CN104356323A - 一种磁性分子印迹纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种磁性分子印迹纳米颗粒及其制备方法和应用。该纳米颗粒不仅可以在体外对溶液中的目标蛋白进行特异性识别、捕集、分离和活性抑制，更为重要的是，能在磁场作用下快速进入活细胞，对其中的目标蛋白进行原位的结合和活性抑制，并可以在进行荧光标记后，通过荧光显微镜对其在细胞中的分布进行示踪，还可以通过检测荧光强度定量。

Description

一种磁性分子印迹纳米颗粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于纳米材料制备技术领域，涉及磁核双壳型蛋白分子印迹聚合物纳米颗粒及其制备方法，以及将其应用于溶液中目标蛋白的捕获和活性抑制，特别是应用于活细胞中目标蛋白的捕获和活性抑制。

背景技术

分子印迹聚合物是指通过功能单体与模板分子组装后发生聚合，之后移除模板分子得到的聚合物，具有价格低廉、稳定性好、特异性识别等优点。相比于天然的抗体和受体分子，分子印迹聚合物有很多优点：制备简单、成本低廉、稳定性好、可重复使用、可用于多种目标物、易于修饰等。

基于分子印迹聚合物与模板分子的作用原理，目前已有报道将分子印迹聚合物用作生物分子的抑制剂。例如，Shea等成功地印迹了由26个氨基酸构成的蜂毒肽，并且抑制了蜂毒肽破坏细胞膜的生物活性(Y.Hoshino,H.Koide,T.Urakami,H.Kanazawa,T.Kodama,N.Oku,K.J.Shea.Recognition,neutralization,and clearance of target peptides in the bloodstream ofliving mice by molecularly imprinted polymer nanoparticles:a plastic antibody.J Am Chem Soc(2010),132:6644-6645)。之后他们又实现了对溶菌酶的选择性捕集与释放(K.Yoshimatsu,B.K.Lesel,Y.Yonamine,J.M.Beierle,Y.Hoshino,K.J.Shea.Temperature-responsive"catch andrelease"of proteins by using multifunctional polymer-based nanoparticles.AngewandteChemie(2012),51:2405-2408.)。另外，Haupt等成功地利用分子印迹聚合物抑制胰蛋白酶，他们将天然的胰蛋白酶抑制剂对氨基苯甲脒上引入双键，从而作为功能能单体参与分子印迹聚合物中，大大提高了对目标酶的抑制作用。本课题组在之前的工作中，也成功合成了对非限制性脱氧核糖核酸酶(DNase I)具有选择性识别和抑制作用的分子印迹聚合物(Y.Liu,S.Wang,C.Zhang,X.Su,S.Huang,M.Zhao.Enhancing the selectivity of enzyme detection by usingtailor-made nanoparticles.Anal Chem(2013),85:4853-4857)，并用于细胞裂解液中目标酶的结合和活性抑制。但是，这些材料由于生物相容性差、对其他生物分子有非特异性结合或难以快速进入细胞等因素的限制，还不能用于活细胞内目标蛋白分子的结合。

中国专利申请201310461379.1公开了一种磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子及其制备方法，是以表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子作为载体，以两种蛋白质作为模板分子，将模板分子固定在磁性载体表面，在3-氨丙基三乙氧基硅烷和辛基三甲基硅烷的作用下，形成聚合物，再将聚合物中的模板分子洗脱下来，得到的磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子。这种材料从制备方法上看，不能算作真正的分子印迹材料，因为发明人在反应体系中没有加入与蛋白分子有特异性相互作用的功能单体，只依靠3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和辛基三甲基硅烷(OTMS)作为功能单体和交联剂合成的材料对蛋白分子的选择性差，对其他生物分子的非特异性吸附也会非常严重。

中国专利申请201410214026.6公开了一种分离、净化莱克多巴胺磁性分子印迹聚合物的制备方法，该方法步骤如下：(1)制备磁性四氧化三铁纳米微球；(2)制备ATPS修饰四氧化三铁材料(ATPS-Fe₃O₄)；(3)制备磁性Fe₃O₄功能单体(MAC-ATPS-Fe₃O₄)；(4)磁性RAC分子印迹聚合物的制备(Fe₃O₄MIPs)。该材料是在有机溶剂而非纯水相体系中制备，表面疏水作用强烈，细胞毒性强，不能用于生物样品。

