CN111004302A - 一种以含谷维素的皂脚为原料制备5种阿魏酸酯单一成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种以含谷维素的皂脚为原料制备5种阿魏酸酯单一成分的方法，包括以下步骤：1)、碱醇热溶与趁热过滤；2)、酸沉与过滤；3)、亲脂性有机溶剂脱脂脱色；4)、制备薄层色谱法分离；条件是步骤3)脱色后所得的沉淀粗品中，谷维素的含量为70‑80wt％。本发明的特征在于以谷维素含量10～20％的皂脚为原料，采用特定前处理提纯步骤得到谷维素的含量为70‑80wt％的产品，再用制备薄层色谱法分离制备单体物质；制备所得的5种单体——24‑亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯、环木菠萝烯醇阿魏酸酯、环木菠萝醇阿魏酸酯、菜油甾醇阿魏酸酯、β‑谷甾醇阿魏酸酯纯度大于90％；单体可用作含量测定的对照品，外标法计算含量和定性峰位标定。

Description

一种以含谷维素的皂脚为原料制备5种阿魏酸酯单一成分的 方法

技术领域

本发明属于植物提取分离技术领域，涉及一种制备谷维素中5种主要阿魏酸酯单体的方法。

背景技术

谷维素(Oryzanol)存在于米糠油中，系以三萜(烯)醇为主体的阿魏酸酯的混合物。主要是环木菠萝醇的同系物(环木菠萝醇、环木菠萝烯醇、2,4-亚甲基环木菠萝烯醇，环米糠醇等)和甾醇类同系物(谷甾醇、豆甾醇等)。工业产品谷维素中各类阿魏酸酯的组成非常复杂，而且它们化学结构，理化性质非常相似，一般化学方法难以分离纯化。

谷维素主要由环木菠萝醇类阿魏酸酯和甾醇类阿魏酸酯组成。

1、环木菠萝醇类阿魏酸酯在谷维素中含量大约为75％～80％。主要组成及占比：(1)24-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯，含量35％～40％；(2)环木菠萝烯醇阿魏酸酯，含量25％～30％；(3)环木菠萝醇阿魏酸酯，含量8％～10％；(4)环米糠醇阿魏酸酯，含量2％～3％；(5)24-甲基环木菠萝醇阿魏酸酯；(6)24-甲基环木菠萝醇烯醇阿魏酸酯；(7)25-氧基环木菠萝醇阿魏酸酯；(8)25-羟基甲基环木菠萝醇阿魏酸酯。

2、甾醇类阿魏酸酯在谷维素中含量大约为15％～20％。主要组成及占比：(1)菜油甾醇阿魏酸酯，含量为10％～12％；(2)β-谷甾醇阿魏酸酯，含量6％～8％；(3)豆甾醇阿魏酸酯，含量为1％～2％；(4)γ-谷甾醇阿魏酸酯，含量极微；(5)二氢-γ-谷甾醇阿魏酸酯，含量极微；(6)二氢-β-谷甾醇阿魏酸酯。

液质联用色谱法对单体成分进行归属的基础：以相关化学基团的分子量为基准，阿魏酸(194.2)、环木菠萝醇(428.7)、菜油甾醇(400.7)、β-谷甾醇(414.7)；当醇与酸结合生成酯以后，总分子量为二者分子量之和去掉一个水分子量18.0；各成分的分子量相差明显。对应24-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯617.9、环木菠萝烯醇阿魏酸酯602.9、环木菠萝醇阿魏酸酯604.9、菜油甾醇阿魏酸酯576.9、β-谷甾醇阿魏酸酯590.9。

目前国内外普遍采用紫外-可见分光光度法(UV)测定谷维素含量。主要原因：(1)谷维素是环木菠萝醇类阿魏酸酯和甾醇类阿魏酸酯组成的混合物，具体成分有十多种，UV法可以一次测定这些同类物质；(2)虽然国内外有文献公开了采用高效液相色谱法(HPLC)测定谷维素含量，并以几种主要组成成分来确定谷维素的含量，但相应的标准品因为量少而稀有，价格昂贵，导致HPLC法的成本远高于UV法。

UV法测定谷维素含量，虽然简单，但是此法适用性有限，即对高含量谷维素的含量测定结果准确，但对于谷维素含量在40％以下的来自米糠油的皂脚、含谷皂基等的含量测定偏差大；只能测定同类物质的总含量，而不能测定谷维素中具体单一成分的含量；受杂质影响巨大，即虽然不是同类物质，但在相同检测波长条件下有强吸收的物质的影响极其显著，测定结果的不可控因素多，容易受掺杂物的影响而无法鉴定，无法保证产品质量。因此，该法的科学性欠缺。HPLC法具有科学性和严谨性，是世界公认的标准检测方法，但此法需要标准品，且来自谷维素的阿魏酸酯类标准品昂贵，导致此法不易普及。同时这些阿魏酸酯类和药物生产也同样需要高纯度的产品作为标准对照品，对药物品质控制有着重要意义。

