CN110997709A - Ror1 car t-细胞 - Google Patents

Abstract

描述了一种嵌合抗原受体(CAR)及其用途，所述嵌合抗原受体包含与受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)选择性结合的抗原结合结构域。还描述了包含CAR的T细胞及其在癌症治疗中的用途。

Description

ROR1 CAR T-细胞

本发明涉及一种嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)及其用途，所述嵌合抗原受体包含与受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(Receptor Tyrosine Kinase LikeOrphan Receptor 1,ROR1)选择性结合的抗原结合结构域。

背景技术

受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)(也称为神经营养性酪氨酸激酶，受体相关1，Neurotrophic Tyrosine Kinase,Receptor-Related 1,NTRKR1)是在胚胎形成过程中表达的癌胚抗原，但在正常成人组织中表达有限。但是，它在许多血液和实体恶性肿瘤中表达：慢性淋巴细胞白血病(Chronic Lymphocytic Leukaemia,CLL)、急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukaemia,ALL)、套细胞白血病、毛细胞白血病、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌、恶性胶质瘤、睾丸癌、子宫癌、肾上腺癌、乳腺癌、肺癌、黑素瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、肾癌。此外，ROR1在癌症干细胞的子集上表达。

最近，已经对T细胞进行了基因工程改造，以在其表面上表达称为嵌合抗原受体或CAR的人工T细胞受体。CAR是这样的蛋白质，其允许T细胞识别在靶肿瘤细胞上发现的特定的、预先选择的蛋白质或抗原。可以在实验室中培养和扩增CAR-T细胞，然后将其重新注入患者体内。通过工程化的T细胞受体的指导，CAR-T细胞可以识别并破坏以下癌细胞：所述癌细胞在其表面上展示特定抗原。2014年，第一个基于嵌合抗原受体T(chimeric antigenreceptor T,CAR-T)细胞的免疫疗法，称为CTL019，获得了美国食品药品监督管理局的突破性药物称号，用于治疗复发性和屈光性急性淋巴细胞白血病(ALL)，并且已经开始用于CLL、淋巴瘤和骨髓瘤。

尽管基于CD19的CAR-T细胞在早期临床试验中已显示出巨大的希望，但它们也靶向正常的B细胞克隆体，从而导致B细胞发育不良和长时间的低丙球蛋白血症，而ROR1则不会发生这种情况。此外，大多数CAR-T细胞靶向疾病特异性抗原，因此靶向的肿瘤范围有限，而ROR1能够靶向广泛范围的血液恶性肿瘤和实体恶性肿瘤。

本发明人已经将ROR1鉴定为有吸引力的治疗靶标，并且产生了与ROR1特异性结合并且可以用于治疗上述癌症的CAR-T细胞。

发明内容

本发明的第一方面涉及一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含与受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)选择性结合的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域与包含氨基酸Gln-261的ROR1的表位结合。

在第一实施方案中，所述抗原结合结构域包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述轻链可变结构域包含轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列；和LCDR3包含SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列，并且其中所述重链可变结构域包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO：57中所示的氨基酸序列，其中每个互补决定区的序列可以在最多两个氨基酸位置处与给定序列不同。

此外，本发明涉及编码所公开的CAR的分离的核酸分子。

本发明还涉及包含所公开的CAR的细胞，优选T细胞，以及制备这种细胞的方法。或者，所述细胞可以是NK细胞，γ-δT细胞或iPS细胞。

本发明进一步涉及包含所公开的CAR的细胞在治疗受试者的癌症中的应用，其中将包含ROR1选择性CAR的细胞给药受试者以引起恶性细胞的选择性消耗。本发明的其他方面涉及治疗癌症的方法。

详细说明

术语

除非另有说明，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常用术语的定义可以在Benjamin Lewin,Genes V,Oxford University Press出版,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等,(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,BlackwellScience Ltd.出版,1994(ISBN0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(ed.),MolecularBiology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)中找到。除非另有说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。

给药：通过选择的途径将组合物给药受试者。给药可以是局部的或全身的。例如，如果选择的途径是静脉内，则通过将组合物引入受试者的静脉中来给药组合物。例如，可以通过口服和肠胃外途径(腹膜内地，静脉内地，皮下地，经皮地，肌内地)给药或经由(例如通过导管或支架)局部递送来给药。在一些实例中，对受试者给药对ROR1多肽特异的CAR。通常，医生将确定最适合单个受试者的实际剂量，并且该剂量将随特定患者的年龄、体重和响应而变化。剂量是足以减少或耗尽恶性细胞的数量的量。

试剂：可用于达到目的或结果的任何物质或物质的任何组合；例如，可用于预防或治疗癌症的物质或物质的组合。试剂包括但不限于蛋白质、核酸分子、化合物、小分子、有机化合物、无机化合物或其他感兴趣的分子。试剂可以包括治疗剂(例如抗病毒剂)、诊断剂或药剂。在一些实施方案中，所述试剂是CAR或包含CAR的细胞。本领域技术人员将理解，特定的试剂对于获得不止一个结果可能是有用的。

氨基酸取代：用不同的氨基酸替换肽中的一个氨基酸。

扩增：一种增加核酸分子(例如RNA或DNA)拷贝数的技术。扩增的例子是聚合酶链反应，其中在允许引物与样本中的核酸模板杂交的条件下，使生物样本与一对寡核苷酸引物接触。引物在合适的条件下延长，与模板解离，然后重新退火，延长，和解离，以增大核酸的拷贝数。扩增的产物可以通过电泳、限制性核酸内切酶切割模式、寡核苷酸杂交或连接，和/或使用标准技术的核酸测序来表征。扩增的其他实例包括如美国专利第5,744,311号中所公开的链置换扩增；如美国专利第6,033,881号中所公开的无转录等温扩增；如PCT公开号为WO 90/01069中所公开的修复链反应扩增；如欧洲专利公开号为EP-A-320308中所公开的连接酶链反应扩增；如美国专利第5,427,930号中所公开的缺口填充连接酶链反应扩增；和如美国专利第6,025,134号中所公开的NASBA^TM RNA无转录扩增。

动物：活的多细胞脊椎动物生物体，种类包括，例如，哺乳动物和鸟类。术语哺乳动物包括人类和非人类哺乳动物。类似地，术语“受试者”包括人类和兽医学受试者。

抗体：基本上由单个免疫球蛋白基因或若干免疫球蛋白基因编码的多肽或其抗原结合片段，其特异性地结合并识别分析物(抗原)，例如ROR1多肽或其免疫原性片段。免疫球蛋白基因包括κ，λ，α，γ，δ，ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。

例如，抗体以完整的免疫球蛋白形式存在，和以各种肽酶消化产生的许多特征明确的片段形式存在。例如，特异性结合至ROR1多肽或该多肽的片段的Fab、Fv、scFv是特异性结合剂。scFv蛋白是一种融合蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通过连接器结合，而在dsFvs中，这些链已经发生突变以引入二硫键以稳定这些链的结合。该术语还包括基因工程形式，例如嵌合抗体和异源缀合物抗体，例如双特异性抗体。还参见Pierce Catalog和Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)；Kuby,Immunology,3^rd Ed.,W.H.Freeman&Co.,New York,1997。

抗体片段包括但不限于以下：(1)Fab，该片段包含通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体以得到完整轻链和部分重链而产生的抗体分子的单价抗原结合片段；(2)Fab'，通过用胃蛋白酶处理完整抗体，然后还原以得到完整轻链和部分重链而获得的抗体分子的片段；每个抗体分子获得两个Fab'片段；(3)(Fab')₂，通过用胃蛋白酶处理完整抗体而不进行还原而获得的抗体的片段。(4)F(ab')₂，通过两个二硫键连接在一起的两个Fab'片段的二聚体；(5)Fv，一种基因工程片段，其包含表达为两条链的轻链的可变区和重链的可变区；(6)单链抗体(“SCA”)，一种遗传工程分子，其包含通过合适的多肽连接器连接的轻链的可变区、重链的可变区，作为遗传融合的单链分子。

抗体的抗原结合片段可以通过修饰整个抗体或使用重组DNA方法从头合成的抗体来产生。在一些实例中，术语抗体包括来自移植到支架上的抗体的一个或多个CDR的氨基酸序列。

通常，天然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键互连的重(H)链和轻(L)链。轻链有两种类型，lambda(λ)和kappa(κ)。有五个主要的重链类型(或同种型)，其决定了抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。所公开的抗体可以是类型转换的。

