CN115521401A - 一种可选择性靶向生物标志物的聚合物的制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可选择性靶向生物标志物的聚合物的制备方法及用途。本发明利用高通量筛选法简单快速的设计筛选出可靶向一系列生物标志物的聚合物。该聚合物对一系列生物标志物具有较高的亲和力和优异的选择性，亲和力常数达10‑11M，可以代替蛋白抗体，应用于靶向识别肿瘤细胞表面过量表达的生物标志物受体，或作为抗肿瘤免疫检查点阻断剂，用于肿瘤的免疫治疗。将聚合物包裹荧光量子点，可在7min内实现血清样品中心衰标志物的荧光定量检测。该聚合物是由化学方法制备，合成过程与再生过程简单，可重复使用，并且具有较高的稳定性、较长的使用寿命和较强的抗恶劣环境的能力。

Description

一种可选择性靶向生物标志物的聚合物的制备方法及用途
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，特别涉及一种可选择性靶向生物标志物的聚合物的制备方法及用途。
背景技术
生物标志物(如蛋白质、激素、酶)存在于患者的血液、体液、细胞或组织中，在这些组织中异常产生，或在疾病发生和发展过程中因病变细胞基因表达的改变而改变。生物标志物对于表征所有生物体的特定生理和病理条件具有重要意义，已成功应用于诊断、预后和风险预测。
基于抗原-抗体的免疫亲和作用已被广泛应用于生物标志物的靶向识别，并在疾病的诊断与治疗中取得了很大进展。然而，在临床医学应用中，这些生物的抗体存在易失活、稳定性差、价格昂贵、具有免疫原性等缺点。因此，如果能够仿生抗原-抗体的免疫亲和作用，设计合成出可选择性识别生物标志物的非生物人工抗体，代替蛋白抗体，则可极大降低疾病诊断和治疗的成本。
发明内容
本发明目的在于克服由天然抗体及单克隆抗体为核心的检测治疗技术自身的众多缺陷，利用高通量筛选法简单快速的设计筛选可靶向一系列生物标志物的聚合物。
所述的可选择性靶向生物标志物的聚合物的制备方法为：以基本单体、功能单体、交联剂和引发剂配制混合反应液；将混合反应液加入到检测池中，原位聚合得到聚合物薄层；冲洗除去未反应的单体后加入生物标志物或其表位多肽孵育，生物标志物或其表位多肽被吸附在聚合物薄层上，通过检测聚合物薄层的吸附量或检测上清液中残余的生物标志物或其表位多肽的量，筛选出亲和力高的聚合物合成配方；然后以生物标志物或其表位多肽为模板分子，采用筛选出的配方通过分子印迹方法制备可选择性靶向生物标志物的聚合物纳米颗粒，洗脱模板分子并用透析袋透析纯化。
所述的基本单体为N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)、N-叔丁基丙烯酰胺(TBAm)、N-苯基丙烯酰胺(PAM)中的一种或几种。
所述的功能单体为丙烯酸(AAc)、甲基丙烯酸(MAA)、乙烯基磺酸钠(SVS)、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(APM)、(3-丙烯酰胺丙基)三甲基氯化铵(ATC)、1-乙烯基咪唑(IM)、丙烯酰胺(AAm)、4-乙烯基苯硼酸(VPBA)、(3-丙烯酰胺丙基)三甲基氯化铵(QAM)、N-3-二甲氨基丙基甲基丙烯酰胺(DMAPA)、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)中的一种或几种。
所述的交联剂为N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、N,N'-乙烯基双丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一种或几种。
所述的引发剂为过硫酸铵、偶氮二异丁腈或四甲基乙二胺。引发剂的用量为0.2-3mg/mL。
所述的基本单体、功能单体和交联剂中，交联剂的质量百分占比为2-10wt％。
所述原位聚合在氮气氛围或密封条件下进行，聚合反应温度为25-80℃，聚合反应时间为2-72h。
所述的生物标志物包括但不限于表皮生长因子受体(EGFR)、N端脑钠肽前体(NT-proBNP)、B型钠尿肽(BNP)、阻断剂对程序性死亡受体-1(PD-1)、程序性死亡配体-1(PD-L1)、小细胞肺癌簇4抗原(CD-24)、分化抗原20(CD-20)。
所述的分子印迹方法的具体步骤为：采用筛选出的配方配制混合反应液，再加入表面活性剂和相应的生物标志物或其表位多肽，超声通氮气5-30min脱除溶液中的氧气，再将反应液加入到反应釜中，搅拌聚合反应得到聚合物纳米颗粒，所述聚合反应的条件与原位聚合合成聚合物薄层相同。
所述的表面活性剂为十二烷基硫酸钠或十六烷基三甲基溴化铵，所述的表面活性剂的用量为0.1-0.4mg/mL。
相应的生物标志物或其表位多肽的加入量为0.05-3mg/mL。
所述的相应的生物标志物或其表位多肽修饰在二氧化硅微球、四氧化三铁磁球或玻璃珠微球的表面后再加入混合反应液中再进行聚合反应。
上述混合反应液中还加入荧光染料、荧光量子点、磁性纳米颗粒、免疫激动剂、化疗药物、光热剂或光动剂。
所述搅拌的转速为300-1000rpm。
所述的洗脱模板分子的方法为：通过升高温度到50-90℃、或降低温度到0-10℃、或加入0.5-5M的NaCl水溶液、或加入0.1-0.3M的醋酸水溶液，搅拌反应2-24h洗脱模板分子。
上述制备的可选择性靶向生物标志物的聚合物在制备选择性靶向识别肿瘤细胞表面抗原、靶向识别循环肿瘤细胞、或抗肿瘤免疫检查点阻断制剂中的应用。
上述制备的可选择性靶向生物标志物的聚合物包裹荧光染料、荧光量子点或磁性纳米颗粒，应用于生物标志物的定量检测。
上述制备的可选择性靶向生物标志物的聚合物包裹免疫激动剂、化疗药物、光热剂、光动剂和磁性纳米颗粒。
