CN111018950B

CN111018950B - 一种腺苷七肽及其制备菌株

Info

Publication number: CN111018950B
Application number: CN201911127892.0A
Authority: CN
Inventors: 周晓容; 杨飞云; 肖融; 刘作华
Original assignee: Chongqing Academy of Animal Sciences
Current assignee: Daozhiyuan Chongqing Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-11-18
Filing date: 2019-11-18
Publication date: 2022-01-04
Anticipated expiration: 2039-11-18
Also published as: CN111018950A

Abstract

本发明涉及一种氨基酸序列为MATINAN的腺苷七肽，该七肽具有较强的耐热、耐胃蛋白酶、胰蛋白酶及糜蛋白酶的生物学特性，稳定性高，且抑菌活性强。本发明还提供了一种获得耐热耐蛋白酶菌株的高通量筛选方法，筛选出一种能产生上述七肽的约氏乳杆菌株，该约氏乳杆菌株于2019年10月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No.18695，具有抗逆性好、分泌量高的优势，成本低，为畜牧饲料、化妆品、保健品等领域产业化大规模制备腺苷七肽奠定了重要的基础。

Description

一种腺苷七肽及其制备菌株

技术领域

本发明涉及一种腺苷七肽及其产生菌株，属于生物技术领域。

技术背景

约氏乳杆菌是一种安全无害的益生菌，可以用来发酵饲料、食品以及作为益生菌调节肠道健康，提高动物或人体免疫力。抗菌肽是生物体产生的与宿主防御和先天免疫相关的小分子多肽，一般由5-50个氨基酸组成。抗菌肽具有抑制杀灭病原体、促进免疫、促进伤口愈合和粘膜防御等功能。

腺苷七肽(又名杆菌七肽、microcin C7肽)是由肠杆菌属、乳杆菌属等微生物分泌的一种细菌素类抗菌肽，由7个氨基酸残基组成，C端通过N-酰磷酰胺键与5'-磷酸腺苷(AMP)所结合形成小分子量抗菌肽，具有抗菌能力强，调节免疫的功能，是潜在的抗生素替代品(冉仁森，中国科学院大学，硕士学位论文，2017)。腺苷七肽的N端的蛋氨酸(Met)残基和C端的谷氨酰胺(Asn)为其保守序列，不同的微生物分泌的杆菌七肽中间的五个氨基酸残基有所差异，抗菌效果和抗逆性也有所不同。其中，约氏乳杆菌(Lactococcus johnsoniiNCC533)分泌的腺苷七肽序列为MHRIMKN(Olga Bantysh，Mbio，2014 Volume 5 Issue 3)。野生型约氏乳杆菌分泌的腺苷七肽对胃蛋白酶、胰蛋白酶以及热处理耐受性差，分泌量少，故用野生型约氏乳杆菌生产腺苷七肽安全性好，但生物稳定性差，且生产成本高，不能实现大规模产业化。

传统筛选目的菌株的方法工作量大、耗时长，专利CN 109400685 A采用Quickchange方法进行腺苷七肽改造，需要宿主是大肠杆菌，且仅能筛选到耐受胰蛋白酶的菌株，无法对约氏乳杆菌基因进行快速改造。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有较高耐热性、耐肠液和胃液效果的腺苷七肽，本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种腺苷七肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列为MATINAN。

上述腺苷七肽经100IU//ml胃蛋白酶或/和100IU/ml胰蛋白处理后或/和100IU/ml糜蛋白和/或95℃高温处理后，含量下降低于10.0％，抑菌效果下降低于10.0％；与野生型七肽或其他氨基酸序列的七肽相比，具有较强的耐热、耐胃蛋白酶和胰蛋白酶的生物学特性，且抑菌活性强。

本发明的另一目的是提供一种菌株，该菌株可用于制备上述腺苷七肽，且能够实现高产。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种约氏乳杆菌株(Lactobacillus johnsonii)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区)，保藏日期是2019年10月16日，保藏号为CGMCCNo.18695。

上述菌株，用于制备上述腺苷七肽。

上述菌株，经100IU//ml胃蛋白酶或/和100IU/ml胰蛋白处理后或/和100IU/ml糜蛋白和/或95℃高温处理后，发酵液中腺苷七肽含量下降低于10.0％，抑菌效果下降低于10.0％。

本发明的还提供了一种上述菌株的高通量筛选方法，包括以下措施：

一种上述菌株的高通量筛选方法，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶作为筛选试剂，筛选时间20-40min。