中国专利申请201410031409.X公开了一种Fe₃O₄/SiO₂/分子印迹羟基磷灰石核壳结构纳米复合光催化剂及其制备方法。所述复合光催化剂的核心为Fe₃O₄颗粒，中间层由惰性SiO₂构成，外壳为分子印迹羟基磷灰石，复合光催化剂的粒径为95-140nm。该材料同样也是在有机溶剂体系中制备，不适用于纯水相的生物样品体系。

综上，现有的材料由于生物相容性较差或选择性不够好，都不能直接用于进入活细胞对细胞内的目标蛋白分子进行捕获和活性抑制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种磁性分子印迹纳米颗粒及其制备方法和应用。该纳米颗粒不仅可以在体外对溶液中的目标蛋白进行特异性识别、捕集、分离和活性抑制，更为重要的是，能在磁场作用下快速进入活细胞，对其中的目标蛋白进行原位的活性抑制，并可以在进行荧光标记后，通过荧光显微镜对其在细胞中的分布进行示踪。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种磁性分子印迹纳米颗粒，从内到外依次包括磁核、内壳层和外壳层，所述磁核为磁性四氧化三铁纳米颗粒或磁性γ-三氧化二铁纳米颗粒，直径在10-20nm之间；所述内壳层为表面修饰有氨基的二氧化硅，厚度在10-20nm之间；所述外壳层为表面亲水的蛋白分子印迹聚合物，厚度在10-20nm之间；所述蛋白印迹磁性荧光纳米颗粒的粒径为50-100nm。

进一步地，所述表面亲水的蛋白分子印迹聚合物是在包含有蛋白模板分子、功能单体和交联剂的水相聚合反应体系中加入亲水性链转移剂，使聚合物的表面带有亲水性基团，如聚乙二醇。

进一步地，所述磁性分子印迹纳米颗粒上还带有荧光标记。

进一步地，所述荧光标记包括：在荧光染料上接上双键的各种荧光功能单体，例如荧光素O-甲基丙烯酸酯。

本发明先在磁核(磁性四氧化三铁(Fe₃O₄)纳米颗粒或磁性γ-三氧化二铁纳米颗粒)表面通过两步合成法包裹一层合适厚度的二氧化硅并修饰上氨基(在反应体系中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)和四乙氧基硅烷(TEOS)的体积比控制在1:2到1:1之间)，再在二氧化硅外层原位聚合一层表面亲水的蛋白分子印迹荧光聚合物。

其中，在磁核表面包覆二氧化硅时采用了两步合成法，第一步先用四乙氧基硅烷(TEOS)进行初步包覆，覆盖四氧化三铁或三氧化二铁表面的不规则缺陷，第二步则在已有的二氧化硅表面上进一步聚合，增加硅胶的厚度并使其表面带有氨基，获得包覆完整、形貌圆满、单分散性好、白色透明的Fe₃O₄SiO₂纳米颗粒或Fe₂O₃SiO₂纳米颗粒。

通过控制反应条件，使磁核直径、内壳层二氧化硅和外壳层分子印迹聚合物的厚度都在10-20nm之间，从而保证最终纳米复合粒子粒径在50-100nm之间，容易通过胞吞作用进入细胞。

由于Fe₃O₄/Fe₂O₃磁纳米颗粒对一些荧光基团具有猝灭作用，因此需要对其进行包硅的修饰增大磁核与荧光基团的距离。本发明中通过控制反应时间和投料量，对Fe₃O₄/Fe₂O₃磁纳米颗粒进行10-20nm厚度的SiO₂的包裹，然后通过共聚合的方法加入荧光功能单体进行荧光标记，得到的材料具有较好的荧光强度，避免了磁核对荧光基团的猝灭作用。更加值得一提的是，这种荧光标记方法几乎不改变原材料的结合性能，从而确保纳米粒子的磁性、荧光性质和分子识别作用相互协调而不冲突，满足快速进入细胞，并在细胞内原位结合蛋白的要求。

更具体地说，中心设计磁核不仅有助于在材料制备过程中对材料进行分离洗涤，而且在导入细胞时，可以借助外加磁场的作用加速纳米粒子进入细胞的过程。因此，磁核粒径不能太小，否则磁性太弱达不到上述目的。但是同时磁核也不能过大，否则整个粒子的粒径过大，且对外层的荧光具有强烈的猝灭作用。

其次，内壳层二氧化硅的厚度控制也十分重要，太薄达不到完整覆盖磁核，增加材料亲水性的目的，也达不到增大距离阻隔磁核对荧光染料猝灭的目的。而太厚又会导致材料磁性减弱。