因谷维素成分复杂，包括多种三萜醇类阿魏酸酯和甾醇类阿魏酸酯类化合物，市场上谷维素产品都是通过从米糠油提纯得到，很少涉及谷维素中单一成分的分离提纯。国内外有关从谷维素中分离制备主要阿魏酸酯单体的文献报导较少，申请号为CN201810457888.X的专利，公开了一种用逆流色谱法从大米米糠提取物中分离制备出高纯度单体环木菠萝烯醇阿魏酸酯、24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯、菜油甾醇阿魏酸酯和谷甾醇阿魏酸酯的方法；它是采用逆流色谱法从大米米糠提取物中分离制备高纯度环木菠萝烯醇阿魏酸酯等四种活性物质，溶剂体系由三个组分构成：石油醚或正构烷烃、二氯甲烷和乙腈或脂肪醇；体积比为：10：0-3：7-12；适用于采用各种型号逆流色谱仪分离制备单体环木菠萝烯醇阿魏酸酯、24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯、菜油甾醇阿魏酸酯和谷甾醇阿魏酸酯，能直接进大量粗品或合成混合物，分离环木菠萝烯醇阿魏酸酯和谷甾醇阿魏酸酯纯度达95％以上，24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯和菜油甾醇阿魏酸酯纯度达90％以上。该方法虽然效率高，操作简单，制备所得单体纯度高，但设备昂贵，花费高；制备过程中使用毒性大的二氯甲烷、乙腈等，极大地影响身体健康，不利于安全操作；并不是所有公司或实验室都具有逆流色谱仪；逆流设备也只适用部分植物提取物单体成分的分离，以致于该技术尚未推广开来。

EP503650公开了一种通过水解γ-谷维素获得阿为酸酯类物质的方法，但并不涉及谷维素中单一成分的分离提纯。

非专利文献“米糠功能因子γ-谷维醇的研究”(中国粮油学报2000，15(6)：14-18)利用高效液相色谱法提纯谷维素获得环木菠萝烯醇阿魏酸酯等单一产物，但该方法目的是检测分析谷维素中的物质，而不是获得其中的单一成分，方法复杂，并且最终也未对产物纯度和收率等进行报道。并不是一种适合制备高纯度单体的方法。

因此有必要找寻一种简单有效的方法，制备谷维素中主要的阿魏酸酯类单体成分，从根本上解决检测成本问题。同时，制备所得标准品或对照品，不仅可用作含量测定的对照品，外标法计算含量，也可用于定性峰位标定，有效地解决了谷维素定量和定性的难题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种简单有效的方法，不使用毒性大的有机溶剂，不使用贵重的仪器设备，以谷维素含量10～20％的皂脚为原料，将谷维素提纯到70～80％的最适含量，再用制备薄层色谱法分离制备谷维素中主要的阿魏酸酯类单体成分，用液质联用色谱对单体成分进行归属，液相和薄层色谱判定纯度，不需外购昂贵的标准品。制备所得5种单体—24-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯、环木菠萝烯醇阿魏酸酯、环木菠萝醇阿魏酸酯、菜油甾醇阿魏酸酯、β-谷甾醇阿魏酸酯，纯度均大于90％，从根本上解决这些单一组分难以制备、成本高的问题。同时，制备所得标准品或对照品，不仅可用作含量测定的对照品，用于液相色谱中的外标法计算含量，也可用于定性峰位标定，有效地解决谷维素定量和定性的难题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种以含谷维素的皂脚为原料制备5种阿魏酸酯单一成分的方法，包括以下步骤：

1)、碱醇热溶与趁热过滤；

2)、酸沉与过滤；

3)、亲脂性有机溶剂脱脂脱色；

4)、制备薄层色谱法分离；

条件是步骤3)脱色后所得的沉淀粗品中，谷维素的含量为70-80wt％。

优选地，所述制备5种阿魏酸酯单一成分的方法，包括以下步骤：

(1)碱醇热溶与趁热过滤：向含谷皂基中加入低碳醇，开启水浴加热，设定水浴温度，搅拌至体系达到水浴温度；用稀碱调节体系的pH，继续加热与搅拌，待含谷皂基溶解、不溶物分开明显时，趁热过滤，得溶解滤液；

(2)酸沉与过滤：用稀酸调节溶解滤液的pH，使沉淀析出，静置，过滤，收集沉淀；

(3)亲脂性有机溶剂脱脂脱色：先向沉淀中加入计算量的石油醚，充分搅拌均匀，静置，过滤，收集沉淀；再向沉淀中加入计算量的正已烷，充分搅拌均匀，静置，过滤，收集沉淀；