本发明制备的聚合物对一系列生物标志物具有较高的亲和力和优异的选择性，亲和力常数达10-11M，可以代替蛋白抗体；该聚合物是由化学方法制备，合成过程与再生过程简单，可重复使用，并且具有较高的稳定性、较长的使用寿命和较强的抗恶劣环境的能力，克服了蛋白抗体存在成本高、制备效率低、筛选周期长、易变性难保存、具有免疫原性等缺点。聚合物通过靶向识别肿瘤细胞表面过量表达的生物标志物受体，可选择性捕获肿瘤细胞，用于癌症的早期诊断。聚合物包裹荧光量子点，可在7min内实现血清样品中心衰标志物的荧光定量检测，线性范围为0.25～10,000pg/mL，检测限为0.208pg/mL(S/N＝3)，回收率为98.9～99.5％。聚合物可作为抗肿瘤免疫检查点阻断剂，通过选择性靶向识别免疫检查点，可阻断T细胞或巨噬细胞与肿瘤细胞的结合，从而可抑制肿瘤细胞的免疫逃逸，促使巨噬细胞、T细胞等免疫细胞杀死肿瘤细胞，提高宿主免疫系统对肿瘤细胞的攻击性，可用于肿瘤的免疫治疗。
附图说明
图1是实施例二中可选择性靶向BNP的聚合物(配方：NP178)的扫描电镜图。(a)图为非印迹聚合物纳米颗粒，(b)图为分子印迹聚合物纳米颗粒。
图2是实施例二中可选择性靶向NT-proBNP的聚合物(配方：NP279)的扫描电镜图。(a)图为非印迹聚合物纳米颗粒，(b)图为分子印迹聚合物纳米颗粒。
图3是实施例二中可选择性靶向EGFR的聚合物(配方：NP278)的扫描电镜图。左图为非印迹聚合物，右图为分子印迹聚合物。
图4是实施例二中合成的PD-1/PD-L1免疫检查点阻断剂(配方：NP135)的扫描电镜图。右图为免疫检查点阻断剂，左图为非印迹聚合物纳米颗粒。
图5是实施例二中合成的CD-24免疫检查点阻断剂(配方：NP220)的扫描电镜图。左图为免疫检查点阻断剂，右图为非印迹聚合物纳米颗粒。
图6是实施例三中(a)包裹碳量子点的分子印迹聚合物纳米颗粒(配方：NP178)的扫描电子显微镜图，(b)包裹碳量子点的分子印迹聚合物纳米颗粒(配方：NP178)的透射电子显微镜图。
图7是二氧化硅包覆的四氧化三铁磁性纳米颗粒(magNP-SiO2)的透射电镜图。
图8是实施例三中(a)固相印迹合成的包裹碳量子点的分子印迹聚合物纳米颗粒(配方：NP178)的扫描电子显微镜图，(b)固相印迹合成的包裹碳量子点的分子印迹聚合物纳米颗粒(配方：NP178)的透射电子显微镜图。
图9是实施例三中(a)包裹量子点的非印记聚合物纳米颗粒(配方：NP178)的扫描电子显微镜图，(b)透射电子显微镜图。
图10是实施例三中(a)包裹碳量子点的印迹聚合物纳米颗粒(配方：NP178)对血清中BNP浓度的检测限，(b)在相同条件下合成的包裹碳量子点的印迹聚合物(配方：NP178)对同一个BNP血清样品(浓度为150pg/mL)的测试结果，(c)合成的同一批次的包裹碳量子点的印迹聚合物(配方：NP178)分别测试10个浓度均为150pg/mL的BNP血清样品的结果。
图11是实施例四中流式细胞仪表征分子印迹聚合物纳米颗粒(配方：NP278)对三株细胞的结合。
图12是实施例四中石英晶体微天平(QCM)法测试分子印迹纳米颗粒(配方：NP278)与MCF-7肿瘤细胞的细胞膜结合的频率和质量变化结果(左图)，以及分子印迹纳米颗粒(配方：NP278)与三株细胞的细胞膜结合的频移结果(右图)。
图13是实施例四中合成的包裹磁性纳米颗粒的印迹聚合物(配方：NP278)对肿瘤细胞的捕获效果。
图14是实施例五中合成的包裹磁性Fe3O4纳米颗粒的PD-1/PD-L1免疫检查点阻断剂(配方：NP135)的扫描电镜SEM图。左边图为免疫检查点阻断剂，右边为非印迹聚合物纳米颗粒。
图15是实施例五中合成的包裹磁性Fe3O4纳米颗粒的PD-1/PD-L1免疫检查点阻断剂(配方：NP135)的透射电镜TEM图。左边图为免疫检查点阻断剂，右边为非印迹聚合物纳米颗粒。
图16是实施例五中流式细胞仪表征包裹磁性Fe3O4纳米颗粒的PD-1/PD-L1免疫检查点阻断剂(配方：NP135)与肿瘤细胞和T细胞的特异性结合。
图17是实施例五中合成的包裹磁性Fe3O4纳米颗粒的PD-1/PD-L1免疫检查点阻断剂(配方：NP135)对肿瘤细胞的免疫抑制阻断效果。
图18是实施例六中合成的CD-24免疫检查点阻断剂(配方：NP220)包裹免疫激动剂咪喹莫特R837的扫描电镜图。
图19是实施例六中石英晶体微天平(QCM)法测试CD-24阻断剂(配方：NP220)与CT26肿瘤细胞的细胞膜结合的频率和质量变化结果(左图)，以及CD-24阻断剂(配方：NP220)与CT26、ID8、G422、B16肿瘤细胞的细胞膜结合的频移结果(右图)。
具体实施方式
实施例一：高通量筛选初步获得高亲和力的单体配方
将所需全部单体配制成200mM的储液，按照表1中配方比例在96孔板中进行添加，最后加入50μL引发剂过硫酸铵，浓度为0.3mg/mL，每个微孔总体积为200μL，总单体浓度为200mM。使用密封贴纸密封96孔板并在70℃的烘箱中反应3小时。反应结束后，去除上清液，使用50mM PBS(pH 7.2)缓冲液洗涤3次，后加入BSA溶液(1％w/v)封闭30分钟，再用50mMPBS(pH 7.2)洗涤3次。最后加入150μL荧光修饰的生物标志物表位多肽溶液(100μg/mL，溶于上述PBS缓冲液)在摇床上孵育3h，取100μL上清液进行荧光强度的检测确定上清中目标物含量变化，最终确定靶向生物标志物的纳米聚合物合成的最佳配方。
靶向EGFR的聚合物合成配方为N-异丙基丙烯酰胺的用量为40.5％，N-叔丁基丙烯酰胺的用量为40％，丙烯酸的用量为7.5％，1-乙烯基咪唑用量为5％，丙烯酰胺用量为5％，N,N'-亚甲基双丙烯酰胺的用量为2％，即配方NP278。
靶向脑钠肽(BNP)的聚合物合成配方为丙烯酸(AAC)的用量为10％，N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)的用量为53％，N-叔丁基丙烯酰胺(TBAm)为用量为35％，N,N'-亚甲基双丙烯酰胺的用量为2％。，即配方NP178。