每条重链和轻链包含恒定区和可变区(这些区也称为“结构域”)。在几个实施方案中，重链和轻链可变结构域组合以特异性地结合抗原。在另外的实施方案中，仅需要重链可变结构域。例如，仅由重链组成的天然存在的骆驼科动物抗体在不存在轻链的情况下是功能性的和稳定的(参见，例如Hamers-Casterman等,Nature,363:446-448,1993；Sheriff etal.,Nat.Struct.Biol.,3:733-736,1996)。轻链和重链可变结构域包含被三个高变区打断的“框架”区，也称为“互补决定区”或“CDR”(参见，例如Kabat等,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services,1991)。不同轻链或重链的框架区的序列在一个物种内相对保守。抗体的框架区，即组成轻链和重链的组合框架区，用于在三维空间中定位和排列CDR。

CDR主要负责抗原结合。不同轻链或重链的框架区的序列在一个物种内相对保守。抗体的框架区，即组成轻链和重链的组合框架区，用于在三维空间中定位和排列CDR。

每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3(从N端到C端)，通常也由特定CDR所在的链来标识。因此，V_H CDR3位于发现它的抗体的重链的可变结构域中，而V_L CDR1是来自发现它的抗体的轻链的可变结构域的CDR1。轻链CDR也可以称为CDR L1、CDR L2和CDR L3，或LCDR1、LCDR2和LCDR3。重链CDR可以称为CDR H1、CDR H2和CDR H3，或HCDR1、HCDR2和HCDR3。

提及“VH”或“VH”是指免疫球蛋白重链的可变区，包括抗体片段(例如Fv、scFv、dsFv或Fab)的可变区。提及“VL”或“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的可变区。

“单克隆抗体”是由B淋巴细胞的单个克隆产生的抗体或由已经转染了单个抗体的轻链和重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如通过从骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合制备杂交抗体形成细胞来产生。这些融合细胞及其后代被称为“杂交瘤”。在一些实施方案中，单克隆抗体可以是人源化单克隆抗体。在一些实施方案中，单克隆抗体可以是嵌合抗体。在一些实例中，单克隆抗体是从受试者分离的。可以确定这样分离的单克隆抗体的氨基酸序列。

“人源化”抗体是包括人框架区和来自非人(例如黑猩猩、小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的一个或多个CDR的抗体。提供CDR的非人抗体称为“供体”，而提供框架的人抗体称为“受体”。在一实施方案中，所有CDR都来自人源化抗体中的供体抗体。恒定区不必存在，但是如果存在，则它们必须与人抗体恒定区基本相同，例如至少约85-90％，例如约95％或更多相同。因此，除可能的CDR外，人源化抗体的所有部分与天然人抗体序列的相应部分基本相同。“人源化抗体”可以包括人源化轻链和人源化重链。人源化抗体与提供CDR的供体抗体的结合相同抗原。人源化抗体的受体框架可以具有有限数目的对来自供体框架的氨基酸的取代。人源化抗体或其他单克隆抗体可具有其他保守氨基酸取代，这些取代对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本上没有影响。可以通过基因工程构建人源化免疫球蛋白(例如，参见美国专利第5,585,089号)。优选地，本发明的抗体是人源化的。

“嵌合”抗体是包括来自(通常不同种类的)两个不同抗体的序列的抗体。例如，嵌合抗体可包含衍生自第一物种的重链和轻链可变区以及衍生自第二物种的重链和轻链恒定区。轻链的可变区和恒定区可源自第一物种，而重链的可变区可源自第一物种和重链的恒定区可源自第二物种。

“中和抗体”是例如通过与病毒、细菌或肿瘤上的特定抗原结合而降低病毒、细菌或肿瘤的作用的抗体。在一些实例中，抗体，或对ROR1特异的CAR中和了肿瘤的作用。

抗原：可以刺激动物体内抗体产生或T细胞响应产生的化合物、组合物或物质，包括注射或吸收到动物体内的组合物。抗原与特定体液或细胞免疫的产物反应，所述产物包括由异源抗原，例如所公开的抗原诱导的那些。“表位”或“抗原决定簇”是指抗原的B和/或T细胞应答区域。在一个实施方案中，当表位与MHC分子结合存在时，T细胞对表位产生应答。表位可以由连续氨基酸形成或通过蛋白质的三级折叠而并列的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常以独特的空间构象包含至少3个、更通常至少5个、大约9个或大约8-10个的氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括，例如，X射线晶体学和核磁共振。

抗原的实例包括但不限于包含抗原决定簇的肽、脂质、多糖和核酸，例如被免疫细胞识别的那些。抗原可包括衍生自感兴趣的病原体或衍生自癌细胞的肽。示例性病原体包括细菌、真菌、病毒和寄生虫。在一些实施方案中，抗原衍生自癌细胞，例如血癌细胞(慢性淋巴细胞白血病-CLL、急性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤)或实体恶性肿瘤(乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤)。在一些实施方案中，抗原是ROR1多肽或其抗原片段。

“靶表位”是抗原上的特异性表位，其特异性地结合感兴趣的抗体，例如单克隆抗体。在一些实例中，靶表位包括接触感兴趣的抗体或CAR的氨基酸残基，使得靶表位可以通过确定要与抗体或CAR接触的氨基酸残基来选择。

结合亲和力：抗体、抗原结合片段或其CAR对抗原的亲和力。在一个实施方案中，亲和力是通过Frankel等,Mol.Immunol.,16:101-106,1979描述的Scatchard方法的改进来计算的。在另一个实施方案中，结合亲和力是通过抗原/抗体的解离速率来测量。在另一个实施方案中，高结合亲和力是通过竞争性放射免疫测定法测量。在几个实例中，高结合亲和力是至少约1×10^-9M。在其他实施方案中，高结合亲和力是至少约1.5×10^-9，至少约2×10^-9，至少约3x 10^-9，至少约4x 10^-9或至少约5x 10^-9M。

细胞：本发明还涉及包含CAR的细胞，例如免疫细胞。所述细胞可以包含本发明的核酸或载体。所述细胞可以是T细胞或自然杀伤(natural killer,NK)细胞。所述细胞也可以是iPS生成的细胞或γδT细胞。

T细胞可以是T细胞或T淋巴细胞，它们是在细胞介导的免疫中起关键作用的一种淋巴细胞。它们可以通过在细胞表面上的T细胞受体(TCR)的存在来与其他淋巴细胞(例如B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞))区分开。T细胞有多种类型，概述如下。

辅助T辅助细胞(TH细胞)在免疫过程中协助其他白细胞，包括将B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞。TH细胞在其表面表达CD4。当通过抗原呈递细胞(APC)的表面上的II类MHC分子呈递肽抗原给TH细胞时，TH细胞就会被激活。这些细胞可以分化为几个亚型(包括TH1、TH2、TH3、TH17、Th9或TFH)之一，它们分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。

细胞毒性T淋巴细胞(TC细胞或CTL)破坏了病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也与移植排斥有关。CTL在其表面处表达CD8。这些细胞通过结合存在于所有有核细胞表面上的与I类MHC有关的抗原来识别其靶标。通过由调节性T细胞分泌的IL-10、腺苷和其他分子，CD8+细胞可以失活至免疫无能状态，其预防了自身免疫性疾病，例如实验性自身免疫性脑脊髓炎。

记忆T细胞是抗原特异性T细胞的子集，其在感染消退后会长期存在。当重新暴露于它们的同源抗原后，它们会迅速扩增为大量的效应T细胞，从而为免疫系统提供抵抗过去感染的“记忆”。记忆T细胞包括三种亚型：中央记忆T细胞(TCM细胞)和两种效应记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。记忆细胞可以是CD4+或CD8+。记忆T细胞通常表达细胞表面蛋白CD45RO。

调节性T细胞(Treg细胞)，以前称为抑制性T细胞，对于维持免疫耐受性至关重要。它们的主要作用是在免疫反应趋近结束时关闭T细胞介导的免疫力，并抑制逃避胸腺负性选择过程的自身反应性T细胞。已经描述了CD4+Treg细胞的两个大类：天然存在的Treg细胞和适应性Treg细胞。天然存在的Treg细胞(也称为CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞)出现在胸腺中，并与已被TSLP激活的髓样(CD11c+)和浆细胞样(CD123+)树突状细胞和发育T细胞之间的相互作用有关。天然存在的Treg细胞可以通过称为FoxP3的细胞内分子的存在与其他T细胞区分开。FOXP3基因的突变可阻止调节性T细胞发育，从而导致致命的自身免疫性疾病IPEX。适应性Treg细胞(也称为Tr1细胞或Th3细胞)可能在正常免疫应答过程中产生。