最后，外壳层分子印迹聚合物的厚度控制也很重要，太薄不足以形成完整的印迹位点，亲和力和选择性差，太厚也会导致磁性进一步减弱，及整个粒子粒径过大，难以进入细胞。

为达到上述精细控制各层尺寸和形貌的目标，本发明的具体合成步骤如下：

1)在磁性四氧化三铁纳米颗粒或磁性γ-三氧化二铁纳米颗粒表面包覆一层二氧化硅，并使二氧化硅表面带有氨基，其中，磁性四氧化三铁纳米颗粒或磁性γ-三氧化二铁纳米颗粒的直径在10-20nm之间(优选10nm)，二氧化硅的厚度在10-20nm之间(优选20nm)；

2)在步骤1)得到的磁纳米颗粒表面偶联偶氮类引发剂；

3)以步骤2)负载有引发剂的磁纳米颗粒为引发剂，在有亲水性链转移剂存在的条件下，加入蛋白模板分子、功能单体和水溶性交联剂，其中，蛋白模板分子与功能单体的摩尔比是1:500-1:10000，水溶性交联剂的摩尔数占功能单体和水溶性交联剂总摩尔数的1％-5％；在室温(20-25℃)下通过紫外光照射引发RAFT(可逆加成-断裂链转移自由基聚合)反应，在负载有引发剂的磁纳米颗粒表面原位合成磁性分子印迹聚合物。

进一步地，步骤2)中所述偶氮类引发剂为4,4'-偶氮二(4-氰基戊酸)(ACPA)。

进一步地，步骤3)中，所述功能单体包括主要功能单体和辅助功能单体，所述主要功能单体为N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)，所述辅助功能单体包括丙烯酸(AAc)，N-(3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺(DMAPMA)或丙烯酰胺(AAm)；所述水溶性交联剂为N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)。

进一步地，步骤3)中，蛋白模板分子与功能单体的摩尔比是1:2000，水溶性交联剂的摩尔数占功能单体和水溶性交联剂总摩尔数的2％；在300rpm速率搅拌下用紫外灯(MAXIMAML3500C/F)照射30min进行RAFT反应。

进一步地，上述制备方法中还包括：步骤3)反应完成后产物用磁铁进行分离，用1M氯化钠溶液超声洗涤直到没有蛋白模板分子检出，在室温下真空干燥。

进一步地，上述制备方法中还包括：在合成用于导入细胞捕获蛋白的磁纳米颗粒时，功能单体中加入摩尔(物质的量)百分比为1-5％的荧光功能单体(例如，荧光素O-甲基丙烯酸酯(FMA，0.2mmol))进行荧光标记。

上述磁性分子印迹纳米颗粒在对活细胞内的目标蛋白分子进行识别、捕获、分离和活性抑制中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明合成了一种磁性分子印迹纳米颗粒，粒径均一，直径优选为83±5nm，对目标蛋白脱氧核糖核酸酶I具有选择性的抑制作用，加入荧光功能单体进行标记后，所获得的纳米颗粒不仅具有磁性、特异性和生物相容性，而且具有荧光性质，从而采用本发明制备的磁性分子印迹纳米颗粒，可以通过荧光显微镜进行体内或细胞内示踪，还可以通过检测荧光强度定量。

本发明中针对的目标是贴壁细胞，通过在细胞培养板底部施加磁场，使得溶液中磁纳米颗粒在磁场作用下快速向底部的细胞靠紧，在细胞内吞作用下进入细胞当中，对细胞质中的目标物进行识别、捕集和活性抑制。由于对其进行了SiO₂的包裹以及PEG修饰，这种材料具有生物相容性好、细胞毒性低的特点。在对细胞中特定酶起到抑制作用的同时，不会影响到细胞正常的生理活性。

此外，本发明制备方法简便，步骤少，成本低廉，制备的磁性分子印迹纳米颗粒具有单分散性好、稳定、选择性高、可快速导入活细胞、可快速捕获蛋白等优点。

附图说明

图1是制备蛋白印迹磁性荧光纳米颗粒的示意图。

图2(a)是原料Fe₃O₄磁纳米颗粒的透射电镜(TEM)照片；图2(b)是制备得到的Fe₃O₄SiO₂的透射电镜(TEM)照片；图2(c)是磁性分子印迹聚合物的透射电镜(TEM)照片。