靶向N端脑钠肽前体(NT-proBNP)的聚合物合成配方为1-乙烯基咪唑(IM)的用量为30％、丙烯酸(AAC)的用量为5％，N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(APM)的用量为1.7％，N-叔丁基丙烯酰胺(TBAm)的用量为30％，N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)的用量为31.3％，即配方NP279。
靶向PD-1/PD-L1免疫检查点较好的配方为带负电单体丙烯酸(AAc)20％，基本单体N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)58％，N-叔丁基丙烯酰胺(TBAm)20％，交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)2％，即配方NP135。
靶向CD24的聚合物配方为N-异丙基丙烯酰胺的用量为41％，N-叔丁基丙烯酰胺的用量为30％，丙烯酸的用量为22％，丙烯酰胺用量为5％，N,N'-亚甲基双丙烯酰胺的用量为2％，即配方NP220。
靶向CD20的聚合物合成配方为丙烯酸(AAc)的用量为15％，N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)的用量为43％，N-叔丁基丙烯酰胺(TBAm)的用量为40％，交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)的用量为2％，即配方NP120。
表1靶向生物标志物的聚合物的合成配方
Figure BDA0003830887930000041
Figure BDA0003830887930000051
Figure BDA0003830887930000061
Figure BDA0003830887930000071
Figure BDA0003830887930000081
Figure BDA0003830887930000091
Figure BDA0003830887930000101
Figure BDA0003830887930000111
实施例二：利用分子印迹技术进一步提高聚合物对生物标志物的亲和力和选择性
根据实施例一高通量筛选获得的对EGFR、BNP、NT-proBNP、PD-1/PD-L1、CD24和CD20等生物标志物的表位多肽具有高亲和力的配比后，分别选择生物标志物的表位多肽作为模板分子，以实施例一得到的最优配比配制反应混合液各50mL，然后分别加入多肽(EGFR：5mg；BNP：1mg；NT-proBNP：2mg；PD-1：10mg；PD-L1：10mg；CD24：10mg；CD20：10mg)作为模板分子。将以上溶液混合在圆底烧瓶中后使用瓶塞和封口膜将圆底烧瓶密封并通入氮气30min，辅助磁力搅拌或机械搅拌，通过沉淀聚合或反相乳液聚合在不同温度下反应一定的时间(EGFR：40℃，12h；BNP：45℃，12h；NT-proBNP：40℃，12h；PD-1：65℃，3h；PD-L1：65℃，3h；CD24：65℃，3h；CD20：65℃，3h)，合成聚合物纳米颗粒。洗脱脱除模板，利用透析袋透析7天后得到可选择性靶向生物标志物的聚合物。或者将表位多肽模板分子固定在材料上进行印迹，首先制备固相支持载体，可为二氧化硅微球、四氧化三铁微球、玻璃珠等微球，在微球表面修饰氨基、羧基以及其他化学键，其后将多肽固定在固相载体表面，加入实施例一得到的最优配比配制反应混合液50mL，辅助机械搅拌，通过沉淀聚合或反相乳液聚合在45℃下反应12h，聚合完成后通过升高温度到65℃或降低温度到4℃洗脱固相模板分子，得到可选择性靶向生物标志物的聚合物纳米颗粒。固相印迹的具体过程见实施例3。其表观形貌见图1-图5的扫描电子显微镜图。
利用生物膜干涉技术(BLI)测定聚合物与表位多肽、生物标志物之间的亲和力，亲和力大小由实验所得的聚合物与表位多肽、生物标志物之间的结合亲和常数KD值说明，结果如表2-表6所示，制备的聚合物对表位多肽、生物标志物有很高的亲和力。印迹聚合物对BNP的KD值可达3.17×10-10M，对NT-proBNP的KD值可达6.75×10-09M，对EGFR的KD值可达4.89×10-10M，对PD-1的KD值可达8.63×10-10M，对PD-L1的KD值可达1.36×10-11M，对CD24的KD值可达2.18×10-11，与非印迹聚合物相比KD值相差2-4个数量级，说明分子印迹技术大大提高了聚合物对生物标志物的亲和力，可选择性靶向生物标志物。
表2.生物膜干涉技术(BLI)测定印迹聚合物、非印迹聚合物与BNP之间的亲和力
Figure BDA0003830887930000112
表3.生物膜干涉技术(BLI)测定印迹聚合物、非印迹聚合物与NT-proBNP之间的亲和力
聚合物 K<sub>D</sub> k<sub>on</sub> k<sub>dis</sub> R<sup>2</sup>
分子印迹聚合物(配方：NP279) 6.75×10<sup>-09</sup> 2.75×10<sup>05</sup> 1.86×10<sup>-03</sup> 0.9219
非印迹聚合物(配方：NP279) 2.03×10<sup>-07</sup> 4.22×10<sup>04</sup> 8.57×10<sup>-03</sup> 0.8911
表4.BLI测定纳米颗粒对EGFR蛋白、人血清白蛋白和细胞色素C的亲和力
Figure BDA0003830887930000121
表5.BLI测定免疫检查点阻断剂对PD-1/PD-L1表位多肽的亲和力