所述细胞可以是天然杀伤细胞(或NK细胞)。NK细胞构成先天免疫系统的一部分。NK细胞以不受MHC约束的方式对来自病毒感染细胞的先天信号提供快速响应。NK细胞(属于先天性淋巴细胞群)被定义为大颗粒淋巴细胞(large granular lymphocytes,LGL)，并且与构成了与常见的淋巴样祖细胞生成的B淋巴细胞和T淋巴细胞不同的第三类细胞。已知NK细胞在骨髓、淋巴结、脾脏、扁桃体和胸腺中分化并成熟，它们然后从该处进入循环系统。

本发明的CAR细胞可以是上述任何细胞类型。

表达根据本发明的CAR的T或NK细胞可以从患者自身的外周血(第一方)离体产生，或在来自供体外周血(第二方)的造血干细胞移植的环境中离体产生，或从无关联的供体(第三方)外周血离体产生。

或者，表达根据本发明的CAR的T或NK细胞可源自可诱导祖细胞或胚胎祖细胞离体分化为T或NK细胞。或者，可以使用保留其裂解功能并且可以充当治疗剂的永生化T细胞系。

在所有这些实施方案中，通过包括用病毒载体转导，用DNA或RNA转染的多种方式之一引入编码CAR的DNA或RNA来产生CAR细胞。

本发明的CAR细胞可以是来自受试者的离体T或NK细胞。T或NK细胞可以来自外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)样本。T或NK细胞在用编码根据本发明第一方面的CAR的核酸转导之前，可以被激活和/或扩增，例如通过用抗CD3单克隆抗体处理。

本发明的T或NK细胞可以通过以下方法制备：

(i)从受试者或上述所列其他来源分离含有T或NK细胞的样本；和

(ii)用编码本发明的CAR的核酸序列转导或转染T或NK细胞。

然后可以纯化，例如基于抗原结合多肽的抗原结合结构域的表达来选择T或NK细胞，。

本公开还可以提供一种试剂盒，其包含含有根据本发明的CAR的T或NK细胞。

嵌合抗原受体(CAR)：嵌合抗原受体(CAR)，也称为嵌合T细胞受体、人工T细胞受体和嵌合免疫受体，是经过工程改造的受体，可将任意特异性移植到免疫效应物细胞上。在经典的CAR中，单克隆抗体的特异性被移植到T细胞上。可以使用例如逆转录病毒载体将编码CAR的核酸转移至T细胞。以这种方式，可以产生大量的癌症特异性T细胞用于过继细胞移植。

CAR的靶抗原结合结构域通常经由间隔子和跨膜结构域融合至内结构域，所述内结构域包含细胞内T细胞信号传导结构域或与细胞内T细胞信号传导结构域相关联。当CAR结合靶抗原时，这导致激活信号传递到其上表达的T细胞。

CAR也可以包含跨膜结构域，其跨越薄膜。它可以包含疏水性α螺旋。跨膜结构域可以衍生自提供良好受体稳定性的CD28。

内结构域是参与信号传输的CAR的部分。内结构域包含细胞内T细胞信号传导结构域或与细胞内T细胞信号传导结构域相关联。抗原识别后，受体聚集并且信号被传递到细胞。最常用的T细胞信号转导成分是CD3-zeta的T细胞信号转导成分，其包含3个ITAM(基于免疫受体酪氨酸的激活基序)。抗原结合后，这向T细胞传递激活信号。CD3-zeta可能无法提供完全有效的激活信号，因此可能需要其他共刺激信号传导。例如，嵌合的CD28，和OX40可以与CD3-Zeta一起使用以传递增殖/存活信号，或者可以将这三种一起使用。另外，41BB可以与CD3-Zeta一起使用。然而，技术人员将理解，可以使用任何合适的共刺激结构域。

CAR的内结构域可以包含CD28内结构域以及OX40和CD3-Zeta内结构域。或者，CAR的内结构域可包含41BB和CD3-Zeta内结构域。

CAR可以包含信号肽，使得当CAR在诸如T细胞的细胞内表达时，新生蛋白被引导至内质网，随后被引导至细胞表面(表达该新生蛋白的地方)。

CAR可以包含间隔子序列，以将ROR1结合结构域与跨膜结构域连接，并将ROR1结合结构域与内结构域空间地分开。柔性间隔子允许ROR1结合结构域在不同方向上定向以实现ROR1结合。技术人员将理解，可以使用任何合适的间隔子序列。

间隔子序列可以例如包含短的柔性连接器、IgG1Fc区、IgG1铰链或CD8茎，或其组合。连接器可替代地包含具有与IgG1 Fc区、IgG1铰链或CD8茎相似长度和/或结构域间隔性质的替代连接器序列。

克隆变体：任何序列，其相差一个或多个核苷酸或氨基酸，存在与种系相同突变的V区，相同的VDJ或VJ基因用法，和相同的D和J长度。“种系”序列旨在是编码没有突变(例如体细胞突变)的抗体/免疫球蛋白(或其任何片段)的序列。同源性百分比表示任何类型的重链部分与抗原接触后经历的突变事件的指示。

偶联物：两个分子连接在一起(例如通过共价键连接在一起)的复合物。在一个实施方案中，CAR可以连接至效应分子；例如，与ROR1多肽特异性结合的抗原结合结构域共价地连接到效应分子或毒素。连接可以通过化学或重组方式进行。在一个实施方案中，连接是化学的，其中抗原结合结构域和效应分子之间的反应已经产生了一个共价键，所述共价键在两个分子之间形成以形成一个分子。肽连接器(短肽序列)可以选择性地被包括在抗原结合结构域和效应分子之间。由于偶联物可以由具有独立功能的两个分子(例如CAR和效应分子)制备，因此有时也称为“嵌合分子”。在一个实施方案中，与效应分子连接的抗原结合结构域可以进一步连接脂质或其他分子以连接到蛋白质或肽，以增加其在体内的半衰期。

接触：直接物理关联地布置；包括固体和液体形式，其可以在体内或体外发生。接触包括一个分子与另一分子之间的接触，例如一个多肽(例如抗原)表面上的氨基酸与另一个多肽，例如抗原结合结构域，接触。接触还可以包括接触细胞，例如通过将CAR与细胞直接物理关联地布置来进行。

对照：参考标准。在一些实施方案中，对照是获自健康患者的样本。在其他实施方案中，对照是获自诊断为癌症的患者的组织样本，其用作阳性对照。在其他实施方式中，对照是历史对照或标准参考值或值范围(例如先前测试的对照样本，例如具有已知预后或结果的感染患者组，或代表基线或正常值的样本组)。

测试样本和对照之间的差异可以是增加，或相反地可以是减少。该差异可以是定性差异或定量差异，例如统计上的显著差异。在一些实例中，差异是相对于对照增加或减少至少约5％，例如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约500％或大于500％。

可检测标记物：可检测分子(也称为标记)，其直接或间接与第二个分子(例如抗体)偶联，以利于第二个分子的检测。例如，可检测标记物能够通过ELISA、分光光度法、流式细胞术、显微镜或诊断成像技术(例如CT扫描、MRI、超声、光纤检查和腹腔镜检查)进行检测。可检测标记物的非限制性实例包括荧光团、荧光蛋白、化学发光剂、酶键、放射性同位素和重金属或化合物(例如用于通过MRI检测的超顺磁性氧化铁纳米晶体)。在一个实例中，“标记的抗体”是指在抗体中掺入另一种分子。例如，标记是可检测标记物，例如向生物素部分的多肽掺入可被标记的亲和素(例如，含有通过光学或比色法可被检测的荧光标记物或酶活性的链霉亲和素)检测的放射性标记氨基酸或附着物。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的并且可以使用。多肽标记的例子包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如³⁵S或¹³¹I)、荧光标记(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、镧系元素磷)、酶标记(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记物、生物素基群、由二级报告物(例如亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)识别的预定多肽表位，或磁性剂，例如钆螯合物。在一些实施方案中，标记通过各种长度的间隔子臂附着以减少潜在的空间位阻。例如，在Sambrook等人(Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York,1989)和Ausubel等(In CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1998)中讨论了使用可检测标记物的方法和指导选择适合各种目的的可检测标记物的方法。在本发明的特定实施方案中，抗原结合结构域或其片段可以用可检测标记物进行标记。