上述高通量筛选方法，筛选温度为95℃，筛选时间为10-20min。

上述高通量筛选方法，步骤如下：

1.获得单个菌株培养上清：将菌株库培养涂布于MRS琼脂，将平板上长出的菌落接种于细胞孔板，培养24小时，获得上清；

2.检测菌株耐热及耐蛋白的性能：在细胞孔板中，每孔加入终浓度为100IU/ml的胃蛋白酶，pH＝4.5-7.0，处理后再加入终浓度为100IU/ml的胰蛋白酶和终浓度为100IU/ml的糜蛋白酶(pH＝6.5-7.5)处理；95℃处理15-20min进行耐热性筛选；

3.检测菌株抑菌效果：灭活蛋白酶，每个孔中加入肉汤培养基及指示菌，培养16h后，OD₅₈₀值<0.1的菌株为抑菌性能稳定且耐高温耐蛋白酶的菌株。

本发明还提供了一种制备上述腺苷七肽的方法。该目的是通过以下措施实现的：

一种上述腺苷七肽的制备方法，将上述菌株于MRS培养基活化18-24小时，然后接种于发酵培养基，经过至少三个批次发酵培养，可获得产量为0.9-1.1g/L的腺苷七肽。

上述制备方法，每1000mL发酵培养基的成分为：蛋白胨15.0g、酵母膏10.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、pH 6.2-6.6。

上述制备方法的发酵条件为：温度25-37℃，溶氧≤5％。

有益效果：

1.本发明公开了一种腺苷七肽，稳定性高，具有较强的耐热、耐胃蛋白酶和胰蛋白酶的生物学特性，与现有的野生型七肽及其他氨基酸序列的七肽相比，具有更强的抗菌效果和抗逆性。

2.本发明提供了一种制备上述腺苷七肽的菌株，具有抗逆性好、分泌量高的优势，成本低，为畜牧饲料、化妆品、保健品等领域产业化大规模制备腺苷七肽奠定了重要的基础。

3.本发明提供了一种获得上述菌株的高通量筛选方法，可快速准确从突变库中筛选到耐热耐蛋白酶的目的菌株，该方法不仅可用于上述菌株的筛选，其他耐热或耐蛋白的菌株也可用该方法快速准确获得。

4.本发明提供了一种上述腺苷七肽的制备方法，采用上述菌株在特制培养基中进行三个批次发酵培养，可获得产量为0.9-1.1g/L的腺苷七肽，为野生型菌株产量的13-18倍，可实现大规模产业化的生产。

附图说明：

图1是高通量筛选过程图

图2是野生型以及不同突变株发酵液对大肠杆菌CGMCC44102的抑菌圈(WT为野生型，对照为无菌水，M1-M4为不同突变株)

图3是人工肠液处理各菌株发酵液上清液对大肠杆菌CGMCC44102的抑菌圈(右为处理前，左为处理90min后各菌株上清液抑菌圈)

图4是人工胃液处理各菌株发酵液上清液对大肠杆菌CGMCC44102的抑菌圈(右为处理前，左为处理90min后各菌株上清液抑菌圈)

图5是90℃水浴热处理各菌株发酵液上清液对大肠杆菌CGMCC44102的抑菌圈(右为处理前，左为处理15min后各菌株上清液抑菌圈)

图6是色谱图(A腺苷七肽M1纯品图谱，B腺苷七肽M1发酵液图谱，C野生型纯品图谱,，D野生型发酵液图谱)

图7是人工胃液、肠液处理腺苷七肽纯品M1、WT纯品的抑菌圈(M1、WT1为腺苷七肽纯品M1、WT形成的抑菌圈，CK为无菌水对照。M1-1为人工胃液处理腺苷七肽M1，M1-2为人工肠液处理腺苷七肽M1；WT-1为人工胃液处理WT，WT-2为人工肠液处理WT，以上处理时间为30min)

具体实施方案

一、建立菌株库

将野生型约氏乳杆菌在MRS肉汤培养基中培养10小时，达到对数生长前中期，采用紫外线照射120s，然后4mg/L亚硝基胍(NTG)处理30min进行联合诱变，构建菌株库。

二、高通量筛选：筛选过程如图1所示。

1.获得单个菌株培养上清：首先将菌株库培养涂布于MRS琼脂，使其每个平板约长出100个菌落，用灭菌牙签挑单菌落接种于96孔板(每个孔含有100μL培养基，其培养基成份为MRS不加吐温和柠檬酸氢二铵)或48孔板或24孔板，培养24h后，离心，吸取100ul上清液到另一96孔板。

2.检测菌株的耐热及耐蛋白性能：每孔加入终浓度为100IU/ml的胃蛋白酶，环境pH＝4.5-7.0，处理20-40min，优选30min；处理后加入终浓度为100IU/ml的胰蛋白酶和终浓度为100IU/ml的糜蛋白酶，环境pH＝6.5-7.5，处理20-40min，优选30min(所用的HCl、NaOH以及蛋白酶配置好后用0.22um滤膜过滤，使其达到无菌状态)，然后95℃处理10-20min，优选15min，进行耐热性筛选。