Figure BDA0003830887930000122
表6.BLI测定免疫检查点阻断剂对CD24表位多肽、杂质肽和CD24蛋白的亲和力
Figure BDA0003830887930000123
实施例三：包裹碳量子点的聚合物纳米颗粒的合成及从血清样品中定量检测BNP
1.包裹碳量子点的聚合物纳米颗粒的合成
(1)碳量子点的合成
将4.2g柠檬酸溶于40mL去离子水中，完全溶解后加入1.34mL乙二胺。然后转移到100mL聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中。将反应容器密封，并在200℃下保持5小时。冷却至室温后，用1000Da透析袋透析24小时。收集与离心管中室温放置备用。
(2)包裹碳量子点的聚合物纳米颗粒的合成
根据实施例一和实施例二得到的可选择性靶向BNP和NT-proBNP的聚合物合成配比(BNP配方为：NP178；NT-proBNP配方为：NP279)，配制反应混合液50mL，加入表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)10mg，BNP表位多肽1mg或NT-proBNP表位多肽2mg，再用注射器将1mL碳量子点溶液(10.8％,w/v)加入到反应体系中，通氮气30min脱除氧气，将反应液加入到圆底烧瓶中，辅助磁力搅拌或机械搅拌，在65℃下反应3h。反应结束后，加入5M NaCl溶液10mL搅拌10min，8000rpm离心5min弃去上清，以除去模板分子和未反应单体，纯水清洗三次后离心获得包裹碳量子点的聚合物纳米颗粒。聚合物纳米颗粒的扫描电子显微镜及透射电子显微镜结果如图6所示。
(3)固相印迹合成包裹碳量子点的聚合物纳米颗粒
①固相模板的合成
磁性四氧化三铁Fe3O4纳米颗粒的合成(magNP)：将1.3g三氯化铁六水合物、0.62g十六烷基三甲基溴化铵和2.6g乙酸钠溶解在40mL乙二醇中。将其置于80℃的磁力搅拌下1小时。将均匀的黄色溶液转移到聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中。反应容器密封并在200℃下反应10h。反应后，等待容器冷却至室温。用磁力倾析法分离黑色沉淀物。随后的产品用去离子水清洗五次，用乙醇清洗三次。最终产物在60℃真空干燥12h。
二氧化硅包覆磁性Fe3O4(magNP@SiO2)：将100mg磁性Fe3O4纳米颗粒通过超声分散在87.1mL乙醇水溶液(80％，v/v)中。向混合物中添加1.4mL氨水(25％，w/v)并超声处理1min。然后添加11.5mL正硅酸乙酯，然后使用机械搅拌搅拌6h。用磁铁分离样品，用水(3×200mL)和乙醇(3×100mL)洗涤，并在40℃的真空烘箱中干燥12h。产物的透射电子显微镜结果如图8所示。
磁性纳米粒子表面氨基功能化(magNP@SiO2-NH2)：在250mL圆底烧瓶中加入300mg二氧化硅包覆的四氧化三铁纳米粒子(magNP@SiO2)，加入180mL乙醇/水(3:1)在室温下超声30min。用密封膜密封烧瓶，并在40℃氮气气氛下机械搅拌。加入1.8mL 3-(氨丙基)三甲氧基硅烷，并反应过夜。用磁倾析法分离氨基功能化产物，用乙醇清洗三次，用去离子水清洗三次。产物在60℃真空下干燥10小时。
在magNP@SiO2-NH2上固定模板肽：使用4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸3-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)将模板肽接合到磁性纳米粒子上。具体步骤如下，将100mg氨基功能化的磁性纳米粒子和1mg sulfo-SMCC混合用去离子水定容至5mL，并在室温下培养30min。用PBS(0.1M，pH 7.4)清洗未反应的sulfo-SMCC。将80mg sulfo-SMCC修饰的磁性纳米粒子和1mg接有巯基的模板多肽溶于1mL PBS(0.1M，pH 7.4)中，室温孵育30min。
固相印迹合成包裹碳量子点的聚合物纳米颗粒：单体总浓度为13mM，溶液体系为50mL。称取38.98mg NIPAm、28.9mg TBAm、4.6μL丙烯酸(AAC)，制备预聚混合物，加入1mL碳量子点。混合溶液超声30分钟，然后将分散在10mL去离子水中的80mg肽修饰磁性纳米粒子添加到烧瓶中。用密封膜密封烧瓶，通氮气30min以排出溶液内的空气。在机械搅拌下，向反应中加入50mg APS和30mL N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)，在45℃下反应12h。用磁铁收集产品，用去离子水冲洗五次，直到溶液在室温下澄清。然后添加10mL去离子水，并将其置于4℃冰箱中冷却6h。剧烈摇晃后，用磁铁分离，上清液为固相印迹合成的包裹碳量子点的聚合物纳米颗粒。其扫描电子显微镜结果如图8(a)所示，透射电子显微镜结果如图8(b)所示。
合成包裹碳量子点的非印迹纳米颗粒的过程与上述相同，只是在预聚合混合液中不加入模板分子。其扫描电镜结果如图9(a)所示，透射电镜结果如图9(b)所示。
利用生物膜干涉技术(BLI)测定包裹碳量子点的印迹聚合物纳米颗粒与BNP表位多肽之间的亲和力，结果如表7所示，可以看出包裹碳量子点的聚合物纳米颗粒对BNP表位多肽的KD值达2.47×10-11M，与非印迹聚合物相比KD值相差2个数量级。以上结果表明，说明包裹碳量子点的印迹聚合物纳米颗粒对BNP表位多肽具有优异的亲和力和选择性。
表7.生物膜干涉技术测定包裹碳量子点印迹聚合物、非印迹聚合物与BNP之间的亲和力
聚合物 K<sub>D</sub> k<sub>on</sub> k<sub>dis</sub> R<sup>2</sup>