图3(a)是含有不同摩尔比荧光功能单体的分子印迹磁纳米颗粒(1％和5％MIP)的荧光光谱曲线。虚线为激发光谱，实线为发射光谱；图3(b)是未荧光标记的分子印迹磁纳米颗粒(0％MIP)以及含有不同摩尔比荧光功能单体的分子印迹磁纳米颗粒(1％和5％MIP)对目标物DNase I和参比物Exo III的吸附容量。

图4(a)是未荧光标记的磁纳米颗粒对目标蛋白起特异选择性抑制作用的结果图；图4(b)是未荧光标记的磁纳米颗粒不干扰非目标酶活性的结果图。

图5是应用本发明将5％荧光功能单体标记的分子印迹磁纳米颗粒导入HeLa细胞对其细胞质中的脱氧核糖核酸酶进行抑制的荧光成像结果图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步描述，但本领域的技术人员应当理解，实施例不应解释为对本发明的限制，在本发明的精神和实质范围内，可以做各种修改和变动，本发明的保护范围应视所附权利要求书而定。

实施例一、制备蛋白印迹磁性荧光纳米颗粒

本发明制备蛋白印迹磁性荧光纳米颗粒的过程如图1所示，具体包括以下步骤：

1)合成尺寸合适的Fe₃O₄SiO₂纳米粒子(其中，磁核直径5-10nm，二氧化硅层厚度10-20nm)，并使二氧化硅表面带有氨基，如图2(b)所示。

将90mg干燥的亲水氨基修饰的Fe₃O₄磁纳米颗粒(如图2(a)所示)充分超声分散在20mL去离子水中，剧烈搅拌下逐滴加入含有462mL环己烷、120g曲拉通X-100和96mL正己醇的混和溶液中。

滴加0.45mL四乙氧基硅烷(TEOS)，反应30min后滴加1.8mL浓氨水，反应12h。

之后再滴加0.9mL TEOS和0.45mL3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)，反应30min后滴加3.6mL浓氨水，继续反应12h后加入丙酮破乳，用磁铁收集得到的磁纳米颗粒，并用丙酮和水交替洗涤3次，室温下真空干燥过夜。

2)Fe₃O₄SiO₂磁纳米颗粒表面偶联引发剂

将步骤1)中得到的100mg Fe₃O₄SiO₂磁纳米颗粒超声分散在50mL二甲亚砜中。

加入100mg4,4'-偶氮二(4-氰基戊酸)(ACPA)，171mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)以及41mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温下避光搅拌12h。产物用无水乙醇洗涤2次，在室温下真空干燥。

3)Fe₃O₄SiO₂MIP磁性分子印迹聚合物的制备

6.2mg模板分子脱氧核糖核酸酶I(DNase I,0.2μmol)，功能单体182μL N-(3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺(DMAPMA,0.96mmol)，226mg N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm,2.0mmol)，66μL丙烯酸(AAc,0.96mmol)，以及12.3mg交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(BIS,0.08mmol)，80mg PEG链转移剂Macro-PEG CTAs(0.08mmol)和0.2mL异丙醇加入到100mL的10mM磷酸盐缓冲液(PB,pH＝7.6)室温搅拌进行混合。

加入引发剂100mg Fe₃O₄SiO₂ACPA，通氮气20min除氧。

在室温以及300rpm速率搅拌下用紫外灯(MAXIMA ML3500C/F)照射30min进行反应，紫外灯与石英烧瓶的距离为5cm。

反应完成后产物用磁铁进行分离，用1M氯化钠溶液在50℃，40KHz下超声洗涤直到没有模板分子检出，在室温下真空干燥，最终得到的磁性分子印迹聚合物如图2(c)所示。

合成作为对照的非分子印迹聚合物时，不加入模板分子DNase I。在合成用于导入细胞捕获蛋白的磁纳米颗粒时，在功能单体中加入荧光素O-甲基丙烯酸酯(FMA,0.2mmol)(一种荧光功能单体)进行荧光标记。加入FMA时，原有的功能单体NIPAm减少相应的量，保持聚合反应的功能单体总量与未标记Fe₃O₄SiO₂MIP磁纳米颗粒的功能单体总量一致，聚合反应条件不变。如图3(a)所示，加入FMA的物质的量百分比为1％-5％时均可实现荧光标记，加入量为5％时，荧光强度最强。由于该功能单体在水中溶解度的限制，加入量最大为5％。如图3(a)和(b)所示，MIP对DNase I的吸附容量几乎不受荧光标记物比例的影响，且远大于非目标物Exo III，对目标的结合能力也大于对应的非分子印迹聚合物(0％、1％、5％NIP)。

