CN102228004B

CN102228004B - 一种胭脂花组培繁殖的种质保存方法

Info

Publication number: CN102228004B
Application number: CN2011101212441A
Authority: CN
Inventors: 潘会堂; 游晓会; 张启翔; 孙明; 程堂仁; 王佳
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2011-05-11
Filing date: 2011-05-11
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2031-05-11
Also published as: CN102228004A

Abstract

本发明提供了一种胭脂花组培繁殖的种质保存方法，包括低温处理后的外植体经表面灭菌后，进行不定芽的诱导，所述的不定芽的诱导培养基为以MS为基本培养基，添加0.2～1.0mg/L 6-BA，0～0.2mg/L IBA，20～40g/L蔗糖的固体培养基，pH为5.9～6.0。本发明提供的组培繁殖胭脂花种质保存方法稳定可靠，可重复性强，为胭脂花优良单株的保存提供了技术保障。

Description

一种胭脂花组培繁殖的种质保存方法

技术领域

本发明涉及植物种质的保存方法，具体涉及一种胭脂花(Primula maximowiczii)组培繁殖的种质保存方法。

背景技术

胭脂花是原产于我国北方的报春花属多年生草本植物，花色鲜艳，观赏价值高，是一种具有很高园林应用潜力的野生花卉。

野生胭脂花群体中存在丰富的观赏价值高的天然变异，主要表现在花色、花眼变异，这些变异为胭脂花的园林应用提供了丰富的种质材料。但由于胭脂花属典型的异花授粉植物，用种子繁殖易丧失优良性状，分株方法增殖系数太低，同时栽培条件较为苛刻，无法有效保存优良种质或品种。本发明则利用组织培养技术来解决胭脂花优良种质的保存问题，迄今国内外尚未有相关方面的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胭脂花组培繁殖的种质保存方法。

为了实现本发明目的，本发明提供了一种胭脂花组培繁殖的种质保存方法，该方法包括低温处理后的外植体经表面灭菌后，进行不定芽的诱导，所述的不定芽的诱导培养基为以MS为基本培养基，添加0.2～1.0mg/L 6-BA，0～0.2mg/L IBA，20-40g/L蔗糖的固体培养基，pH为5.9-6.0。

其中，该种质保存方法还包括增殖和继代培养，所述的增殖和继代培养基为以MS为基本培养基，添加0.5～1.0mg/L 6-BA，0.05～0.5mg/L NAA，20～40g/L蔗糖的固体培养基，pH为5.9～6.0；所述的继代培养每隔1～2月继代一次。

其中，该种质保存方法还包括生根培养，所述的生根培养的培养基为以MS为基本培养基，添加0.02～0.05mg/L IBA，20～40g/L蔗糖的固体培养基，pH为5.9。其中，该种质保存方法还包括组培苗的移栽，所述的组培苗的移栽选择在生根培养3～4周后，平均每株生根4～5条，打开瓶盖，炼苗4～5天，待叶色加深，再移栽到温室，栽培基质为草炭∶珍珠岩为2∶1(体积比)；开始一周使湿度保持在80％以上，每天喷水2～3次，移栽温度为18～25℃。

其中，所述的不定芽的诱导培养基优选为以MS为基本培养基，添加1.0mg/L 6-BA，0.2mg/L IBA，20～40g/L蔗糖的固体培养基，pH为5.9。

其中，所述的增殖和继代培养基优选为以MS为基本培养基，添加1.0mg/L 6-BA，0.2mg/L NAA，20～40g/L蔗糖的固体培养基，pH为5.9。

其中，所述的生根培养的培养基优选为以MS为基本培养基，添加0.02mg/L IBA，20～40g/L蔗糖的固体培养基，pH为5.9。

其中，所述低温处理温度为-2～-5℃，时间为2～4个月。

其中，所述的外植体为顶芽中带腋芽的幼叶。

其中，所述的顶芽中带腋芽的幼叶在接种时切成1.5cm×1.5cm带腋芽的方块。

其中，所述的外植体表面消毒过程如下：剥去外层叶片的顶芽经洗洁精和自来水洗净，流水下冲洗30～40min后，置于75％酒精中处理30s左右，然后再经0.1％升汞消毒7～8min，无菌水冲洗5～6次后将带腋芽幼叶剥下。