分子印迹聚合物(配方NP178) 2.47×10<sup>-11</sup> 2.25×10<sup>08</sup> 5.55×10<sup>-03</sup> 0.9306
非印迹聚合物(配方NP178) 2.61×10<sup>-09</sup> 1.75×10<sup>06</sup> 4.56×10<sup>-03</sup> 0.938
2.基于碳量子点荧光检测实现血清样本中BNP的定量检测
标准曲线的测定：配置一系列已知BNP浓度的血清(0、50、100、200、300、400、500、600pg/mL)。首先在96孔板中加入根据权利实施例3中合成的印迹聚合物纳米颗粒(配方NP178)120μL(1.46mg/mL)，使用酶标仪测定其在420nm处的荧光强度值，加入事先配制好的已知浓度血清样本40μL，避光待反应5min后，测定反应后荧光强度值，将反应前后的荧光值做差值并减去纯血清的荧光值，将各浓度点进行线性拟合，得到标准曲线。
检测限测定：使用3Sb/m方程计算出检测限(LOD)为0.208pg/mL。Sb是空白测量的标准偏差(n＝11)，m是校准曲线的斜率。在BNP浓度为0.25pg/mL到10,000pg/mL的范围内具有线性关系。结果如图10(a)所示。
回收率测定：测试了血清样本中BNP浓度分别160,200,240pg/mL的回收率，如表8所示，可以看出，回收率为98.9～99.5％。
表8.检测方法的回收率测定
BNP浓度(pg/mL) 回收率(％,n＝5) 相对标准偏差RSD(％,n＝5)
160 99 2.55
200 99.5 2.25
240 98.9 1.65
实验方法稳定性测试：实验分为两部分：(1)在相同的条件下合成十批包裹量子点的印迹聚合物纳米颗粒(配方NP178)，对BNP浓度为150pg/mL的血清样品进行10次测试。结果如图10(b)所示，相对标准偏差(RSD)为2.54％；(2)合成同一批包裹量子点的印迹聚合物纳米颗粒(配方NP178)，分别配制BNP浓度为150pg/mL的血清样品10份进行测试。结果如图10(c)所示，相对标准偏差(RSD)为3.13％。同时，整个检测过程只需7min，检测速度远远由于目前报道的BNP检测方法。
实施例四：可选择性靶向EGFR的聚合物纳米颗粒(配方NP278)的合成及肿瘤细胞的捕获检测
1.荧光标记的聚合物纳米颗粒的合成
取0.037g的N-异丙基丙烯酰胺，0.002g的N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，0.01g的十二烷基硫酸钠和0.002g的丙烯酰胺分别用1mL水溶解，取0.025g的N-叔丁基丙烯酰胺用0.5mL乙醇溶解，取4μL丙烯酸和3μL的1-乙烯基咪唑分别用1mL水溶解。最后，将所有的单体溶液，4mg的罗丹明B和10mg多肽模板分子混合均匀，最终溶液体积为50mL。将溶液加入100mL用锡纸包好的，洗净干燥的圆底烧瓶内，加入干净干燥的磁子后，封口。在磁力搅拌下，鼓吹氮气30min，用双面胶封住针孔，放入40℃的油浴中预热20min，加入引发剂，引发剂包括30mgAPS和20μL TEMED。在40℃的条件下反应12h，得到荧光标记的印迹聚合物纳米颗粒。反应液装入14000Da的透析袋中透析4天，通过洗脱、透析作用除去模板、未反应的单体、表面活性剂等。合成荧光标记的非印迹纳米颗粒的过程与上述相同，只是在预聚合混合液中不加入模板分子。
2.包裹磁性颗粒的聚合物的合成
取0.037g的N-异丙基丙烯酰胺，0.002g的N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，0.01g的十二烷基硫酸钠和0.002g的丙烯酰胺分别用1mL水溶解，取0.025g的N-叔丁基丙烯酰胺用0.5mL乙醇溶解，取4μL丙烯酸和3μL的1-乙烯基咪唑分别用1mL水溶解。最后，将所有的单体溶液和10mg多肽模板分子混合均匀，最终溶液体积为50mL，超声。溶液混合均匀后，将反应液转移到洗净干燥的三颈烧瓶中，印迹聚合物加入25μL磁球和10mg的多肽，未印迹聚合物加入25μL磁球。用胶塞和封口膜将烧瓶两端的开口密封，超声1min，使反应液、磁球和多肽均匀分散在溶液里。然后，将三颈烧瓶放入已升温至40℃的水浴锅中，将搅拌桨和机械搅拌器组装在一起后，打开机械搅拌器，调节其转速稳定为600rpm，搅拌10min后，在反应液中通氮气30min。加入引发剂，引发剂包括30mg APS和20μL TEMED。在40℃的条件下，反应12h回收反应液，得到磁性印迹和非印迹纳米颗粒。
3.流式细胞仪表征聚合物纳米颗粒与细胞的结合
荧光标记的印迹纳米颗粒和非印迹纳米颗粒过0.22μm滤菌膜后，分别用培养基配制成浓度为60μg/mL的溶液。在激光共聚焦皿中，45万细胞(3mL)贴壁培养4h，在显微镜下观察生长情况，弃掉培养基。分别用3mL的PBS，EGFR荧光抗体(PBS稀释100倍)，荧光标记的印迹纳米颗粒和非印迹纳米颗粒与三柱细胞共孵育30min，弃掉各溶液，用PBS清洗三次。胰酶消化后离心去上清液，用3mL 1％固定液固定。流式细胞仪测细胞与各组结合的荧光值。从图11所示的流式结果可以看到，EGFR的荧光抗体与三株细胞系结合的荧光强度表明A549和MCF-7为EGFR阳性表达细胞，WPMY-1为EGFR阴性表达细胞。荧光标记的分子印迹纳米颗粒与细胞共孵育3min后，A549和MCF-7癌细胞系荧光强度在105-107之间，且与EGFR荧光抗体的荧光强度相近，而WPMY-1细胞系显示出与PBS对照组相似的荧光强度，在104-105之间。同时，所有的细胞系在与荧光标记的非印迹纳米颗粒共孵育后均与对照组的荧光强度相同。因此，流式结果证实了分子印迹纳米颗粒对EGFR阳性表达细胞(A549和MCF-7)的选择性高于EGFR阴性表达的正常细胞(WPMY-1)的选择性。这些结果表明，分子印迹纳米颗粒通过与癌细胞上过表达的EGFR结合来特异性靶向癌细胞。