实施例二、选择性抑制溶液中的脱氧核糖核酸酶并直接用DNA荧光探针检测其活性

未进行SiO₂包裹的磁纳米颗粒由于表面氨基带有正电荷，未修饰聚乙二醇的磁性分子印迹聚合物表面带有弱的正电荷，都对DNA荧光探针具有非特异性吸附作用，从而会干扰DNA荧光探针的原位检测。在进行包硅和聚乙二醇修饰之后，磁性分子印迹聚合物在水溶液中具有较好的分散性和稳定性，加入到待测体系中对目标酶起特异性抑制作用，这时可以直接加入DNA荧光探针对其活性进行测定。

另外体系中有其他酶(以核酸外切酶III(Exo III)为例)存在时，直接加入相应的DNA荧光探针可以对其他酶活性进行检测而不受体系中磁纳米颗粒的干扰，无需对磁纳米粒子进行分离，从而可以进行原位测定。

在该实施例中，设计的探针序列如下：

DNase I探针：C*A*A*C*(dT-TAMRA)*ACATCACTCGGATG(dT-BHQ2)*A*G*T*T*G

Exo III探针：

A*T*C*A*T*C*T*T*T*A*C*G*C*A*A*G*A*(dT-BHQ1)*G*A*T-FAM

其中下划线斜体表示互补序列，加星号表示硫代修饰的碱基，TAMRA和FAM分别为羧基四甲基罗丹明和羧基荧光素标记，BHQ2和BHQ1分别为其对应的猝灭基团。

实验步骤如下：

1.在100μL八连管中，加入5μL1mg/mL MIP或NIP磁性纳米颗粒溶液，5μL10×DNase I缓冲液和1μL10μg/mL DNase I，补加去离子水使得总体积为48μL，在25℃下放置15min进行吸附。

加入2μL2μM DNase I探针检测酶活性。

采用Stratagene Mx3000P荧光PCR仪，37℃下每5s采集荧光共采集250圈，激发波长为556nm，在580nm下测发射信号。

检测结果如图4(a)所示，MIP抑制DNase I的活性，而NIP对DNase I的活性没有影响。

2.在100μL八连管中，加入5μL1mg/mL MIP或NIP磁性纳米颗粒溶液，5μL10×DNase I缓冲液和1μL10μg/mL Exo III，补加去离子水使得总体积为48μL，在25℃下放置15min进行吸附。

加入2μL2μM Exo III探针检测酶活性。

采用Stratagene Mx3000P荧光PCR仪，37℃下每5s采集荧光共采集250圈，激发波长为492nm，在516nm下测发射信号。

检测结果如图4(b)所示，MIP和NIP对Exo III的活性都没有影响。

实施例三、蛋白印迹磁性荧光纳米颗粒在磁场作用下快速导入细胞并成像

制备得到的磁性分子印迹聚合物具有较好的稳定性、生物相容性，在磁场作用下通过细胞内吞作用可以快速导入Hela细胞并抑制其中的DNase I的活性。之后利用链霉溶菌素O(SLO)蛋白在细胞膜上形成微孔，将DNA荧光探针导入细胞对其中DNase I的活性进行荧光成像从而证明分子印迹纳米颗粒对DNase I的原位抑制作用，同时对Exo III活性进行检测对比说明其活性未受到DNase I分子印迹聚合物的影响。DNase I探针采用与上面相同的序列，Exo III探针受荧光显微镜检测通道的限制，将FAM荧光标记基团改为Cy5，相应的猝灭基团为BHQ2。

实验步骤如下：

1.在含有1％青霉素-链霉素双抗和10％失活胎牛血清的DMEM培养基中培养细胞，培养箱条件为37℃以及5％CO₂/95％空气。当细胞长至覆盖培养瓶的70％-80％时，加入0.25％的胰酶在37℃下处理4min然后将细胞转移96孔平底玻璃板上，每个孔含有0.1mL细胞培养液，约有10⁴个细胞。在实验前将细胞培养24h使得其贴壁。

2.用DPBS缓冲液对细胞进行洗涤，然后加入含有0.1mg/mL荧光标记的MIP或者NIP的0.1mL10mM PB缓冲液(pH＝7.6)。将96孔板置于Chemicell公司的MagnetoFACTOR-96磁板上，在37℃以及5％CO₂/95％空气的培养箱中放置30min。移去磁板后，吸走96孔板中的溶液，用DPBS缓冲液洗涤细胞5次充分洗去没有进入细胞的磁纳米颗粒。

