水洗去多余的HAc和SDS,将产物4 ℃冷冻干燥12 h,得到比率荧光分子印迹聚合物。
实施例3:
(1). 氨基化二氧化硅的制备:15 mL氨水加到250 mL无水乙醇中,室温下搅拌均匀,30 min后加入2.5 mL TEOS,反应12 h,再加入1.25 mL TEOS和0.1 mL APTES。12 h后,产物离心分离,乙醇和去离子水洗至中性,然后分散至10 mL超纯水中,得到溶液A,4 ℃保存。
(2). APTES修饰CDs的制备:将0.4 g柠檬酸钠加入8 mL超纯水中搅拌溶解,再加入2 mL APTES,转移至反应釜中200 ℃反应2 h。反应液用500 KDa的透析袋透析12 h后,氮吹仪吹至5 mL,得到APTES-CDs,置于4 ℃避光保存。
(3). APTES修饰NBD的制备:取洁净干燥的两口烧瓶,装干燥管,用锡纸包好。在避光条件下,取11.8 mg NBD-Cl置于三口烧瓶中,依次加入600 μL APTES,10 mL无水乙醇,通30 min氮气,冰浴搅拌24 h,得到APTES-NBD,装入试剂瓶内,密封避光保存备用。
(4). 比率荧光分子印迹聚合物的制备:将5 mL溶液A离心除去上清液,加入25 mLPBS,超声分散后,加入10 mg CNP、200μL APTES-CDs以及600μL APTES-NBD,搅拌1.5 h后,加入200μL TEOS和200μL氨水,搅拌过夜。反应结束后离心除去上清液,用超纯水洗涤,除去未反应完的单体,再将10% (v/v) HAc-10% (w/v) SDS溶液反复超声洗涤,直至上清液紫外检测不到模板分子为止,最后用超纯水洗去多余的HAc和SDS,将产物4 ℃冷冻干燥12 h,得到比率荧光分子印迹聚合物。
实施例4:
(1). 氨基化二氧化硅的制备:15 mL氨水加到250 mL无水乙醇中,室温下搅拌均匀,30 min后加入2.5 mL TEOS,反应12 h,再加入1.25 mL TEOS和0.1 mL APTES。12 h后,产物离心分离,乙醇和去离子水洗至中性,然后分散至10 mL超纯水中,得到溶液A,4 ℃保存。
(2). APTES修饰CDs的制备:将0.4 g柠檬酸钠加入8 mL超纯水中搅拌溶解,再加入2 mL APTES,转移至反应釜中200 ℃反应2 h。反应液用500 KDa的透析袋透析12 h后,氮吹仪吹至5 mL,得到APTES-CDs,置于4 ℃避光保存。
(3). APTES修饰NBD的制备:取洁净干燥的两口烧瓶,装干燥管,用锡纸包好。在避光条件下,取11.8 mg NBD-Cl置于三口烧瓶中,依次加入550 μL APTES,10 mL无水乙醇,通30 min氮气,冰浴搅拌24 h,得到APTES-NBD,装入试剂瓶内,密封避光保存备用。
(4). 比率荧光分子印迹聚合物的制备:将4 mL溶液A离心除去上清液,加入25 mLPBS,超声分散后,加入10 mg CNP、200μL APTES-CDs以及800μL APTES-NBD,搅拌1.5 h后,加入200μL TEOS和200μL氨水,搅拌过夜。反应结束后离心除去上清液,用超纯水洗涤,除去未反应完的单体,再将10% (v/v) HAc-10% (w/v) SDS溶液反复超声洗涤,直至上清液紫外检测不到模板分子为止,最后用超纯水洗去多余的HAc和SDS,将产物4 ℃冷冻干燥12 h,得到比率荧光分子印迹聚合物。
实施例5:
(1). 氨基化二氧化硅的制备:15 mL氨水加到250 mL无水乙醇中,室温下搅拌均匀,30 min后加入2.5 mL TEOS,反应12 h,再加入1.25 mL TEOS和0.1 mL APTES。12 h后,产物离心分离,乙醇和去离子水洗至中性,然后分散至10 mL超纯水中,得到溶液A,4 ℃保存。
