CN110999790B - 一种同时抑菌和延长马铃薯组培苗继代时间的方法及继代培养方法 - Google Patents

Abstract

本申请实施例提供一种同时抑菌和延长马铃薯组培苗继代时间的方法及继代培养方法，涉及组培苗保存领域。同时抑菌和延长马铃薯组培苗继代时间的方法是将马铃薯组培苗接种于添加有卡松的培养基上并进行培养，培养基中卡松的浓度为20～2000ppm。马铃薯组培苗的继代培养方法是将经过上述的同时抑菌和延长马铃薯组培苗继代时间的方法培养的马铃薯组培苗，剪取培养基上的部分，并重新接种到未添加卡松的培养基上，恢复培养6～8d以上。同时抑菌和延长马铃薯组培苗继代时间的方法用以保存马铃薯组培苗不受污染，同时还能有效延缓马铃薯组培苗的生长，从而有效延长马铃薯组培苗继代时间，继代培养方法容易恢复生长。

Description

一种同时抑菌和延长马铃薯组培苗继代时间的方法及继代培 养方法

技术领域

本申请涉及组培苗保存领域，具体而言，涉及一种同时抑菌和延长马铃薯组培苗继代时间的方法及继代培养方法。

背景技术

马铃薯是世界第三，我国第四大粮食作物，它既是重要的粮食作物，又作为最基本的蔬菜作物，而且还是优良的饲料作物，更是增值潜力巨大的工业原料作物。由于马铃薯为营养繁殖作物，生产上主要采用薯块进行种植，薯块多代种植易导致薯块中积累病毒、类病毒、细菌、真菌等各种病原体，使马铃薯产量和品质下降。为克服上述问题，防止种薯带病，目前多使用脱毒技术生产脱毒种薯用于马铃薯生产，提高马铃薯的产量、改善品质，而马铃薯脱毒及脱毒种薯工厂化生产都离不开组培苗的培养。

但是马铃薯苗在组织培养过程中仍然会存在一些问题，例如在马铃薯组培苗保存过程中，组培苗在合适的营养条件下，生长速率很快，每个月都要对组培苗进行继代一次，即使采用较高浓度的蔗糖能达到延缓组培苗的生长，但3个月左右也要继代一次。频繁的进行继代不仅会消耗大量的人力物力，而且极其容易造成育种资源的污染和混杂。

对此，很多学者进行了关于延缓马铃薯组培苗生长方面的研究，例如采取降低组培苗的保存温度，利用不同浓度的矮壮素、青鲜素等对试管苗进行培养，虽然低温能很好地抑制苗的生长且遗传物质没有发生改变，但这需要耗费大量的能源。还有研究者使用多效唑、甘露醇在马铃薯组培苗保存中进行应用，也取得了延缓生长的效果，但是无法抑制细菌污染，还需要使用抑菌剂。有研究者通过在培养基中添加抗生素来抑制组培苗培养中的细菌污染，虽然这些抗生素可抑制细菌的污染，但操作过程复杂，容易造成重复污染。

发明内容

本申请实施例的目的在于提供一种同时抑菌和延长马铃薯组培苗继代时间的方法及继代培养方法，用以保存马铃薯组培苗不受污染，同时还能有效延缓马铃薯组培苗的生长，从而有效延长马铃薯组培苗继代时间，而且容易恢复生长。

第一方面，本申请实施例提供了一种同时抑菌和延长马铃薯组培苗继代时间的方法，将马铃薯组培苗接种于添加有卡松的培养基上并进行培养，培养基中卡松的浓度为20～2000ppm。

在上述技术方案中，卡松(Kathon)是一种防腐剂，是5-氯-2甲基-4异噻唑啉-3酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CIT/MIT)的混合物，与其他防腐剂，比如尼泊金、苯甲酸钠等防腐剂相比来说，卡松具有毒性低、抗菌作用范围广、效果强、使用过程不会产生气泡、使用方便、可直接加入等优点。申请人发现在马铃薯组培苗的保存过程中，添加少量卡松就可以达到较佳的抑菌效果，而且申请人还创造性的发现，采用含一定浓度卡松的培养基培养马铃薯组培苗，对马铃薯组培苗的生长速率具有明显的抑制作用，可以在常温培养下延缓组培苗的生长(不生根，保持原始高度)，且马铃薯组培苗容易恢复生长。因此采用本申请的方法保存马铃薯组培苗，不仅能保存马铃薯组培苗不受污染，同时还能有效延缓马铃薯组培苗的生长，从而有效延长马铃薯组培苗继代时间，进而降低马铃薯组培苗培养的工作量，节约能源，降低组培苗污染几率，降低种质资源因污染而灭失的风险。