(4)制备薄层色谱法分离：用异丙醇和正庚烷的混合溶剂将沉淀溶解，再进行薄层色谱法的分离。

现有技术中，常采用制备型高效液相色谱仪、高速逆流色谱仪等昂贵大型的设备对谷维素中的各种物质进行分离，而没有使用制备薄层色谱这种较为简便有效的方式分离制备谷维素中的各种物质。主要原因：(1)谷维素的溶解特性。高纯度谷维素(含量95％以上)在各种有机溶剂中的溶解度很小，以致于在制备薄层色谱中用溶剂溶解样品时需要大量的溶剂，从而导致操作时间长、操作麻烦，并且制备产率低。而本专利发明人预料不到地发现，按照前述方法中，通过对步骤1)到步骤3)的条件加以控制，将脱色后的产品中谷维素含量控制在70-80wt％，恰好可以满足薄层色谱分离需要的溶解度条件，在此条件下溶解，其溶解量为高含量谷维素的3倍，制备薄层色谱的上样量显著增加。(2)各单位条件。现阶段专注于研究谷维素中阿魏酸酯单体物质的企业少，由于有现成的紫外-可见分光光度法(UV)测定谷维素的含量，一般企业均未做深入研究。本发明将谷维素项目立项并要实现产品出口，就需要用到先进的高效液相色谱法(HPLC)测定谷维素中各成分的含量，因此，需要这些单体物质的对照品。而这些对照品市场上难以寻找，且没有大型制备设备，故必须深入基础研究，以自制所需对照品。(3)采用制备薄层色谱法分离制备谷维素中的各种主要成分，其分离条件难以摸索，需要大量薄层色谱实验才能最终确定如样品溶解条件、展开溶剂及配比、制备分离次数、单体深入纯化等参数，耗时长。有企业购置了昂贵的制备型高效液相色谱仪，或高速逆流色谱仪等先进设备，本发明经大量的试验，采用简易，成本低的薄层色谱法即可制备谷维素中的五种不同的阿魏酸酯化合物，不需要采用昂贵的设备和复杂的方法，明显具有产业上的优势。

优选地，步骤1)中，所述低碳醇是指甲醇或乙醇，相应浓度≥85％，加入量为含谷皂基重量的5～10倍。国内有专利和文献报导用甲醇溶解米糠油皂脚、含谷皂基等含有谷维素的原料，本专利发明人通过实验证明，乙醇对含有谷维素的原料也有较好的溶解性，因此，本专利选择甲醇或乙醇来溶解原料；经实验发现，当低碳醇的浓度低于85％时，溶剂对原料的溶解性能变差，需要显著增加溶剂量才能将原料溶解，因此，设定浓度大于85％；低碳醇的加入量受原料中谷维素含量的影响，当原料中谷维素含量高时，倍数量多，反之则少，因此，本专利根据市场上所能采购到的原料中谷维素的含量范围，设定低碳醇的加入量为含谷皂基重量的5～10倍。

优选地，步骤1)中，所述设定的水浴温度为50～60℃。若加热温度高或溶解时间长，则在碱性条件下对谷维素有显著破坏作用，并导致产品收率严重下降；若加热温度低或溶解时间短，则不利于谷维素的溶出，不溶物增加，在降低产品收率的同时，也导致抽滤的速度慢或离心效果差。

优选地，步骤1)中，所述稀碱为氢氧化钠或氢氧化钾水溶液，相应浓度为2～10％，所调节体系的pH为8～11。氢氧化钠水溶液是调碱性溶液最经济的物质，浓度低则用量大，浓度高则在配制过程中易产生大量溶解热并且气味难闻。最终调节溶解液的pH过高，则会显著破坏谷维素，导致谷维素产率低；过低则不利于谷维素溶解，从而导致产量少。

优选地，步骤1)中，所述过滤方式为抽滤或离心，且离心速度大于3000转/min。专利发明人通过大量实验发现，不同厂家所提供的含谷皂基原料中谷维素含量和杂质不同，一些厂家的原料因油脂性杂质太多而无法抽滤，只能离心。为了缩短离心时间和保证离心效果，需要控制离心机转速3000转/min以上。

优选地，步骤2)中，所述稀酸为盐酸或硫酸水溶液，相应浓度为5～10wt％，盐酸和硫酸水溶液均可以用来调节碱性溶液的pH至中性或弱酸性，应用范围广，且不与主产品发生化学反应。浓度低则用量大，浓度高则配置过程产生大量溶解热且不利于劳动安全。所调节的pH为6.0～7.0，最终调节pH过低，则大量脂肪酸附着到主产品谷维素中，不利于谷维素纯化；若pH过高，则主产品谷维素析出不完全，收率低。