检测：为了识别事物的存在、出现或事实。检测的一般方法是技术人员已知的(参见，例如，美国专利第7,635,476号)，并且可以补充本文公开的方案和试剂。

表位：抗原决定簇。这些是分子上的特定化学基团或肽序列，其是抗原性的，即引起特异性免疫应答。抗原结合结构域或抗体特异性地结合多肽上的特定抗原表位。在一些实例中，公开的抗原结合结构域特异性地结合至ROR1表面上的表位。

框架区：插入CDR之间的氨基酸序列。该术语包括可变轻链和可变重链框架区。框架区用于将CDR保持在适合抗原结合的方向上。

Fc多肽：包含除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的抗体的恒定区的多肽。Fc区通常是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域。Fc区还可包括至这些结构域的柔性铰链N末端的部分或全部。对于IgA和IgM，Fc区可以包含或可以不包含尾链，并且可以或可以不通过J链结合。对于IgG，Fc区包含免疫球蛋白结构域Cgamma2和Cgamma3(Cγ2和Cγ3)以及Cgamma1(Cγ1)和Cγ2之间的铰链的下部。尽管Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常被限定为包含C226或P230到其羧基末端残基，其中编号根据EU索引。对于IgA，Fc区包含免疫球蛋白结构域Calpha2和Calpha3(Cα2和Cα3)以及Calpha1(Cα1)和Cα2之间的铰链的下部。Fc区的定义内包含Fc区的功能上等同的类似物和变体。Fc区的功能上等同的类似物可以是变体Fc区，其包含相对于野生型或天然存在的Fc区的一个或多个氨基酸修饰。变体Fc区将与天然存在的Fc区具有至少50％的同源性，例如约80％、约90％或至少约95％的同源性。Fc区的功能上等同的类似物可包含添加至蛋白质的N末端或C末端的一个或多个氨基酸残基或从其所述蛋白质的N末端或C末端缺失一个或多个氨基酸残基，例如不超过30个或不超过10个添加和/或缺失。Fc区的功能上等同的类似物包括可操作地连接至融合配偶体的Fc区。Fc区的功能上等同的类似物必须包含构成如上定义的Fc区的所有Ig结构域的大部分；例如，本文定义的IgG和IgA Fc区必须包含编码CH₂的序列的大部分和编码CH₃的序列的大部分。因此，单独的CH₂结构域或单独的CH₃结构域不被认为是Fc区。Fc区可以单独地指该区域，或在Fc融合多肽的情况下的该区域。

宿主细胞：可以在其中繁殖载体并表达所述载体的DNA的细胞，例如可以在宿主细胞中表达公开的CAR。该细胞可以是原核的或真核的。该术语还包括受试者宿主细胞的任何后代。应当理解，所有后代可能与亲代细胞并不相同，因为在复制过程中可能会发生突变。然而，当使用术语“宿主细胞”时，包括了这种后代。

免疫复合物：抗体与可溶性抗原的结合形成了免疫复合物。可以通过技术人员已知的常规方法来检测免疫复合物的形成，例如免疫组织化学、免疫沉淀、流式细胞术、免疫荧光显微镜检查、ELISA、免疫印迹(例如Western印迹)、磁共振成像、CT扫描、X-射线和亲和色谱法。所选抗体的免疫结合特性可以使用本领域众所周知的方法定量。

免疫学反应条件：包括参考这样的条件：允许针对特定表位产生的抗体或抗原结合结构域，以更大的可检测程度(相比于与所有其他表位的结合)，和/或基本上排除与所有其他表位的结合，结合至该表位。免疫学反应条件取决于抗体结合反应的形式，通常是免疫测定方案中使用的条件或体内遇到的条件。有关免疫测定形式和条件的描述，请参见上文的Harlow&Lane。该方法中使用的免疫反应条件是“生理条件”，其包括参考这样的条件：在活的哺乳动物或哺乳动物细胞内是典型的条件(例如温度、渗透压、pH)。尽管认识到某些器官会受到极端条件的影响，但生物体内和细胞内的环境通常处于pH 7左右(例如，从pH 6.0到pH 8.0，更通常pH 6.5到7.5)，包含水作为主要溶剂，并且存在于高于0℃和低于50℃的温度下。渗透压在支持细胞生存力和增殖的范围内。

抑制或治疗疾病：例如在处于患癌风险的受试者中，抑制疾病或病症的全面发展。“治疗”是指疾病或病理状况开始发展后，改善所述疾病或病理状况的迹象或症状的治疗性干预措施。关于疾病或病理状况，术语“改善”是指对于疾病或病理状况治疗的任何可观察到的有益效果。有益效果可以例如通过易感受试者的疾病的临床症状的延迟发作、疾病的一些或全部临床症状的严重性降低、疾病的进展减慢、肿瘤/癌症大小的减小、受试者整体健康或幸福感的改善来证明，或通过本领域公知的对特定疾病是特异性的其他参数来证明。“预防性”治疗是对不表现出疾病征兆或仅表现出早期征兆的受试者给药的治疗，用于降低病理学发展的风险的目的。

分离的：“分离的”生物学成分(诸如细胞，例如B细胞、核酸、肽、蛋白质、重链结构域或抗体)已与有机体的细胞中的其他生物学成分基本上分开，从其分离产生或远离其纯化，所述有机体的细胞中，所述成分天然存在，例如其他染色体和染色体外的DNA和RNA以及蛋白质。已经“分离”的核酸、肽和蛋白质因此包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还涵盖通过在宿主细胞中重组表达而制备的核酸、肽和蛋白质，以及化学合成的核酸。

K_d：给定相互作用(例如多肽配体相互作用或抗体抗原相互作用)的解离常数。例如，对于抗原结合结构域或抗体(例如本文公开的任何抗原结合结构域)与抗原(例如ROR1多肽)的双分子相互作用，其是双分子相互作用的各个组分的浓度除以复合物的浓度。

标记：可检测的化合物或组合物，其直接或间接地与另一个分子(例如抗体或蛋白质)偶联，以利于该分子的检测。标记的具体非限制性实例包括荧光标签、酶键(enzymaticlinkages)和放射性同位素。在一些实例中，公开的CAR可以被标记。

恶性细胞：术语“恶性”在本文中根据其标准含义使用，指的是对其生长不受自身限制，可以侵入邻近组织并且可以扩散至远处组织的细胞。

核酸：由通过磷酸二酯键、相关的天然存在的结构变体，及其合成的非天然存在的类似物连接的核苷酸单元(核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物)组成的聚合物。因此，该术语包括核苷酸聚合物，其中核苷酸及它们之间的连接包括非天然存在的合成类似物，例如但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)等。这样的多核苷酸可以例如使用自动化DNA合成仪合成。术语“寡核苷酸”通常是指短的多核苷酸，通常不大于约50个核苷酸。将理解的是，当核苷酸序列由DNA序列(即A、T、G、C)表示时，其还包括RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”替代“T”。

本文使用常规符号来描述核苷酸序列：单链核苷酸序列的左手端是5'端；双链核苷酸序列的左手方向称为5'方向。在新生的RNA转录物中，核苷酸的5'至3'的添加方向称为转录方向。具有与mRNA相同的序列的DNA链称为“编码链”；DNA链上具有与从该DNA转录的mRNA相同的序列(其位于RNA转录物的5'至5'端)称为“上游序列”；DNA链上具有与RNA相同的序列(其是编码RNA转录物的3'至3'端)称为“下游序列”。

“cDNA”是指与mRNA互补或相同的DNA，呈单链或双链形式。

“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因，cDNA或mRNA，用作在生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板，该模板具有确定的核苷酸(即rRNA、tRNA和mRNA)序列或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性。因此，如果由基因产生的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则所述基因编码所述蛋白质。基因或cDNA的编码链和非编码链都可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物，其中所述编码链的核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供，所述非编码链用作转录的模板。除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可能包括内含子。

“重组核酸”是指具有核苷酸序列不天然连接在一起的核酸。这包括包含扩增的或装配的核酸的核酸载体，所述扩增的或装配的核酸可用于转化合适宿主细胞。包含重组核酸的宿主细胞被称为“重组宿主细胞”。然后，基因在重组宿主细胞中被表达以产生例如“重组多肽”。重组核酸也可用于非编码功能(例如，启动子、复制起点、核糖体结合位点等)。

如果序列为第一序列的多核苷酸与序列为第二序列的多核苷酸特异性杂交，则第一序列相对于第二序列为“反义”。

用于描述两个或多个核苷酸序列或氨基酸序列之间的序列关系的术语包括“参考序列”，“选自”，“比较窗口”，“相同”，“序列同一性百分比”，“基本相同”，“互补”，和“实质上互补”。