在一种可能的实现方式中，培养基中卡松的浓度为50～200ppm。

在上述技术方案中，浓度为50～200ppm的卡松即可在马铃薯组培苗培养中呈现延长马铃薯组培苗继代时间和抑菌的双重效果，从而可以大幅降低马铃薯组培苗长期培养的工作量和污染概率。

在一种可能的实现方式中，培养为密闭式培养，培养条件为20～30℃，每天光照12～20h，其余时间黑暗。

在上述技术方案中，采用添加有一定浓度卡松的培养基培养马铃薯组培苗，按照常规的保存条件，就可以实现在常温培养下延缓组培苗的生长和降低污染的目的。

在一种可能的实现方式中，培养基为MS培养基并附加7～9g/L琼脂和28～32g/L蔗糖。

在上述技术方案中，采用附加琼脂和蔗糖的MS培养基就能满足培养马铃薯组培苗所需营养物质，使马铃薯组培苗保持存活状态。

在一种可能的实现方式中，添加有卡松的培养基的制备方法包括以下步骤：

在培养基组成成分中加入蒸馏水，调pH至5.5～6，于120～123℃灭菌15～30min，冷却至45～55℃，加入卡松溶液后摇匀，卡松溶液为卡松质量浓度为13％～15％的卡松水溶液。

在上述技术方案中，按照上述的制备方法，就能够得到满足马铃薯组培苗培养要求的培养基，还能使卡松均匀分散于培养基中，从而稳定发挥其在培养过程中的作用。

在一种可能的实现方式中，组培苗的接种方法包括以下步骤：

待培养基凝固并冷却至室温后，在培养基上接种马铃薯组培苗带芽茎段，组培苗高度控制为1～2cm。

在上述技术方案中，按照上述的接种方法接种马铃薯组培苗，能够在保证马铃薯组培苗存活的前提下，有效延缓马铃薯组培苗的生长。

在一种可能的实现方式中，培养的时间为0～12个月。

在上述技术方案中，按照本申请的方法保存马铃薯组培苗，可以12个月的时间内起到延缓马铃薯组培苗生长的作用，同时降低受污染概率，减少频繁继代的工作量及降低组培材料混杂、灭失的风险。

第二方面，本申请实施例还提供了一种马铃薯组培苗的继代培养方法，将经过第一方面提供的同时抑菌和延长马铃薯组培苗继代时间的方法培养的马铃薯组培苗，剪取培养基上的部分，并重新接种到未添加卡松的培养基上，恢复培养6～8d以上。

在上述技术方案中，按照本申请的方法长期保存马铃薯组培苗后，只需要将马铃薯组培苗转接到不含卡松的培养基上，马铃薯组培苗就可以在短时间恢复正常生长，而且不会发生明显的形态变异现象。

具体实施方式

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本申请实施例的一种同时抑菌和延长马铃薯组培苗继代时间的方法及继代培养方法进行具体说明。

本申请实施例提供了一种同时抑菌和延长马铃薯组培苗继代时间的方法，将马铃薯组培苗接种于添加有卡松的培养基上并进行培养，培养基中卡松的浓度为20～2000ppm，在本申请的一些实施例中，培养基中卡松的浓度为50～200ppm，比如，培养基中卡松的浓度为20ppm、30ppm、50ppm、70ppm、100ppm、200ppm、300ppm、400ppm、500ppm、800ppm、1000ppm、1500ppm或2000ppm，或上述任意两个数值之间的中间值。本申请中的“ppm”是指卡松占培养基的百万分比浓度。

本申请对培养基不做特殊限定，只需要能够满足马铃薯组培苗培养所需营养需求即可，比如为常规的MS培养基。在本申请的一些实施例中，培养基为MS培养基并附加7～9g/L琼脂和28～32g/L蔗糖，比如在常规的MS培养基中另外添加7g/L、8g/L或9g/L琼脂和28g/L、30g/L或32g/L蔗糖。

本申请对添加有卡松的培养基的制备方法不做限定，只需要能够使卡松分散在培养基中，能够满足马铃薯组培苗的培养需求即可。在本申请的一些实施例中，添加有卡松的培养基的制备方法可以包括以下步骤：