优选地，步骤2)中，所述静置时间为3～6h。专利发明人通过实验观察表明3～6h为实验室沉淀的最佳时间，在此时间范围内，沉淀明显且上清液澄清透明。若时间短，则沉淀不完全；若时间长，则实验效率低下，实验周期长。

优选地，步骤2)中，所述过滤方式为抽滤或离心，且离心速度大于3000转/min。与步骤1所遇到的问题一样，专利发明人通过实验发现，不同厂家所提供的含谷皂基原料中谷维素含量和杂质不同，一些厂家的原料因油脂性杂质太多而无法抽滤，只能离心。为了缩短离心时间和保证离心效果，需要控制离心机转速3000转/min以上。

优选地，步骤3)中，所述亲脂性有机溶剂为石油醚和正已烷，石油醚加入量为沉淀重量的3～6倍，正已烷加入量为沉淀重量的3～6倍。专利发明人根据文献以及通过实验发现，石油醚和正已烷对本工艺前述实验所得沉淀具有很好的脱脂和脱色效果，二者按顺序联用，效果更佳，因此，在实验室制备阿魏酸酯单体过程中采用这2种溶剂。溶剂加入量受亲脂性杂质和色素的影响，实验表明，当加入量大于6倍以后，脱脂脱色效果并无太大差异，因此，确定溶剂加入量为3～6倍。

优选地，步骤3)中，所述过滤方式为抽滤。在本工艺实验室条件下，抽滤可以使溶剂逐层透过沉淀层，从而将色素除去，是通过实验证明的最佳方式，具有实验室离心所达不到的脱脂脱色效果。

发明人预料不到地发现，经过上述步骤1)至步骤3)后，所得沉淀中谷维素含量在70-80wt％，达到最佳的谷维素与亲脂性杂质及色谱的相对含量，显著增加了谷维素在制备薄层色谱所用溶剂中的溶解度，再用制备薄层色谱进行高效分离，从而得到高纯度单体化合物。

步骤4)所述制备薄层色谱法分离包括以下步骤：①制备薄层板；②将步骤3)脱色后所得沉淀溶解；③配制展开剂1，将步骤②所得溶液用展开剂展开，紫外灯检视，合并相同色带；④相同色带的物质继续用展开剂2进行薄层色谱法分离，紫外灯检视，有一个主色带；⑤可选地，重复进行步骤③和④；⑥相同色带合并后装入层析柱，柱层析洗脱，结晶，抽滤，沉淀为高纯度组产品，母液回收溶剂后为低纯度组产品；

所述展开剂1为甲醇、异丙醇和正已烷按照体积比1：2-3：2-3的混合溶剂；所述展开剂2为丙酮、乙酸乙酯和石油醚按照体积比1：3-5：4-6的混合溶剂。专属展开剂1和2的配制，是根据多次薄层色谱不同展开剂条件下的展开，直至斑点分开明显才最终确定溶剂组成及比例。因单一展开剂一次展开不能保证达到制备高纯度单体的目的，故需要结合两种及以上的展开条件，才能制备得到高纯度的单体物质。

步骤4)中，所述制备薄层色谱法分离是制备5种阿魏酸酯单体以及初步鉴定纯度的关键。本专利发明人通过大量实验表明，在常规实验条件下，只使用薄层色谱法就可以简单、高效地从含谷皂基中分离制备高纯度的5种阿魏酸酯单体，并可以通过薄层的斑点情况来初步判断产品的纯度，是一种行之有效、简单实用的方法，也是本发明的关键所在。

步骤①制备薄层板的技术是本领域所熟知的，本发明是配制0.5-1wt％的CMC-Na水溶液，与400-800目的硅胶G按比例3-5:1研磨混合均匀，用自动涂布器制备厚度1.5-2mm薄层板，110-120℃干燥1-2h脱水，得到薄层板。

溶解沉淀的溶剂为异丙醇和正庚烷所组成的混合溶剂，相应组成为异丙醇：正庚烷2-3：2-3。虽然文献报导，谷维素可溶于甲醇、乙醇等有机溶剂中，但实际上谷维素纯度越高，在各种有机溶剂中越难以溶解。本专利发明人通过前期提纯技术，将谷维素含量提纯到70-80wt％，再结合多次溶解性实验，才确定用异丙醇和正庚烷按一定比例组成混合溶剂来溶解谷维素，这也是制备薄层色谱法得以正常进行的前提。