对于核酸序列的序列比较，通常一个序列用作参考序列，测试序列与其进行比较。使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。使用默认程序参数。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981的局部同源算法进行，通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970的同源比对算法进行，通过Pearson&Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444,1988的寻找相似性方法进行，通过这些算法的计算机实现(威斯康星州遗传学软件包中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，遗传计算机组，威斯康星州575科学博士Madison,WI)，或通过手动比对和目视检查进行(参见例如，分子生物学最新协议(Ausubel等人，eds 1995增刊))。

一种有用的算法示例是PILEUP。PILEUP使用Feng&Doolittle,J.Mol.Evol.35:351-360,1987的渐进比对方法的简化。使用的方法类似于Higgins&Sharp,CABIOS 5:151-153,1989中描述的方法。使用PILEUP，使用以下参数：默认间隙权重(3.00)，默认间隙长度权重(0.10)和加权末端间隙，将参考序列与其他测试序列进行比较，以确定序列同一性百分比关系。可以从GCG序列分析软件包(例如7.0版)中获得PILEUP(Devereaux等人,Nuc.Acids Res.12:387-395,1984。

适于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的另一示例是BLAST和BLAST2.0算法，其在Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410,1990和Altschul等人,NucleicAcids Res.25:3389-3402,1977中描述。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(ncbi.nlm.nih.gov)公开获得。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11，比对(B)为50，期望(E)为10，M＝5，N＝-4以及两条链的比较作为默认值。BLASTP程序(用于氨基酸序列)默认使用字长(W)为3，期望(E)为10和BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915,1989)。寡核苷酸是长度最多约100个核苷酸碱基的线性多核苷酸序列。

ClustalW是以计算有效的方式比对三个或更多个序列的程序。比对多个序列突出显示了相似性区，该相似性区可能与比其他区域更高度保守的特定特征有关。因此，该程序可以对序列进行分类，以进行系统进化分析，其目的是对进化过程中发生的取代进行建模，并得出序列之间的进化关系。ClustalW多序列比对网络表格可从EMBL-EBI(ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)在互联网上获得，另请参见Larkin等人,Bioinformatics 200723(21):2947-2948。

多核苷酸或核酸序列是指长度至少10个碱基的核苷酸的聚合形式。重组多核苷酸包括与两个编码序列不立即相邻的多核苷酸，而衍生所述多核苷酸的天然存在的生物基因组中，所述多核苷酸与两个编码序列立即相邻(一个在5'端，一个在3'端)。因此，该术语包括，例如，掺入载体中的重组DNA；掺入自主复制的质粒或病毒中的重组DNA；或掺入原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA，或以独立于其他序列的独立分子(例如cDNA)存在的重组DNA。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或任一核苷酸的修饰形式。该术语包括DNA的单链和双链形式。

药学上可接受的载体：药学上可接受的载体是常规的。Remington’sPharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,19thEdition,1995描述了适用于药物递送本文公开的细胞和CAR的组合物和制剂。

通常，载体的性质将取决于所采用的特定给药方式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射的流体，其包括药学上和生理上可接受的流体，所述流体包括但不限于水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等作为载体。对于固体组合物(例如粉末、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规的无毒固体载体可包括例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物中性载体外，待给药的药物组合物可包含少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

药物试剂：当适当地给药于受试者或细胞时能够诱导期望的治疗或预防作用的化学化合物或组合物。在一些实例中，试剂包括表达根据本发明的CAR的所公开的细胞中的一种或多种。

多肽：任何氨基酸链，无论长度或翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)如何。在一个实施方案中，该多肽是ROR1多肽。在一个实施方案中，该多肽是公开的抗体或其片段。“残基”是指通过酰胺键或酰胺键模拟物(mimetic)掺入多肽的氨基酸或氨基酸模拟物。多肽具有氨基末端(N末端)和羧基末端。提供功能上相似的氨基酸的保守氨基酸替换表是本领域普通技术人员众所周知的。以下六组是被认为是彼此的保守替换氨基酸：

1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；和

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

纯化的：术语“纯化的”不需要绝对纯度。相反，它旨在作为一个相对术语。因此，例如，纯化的肽制品是其中肽或蛋白质(例如抗体)比细胞中其天然环境中的肽或蛋白质更富集的制品。在一个实施方案中，制品被纯化为使得蛋白质或肽占制品的总肽或蛋白质含量的至少50％。

重组：重组核酸是具有非天然存在的序列的核酸，或具有由两个其他分离的序列片段人工组合而成的序列的核酸。这种人工组合通常通过化学合成或更普遍地通过人工操作分离的核酸片段，例如通过基因工程技术来完成。

序列同一性：氨基酸序列之间的相似性以序列之间的相似性表示，否则称为序列同一性。序列同一性经常用同一性(或相似性或同源性)百分比来衡量。百分比越高，两个序列越相似。当使用标准方法比对时，多肽的同源物或变体将具有较高程度的序列同一性。

用于比较的多肽序列的比对方法是本领域众所周知的。如上所述，可以使用各种程序和比对算法。Altschul等人,Nature Genet.6:119,1994提出了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。NCBI基本局部比对搜索工具(NCBI Basic Local Alignment SearchTool,BLAST)(Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403,1990)可从多种渠道获得，包括美国国家生物技术信息中心(NCBI,Bethesda,MD)和互联网(以及如何使用此程序确定序列同一性的说明)。

特异性结合多肽的抗原结合结构域的V_L或V_H的同源物和变体通常通过与感兴趣的氨基酸序列比对，在整个序列长度上，具有至少约75％，例如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性来表征。当通过这种方法评估时，与参考序列具有更高相似性的蛋白质将显示增加的同一性百分比，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。当比较少于整个序列的序列同一性时，同源物和变体通常在10-20个氨基酸的短窗口内具有至少80％的序列同一性，并且可能具有至少85％或至少90％或95％的序列同一性(取决于它们与参考序列的相似性)。本领域的技术人员将意识到，这些序列同一性范围仅用于指导。完全有可能获得超出所提供范围的非常重要的同源物。

“选择性杂交”或“选择性结合”的核酸在中度或高度严格的条件下进行，排除了无关核苷酸序列。在核酸杂交反应中，用于达到特定严格水平的条件将变化，这取决于所杂交核酸的性质。例如，在选择杂交条件时，可以考虑核酸的杂交区域的长度、互补程度、核苷酸序列组成(例如，GC相对于AT含量)和核酸类型(例如，RNA对DNA)。另一个考虑因素是核酸之一是否固定在例如过滤器上。

逐步提高的严格性条件的一个具体例子如下：约室温下2x SSC/0.1％SDS(杂交条件)；约室温下0.2x SSC/0.1％SDS(低严格条件)；约42℃下0.2x SSC/0.1％SDS(中等严格条件)；约68℃下0.1x SSC(高严格条件)。本领域技术人员可以容易地确定这些条件下的变化(例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,vol.1-3,ed.Sambrook等人,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)。可以仅使用这些条件中的一种(例如高严格性条件)进行洗涤，或者可以使用每种条件，例如按以上述顺序分别进行10-15分钟，并重复所列出的任何或所有步骤。但是，如上所述，最佳条件将根据所涉及的特定杂交反应而变化，并且可以凭经验确定。

特异性结合：当涉及抗体或抗原结合结构域时，是指一种结合反应，其可在蛋白质和其他生物制剂的异质群体存在下确定目标蛋白质、肽或多糖的存在。因此，在指定条件下，抗体或抗原结合结构域优先结合特定的靶蛋白、肽或多糖(例如肿瘤表面上存在的抗原，例如ROR1)，而不会大量结合样本或受试者中存在的其他蛋白质或多糖。特异性结合可以通过本领域已知的方法来确定。关于抗体抗原复合物，抗原和抗体的特异性结合具有小于约10^-7摩尔(例如小于约10^-7摩尔，10^-8摩尔，10^-9或甚至小于约10^-10摩尔)的Kd。

T细胞受体(TCR)：T细胞受体(TCR)在T淋巴细胞的表面表达，负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。当TCR与抗原肽和MHC(肽/MHC)结合时，T淋巴细胞通过一系列由相关酶、共受体、特化衔接子分子以及激活或释放的转录因子介导的生化事件而被激活。

TCR是二硫键连接的膜锚定的异二聚体，通常由高度可变的alpha(α)和beta(β)链组成，表达具有不变CD3链分子的复合物的一部分。表达该受体的T细胞称为α：β(或aβ)T细胞(约占总T细胞的95％)。少数T细胞表达由可变的gamma(γ)和delta(δ)链形成的替代受体，被称为γδT细胞(约占总T细胞的5％)。