4.利用石英晶体微天平QCM表征聚合物纳米颗粒与细胞膜的特异性结合
将金芯片置于旋涂仪上，选用F模式，酒精清洗两次，去离子水清洗两次，然后滴上细胞膜碎片溶液旋涂(200μL)；旋涂结束后安装到QCM卡槽上，形成密闭腔室；打开泵的开关，设置50μL/min，先通入去离子水实现液相环境，待QCM曲线稳定后，再通入纳米颗粒溶液，测量二者的界面作用，待曲线稳定后再次通入去离子水，曲线再次稳定后通入去离子水清洗(200-300μL/min),然后在空气中排除管中水分，取下芯片，QCM卡槽用氮气吹干(保护内置电子元件)。从图12可以看出分子印迹纳米颗粒与EGFR阳性表达癌细胞膜(A549,MCF-7)结合频移可达-60Hz，非印迹纳米颗粒与阳性表达细胞膜结合频移仅有-12Hz左右；而无论是分子印迹纳米颗粒还是非印迹纳米颗粒与EGFR阴性表达的正常细胞膜WPMY-1的结合频移仅有-10Hz左右，证明了分子印迹纳米颗粒可以与EGFR阳性表达细胞特异性、高亲和性的结合。
5.肿瘤细胞的捕获
磁性纳米颗粒在使用时先烘干，用PBS缓冲液配制成2mg/mL的溶液。然后根据需求分别用PBS稀释成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/mL的溶液，备用。依次用500μL的0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/mL的磁性印迹纳米颗粒溶液分别和A549和MCF-7细胞共孵育。两株细胞数量均为2×105个。在37℃的摇床中孵育60min后，用血球计数板计算上清液中残留的细胞数量，得到不同浓度的磁性纳米人工抗体对两柱细胞的捕获率。从图13上面两组图可以看出，在含有2×105个肿瘤细胞的磷酸缓冲液中，随着磁性印迹纳米颗粒浓度的增加，对A549和MCF-7的捕获率也逐渐增加。当磁性印迹纳米颗粒浓度为1.2mg/mL时，磁性印迹纳米颗粒对A549和MCF-7的捕获率达94％左右。
为了进一步验证构建的磁性纳米颗粒对细胞的高捕获效率，测试了在不同时间段，磁性印迹纳米颗粒对MCF-7和A549的捕获效率。其细胞捕获效率如图13(左下)所示，当捕获时间从5min增加到60min时，磁性印迹纳米颗粒对阳性细胞A549的捕获效率从64.36％增加到94.45％，对MCF-7的捕获效率从68.12％增加到94.27％，在30min时，磁性分子印迹纳米颗粒对MCF-7细胞和A549细胞的捕获效率达最大并不再改变，这表明构建的磁性分子印迹纳米颗粒可以迅速地捕获肿瘤细胞。
最后，在含有2×105个肿瘤细胞的磷酸缓冲液中，将1.2mg/mL的磁性分子印迹和非印迹纳米颗粒分别与MCF-7、A549、WPMY-1在37℃的摇床中共培养30min后，用血球计数板计算上清液中残留的细胞数量，得到磁性分子印迹和非印迹纳米颗粒分别对A549、MCF-7、WPMY-1细胞的捕获率。从图13(右下)可以看出磁性分子印迹纳米颗粒对阳性细胞A549和MCF-7的捕获率分别为94.56％和96.12％，磁性非印迹纳米颗粒对阳性细胞A549和MCF-7的捕获率分别为70.15％和78.43％，而对于阴性细胞WPMY-1来说，无论是磁性分子印迹纳米颗粒(34.67％)或磁性非印迹纳米颗粒(46.25％)，其捕获效率明显要低于阳性细胞的捕获率。这说明构建的磁性分子印迹纳米颗粒具有很好的靶向肿瘤细胞的能力。
实施例五：包裹磁性Fe3O4纳米颗粒的PD-1/PD-L1免疫检查点阻断剂(配方NP135)的合成及应用
1.包裹磁性Fe3O4纳米颗粒的PD-1/PD-L1免疫检查点阻断剂的合成
根据实施例一和实施例二获得的可选择性靶向PD-1/PD-L1表位多肽的聚合物合成配比，配制反应混合液50mL，加入表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)10mg，PD-1和PD-L1表位多肽多肽各10mg，再用注射器将200μL磁性Fe3O4纳米颗粒溶液(10％,w/v)加入到反应体系中，通氮气30min脱除氧气，将反应液加入到圆底烧瓶中，辅助机械搅拌，在65℃下反应3h。反应结束后，加入5M NaCl溶液10mL搅拌10min，8000rpm离心5min弃去上清，以除去模板分子和未反应单体，纯水清洗三次后离心获得包裹磁性Fe3O4纳米颗粒的PD-1/PD-L1的免疫检查点阻断剂，合成包裹磁性Fe3O4的非印迹纳米颗粒的过程与上述相同，只是在预聚合混合液中不加入模板分子。其扫描电镜结果如图14所示，透射电镜结果如图15所示。
利用生物膜干涉技术(BLI)测定包裹磁性Fe3O4纳米颗粒的免疫检查点阻断剂与PD-1/PD-L1表位多肽之间的亲和力，结果如表9所示，可以看出包裹磁性Fe3O4纳米颗粒的免疫检查点阻断剂对PD-1表位多肽的KD值达4.54×10-9M，对PD-L1表位多肽的KD值达2.98×10-8M，与非印迹聚合物相比KD值相差2-3个数量级。同时测试了阻断剂与免疫检查点蛋白PD-1和PD-L1之间的亲和力，结果如表10所示可以看出包裹磁性Fe3O4纳米颗粒的阻断剂对PD-1蛋白的KD值达8.75×10-10M，对PD-L1蛋白的KD值达5.71×10-9M，与非印迹聚合物相比KD值相差3-4个数量级；而对杂质蛋白小鼠血清白蛋白和血红蛋白的KD值分别仅为3.05×10- 6M和2.79×10-5M(表11)。以上结果表明，说明包裹磁性Fe3O4纳米颗粒的免疫检查点阻断剂对PD-1/PD-L1表位多肽和PD-1/PD-L1蛋白具有优异的亲和力和选择性。
表9.BLI测定包裹磁性Fe3O4纳米颗粒的免疫检查点阻断剂(配方NP135)对PD-1/PD-L1表位多肽的亲和力
Figure BDA0003830887930000171