3.在导入磁纳米颗粒的细胞中加入含有1.6U/mL SLO，1.0μM DNase I探针和1.0μMExo-Cy5探针的0.1mL DPBS缓冲液，在37℃以及5％CO₂/95％空气的培养箱中放置5min。用DPBS洗涤细胞一次，加入DMEM培养基培养在37℃以及5％CO₂/95％空气的培养箱中30min后用于细胞成像。采用配备Evolve-EMCCD的Olympus IX71荧光显微镜以及100倍物镜下拍摄细胞，用相应的荧光光栅拍摄对应不同探针的荧光图片(曝光时间10ms，发射增益值EM gain为100)。用ImageJ软件进行结果处理，如图5所示。由图中可以看出，MIP几乎将DNase I的活性完全抑制(TAMRA Probe-D)，而不影响ExoIII的活性(Cy5Probe-E)。而NIP对两种酶的活性几乎都没有影响。

Claims (10)

1.一种磁性分子印迹纳米颗粒，从内到外依次包括磁核、内壳层和外壳层，所述磁核为磁性四氧化三铁纳米颗粒或磁性γ-三氧化二铁纳米颗粒，直径在10-20nm之间；所述内壳层为表面修饰有氨基的二氧化硅，厚度在10-20nm之间；所述外壳层为表面亲水的蛋白分子印迹聚合物，厚度在10-20nm之间；所述蛋白印迹磁性荧光纳米颗粒的粒径为50-100nm。

2.如权利要求1所述的磁性分子印迹纳米颗粒，其特征在于，所述磁性分子印迹纳米颗粒上还带有荧光标记。

3.如权利要求2所述的磁性分子印迹纳米颗粒，其特征在于，所述荧光标记包括：在荧光染料上接上双键的荧光功能单体。

4.一种磁性分子印迹纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

1)在磁性四氧化三铁纳米颗粒或磁性γ-三氧化二铁纳米颗粒表面包覆一层二氧化硅，并使二氧化硅表面带有氨基，其中，磁性四氧化三铁纳米颗粒或磁性γ-三氧化二铁纳米颗粒的直径在10-20nm之间，二氧化硅的厚度在10-20nm之间；

2)在步骤1)得到的磁纳米颗粒表面偶联偶氮类引发剂；

3)以步骤2)负载有引发剂的磁纳米颗粒为引发剂，在有亲水性链转移剂存在的条件下，加入蛋白模板分子、功能单体和水溶性交联剂，其中，蛋白模板分子与功能单体的摩尔比是1:500-1:10000，水溶性交联剂的摩尔数占功能单体和水溶性交联剂总摩尔数的1％-5％；在室温下通过紫外光照射引发RAFT反应，在负载有引发剂的磁纳米颗粒表面原位合成磁性分子印迹聚合物。

5.如权利要求4所述的磁性分子印迹纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述偶氮类引发剂为4,4'-偶氮二(4-氰基戊酸)。

6.如权利要求4所述的磁性分子印迹纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述功能单体包括主要功能单体和辅助功能单体，所述主要功能单体为N-异丙基丙烯酰胺，所述辅助功能单体包括丙烯酸，N-(3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺或丙烯酰胺；所述水溶性交联剂为N,N'-亚甲基双丙烯酰胺。

7.如权利要求4所述的磁性分子印迹纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤3)中，蛋白模板分子与功能单体的摩尔比是1:2000，水溶性交联剂的摩尔数占功能单体和水溶性交联剂总摩尔数的2％；在300rpm速率搅拌下用紫外灯照射30min引发RAFT反应。

8.如权利要求4所述的磁性分子印迹纳米颗粒的制备方法，其特征在于，还包括：步骤3)反应完成后产物用磁铁进行分离，用1M氯化钠溶液超声洗涤直到没有蛋白模板分子检出，在室温下真空干燥。

9.如权利要求4-8任一所述的磁性分子印迹纳米颗粒的制备方法，其特征在于，还包括：在功能单体中加入摩尔百分比为1-5％的荧光功能单体进行荧光标记。

10.权利要求1-3任一所述的磁性分子印迹纳米颗粒在对活细胞内的目标蛋白分子进行识别、捕获、分离和活性抑制中的应用。