每条α和β链均由两个胞外结构域组成：可变(V)区和恒定(C)区，两个免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域均形成反平行的β-折叠。恒定区靠近细胞膜，随后是跨膜区和短的细胞质尾巴，而可变区则与肽/MHC复合物结合(见图1)。TCR的恒定区由短连接序列组成，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而形成两条链之间的连接。

TCRα链和β链的可变结构域均具有三个高变或互补决定区(CDR)。β链的可变区还具有一个额外的高变区域(HV4)，但是，该区域通常不与抗原接触，因此不被视为CDR。

TCR还包含最多五个的不变链γ，δ，ε(统称为CD3)和ζ。CD3和ζ亚基通过特定的胞质域介导TCR信号传导，在被αβ或γδ识别出抗原后，所述特定的胞质域与第二信使和衔接子分子相互作用。TCR复合物的细胞表面表达之前是亚基的成对组装，其中TCRα和β的跨膜和胞外结构域以及CD3γ和δ都起了作用。

因此，TCR通常由CD3复合物以及TCRα和β链组成，而TCRα和β链又由可变区和恒定区组成(图1)。

治疗剂：泛指使用，包括治疗剂、预防剂和替代剂。

治疗有效量或有效量：足以在被治疗的受试者中获得所需效果的特定物质(例如所公开的抗体)的量。例如，这可以是抑制肿瘤生长所需的量。在几个实施方案中，治疗有效量是减轻疾病症状所需的量。当给药受试者时，通常将使用达到目标组织浓度的剂量，该剂量已显示实现所需的体外作用。

载体：可以通过载体将核酸分子引入宿主细胞，从而产生转化的宿主细胞。载体可以包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包括一个或多个本领域已知的选择标记基因和其他遗传元素。载体可以是例如质粒或病毒载体，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体，或基于转座子的载体或合成的mRNA。载体可以能够转染或转导T细胞或NK细胞。

除非上下文另外明确指出，否则单数术语“一”，“一个”和“所述”包括复数对象。类似地，除非上下文另外明确指出，否则单词“或”旨在包括“和”。还应理解，针对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子量值均为近似值，并被提供用于描述。尽管类似于或等同于本文描述的那些的方法和材料可以用于本公开的实践或测试中，但是合适的方法和材料描述如下。术语“包含”是指“包括”。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用全文并入本文。在发生冲突的情况下(包括术语解释)，以本说明书为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并不意图是限制性的。

与ROR1特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)

本文公开了包含与ROR1选择性结合的抗原结合结构域的临床上有用的CAR。

在一些实施方案中，抗原结合结构域以6nM或更小的平衡常数(K_d)与ROR1多肽特异性结合。在几个实施方案中，抗原结合结构域以约1.6×10^-9M或更小、约2×10^-9M或更小、约3×10^-9M或更小、约4×10^-9M或更小，或约5x 10^-9M或更小的K_D结合ROR1多肽。

本文公开的抗原结合结构域可以源自大鼠抗体，并且可以包括大鼠框架区。在一些优选的实施方案中，抗原结合结构域是人源化的，因此包括一个或多个人框架区。在一些实施方案中，本文公开的抗原结合结构域是嵌合的。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括大鼠和人区。

抗原结合结构域可以特异性结合ROR1多肽。优选地，抗原结合结构域可以特异性结合人ROR1多肽。抗原结合结构域优选包含重链和轻链，并且优选每个VH和VL由三个CDR和四个FWR组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：如上所述的FWR1、CDR1、FWR2、CDR2、FWR3、CDR3、FWR4。

在第一实施方案中，抗原结合结构域包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中轻链可变结构域包括轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ IDNO：16中所示的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列；和LCDR3包含SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列，并且其中所述重链可变结构域包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列；HCDR2包含SEQID NO：25中所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO：57中所示的氨基酸序列，其中每个互补决定区的序列可以在最多两个氨基酸位置处与给定序列不同。

每个CDR的序列可以在最多两个氨基酸位置处与给定序列不同。这意味着与给定序列相比，CDR可以包含一个或两个氨基酸取代。但是，如果一个或多个CDR确实包含氨基酸取代，则CAR仍可以选择性地与ROR1结合。优选地，氨基酸取代是保守取代。

优选地，每个CDR的序列可以在一个氨基酸位置处与给定序列不同。这意味着与给定序列相比，CDR可包含一个氨基酸取代。优选地，氨基酸取代是保守取代。

在一些实施方案中，重链互补决定区3(HCDR3)包含选自SEQ ID NO：27、36、44和49中所示的任何序列的氨基酸序列。优选地，HCDR3包含选自SEQ ID NO：36、44和49中所示的任何序列的氨基酸序列。

抗原结合结构域可以具有轻链可变结构域，其包含轻链框架区(LCFR)1、LCFR2、LCFR3和LCFR4，轻链框架区(LCFR)1包含如SEQ ID NO：15、29、50和53之一所示的氨基酸序列，LCFR2包含如SEQ ID NO：17、30、38和46之一所示的氨基酸序列，LCFR3包含如SEQ IDNO：19、31、39、47和54之一所示的氨基酸序列，LCFR4包含如SEQ ID NO：21、32和40之一所示的氨基酸序列。

优选地，抗原结合结构域具有轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含LCFR1、LCFR2、LCFR3和LCFR4，LCFR1包含如SEQ ID NO：29、50和53之一所示的氨基酸序列，LCFR2包含如SEQ ID NO：30、38和46之一所示的氨基酸序列，LCFR3包含如SEQ ID NO：31、39、47和54之一所示的氨基酸序列，LCFR4包含如SEQ ID NO：32和40之一所示的氨基酸序列。

抗原结合结构域可具有重链可变结构域，其包含重链框架区(HCFR)1、HCFR2、HCFR3和HCFR4，重链框架区(HCFR)1包含如SEQ ID NO：22、33、41和55之一所示的氨基酸序列，HCFR2包含如SEQ ID NO：24、34、42和51之一所示的氨基酸序列，HCFR3包含如SEQ IDNO：26、35、43、48、52和56之一所示的氨基酸序列，HCFR4包含如SEQ ID NO：28、37和45之一所示的氨基酸序列。

优选地，抗原结合结构域可以具有重链可变结构域，其包含HCFR1、HCFR2、HCFR3和HCFR4，HCFR1包含如SEQ ID NO：33、41和55之一所示的氨基酸序列，HCFR2包含如SEQ IDNO：34、42和51之一所示的氨基酸序列，HCFR3包含如SEQ ID NO：35、43、48、52和56之一所示的氨基酸序列，HCFR4包含如SEQ ID NO：37和45之一所示的氨基酸序列。

如下所示，上面提到的每个框架区的序列可以与给定序列不同。例如，它可能在最多10个氨基酸位置处有所不同，尽管优选的是存在少于10个氨基酸取代，以便最多可以有9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代。或者，每个框架区可包含与序列表中所示氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

优选地，轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：3、4、5、6、7和8之一所示的氨基酸序列。更优选地，轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：4、5、6、7和8之一所示的氨基酸序列。

优选地，重链可变结构域包含如SEQ ID NO：9、10、11、12、13和14之一所示的氨基酸序列。更优选地，重链可变结构域包含如SEQ ID NO：10、11、12、13和14之一所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4、5、6、7和8是人源化轻链可变区。SEQ ID NO：10、11、12、13和14是人源化轻链可变区。发明人尝试了这些轻链和重链区的所有组合，得到了25种不同的构建体。

因此，在一些实施方案中，轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含如SEQ ID NO：10、11、12、13和14之一所示的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含如SEQ ID NO：10、12和13之一所示的氨基酸序列。

在其他实施方案中，轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含如SEQ ID NO：10、11、12、13和14之一所示的氨基酸序列。

在进一步的实施方案中，轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含如SEQ ID NO：10、11、12、13和14之一所示的氨基酸序列。

在替代实施方案中，轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含如SEQ ID NO：10、11、12、13和14之一所示的氨基酸序列。

在各种实施方案中，轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含如SEQ ID NO：10、11、12、13和14之一所示的氨基酸序列。

类似地，在一些实施方案中，重链可变结构域包含如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，而轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：4、5、6、7和8之一所示的氨基酸序列。

在其他实施方案中，重链可变结构域包含如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，而轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：4、5、6、7和8之一所示的氨基酸序列。