表10.包裹磁性Fe3O4纳米颗粒的PD-1/PD-L1阻断剂(配方NP135)对蛋白质亲和力
Figure BDA0003830887930000172
表11.包裹磁性Fe3O4纳米颗粒的PD-1/PD-L1阻断剂(配方NP135)的选择性
Figure BDA0003830887930000173
2.MTT法测定包裹磁性Fe3O4纳米颗粒的PD-1/PD-L1免疫检查点阻断剂的体外细胞毒性
采用MTT法研究PD-1/PD-L1免疫检查点阻断剂对小鼠脾细胞和B16细胞的体外细胞毒性。具体过程如下：肿瘤细胞B16细胞(每孔5000个细胞)培养在96孔板中，温度37℃，5％CO2。细胞贴壁24h后，分别用25、50、100、150、200和250μg/mL浓度的PD-1/PD-L1免疫检查点阻断剂处理细胞。孵育24h后，加入MTT溶液(5.0mg/mL)20μL，再孵育4h，每孔加入DMSO100μL。
3.利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪表征荧光标记的包裹磁性Fe3O4纳米颗粒的PD-1/PD-L1免疫检查点阻断剂与肿瘤细胞及T细胞的特异性结合
(1)荧光标记包裹磁性Fe3O4纳米颗粒的PD-1/PD-L1免疫检查点阻断剂的合成
根据高通量筛选得到的可选择性靶向PD-1/PD-L1表位多肽的聚合物合成配比，配制反应混合液50mL，加入表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)10mg，PD-1和PD-L1表位多肽多肽各10mg，再用注射器将200μL磁性四氧化三铁溶液(10％,w/v)加入到反应体系中，加入1mL 10mM荧光分子罗丹明B或FITC，通氮气30min脱除氧气，将反应液加入到圆底烧瓶中，辅助机械搅拌，在65℃下反应3h。反应结束后，加入5M NaCl溶液10mL搅拌10min，磁性分离弃去上清，以除去模板分子和未反应单体，纯水清洗三次磁性分离获得荧光标记的包裹磁性Fe3O4纳米颗粒的PD-1/PD-L1的免疫检查点阻断剂。合成荧光标记的包裹磁性Fe3O4的非印迹纳米颗粒的过程与上述相同，只是在预聚合混合液中不加入模板分子。
(2)利用流式细胞仪表征荧光标记的包裹磁性Fe3O4纳米颗粒的免疫检查点阻断剂与肿瘤细胞和T细胞的特异性结合
收集肿瘤细胞、T细胞，稀释细胞至3万/mL，取2mL稀释后细胞1000rpm离心3min收集细胞，加入90μg/mL FITC荧光标记免疫检查点阻断剂和FITC荧光标记非印迹纳米颗粒2mL孵育3h，之后利用流式细胞仪检测，结果如图16所示，可以看出包裹磁性Fe3O4纳米颗粒的PD-1/PD-L1阻断剂对肿瘤细胞和T细胞有高选择性。
4.乳酸脱氢酶(LDH)法测定包裹磁性Fe3O4纳米颗粒的免疫检查点阻断剂的体外免疫治疗效果
收集指数增长期的癌细胞以1×106个/孔浓度铺至6孔板，待细胞铁壁后，添加T细胞1×107个/孔，并添加包裹磁性Fe3O4纳米颗粒的免疫检查点阻断剂200μg/mL，共培养24h后取上清液离心去除T细胞。取上清0.1mL加于96孔板中，置37℃预温10min，每孔加入新鲜配制的乳酸脱氢酶底物溶液0.1mL，室温避光反应15min，每孔加入1mol/L柠檬酸终止液30μL，以终止酶促反应。用酶联检测仪在570nm波长下读取各孔OD值，可知上清液中乳酸脱氢酶含量。如图17所示，阻断剂处理后的阳性细胞上清中相较阴性细胞上清中乳酸脱氢酶浓度高0.17μmol/mL，说明阻断剂处理的肿瘤细胞在T细胞存在下有明显的免疫反应而死亡。
实施例六：负载咪喹莫特R837的CD24免疫检查点阻断剂(配方NP220)的合成及应用
1.负载咪喹莫特R837的CD24免疫检查点阻断剂的合成
取0.075g的N-异丙基丙烯酰胺，0.005g的N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，0.01g的十二烷基硫酸钠和0.006g的丙烯酰胺分别用1mL水溶解，取0.063g的N-叔丁基丙烯酰胺用0.5mL乙醇溶解，取26μL丙烯酸用1mL水溶解。最后，将所有的单体溶液，10mg多肽模板分子和2mg咪喹莫特R837混合均匀，最终溶液体积为25mL。将溶液加入50mL洗净干燥的圆底烧瓶内，加入干净干燥的磁子后，封口。在磁力搅拌下，鼓吹氮气30min，用双面胶封住针孔，放入65℃的油浴中预热20min，加入引发剂过硫酸铵30mg引发聚合反应3h。反应后，将反应液装入14000Da的透析袋中透析4天，通过洗脱、透析作用除去模板、未反应的单体、表面活性剂等。合成负载咪喹莫特的非印迹纳米颗粒的过程与上述相同，只是在预聚合混合液中不加入模板分子。通过图18的扫描电镜图可以看出，得到的负载咪喹莫特的免疫检查点阻断剂和非印迹纳米颗粒呈圆形，大小均一，粒径在180nm左右。
利用生物膜干涉技术(BLI)测定了免疫检查点阻断剂负载咪喹莫特R837后与CD24表位多肽和CD24蛋白结合的KD，如表12所示，负载咪喹莫特后，免疫检查点阻断剂和非印迹纳米颗粒与CD24表位多肽和CD24蛋白结合KD并未发生太大的改变，这表明负载咪喹莫特并没有影响阻断剂对CD24的亲和力和选择性。
表12.BLI测定负载咪喹莫特的免疫检查点阻断剂(配方NP220)对CD24表位多肽和CD24蛋白的亲和力
Figure BDA0003830887930000191
2.利用石英晶体微天平QCM表征CD24免疫检查点阻断剂与CD24阳性表达的癌细胞膜的特异性结合