其中，所述的芽的诱导、增殖、继代、生根培养时光照条件为自然散射光2500～3000Lux加人工辅助光1500～2000Lux，光照时间为14h/d，培养温度为20～25℃。所述的芽的诱导时间为15～20d。

本发明的一种胭脂花组培繁殖的种质保存方法，2个月内繁殖系数达到4～6，生根率96％以上，移栽成活率近100％；同时，以顶芽中带腋芽的幼叶为外植体繁殖保存的胭脂花种质可保持遗传稳定性，为新品种和优异种质的保存提供了保障。

与常规方法相比，本发明的优点在于：

1.胭脂花是典型的自交不亲和植物，很难采用实生繁殖方法获得稳定遗传的保持原种质遗传性状的后代。利用本方法保存繁育的胭脂花可稳定遗传。

2.与分株方法进行种质保存和繁殖的方法相比，本发明不受自然条件或地区差异的限制，繁殖系数高，可以随时大规模提供种苗。

3.减少常规种质保存用地：常规的种质保存方法需要占用一定的土地，且易感染病毒、病害，造成种质资源退化。利用本发明提供的方法，可以减少用地，并可以对生长过弱、严重感病的种质进行脱毒培养，复壮、纯化，达到种质长期保存的目的。

附图说明

图1为本发明所述经过表面消毒后的胭脂花的顶芽；

图2为本发明所述利用幼叶为外植体诱导芽的情况；

图3为本发明所述芽在增殖培养基中增殖培养的情况；

图4为本发明所述不定芽在生根培养基上的生根情况；

图5为本发明所述试管苗移栽到温室中培养。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1外植体的选择

10月初将已形成休眠顶芽的植株置于-2℃的冷库中冷冻处理2～4个月后，取出植株，剥出顶芽，取顶芽幼叶作为外植体。

实施例2外植体的表面消毒

选取生长健壮的胭脂花的顶芽，用洗洁精和自来水洗净后，再在流水下冲洗30min，在超净工作台内先用75％乙醇消毒30s，无菌水冲洗3次，然后再经0.1％升汞消毒8min，无菌水冲洗6次。

实施例3外植体诱导芽的生成

顶芽经表面消毒后，在无菌操作台内将其幼叶剥下，选取健壮的带腋芽的幼叶，将其从基部切成1.5cm×1.5cm的方块，叶片基部插入以MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA和NAA的固体培养基中，具体参见下表。每瓶接种2个。光照条件为自然散射光3000Lux加上人工辅助光源1800±200Lux，光照14h，温度20～25℃。接种后，叶色逐渐加深变绿，5天后，从每个叶片基部抽出1～2个新芽，15天后，芽长至1～1.5cm高，生长健壮。

实验结果表明，在以MS为基本培养基，添加1.0mg/L6-BA，0.2mg/LNAA，20～40g/L蔗糖的固体培养基条件下，诱导芽长势最好，其中萌芽率100％，平均苗高1.68cm。

表一在不同浓度培养基条件下诱导芽萌芽情况

注：诱导15d后统计数据。

实施例4增殖和继代培养

幼叶在诱导培养基上培养15～20天，芽高1.5cm左右时，将诱导出的芽从幼叶上切下转接到以MS、B5和N6为基本培养基，添加不同浓度的6-BA和NAA的增殖培养基中进行增殖，每瓶接种2～3个芽；光照条件为自然散射光3000Lux加上人工辅助光源1800±200Lux，光照时间14h，温度为20～25℃。之后可每1～2个月移至相同培养基上继代培养。

统计结果显示在以MS为基本培养基，添加1.0mg/L6-BA，0.2mg/LNAA，20～40g/L蔗糖的的固体培养基上诱导芽生长情况最好。接种2个月后，平均每个芽能分化出丛生芽的数目是20～35个。芽在诱导培养基上生长的天数影响组培苗的质量和增殖系数：在15～20天之间，芽叶色浓绿，生长健壮；超过25天，芽逐渐变黄，底部出现污染并逐渐死亡。