在另外的实施方案中，重链可变结构域包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，而轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：4、5、6、7和8之一所示的氨基酸序列。

在替代实施方案中，重链可变结构域包含如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，而轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：4、5、6、7和8之一所示的氨基酸序列。

在各种实施方案中，重链可变结构域包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，而轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：4、5、6、7和8之一所示的氨基酸序列。

在特定的实施方式中，

(a)轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，和重链可变结构域包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；

(b)轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，和重链可变结构域包含如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；

(c)轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，和重链可变结构域包含如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；

(d)轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，和重链可变结构域包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列；

(e)轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，和重链可变结构域包含如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；或

(f)轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，和重链可变结构域包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。

如下所述，上述每个轻链可变结构域和重链可变结构域的序列可以与给定序列不同。例如，轻链/重链可变结构域可包含与序列表中所示的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。可选择地，轻/重链可变结构域序列可以在最多10个氨基酸位置处不同，尽管优选存在少于10个氨基酸取代，使得最多可以有9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代。

如上所述，在一些实施方案中，轻链框架区、重链框架区、轻链可变结构域和重链可变结构域包含与上述的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％，96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。例如，轻链框架区、重链框架区、轻链可变结构域和重链可变结构域可以在如上所述的氨基酸序列中包括至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多两个或至多一个氨基酸取代。在轻链可变结构域和重链可变结构域的序列中存在变化的情况下，任何氨基酸取代优选不在CDR中。特别地，上述抗体的轻链框架区和/或重链框架区可包含与上述氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。此外，轻链框架区和/或重链框架区可在如上所述的氨基酸序列中包括至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多两个或至多一个氨基酸取代。优选地，氨基酸取代是如上所述的保守取代。例如，框架区可包含这样的取代以便使序列人源化。优选地，框架区是人源化的。

在第二实施方案中，抗原结合结构域包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中轻链可变结构域包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：58中所示的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：59中所示的氨基酸序列；LCDR3包含SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列。其中重链可变结构域包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：60中所示的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO：61中所示的氨基酸序列；和HCDR3包含SEQ IDNO：62中所示的氨基酸序列。其中每个互补决定区的序列可以在最多两个氨基酸位置上与给定序列不同。

如上所述，每个CDR的序列可以在最多两个氨基酸位置处与给定序列不同。这意味着与给定序列相比，CDR可以包含一个或两个氨基酸取代。但是，如果一个或多个CDR确实包含氨基酸取代，则抗原结合结构域仍可以选择性地与ROR1结合。优选地，氨基酸取代是保守取代。

优选地，每个CDR的序列可以在一个氨基酸位置与给定序列不同。这意味着与给定序列相比，CDR可包含一个氨基酸取代。优选地，氨基酸取代是保守取代。更优选地，每个CDR的序列与给定序列没有不同。

优选地，轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：3、4、5、6、7和8之一所示的氨基酸序列。更优选地，轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：4、5、6、7和8之一所示的氨基酸序列。

优选地，重链可变结构域包含如SEQ ID NO：9、10、11、12、13和14之一所示的氨基酸序列。更优选地，重链可变结构域包含如SEQ ID NO：10、11、12、13和14之一所示的氨基酸序列。

如以上关于本发明的第一实施方式所述，发明人尝试了轻链可变结构域(SEQ IDNO：4、5、6、7和8)和重链可变结构域(SEQ ID NO：10、11、12、13和14)的所有组合，产生了25个不同的构建体。因此，以上关于这些序列的组合的描述也适用于上述第二实施例。

在特定的实施方式中，

(a)轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，和重链可变结构域包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；

(b)轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，和重链可变结构域包含如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；

(c)轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，和重链可变结构域包含如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；

(d)轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，和重链可变结构域包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列；

(e)轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，和重链可变结构域包含如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；或

(f)轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，和重链可变结构域包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。

以上提及的每个轻链可变结构域和重链可变结构域的序列可以与给定序列不同。例如，轻链/重链可变结构域可包含与序列表中所示的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。可选择地，轻/重链可变结构域序列可以在最多10个氨基酸位置处不同，尽管优选存在少于10个氨基酸取代，使得最多可以有9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代。

对于上述所有实施方案，本领域技术人员将意识到，任何取代将保留对于在V_H和V_L区之间正确折叠和稳定所必需的关键氨基酸残基，并且将保留这些残基的电荷特征，以保护CAR的低pI和低毒性。因此，本领域技术人员可以容易地回顾上述序列，鉴定保守取代，并使用众所周知的分子技术产生保守变体。

已经针对上述讨论的抗原结合结构域进行了表位作图。在一个实施方案中，已经发现人ROR1的残基Gln-261对于抗原结合结构域是必不可少的。因此，还提供了与ROR1的表位结合的抗原结合结构域，其中该表位包含氨基酸Gln-261。

抗原结合结构域可以具有抗体片段(例如Fab，F(ab')₂和Fv)的结构，其包括重链和轻链可变区并且能够结合ROR1上的表位决定簇。这些抗体片段保留了与抗原选择性结合的能力，并如上所述。制备这些片段的方法是本领域已知的(参见，例如Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1988)。

在另一组实施方案中，抗原结合结构域可以具有Fv抗体的结构，其通常为约25kDa，并且包含完整的抗原结合位点，每条重链和每条轻链具有三个CDR。为了产生这些抗体，可以从宿主细胞中的两个单独的核酸构建体表达V_H和V_L。如果V_H和V_L非连续地表达，则Fv抗体的链通常通过非共价相互作用保持在一起。然而，这些链在稀释时趋于解离，因此已经开发了方法以通过戊二醛、分子间二硫化物或肽连接器使链交联。因此，在一个实例中，Fv可以是二硫键稳定的Fv(dsFv)，其中重链可变区和轻链可变区通过二硫键化学地连接。

在另一个实例中，Fv片段包含通过肽连接器连接的V_H和V_L链。这些单链抗原结合蛋白(scFv)通过构建结构基因来制备，所述结构基因包含编码经由寡核苷酸连接的V_H和V_L结构域的DNA序列。所述结构基因被插入表达载体中，其随后被引入宿主细胞(例如大肠杆菌)中。重组宿主细胞合成具有桥接两个V结构域的连接器肽的单个多肽链。产生scFv的方法是本领域已知的(参见Whitlow等人,Methods:a Companion to Methods in Enzymology,Vol.2,page 97,1991；Bird等人,Science 242:423,1988；U.S.Patent No.4,946,778；Packet al.,Bio/Technology 11:1271,1993；和Sandhu，同上)。也考虑了单链抗体(scFV₂)的二聚体。

包含抗原结合结构域的抗体片段可以通过抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌中表达编码该片段的DNA来制备。抗体片段可以经由常规方法通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整的抗体来获得。例如，抗体片段可以通过用胃蛋白酶酶促切割抗体来产生，以提供表示为F(ab')₂的5S片段。该片段可以使用硫醇还原剂和任选地由二硫键的断裂产生的巯基的保护基进一步切割，以产生3.5S Fab'单价片段。或者，使用胃蛋白酶的酶促切割直接产生两个单价Fab'片段和一个Fc片段(参见美国专利4,036,945和美国专利4,331,647，以及包含在其中的参考文献；Nisonhoff等人,Arch.Biochem.Biophys.89:230,1960；Porter,Biochem.J.73:119,1959；Edelman等人,Methods in Enzymology,Vol.1,page 422,Academic Press,1967；和Coligan等人at sections2.8.1-2.8.10and 2.10.1-2.10.4)。

切割抗体(例如分离重链以形成单价轻-重链片段)的其他方法进一步切割片段，或者其他酶促的、化学的或遗传技术也可以使用，只要这些片段与被完整抗体识别的抗原结合即可。

本文公开的抗原结合结构域、抗体或抗体片段可以被衍生化或连接至另一个分子(例如另一个肽或蛋白质)。通常，抗体或其部分被衍生化，使得与ROR1多肽的结合不受衍生化或标记的不利影响。例如，抗体可以例如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或以其他方式与一个或多个其他分子实体功能性地连接，所述其他分子实体例如是可以介导抗体或抗体部分与另一种分子(例如链霉亲和素核心区或聚组氨酸标签)结合的另一种抗体(例如，双特异性抗体或双抗体)、检测剂、药物制剂，和/或蛋白质或肽。

一种类型的衍生抗体是通过交联两个或多个抗体(相同类型或不同类型，例如以生成双特异性抗体)而产生的。合适的交联剂包括杂双功能的那些，具有被适当的间隔子(例如间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)隔开的两个不同的反应性基团，或同双功能的那些(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。此类连接器可从Pierce ChemicalCompany(Rockford,IL)获得。