可选地，步骤⑤重复进行步骤③和④，是指将相同色带收集后，重新用展开剂1和展开剂2依次进行薄层色谱分离，以进一步提升阿魏酸酯类单体的纯度。

优选地，步骤⑥中，所述柱层析洗脱溶剂为温度60～65℃的异丙醇，异丙醇和层析硅胶的体积质量比(W/V)为2-4:1，结晶方式为将溶剂浓缩至少量时，加入纯化水，放置，自然析晶。专利发明人通过实验发现，热的异丙醇对谷维素中的阿魏酸酯类单体成分具有较好的溶解性，为了减少异丙醇的挥发，选定最佳的60～65℃的异丙醇。异丙醇洗脱后，对洗脱液加入3-6倍体积的纯化水，阿魏酸酯类单体成分由于溶解度下降，会析出白色结晶，因此，本专利采用将异丙醇浓缩至一定程度再加水的方式，使阿魏酸酯类单体成分结晶析出，从而制备得到纯白色的高纯度单体。

得到高纯度的阿魏酸酯单品后，用液质联用色谱判定成分归属，即用液质联用色谱的液相分离与质谱鉴定技术，对相应单体进行了峰位标定，从而确定单体物质的归属。具体是根据液质联用色谱的操作规范，分别称取5种化学成分的单体少量，用甲醇溶解与定容，微孔滤膜过滤后注入液质联用色谱仪分析，根据仪器读取的分子量判断相应化学成分单体的归属。

发明人经过大量工作，还发现了一种简单有效地判断阿魏酸酯单品产品纯度的方法，即用薄层色谱三种不同条件的展开均显单一斑点，并结合液相色谱的面积归一化法，进行了产品的纯度判定，不需要外购昂贵的标准品通过液相色谱的外标法来进行单体物质的纯度判定。所述不同条件薄层色谱中展开剂为以下三种：(1)甲醇：异丙醇：正已烷1：2-2.5：2-2.5；(2)丙酮：乙酸乙酯：石油醚1：3-3.5：4-4.5；(3)甲醇：乙酸乙酯：正已烷1-1.2：1-1.2：1-1.2。三种不同条件薄层色谱展开，是鉴定单体纯度的有效方法，所得单体在上述三种不同条件下展开，若单体均只显示一个明显的主斑点，而无其他斑点或其他斑点很弱，则可表明，制备所得单体纯度已较高，初步判定纯度在90％以上。

上述利用三种不同条件薄层色谱展开，判断产品纯度的方法经过高效液相色谱(HPLC)的面积归一化法的验证，证实了若阿魏酸酯产品在上述薄层色谱三种不同条件的展开均显单一斑点，判断产品纯度在90％以上的可靠性。

本发明方法的原理如下：

本发明以含谷维素的皂脚为原料制备5种阿魏酸酯单体。原料中主要含有谷维素以及脂肪酸、亲脂性杂质和脂溶性色素等，这些成分可以被浓度85％以上乙醇在pH为8～11，温度50～60℃的条件下充分溶解，并且谷维素在此条件下比较稳定。原料的溶解液经抽滤或离心，可以去除不溶解的杂质，从而得到澄清的滤液。谷维素和一些亲脂性杂质、脂溶性色素存在于滤液中，但谷维素不溶于酸性甲醇和酸性乙醇溶液中，通过调节溶液pH为6.0～7.0，使谷维素沉淀析出，而部分亲脂性杂质和脂溶性色素溶解于酸性乙醇中，待沉淀完全以后，通过抽滤或离心，进一步将谷维素与亲脂性杂质和脂溶性色素分离。脂溶性色素和亲脂性杂质易溶于石油醚、正已烷等亲脂性有机溶剂中，而谷维素难溶，通过这些亲脂性有机溶剂，结合抽滤，可以将绝大部分脂溶性色素和亲脂性杂质去除，从而得到类白色的谷维素。

通过上述技术手段的对谷维素的分离提纯，使得产品中谷维素的含量在70-85wt％之间，此时产品适合使用薄层色谱技术进行阿魏酸酯单体的分离。通过适当的有机溶剂将类白色的谷维素溶解，再利用薄层色谱分离技术，使用两次及以上不同的展开条件进行薄层色谱分离，收集相同的区段，最终得到较纯的5种阿魏酸酯单体成分。最后通过柱层析，用适当的有机溶剂溶解，将硅胶G上所吸附并合并的单体成分洗脱下来，采用适当的结晶方式，制备得到纯白色、纯度高的5种阿魏酸酯单体成分。

在已知单体分子量以及植物来源或分子构成，并且已制备得到高纯度单体的前提下，对于非挥发性成分，采用液质联用色谱技术可以简单高效地鉴定单体成分归属，并利用高效液相色谱(HPLC)的面积归一化法，可以在前期已用薄层色谱技术鉴定单体纯度之后，进一步对5种阿魏酸酯类单体的纯度进行鉴定，从而保证了每种单体的准确性。