将金芯片置于旋涂仪上，选用F模式，酒精清洗两次，去离子水清洗两次，然后滴上癌细胞膜碎片溶液旋涂(200μL)；旋涂结束后安装到QCM卡槽上，形成密闭腔室；打开泵的开关，设置50μL/min，先通入去离子水实现液相环境，待QCM曲线稳定后，再通入CD24免疫检查点阻断剂溶液，测量二者的界面作用，待曲线稳定后再次通入去离子水，曲线再次稳定后通入去离子水清洗(200-300μL/min)，然后在空气中排除管中水分，取下芯片，QCM卡槽用氮气吹干(保护内置电子元件)。从图19可以看出免疫检查点阻断剂与CD24阳性表达癌细胞膜(CT26,ID8)结合频移可达-80Hz，非印迹纳米颗粒与阳性表达细胞膜结合频移仅有-16Hz左右；而无论是免疫检查点阻断剂还是非印迹纳米颗粒与CD24阴性表达癌细胞膜(B16,G422)的结合频移仅有-14Hz左右，证明了CD24免疫检查点阻断剂可以与CD24阳性表达癌细胞特异性、高亲和性的结合。
3.巨噬细胞体外吞噬实验
利用无菌针头式过滤器(孔径为0.22μm)过滤掉免疫检查点阻断剂和非印迹纳米颗粒中的细菌，用DMEM培养基配制成浓度为90μg/mL的溶液。pH敏感的荧光染料与肿瘤细胞CT26共孵育30min后，得到荧光标记的肿瘤细胞，将荧光标记的肿瘤细胞以2×105/mL的密度接种于激光共聚焦皿中，4h后癌细胞贴壁。设置六组实验，在六个实验组的共聚焦皿中分别加入PBS、CD24抗体、免疫检查点阻断剂、非印迹纳米颗粒、负载咪喹莫特的免疫检查点阻断剂以及负载咪喹莫特的非印迹纳米颗粒与癌细胞共培养，观察各实验组被巨噬细胞吞噬情况。随着时间的变化，免疫检查点阻断剂组及负载咪喹莫特的免疫检查点阻断剂组的肿瘤细胞逐渐被巨噬细胞吞噬，这一情况与CD24的抗体组相同，证明免疫检查点阻断剂可以阻断肿瘤细胞的免疫逃逸。

Claims (10)

1.一种可选择性靶向生物标志物的聚合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体步骤为：以基本单体、功能单体、交联剂和引发剂配制混合反应液；将混合反应液加入到检测池中，原位聚合得到聚合物薄层；冲洗除去未反应的单体后加入生物标志物或其表位多肽孵育，生物标志物或其表位多肽被吸附在聚合物薄层上，通过检测聚合物薄层的吸附量或检测上清液中残余的生物标志物或其表位多肽的量，筛选出亲和力高的聚合物合成配方；然后以生物标志物或其表位多肽为模板分子，采用筛选出的配方通过分子印迹方法制备可选择性靶向生物标志物的聚合物纳米颗粒，洗脱模板分子并用透析袋透析纯化。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的基本单体为N-异丙基丙烯酰胺、N-叔丁基丙烯酰胺、N-苯基丙烯酰胺中的一种或几种；所述的功能单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、乙烯基磺酸钠、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺、(3-丙烯酰胺丙基)三甲基氯化铵、1-乙烯基咪唑、丙烯酰胺、4-乙烯基苯硼酸、(3-丙烯酰胺丙基)三甲基氯化铵、N-3-二甲氨基丙基甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸羟乙酯中的一种或几种；所述的交联剂为N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、N,N'-乙烯基双丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一种或几种；所述的引发剂为过硫酸铵、偶氮二异丁腈或四甲基乙二胺。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述原位聚合在氮气氛围或密封条件下进行，聚合反应温度为25-80℃，聚合反应时间为2-72h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的生物标志物包括但不限于表皮生长因子受体、N端脑钠肽前体、B型钠尿肽、阻断剂对程序性死亡受体-1、程序性死亡配体-1、小细胞肺癌簇4抗原、分化抗原20。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的分子印迹方法的具体步骤为：采用筛选出的配方配制混合反应液，再加入表面活性剂和相应的生物标志物或其表位多肽，超声通氮气5-30min脱除溶液中的氧气，再将反应液加入到反应釜中，搅拌聚合反应得到聚合物纳米颗粒，所述聚合反应的条件与原位聚合合成聚合物薄层相同。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的相应的生物标志物或其表位多肽修饰在二氧化硅微球、四氧化三铁磁球或玻璃珠微球的表面后再加入混合反应液中进行聚合反应。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述混合反应液中还加入荧光染料、荧光量子点、磁性纳米颗粒、免疫激动剂、化疗药物、光热剂或光动剂。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的洗脱模板分子的方法为：通过升高温度到50-90℃、或降低温度到0-10℃、或加入0.5-5M的NaCl水溶液、或加入0.1-0.3M的醋酸水溶液，搅拌反应2-24h洗脱模板分子。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的可选择性靶向生物标志物的聚合物在制备选择性靶向识别肿瘤细胞表面抗原、靶向识别循环肿瘤细胞、或抗肿瘤免疫检查点阻断制剂中的应用。
10.根据权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的可选择性靶向生物标志物的聚合物包裹荧光染料、荧光量子点或磁性纳米颗粒，应用于生物标志物的定量检测。
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