在培养基组成成分中加入蒸馏水，调pH至5.5～6，于120～123℃灭菌15～30min，冷却至45～55℃，加入卡松溶液后摇匀，卡松溶液为卡松质量浓度为13％～15％的卡松水溶液。

本申请对马铃薯组培苗的接种方法不做限定，按照常规的接种方法即可。在本申请的一些实施例中，组培苗的接种方法包括以下步骤：

待培养基凝固并冷却至室温后，在培养基上接种马铃薯组培苗带芽茎段，组培苗高度控制为1～2cm，比如组培苗露出培养基的部分(位于培养基上的部分)高度为1cm、1.5cm或2cm。

本申请对马铃薯组培苗的培养方法不做限定，按照组培苗常规保存方法即可。在本申请的一些实施例中，所述培养为密闭式培养，所述培养条件为20～30℃，每天光照12～20h，其余时间黑暗。培养的时间为0～12个月，比如培养0个月、1个月、2个月、4个月、6个月、8个月或12个月，均能够保证延缓组培苗生长和降低污染概率的双重作用。

本申请实施例还提供了一种马铃薯组培苗的继代培养方法，将经过上述的同时抑菌和延长马铃薯组培苗继代时间的方法培养的马铃薯组培苗，剪取培养基上的部分，并重新接种到未添加卡松的培养基上，恢复培养6～8d以上，即可恢复生长。

以下结合试验对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。

试验一

试验方法：分为多个试验组(实施例1-实施例5、对比例1-对比例6、对照组)，每个试验组是将马铃薯组培苗接种于添加有相应添加剂的培养基上并进行培养。

试验所用组培苗为马铃薯(Solanum tuberosum L.)主栽品种合作88组培苗；所用卡松为质量浓度14％卡松溶液，购自宜兴市可信的化工贸易有限公司。

试验所用培养基的制备方法如下：以MS培养基附加8g/L琼脂和30g/L蔗糖为培养基，分别称取培养基各个组成成分(MS培养基0.884g、蔗糖6g、琼脂1.6g)倒入250ml的锥形瓶中，再加入蒸馏水接近200ml，以1M氢氧化钾溶液调pH至5.8，最后定容至200ml，用封口膜封口，放入高压灭菌锅内121℃灭菌20min。将经高压灭菌后的培养基在超净工作台内冷却至约50℃后，依次用移液枪按表1所示的添加剂情况(不同的添加剂和添加量)向各个锥形瓶中加入添加剂后摇匀，每个锥形瓶中的溶液分别均匀倒到三个培养瓶内，作3个重复。

表1不同试验组中添加剂的情况

接种和培养方法为：待培养基凝固并冷却至室温后，在超净工作台上操作，在每个培养瓶内接种8株马铃薯组培苗带芽茎段，尽量保证组培苗高度一致均为1cm，接种后打开瓶盖全部放置于通风的窗台上暴露2h，使培养基充分接触含有微生物的空气；然后旋紧瓶盖，置于培养间内进行培养(25℃，光照16h，黑暗8h)。两天后开始观察并记录污染情况及生长状况(生根情况和生长高度)，结果如表2所示。

表2不同试验组的污染情况及生长情况

通过分析实施例1-5和对比例1-6、对照组的污染情况发现，在相同培养条件下，随着卡松浓度的升高，抑菌效果越好：没有添加卡松的组培苗(对照组)在接种后的第3天开始大量滋生霉菌；卡松浓度较低的培养基(对比例1)中的组培苗被污染的时间比对照组要晚；而卡松浓度为不小于20ppm(实施例1-实施例5、对比例2)的组培苗在整个培养实验过程中都没有被污染，说明卡松浓度达到20ppm浓度后对组培苗的培养具有很好的抑菌效果，在组培苗的开放式培养上应用可以起到较好的抑菌效果，能够减少马铃薯组培苗因被污染而造成的浪费。

通过分析实施例1-5和对比例1-2、对照组的生长情况发现，在相同培养条件下，随着卡松浓度的升高，对马铃薯组培苗生长的抑制程度也越大：在低浓度的卡松(对比例1)的抑制程度较小，植株在接种的第4天到第5天生根，生根后生长速率也较快。而卡松在高浓度范围内(实施例1-实施例5，20-2000ppm)下生长的植株受抑制程度很大，植株颜色也会偏黄，在整个培养过程中不生根，植株高度基本不变，保持了原始高度，很好的抑制了植株的生长，这样人工劳动、组织培养应用的成本和周期性转移过程中的资源消耗也会减少，节约了保存成本。但是超高浓度的卡松(对比例2)会影响植株存活，甚至死亡。