本发明方法的有益效果如下：

1、本发明以谷维素含量10～20％的皂脚为原料，通过制备薄层色谱技术制备得到5种阿魏酸酯单体—24-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯、环木菠萝烯醇阿魏酸酯、环木菠萝醇阿魏酸酯、菜油甾醇阿魏酸酯、β-谷甾醇阿魏酸酯，相应纯度大于90％，属于市场上难有的对照品。

2、制备所得单体可用作含量测定的对照品，用于高效液相色谱(HPLC)外标法计算含量，定性峰位标定。

3、不使用毒性大的有机溶剂，不使用贵重的仪器设备。

4、建立了一种简单有效的方法，制备谷维素中主要的阿魏酸酯类单体成分，从根本上解决了谷维素定量测定的标准品难以寻找，检测成本高的问题，解决了谷维素精确定量和定性的难题，从而使高效液相色谱法(HPLC)测定谷维素含量成为可能。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的以含谷维素的皂脚为原料制备5种阿魏酸酯酯单体的方法作进一步说明。

本发明实施例所使用的原料含有谷维素的皂脚购于湖南，谷维素的含量为13.65wt％。本发明实施例所使用的甲醇、乙醇、氢氧化钠、氢氧化钾、盐酸、硫酸、石油醚、正已烷、异丙醇、正庚烷、正已烷、丙酮、乙酸乙酯、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、硅胶G均为分析纯AR级，纯水为实验室用二级纯水设备制备。本发明实施例所使用的化学试剂和原辅材料，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

本发明实施例中，采用薄层色谱和液质联用色谱的面积归一化法判断单体纯度，用液质联用色谱对单体进行归属。依据分子量：阿魏酸(194.2)、环木菠萝醇(428.7)、菜油甾醇(400.7)、β-谷甾醇(414.7)；当醇与酸结合生成酯以后，总分子量为二者分子量之和去掉一个水分子量18.0，对应24-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯(617.9)、环木菠萝烯醇阿魏酸酯(602.9)、环木菠萝醇阿魏酸酯(604.9、菜油甾醇阿魏酸酯(576.9)、β-谷甾醇阿魏酸酯(590.9)。

实施例1

1)、碱醇热溶与趁热过滤。将100.3g含有谷维素的皂脚原料放入1000mL烧杯中，加入800mL甲醇，水浴52℃加热，经常搅拌，至烧杯内外温度一致。再用浓度4％的氢氧化钠水溶液调节体系的pH为10.0，于52℃保温并不断搅拌10min，至含谷皂基溶解、不溶物分开明显时，趁热离心，以3500转/min离心5min，收集离心液，得溶解滤液。

2)、酸沉与过滤。用浓度10％的稀盐酸调节溶解滤液的pH为7.0，搅拌5min后静置，使沉淀析出，继续静置4h，抽滤，收集沉淀，得62.5g黄色沉淀。

3)、亲脂性有机溶剂脱脂脱色。先向沉淀中加入250mL石油醚，充分搅拌5min并混合均匀，静置10min，抽滤，收集沉淀；再向沉淀中加入250mL正已烷，充分搅拌5min并混合均匀，静置10min，抽滤，收集沉淀，得28.7g白色沉淀。

4)、制备薄层色谱法分离。按以下步骤操作：

①配制0.5％的CMC-Na水溶液，与400目的硅胶G按比例3:1研磨混合均匀，用自动涂布器制备厚度1.5mm的制备薄层板，规格20×20cm，110℃干燥60min脱水，得制备薄层板。

②用异丙醇和正庚烷3:2的混合溶剂150mL将28.7g沉淀溶解，点板上样，每板点1mL，多次多板使用，至用完溶解液。

③配制专属展开剂1，甲醇:异丙醇:正已烷1:2:2，展开，展距16cm，取出晾干，紫外灯检视，合并相同色带。用60℃异丙醇将色带上的成分溶解出来，挥干异丙醇，再用异丙醇和正庚烷3:2的混合溶剂将残渣溶解。

④第2次制备薄层色谱法分离，配制专属展开剂2，丙酮：乙酸乙酯：石油醚1：3：4，展开，展距16cm，取出晾干，紫外灯检视，合并相同色带。用60℃异丙醇将色带上的成分溶解出来，挥干异丙醇，再用异丙醇和正庚烷3:2的混合溶剂将残渣溶解。

⑤第3次制备薄层色谱法分离条件同③，第4次制备薄层色谱法分离条件同④，最后将各个成分相同的色带分别收集。

⑥将相同色带合并后装入层析柱，用60℃异丙醇洗脱，回收异丙醇至10mL时，加入30mL纯化水，结晶，静置4h，抽滤。沉淀为高纯度对照品；母液回收溶剂得低纯度对照品，低纯度组产品的纯度在85-92％左右。