表二在不同浓度培养基条件下诱导芽生长情况

注：+：丛生芽发育不良；++：丛生芽发育较好；+++丛生芽发育良好；++++：丛生芽发育很好增殖培养四周后统计数据

实施例5组培苗的生根培养

丛生芽长出3～4片叶子时，将其转移至生根培养基，配方：MS、MS+NAA(0.02mg/l、0.05mg/l、0.2mg/l)、MS+IBA(0.05mg/l、0.2mg/l)、MS+IAA(0.05mg/l、0.2mg/l)中，pH为5.9；光照条件为自然散射光3000Lux加上人工辅助光源3000Lux，光照时间14h，温度为20～23℃。

生根培养四周后统计发现，添加生长素的培养基中试管苗开始生根所需时间短，为6～8天，而在MS培养基中10～12天开始生根。总体上，IBA比NAA和IAA更有利于根的生成，从生根率、根的质量和植株的长势等方面综合考虑，选择用以MS为基本培养基，添加0.02mg/L IBA，20～40g/L蔗糖的的固体培养基作为根诱导的最佳培养基。此时，组培苗平均高度可达4.0cm，平均根条数为4～5条，生根率为96％以上。

表三在不同浓度培养基条件下生根情况

注：生根培养四周后统计数据。

实施例6组培苗的移栽

生根培养四周以后，平均每株组培苗生根4～5条，平均根长达到2cm时，即可开始准备移栽。试管苗炼苗4～5天后，移栽至温室细草炭∶珍珠岩(体积比)为2∶1的栽培基质中，基质提前铺满穴盘，清水浸透；试管苗移栽后保持湿度80％以上，覆薄膜并每天喷水2～3次，1周以后即可逐步进行正常管理，移栽成活率几乎为100％。

移栽至温室中的组培苗生长健壮整齐，通过一系列生物学性状调查及统计，组培小苗表现出与上代母株极大的一致性，同一来源的无性系的田间植株长势整齐，仍保持原有品系的明显特征。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种胭脂花组培繁殖的种质保存方法，其特征在于，包括报春花属的胭脂花，以低温处理后的顶芽经表面灭菌后选取健壮的带腋芽的幼叶为外植体，进行不定芽的诱导，所述低温处理温度为-2～-5℃，时间为2～4个月，所述的不定芽的诱导培养基为以MS为基本培养基，添加0.2～1.0mg/L 6-BA，0～0.2mg/L IBA，20～40g/L蔗糖的固体培养基，pH为5.9～6.0；该种质保存方法还包括增殖和继代培养，所述的增殖和继代培养基为以MS为基本培养基，添加0.5～1.0mg/L6-BA，0.05～0.5mg/L NAA，20～40g/L蔗糖的固体培养基，pH为5.9～6.0；所述的继代培养每隔1～2月继代一次；该种质保存方法还包括生根培养，所述的生根培养的培养基为以MS为基本培养基，添加0.02~0.05mg/L IBA，20～40g/L蔗糖的固体培养基，pH为5.9；该种质保存方法还包括组培苗的移栽，所述的组培苗的移栽选择在生根培养3～4周后，平均每株生根4～5条，打开瓶盖，炼苗4～5天，待叶色加深，再移栽到温室，栽培基质为体积比为2：1的草炭：珍珠岩；开始一周使湿度保持在80%以上，每天喷水2～3次，移栽温度为18～25℃。

2.根据权利要求1所述的种质保存方法，其特征在于，所述的不定芽的诱导培养基为以MS为基本培养基，添加1.0mg/L 6-BA，0.2mg/L IBA，20～40g/L蔗糖的固体培养基，pH为5.9。

3.根据权利要求1所述的种质保存方法，其特征在于，所述的增殖和继代培养基优选为以MS为基本培养基，添加1.0mg/L 6-BA，0.2mg/L NAA，20～40g/L蔗糖的固体培养基，pH为5.9。

4.根据权利要求1所述的种质保存方法，其特征在于，所述的生根培养的培养基优选为以MS为基本培养基，添加0.02mg/L IBA，20～40g/L蔗糖的固体培养基，pH为5.9。

5.根据权利要求1所述的种质保存方法，其特征在于，所述的顶芽中带腋芽的幼叶在接种时切成1.5cm×1.5cm带腋芽的方块。