(2). APTES修饰CDs的制备:将0.4 g柠檬酸钠加入8 mL超纯水中搅拌溶解,再加入2 mL APTES,转移至反应釜中200 ℃反应2 h。反应液用500 KDa的透析袋透析12 h后,氮吹仪吹至5 mL,得到APTES-CDs,置于4 ℃避光保存。
(3). APTES修饰NBD的制备:取洁净干燥的两口烧瓶,装干燥管,用锡纸包好。在避光条件下,取11.8 mg NBD-Cl置于三口烧瓶中,依次加入600 μL APTES,10 mL无水乙醇,通30 min氮气,冰浴搅拌24 h,得到APTES-NBD,装入试剂瓶内,密封避光保存备用。
(4). 比率荧光分子印迹聚合物的制备:将2 mL溶液A离心除去上清液,加入25 mLPBS,超声分散后,加入5 mg CNP、100 μL APTES-CDs以及300 μL APTES-NBD,搅拌1.5 h后,加入100 μL TEOS和100μL氨水,搅拌过夜。反应结束后离心除去上清液,用超纯水洗涤,除去未反应完的单体,再将10% (v/v) HAc-10% (w/v) SDS溶液反复超声洗涤,直至上清液紫外检测不到模板分子为止,最后用超纯水洗去多余的HAc和SDS,将产物4 ℃冷冻干燥12 h,得到比率荧光分子印迹聚合物。
实施例6:
(1). 氨基化二氧化硅的制备:15 mL氨水加到250 mL无水乙醇中,室温下搅拌均匀,30 min后加入2.5 mL TEOS,反应12 h,再加入1.25 mL TEOS和0.1 mL APTES。12 h后,产物离心分离,乙醇和去离子水洗至中性,然后分散至10 mL超纯水中,得到溶液A,4 ℃保存。
(2). APTES修饰CDs的制备:将0.4 g柠檬酸钠加入8 mL超纯水中搅拌溶解,再加入2 mL APTES,转移至反应釜中200 ℃反应2 h。反应液用500 KDa的透析袋透析12 h后,氮吹仪吹至5 mL,得到APTES-CDs,置于4 ℃避光保存。
(3). APTES修饰NBD的制备:取洁净干燥的两口烧瓶,装干燥管,用锡纸包好。在避光条件下,取11.8 mg NBD-Cl置于三口烧瓶中,依次加入600 μL APTES,10 mL无水乙醇,通30 min氮气,冰浴搅拌24 h,得到APTES-NBD,装入试剂瓶内,密封避光保存备用。
(4). 比率荧光分子印迹聚合物的制备:将3 mL溶液A离心除去上清液,加入25 mLPBS,超声分散后,加入10 mg CNP、300μL APTES-CDs以及600μL APTES-NBD,搅拌1.5 h后,加入150 μL TEOS和200μL氨水,搅拌过夜。反应结束后离心除去上清液,用超纯水洗涤,除去未反应完的单体,再将10% (v/v) HAc-10% (w/v) SDS溶液反复超声洗涤,直至上清液紫外检测不到模板分子为止,最后用超纯水洗去多余的HAc和SDS,将产物4 ℃冷冻干燥12 h,得到比率荧光分子印迹聚合物。
测试实施例:
取上述实施例3中合成的CDs、NBD以及比率荧光分子印迹聚合物进行如下测试实验。
测试实施例1:透射电镜表征
图1是本发明合成的比率荧光分子印迹聚合物透射电镜图,该聚合物具有高度的球形结构,分散均匀。
测试实施例2: 荧光光谱图
图2是本发明合成的CDs、NBD以及比率荧光分子印迹聚合物荧光光谱图。荧光仪狭缝宽度为10 nm,电压为700 V,在350 nm激发波长下,所得聚合物保持了CDs和NBD的荧光特性,具有双发射荧光。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。