⑦高纯度对照品用3种不同条件薄层色谱展开，甲醇：异丙醇：正已烷1：2：2；丙酮：乙酸乙酯：石油醚1：3：4；甲醇：乙酸乙酯：正已烷1：1：1，展距16cm，取出晾干，紫外灯检视，均只见一个斑点，可以初步判断所得单体纯度大于90％；

⑧将各个成分的高纯度组产物和低纯度组产物分别干燥，真空度-0.09MPa，温度60℃，得成品。产出情况如下表1所示。

表1

5)、液质联用色谱判定成分归属。根据液质联用色谱的操作规范标准操作，根据仪器读取的分子量判断相应化学成分单体的归属，24-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯617.9、环木菠萝烯醇阿魏酸酯602.9、环木菠萝醇阿魏酸酯604.9、菜油甾醇阿魏酸酯576.9、β-谷甾醇阿魏酸酯590.9。

根据面积归一化法进一步验证所得高纯组和低纯组产品的纯度，见下表2所示。

表2

实施例2

1)、碱醇热溶与趁热过滤。将200.9g含有谷维素的皂脚原料放入2000mL烧杯中，加入1500mL乙醇，水浴56℃加热，经常搅拌，至烧杯内外温度一致。再用浓度5％的氢氧化钾水溶液调节体系的pH为9.5，于56℃保温并不断搅拌12min，至含谷皂基溶解、不溶物分开明显时，趁热抽滤，收集滤液，得溶解滤液。

2)、酸沉与过滤。用浓度5％的稀硫酸调节溶解滤液的pH为6.8，搅拌3min后静置，使沉淀析出，继续静置5h，离心，以3500转/min离心5min，收集沉淀，得131.6g黄色沉淀。

3)、亲脂性有机溶剂脱脂脱色。先向沉淀中加入600mL石油醚，充分搅拌5min并混合均匀，静置10min，抽滤，收集沉淀；再向沉淀中加入600mL正已烷，充分搅拌5min并混合均匀，静置10min，抽滤，收集沉淀，得59.0g白色沉淀。

4)、制备薄层色谱法分离。按以下步骤操作：

①配制0.5％的CMC-Na水溶液，与400目的硅胶G按比例3:1研磨混合均匀，用自动涂布器制备厚度1.5mm的制备薄层板，规格20×20cm，110℃干燥60min脱水，得制备薄层板。

②用异丙醇和正庚烷3:2的混合溶剂300mL将59.0g沉淀溶解，点板上样，每板点1mL，多次多板使用，至用完溶解液。

③配制专属展开剂1，甲醇:异丙醇:正已烷1:3:3，展开，展距16cm，取出晾干，紫外灯检视，合并相同色带。用60℃异丙醇将色带上的成分溶解出来，挥干异丙醇，再用异丙醇和正庚烷3:2的混合溶剂将残渣溶解。

④第2次制备薄层色谱法分离，配制专属展开剂2，丙酮：乙酸乙酯：石油醚1：4：6，展开，展距16cm，取出晾干，紫外灯检视，合并相同色带。用60℃异丙醇将色带上的成分溶解出来，挥干异丙醇，再用异丙醇和正庚烷3:2的混合溶剂将残渣溶解。

⑤第3次制备薄层色谱法分离条件同③，第4次制备薄层色谱法分离条件同④，最后将各个成分相同的色带分别收集。

⑥将相同色带合并后装入层析柱，用60℃异丙醇洗脱，回收异丙醇至15mL时，加入45mL纯化水，结晶，静置4h，抽滤。沉淀为高纯度对照品；母液回收溶剂得低纯度对照品，低纯度组单体的纯度在85-92％左右。

⑦高纯度对照品用3种不同条件薄层色谱展开，甲醇：异丙醇：正已烷1：2.5：2.5；丙酮：乙酸乙酯：石油醚1：3：4.5；甲醇：乙酸乙酯：正已烷1.2：1：1.2，展距16cm，取出晾干，紫外灯检视，均只见一个斑点，可以初步判断所得单体纯度大于90％；

⑧将各个成分的高纯度产物和低纯度产物分别干燥，真空度-0.09MPa，温度62℃，得成品。产出情况如下表3所示。

表3

5)、液质联用色谱判定成分归属。根据液质联用色谱的操作规范标准操作，根据仪器读取的分子量判断相应化学成分单体的归属，4-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯617.9、环木菠萝烯醇阿魏酸酯602.9、环木菠萝醇阿魏酸酯604.9、菜油甾醇阿魏酸酯576.9、β-谷甾醇阿魏酸酯590.9。