3.检测菌株抑菌效果：同时灭活蛋白酶，每个孔中加入MH肉汤培养基(96孔板，每孔加入100μL)，加入大肠杆菌CGMCC44102(活菌数10⁶CFU/mL)，培养16h后，用酶标仪测定OD₅₈₀，其OD值<0.1为抑制大肠杆菌生长的菌株，从中筛选出后进行验证。从38400株菌株中筛选到4株耐蛋白酶和高温的菌株，其中M1的抑菌效果最好(图2)，作为其筛选出的目的菌株。相同培养条件，菌株M1-4发酵液的抑菌圈直径比野生型都有不同程度的提高。

三、各菌株核酸序列和氨基酸序列的确定。根据GenBank公布的约氏乳杆菌mccA序列以及上下游序列，在mccA上下游约50bp处设计引物P1和P2，通过PCR方法克隆各菌株的mccA序列，其DNA扩增体系为50μL：2.5U/μL Taq酶，1μL；10×反应缓冲液，5μL；引物，各1μL；模板，1μL；10mM dNTP，1μL；ddH2O，40μL，扩增条件为：变性，94℃，0.5min；退火55℃，0.5min；延伸72℃，20s。所获得M1-M4序列经过测序后，得到DNA序列及氨基酸序列如下：

四、菌株发酵液的抗逆性验证：

人工胃液按照如下配制：取稀盐酸16.4ml，加水约800ml与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水定容成1000ml，pH值调至4.5-6.5。人工肠液按照如下配制：取磷酸二氢钾6.8g，加水500ml使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶(含胰蛋白酶及糜蛋白酶)10g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至1000ml。取约氏乳杆菌发酵液(其培养基成份为MRS不加吐温和柠檬酸三铵)样品1.0ml：①定溶于10mL人工肠液，其中胰蛋白酶的终浓度为100IU/ml，糜蛋白酶的终浓度为100IU/ml，环境pH值为6.5-7.5；②或定溶于10mL人工胃液中，其中胃蛋白酶的终浓度为100IU/ml，环境pH值为4.5-7.0。开始计时，分别在30、60、120min不同时间点取样加酸或碱中和pH＝7.0，再95℃处理10-20min，优选15min灭活蛋白酶，然后梯度稀释，以CGMCC44102指示菌进行抑菌试验，每个试验两个重复。取发酵液样品10mL，定容于100mL无菌水中，分成4份为1-4号样，每份20mL，1-3号样分别与75、85、95℃水浴处理15min，4号样为对照室温放置。以大肠杆菌CGMCC44102为指示菌进行抑菌试验。每个试验两个重复。由于抑菌圈的直径的平方与抗菌物质的效价对数成正比，故抗逆性试验通过可以抑菌圈的直径来确定发酵液中腺苷七肽的效价。通过高通量筛选，所得突变株发酵液对蛋白酶的耐受性明显增加,其中，M1的抗逆性和抑菌性最强，经人工胃液及人工肠液处理后其抑菌圈的直径基本不发生变化(<10.0％)，而野生型的抑菌圈处理30min后明显减小，处理60min后不具有抑菌作用(表1，2，图3，图4)，而且耐热性明显提高(表3，图5)。采用高通量筛选所得突变株的发酵液抑菌圈直径明显大于野生型，突变后抑菌能力增强，耐受性提高。

表1人工肠液处理发酵液对大肠杆菌CGMCC44102抑菌活性的影响

—表示无明显抑菌圈，下同

表2人工胃液处理发酵液对大肠杆菌CGMCC44102抑菌活性的影响

表3热处理发酵液对大肠杆菌CGMCC44102抑菌活性的影响

五、从约氏乳杆菌M1中获得腺苷七肽

将约氏乳杆菌M1在MRS培养基活化后，连续传代三个批次发酵液定量测定其腺苷七肽，其腺苷七肽的含量为0.98g/L、0.93g/L、1.10g/L，而野生型的发酵液中腺苷七肽的含量为0.06、0.07、0.06g/L(发酵培养基成分如下：蛋白胨15.0g、酵母膏10.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1000mL、pH 6.2-6.6、温度：35-37℃，溶氧≤5％)。突变株的腺苷七肽的分泌量是野生型菌株的13-18倍。经过三个批次发酵液腺苷七肽含量稳定，证明此菌株具有良好的遗传稳定性，其产生的腺苷七肽可以进行产业化。2.发酵液腺苷七肽的含量测定方法如下：按M1菌株的腺苷七肽氨基酸序列，在生物公司采用化学法分别合成腺苷七肽M1和野生型菌株腺苷七肽WT(南京金斯瑞)纯品(99％)，以纯品为标准，测定发酵液中腺苷七肽的含量。其方法如下：用反相色谱柱：C18(4.6×250mm)；洗脱液：流动相A(0.1％三氟乙酸)、流动相B(90％乙腈)按表4进行洗脱。所设的参数应为：柱温：25℃，检测波长：260nm；最大压力：200bar。