而对比例3-4采用多效唑或蔗糖和甘露醇能够抑制植株生长，但是无法同时抑菌；对比例5-6采用青霉素或次氯酸钠抑菌剂虽然能够抑制霉菌，但是不具有马铃薯组培苗生长的作用，马铃薯组培苗正常生长，因此常用于马铃薯组培苗的开放式培养。

试验二

试验方法：分为多个培养组，每个培养组是将试验一中各个试验组(实施例1-实施例5、对比例1-对比例6、对照组)的马铃薯组培苗接种于培养基上进行继代培养。

以MS培养基附加8g/L琼脂和30g/L蔗糖为基础培养基配制3600ml的培养基，均匀倒入60个培养瓶内，使每个瓶内的培养基量基本保持一致；然后将全部培养基放到高压灭菌锅(121℃)中灭菌20min，取出待培养基凝固后，每5瓶培养基为一组，共12组；分别将实施例1-实施例5、对比例1-对比例6、对照组的组培苗，剪取培养基上的部分，重新接种到对应组的5瓶培养基上，初始高度保持一致，均为1cm。接种后第二天开始每天记录组培苗的生根情况和生长高度。结果如表3所示。

表3不同试验组的继代培养情况

通过对比不同培养组的生长情况可以发现：未被抑制、正常生长的组培苗(对照组)重新转接到正常的培养基后，植株在第2天到第3天开始生根，第4天开始长高，随后每天植株都有所伸长，呈正常生长。而被卡松抑制生长的组培苗(实施例1-5)需要一段时间的恢复，大约1周左右，抑制苗也开始生根长高，恢复后的生长速率与正常苗接近，经长期保存的组培苗恢复培养第10天开始已比接种时有显著伸长，并与对照组培养6天时近似。由此可知，被卡松抑制生长的组培苗在继代前期的生长速率较低，大概需要一个6-8d的恢复期，12d时抑制苗生长速率已与未被抑制的组培苗继代6d时相近，说明卡松对马铃薯组培苗的抑制状态可以很快恢复。另外对比例4经甘露醇保存的组培苗恢复生长会有植株畸形的现象，实施例1-5经卡松保存没有发现植株有表型异常的现象，因此经卡松抑制培养的组培苗在继代后期与正常生长的组培苗没有可见差异，对组培苗继代后期生长也没有明显的不良影响。

综上所述，本申请实施例的同时抑菌和延长马铃薯组培苗继代时间的方法及继代培养方法，用以保存马铃薯组培苗不受污染，同时还能有效延缓马铃薯组培苗的生长，从而有效延长马铃薯组培苗继代时间，而且容易恢复生长。

以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请的保护范围，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种同时抑菌和延长马铃薯组培苗继代时间的方法，其特征在于，将马铃薯组培苗接种于添加有卡松的培养基上并进行培养，所述培养基中所述卡松的浓度为20～2000ppm，所述培养的时间为1～12个月；

所述培养为密闭式培养，所述培养条件为20～30℃，每天光照12～20h，其余时间黑暗；

所述培养基为MS培养基并附加7～9g/L琼脂和28～32g/L蔗糖。

2.根据权利要求1所述的同时抑菌和延长马铃薯组培苗继代时间的方法，其特征在于，所述培养基中所述卡松的浓度为50～200ppm。

3.根据权利要求1所述的同时抑菌和延长马铃薯组培苗继代时间的方法，其特征在于，添加有所述卡松的所述培养基的制备方法包括以下步骤：

在培养基组成成分中加入蒸馏水，调pH至5.5～6，于120～123℃灭菌15～30min，冷却至45～55℃，加入卡松溶液后摇匀，所述卡松溶液为卡松质量浓度为13％～15％的卡松水溶液。

4.根据权利要求1所述的同时抑菌和延长马铃薯组培苗继代时间的方法，其特征在于，所述组培苗的接种方法包括以下步骤：

待所述培养基凝固并冷却至室温后，在所述培养基上接种马铃薯组培苗带芽茎段，所述组培苗高度控制为1～2cm。

5.一种马铃薯组培苗的继代培养方法，其特征在于，将经过如权利要求1所述的同时抑菌和延长马铃薯组培苗继代时间的方法培养的马铃薯组培苗，剪取所述培养基上的部分，并重新接种到未添加卡松的培养基上，恢复培养6～8d以上。