根据面积归一化法进一步验证所得高纯组和低纯组产品的纯度，见下表4所示。

表4

实施例3

其它操作同实施例1，区别在于步骤4)中，取消步骤⑤的第三次和第四次的薄层色谱的展开。

在步骤4)的⑦中，高纯度组和低纯度组产品使用3种不同条件薄层色谱展开，甲醇：异丙醇：正已烷1：2：2；丙酮：乙酸乙酯：石油醚1：3：4；甲醇：乙酸乙酯：正已烷1：1：1，展距16cm，取出晾干，紫外灯检视，其中仅24-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯和环木菠萝烯醇阿魏酸酯在三种不同的展开条件下均为单一的斑点，其它三种阿魏酸酯产品在某一展开条件下出现多个斑点，说明所得单体纯度没有达到90％；低纯度组产品在三种不同展开条件下不能均显示出单一的斑点，说明低纯度组纯度均没有达到90％。

⑧将各个成分的高纯度产物和低纯度组分别干燥，真空度-0.09MPa，温度60℃，得成品。根据面积归一化法验证高纯组和低纯度产品中单体的纯度，如下表5所示。

表5

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种以含谷维素的皂脚为原料制备5种阿魏酸酯单一成分的方法，包括以下步骤：

1)、碱醇热溶与趁热过滤；

2)、酸沉与过滤；

3)、亲脂性有机溶剂脱脂脱色；

4)、制备薄层色谱法分离；

条件是步骤3)脱色后所得的沉淀粗品中，谷维素的含量为70-80wt％。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)碱醇热溶与趁热过滤：向含谷皂基中加入低碳醇，开启水浴加热，设定水浴温度，经常搅拌至体系达到水浴温度；用稀碱调节体系的pH，继续加热与搅拌，待含谷皂基溶解、不溶物分开明显时，趁热过滤，得溶解滤液；

(2)酸沉与过滤：用稀酸调节溶解滤液的pH，使沉淀析出，静置，过滤，收集沉淀；

(3)亲脂性有机溶剂脱脂脱色：先向沉淀中加入计算量的石油醚，充分搅拌均匀，静置，过滤，收集沉淀；再向沉淀中加入计算量的正已烷，充分搅拌均匀，静置，过滤，收集沉淀；

(4)制备薄层色谱法分离：用异丙醇和正庚烷的混合溶剂将沉淀溶解，再进行薄层色谱法的分离。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述低碳醇是指甲醇或乙醇，相应浓度≥85％，加入量为含谷皂基重量的5～10倍；和/或水浴温度为50～60℃；和/或所调节体系的pH为8～11。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所调节的pH为6.0～7.0；和/或所述静置时间为3～6h。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述亲脂性有机溶剂为石油醚和正已烷，石油醚和正己烷的加入量分别为沉淀重量的3～6倍。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤4)所述制备薄层色谱法分离包括以下步骤：①制备薄层板；②将步骤3)脱色后所得沉淀溶解；③配制展开剂1，将步骤②所得溶液用展开剂展开，紫外灯检视，合并相同色带；④相同色带的物质继续用展开剂2进行薄层色谱法分离，紫外灯检视，有一个主色带；⑤可选地，重复进行步骤③和④；⑥相同色带合并后装入层析柱，柱层析洗脱，结晶，抽滤，沉淀为高纯度组产品，母液回收溶剂后为低纯度组产品；

所述展开剂1为甲醇、异丙醇和正已烷的混合溶剂；所述展开剂2为丙酮、乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述展开剂1为甲醇、异丙醇和正已烷按照体积比1：2-3：2-3的混合溶剂；所述展开剂2为丙酮、乙酸乙酯和石油醚按照体积比1：3-5：4-6的混合溶剂。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤②中溶解沉淀的溶剂为异丙醇和正庚烷的混合溶剂，优选为异丙醇和正庚烷按照体积比2-3:2-3混合溶剂

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤⑥中，所述柱层析洗脱溶剂为温度60～65℃的异丙醇，异丙醇和层析硅胶的体积质量比(W/V)为2-4:1，结晶方式为将溶剂浓缩至少量时，加入纯化水，放置，自然析晶。

10.一种判断阿魏酸单品纯度的简易方法，其特征在于，包括如下步骤：样品用薄层色谱在三种不同条件的展开均显单一斑点即判断产品纯度在90％以上；所述不同条件薄层色谱中展开剂为以下三种：(1)甲醇：异丙醇：正已烷1：2-2.5：2-2.5；(2)丙酮：乙酸乙酯：石油醚1：3-3.5：4-4.5；(3)甲醇：乙酸乙酯：正已烷1-1.2：1-1.2：1-1.2。