表4高效液相洗脱条件

纯品溶于水中，上样测定纯品的出峰时间，然后发酵液上样。外标法以峰面积和浓度(上样量一致)成正比计算，采用下列公式计算含量：

式中AX为发酵液腺苷七肽的峰面积；C_X为发酵液中腺苷七肽的含量(μg/g)；AR为对照品的峰面积：C_R为对照品的浓度(μg/mL)。M1腺苷七肽纯品和发酵液图谱为图6A、6B，野生型纯品和发酵液图谱6C、6D。

六、腺苷七肽M1和腺苷七肽WT抗逆性的验证

用化学合成法合成(南京金斯瑞生物有限公司)腺苷七肽M1(序列为MATINAN)和WT(序列为MHRIMKN)，分别配制M1和WT溶液1.0mg/mL，然后用人工胃液或肠液按照1：10稀释腺苷七肽M1和WT溶液，其中胃蛋白酶的终浓度为100IU/ml，胰蛋白酶的终浓度为100IU/ml，糜蛋白酶的终浓度为100IU/ml，处理20-40min，优选30min，再95℃，处理10-20min，优选15min，进行耐热性处理，同时灭活蛋白酶，调节pH＝7.0。结果显示经人工肠液或人工胃液处理后，腺苷七肽M1的抑菌圈直径与对照组相比仅下降8.30±1.23或7.42±1.11％，抑菌圈直径显著大于腺苷七肽WT，腺苷七肽M1的含量与对照组相比仅下降5.48±0.92或4.71±0.88％，含量显著高于腺苷七肽WT，证实腺苷七肽M1的抑菌效果和抗蛋白酶活性显著强于腺苷七肽WT(表5，图7)。

表5纯品腺苷七肽M1和WT抗逆性验证结果

同项目同行肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆市畜牧科学院

<120>一种腺苷七肽及其制备菌株

<160>

<210> 1

<211> 24

<212> 野生型WT菌株核苷酸序列

<213> DNA

<400> 1

atgcacagga tcatggctac ctaa 24

<210> 2

<211> 7

<212> 野生型WT菌株氨基酸序列

<213> Protein

<400> 2

MHRIMKN 7

<210> 3

<211> 24

<212> M1菌株核苷酸序列

<213> DNA

<400> 3

atggctacta tcaatgcaaa ctaa 24

<210> 4

<211> 7

<212> M1菌株氨基酸序列

<213> Protein

<400> 4

MATINAN 7

<210> 5

<211> 24

<212> M2菌株核苷酸序列

<213> DNA

<400> 5

atggctacta tcatgactac ctaa 24

<210> 6

<211> 7

<212> M2菌株氨基酸序列

<213> Protein

<400> 6

MATIMKN 7

<210> 7

<211> 24

<212> M3菌株核苷酸序列

<213> Artificial(人工序列)

<400> 7

atgcacactg gtatgactac ctaa 24

<210> 8

<211> 7

<212> M3菌株氨基酸序列

<213> Protein

<400> 8

MHTGMKN 7

<210> 9

<211> 24

<212> M4菌株核苷酸序列

<213> DNA

<400> 9

atgcacactg gtatgactac ctaa 24

<210> 10

<211> 7

<212> M4菌株氨基酸序列

<213> Protein

<400> 10

MARGMKN 7

Claims

1.一种腺苷七肽，其特征在于：氨基酸序列为MATINAN。

2.一种约氏乳杆菌菌株，其特征在于：保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期是2019年10月16日，保藏号为CGMCC No.18695。

3.权利要求2所述的约氏乳杆菌菌株在制备权利要求1所述的腺苷七肽中的应用。

4.权利要求1所述的腺苷七肽的制备方法，其特征在于：将权利要求2所述的菌株于MRS培养基活化18-24小时，然后接种于发酵培养基，经过至少三个批次发酵培养，可获得产量为0.9-1.1g/L的腺苷七肽。

5.如权利要求4所述的腺苷七肽的制备方法，其特征在于：每1000mL发酵培养基的成分为：蛋白胨15.0g、酵母膏10.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、pH6.2-6.6；发酵条件为温度25-37℃，溶氧≤5%。