特异性结合ROR1多肽的抗原结合结构域可以用如上所述的可检测部分或标记物标记。

抗原结合结构域也可以用放射性标记的氨基酸标记。放射性标记的例子包括但不限于以下放射性同位素或放射性核苷酸：³H,¹⁴C,¹⁵N,³⁵S,⁹⁰Y,⁹⁹Tc,¹¹¹In,¹²⁵I,¹³¹I。放射性标记可用于诊断和治疗目的。

检测此类标记的方法是本领域技术人员众所周知的。因此，例如，放射性标记可以使用摄影胶片或闪烁计数器来检测，荧光标记可以使用光检测器来检测以检测发射的照度。酶标记通常通过向底物提供酶并检测由于酶在底物上的作用而产生的反应产物来检测，并且比色标记通过简单地可视化有色标记来检测。

抗原结合结构域也可以用化学基团例如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基、或碳水化合物基团来衍生。这些基团可用于改善抗原结合结构域的生物学特性，例如以增加血清半衰期或增加组织结合。

多核苷酸和表达

还提供了编码特异性结合ROR1多肽的抗原结合结构域的核苷酸序列。还提供表达载体用于其在细胞(例如T细胞)中的有效表达。

抗原结合结构域的重组表达通常需要构建含有编码抗体或抗体片段的多核苷酸的表达载体。提供了可复制的载体，其包含与启动子可操作连接的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码抗体分子、抗体的重链或轻链、抗体重链或轻链可变结构域或其部分，或重链或轻链CDR。这样的载体可以包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见，例如，美国专利5,981,216；5,591,639；5,658,759和5,122,464)，并且可以克隆抗体的可变结构域到这种载体中以表达整个重链、整个轻链或整个重链和轻链。

编码本文提供的多肽(包括但不限于抗原结合结构域)的核酸分子(也称为多核苷酸)可以由本领域技术人员容易地产生。例如，可以使用本文提供的氨基酸序列(例如CDR序列，重链和轻链序列)、本领域可获得的序列(例如框架序列)和遗传密码来产生这些核酸。

本领域技术人员可以容易地使用遗传密码来构建各种功能上等效的核酸，例如在序列上不同但编码相同抗体序列的核酸，或编码包括V_L和或V_H核酸序列的缀合物或融合蛋白的核酸。

编码特异性结合ROR1多肽的抗原结合结构域的核酸序列可以通过任何合适的方法(包括例如克隆合适的序列)来制备，或者通过以下方法的直接化学合成来制备：诸如Narang等人,Meth.Enzymol.68:90-99,1979的磷酸三酯法；Brown等人,Meth.Enzymol.68:109-151,1979的磷酸二酯法；Beaucage等人,Tetra.Lett.22:1859-1862,1981的四乙基亚磷酰胺法；Beaucage&Caruthers,Tetra.Letts.22(20):1859-1862,1981描述的固相亚磷酰胺三酯法，例如，使用例如在Needham-VanDevanter等人,Nucl.Acids Res.12:6159-6168,1984中所描述的自动合成仪；和美国专利4,458,066的固体支撑方法。化学合成产生单链的寡核苷酸。这可以通过与互补序列杂交或通过使用单链作为模板用DNA聚合酶进行聚合来转化为双链DNA。技术人员会认识到，尽管DNA的化学合成通常限于约100个碱基的序列，但可以通过连接较短的序列来获得较长的序列。

示例性核酸可以通过克隆技术来制备。合适的克隆和测序技术的例子，以及足以指导技术人员进行许多克隆练习的说明，可在上文的Sambrook等人，上文的Berger andKimmel(eds.)和上文的Ausubel中找到。来自生物试剂和实验设备的制造商的产品信息也提供了有用的信息。此类制造商包括SIGMA Chemical Company(Saint Louis,MO),R&DSystems(Minneapolis,MN),Pharmacia Amersham(Piscataway,NJ),CLONTECHLaboratories,Inc.(Palo Alto,CA),Chem Genes Corp.,Aldrich Chemical Company(Milwaukee,WI),Glen Research,Inc.,GIBCO BRL Life Technologies,Inc.(Gaithersburg,MD),Fluka Chemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG,Buchs,Switzerland),Invitrogen(Carlsbad,CA),和Applied Biosystems(Foster City,CA)，以及技术人员已知的许多其他商业资源。

核酸也可以通过扩增方法来制备。扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)、自主序列复制系统(3SR)。多种克隆方法，宿主细胞和体外扩增方法是技术人员众所周知的。

本文公开的编码任何抗原结合结构域、V_H和/或V_L的任何核酸(或其片段)均可在重组工程细胞如细菌、植物、酵母、昆虫和哺乳动物细胞中表达。这些抗体可以表达为单独的V_H和/或V_L链，也可以表达为融合蛋白。免疫粘附素也可以被表达。因此，在一些实例中，提供了编码V_H和V_L的核酸以及免疫粘附素。核酸序列可以任选地编码前导序列。

为了产生单链抗体(scFv)，编码V_H和V_L的DNA片段可操作地连接至另一编码柔性连接器(例如编码氨基酸序列(Gly₄-Ser)₃)的片段，从而V_H和V_L序列可以被表达为连续的单链蛋白，其中V_L和V_H结构域通过柔性连接器连接(参见，例如，Bird等人,Science 242:423-426,1988；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883,1988；McCafferty等人,Nature348:552-554,1990)。任选地，切割位点可包含在连接器中，例如弗林蛋白酶切割位点。

编码V_H和/或V_L的核酸可任选地编码Fc结构域(免疫粘附素)。Fc结构域可以是IgA、IgM或IgG Fc结构域。Fc结构域可以是优化的Fc结构域，如美国公开专利申请20100/093979中所描述的，该文献通过引用并入本文。在一实例中，免疫粘附素为IgG₁Fc。

期望本领域技术人员在众多可用于表达蛋白质的表达系统方面知识丰富，所述表达系统包括大肠杆菌、其他细菌宿主、酵母菌以及各种高级真核细胞(例如COS、CHO、HeLa和骨髓瘤细胞系)。一旦通过常规技术将表达载体转移至宿主细胞，然后通过常规技术培养转染的细胞，例如以产生抗体。因此，提供了宿主细胞，含有与异源启动子可操作连接的多核苷酸，所述多核苷酸编码抗原结合结构域或其重链或轻链或其部分。在表达双链抗原结合结构域的某些实施方案中，编码重链和轻链的载体可以在宿主细胞中共表达以表达整个免疫球蛋白分子，如下文详述。

可用作表达重组抗体的宿主的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的，包括许多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系，其包括但不限于：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、婴儿仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如HepG2)、人上皮肾293细胞和许多其他细胞系。不同的宿主细胞具有用于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性和特定机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保被表达的抗体或其部分的正确修饰和加工。为此，可以使用这样的真核宿主细胞，其具有用于适当加工基因产物的初级转录物、糖基化和磷酸化的细胞机制。这样的哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(不内源产生任何功能性免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、SP20、CRL7O3O和HsS78Bst细胞。在一实施方案中，使用人细胞系。在一个实施方案中，可以使用人细胞系PER.C6.(Crucell,Netherlands)。可用作表达重组抗体的宿主的其他细胞系包括但不限于昆虫细胞(例如Sf21/Sf9，粉夜蛾属ni Bti-Tn5b1-4)或酵母细胞(例如酿酒酵母、毕赤酵母、美国专利7,326,681)、植物细胞(美国公开专利申请号20080066200)；和鸡细胞(PCT公开号WO2008142124)。

宿主细胞可以是革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌、链球菌、链霉菌、葡萄球菌、肠球菌、乳杆菌、乳球菌、梭菌、地芽孢杆菌和大肠杆菌。在革兰氏阳性细菌例如乳杆菌中表达蛋白质的方法是本领域众所周知的，参见例如美国公开专利申请号20100/080774。用于乳杆菌的表达载体描述于例如美国专利6,100,388和美国专利5,728,571中。可以包括前导序列以在乳杆菌中表达。革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌、假单胞菌、沙门氏菌、弯曲杆菌、幽门螺杆菌、黄杆菌、梭菌、泥杆菌、奈瑟氏菌和脲原体。

通过将DNA转移到合适的宿主细胞中来体外表达编码抗原结合结构域或其片段的一个或多个DNA序列。该术语还包括受试者宿主细胞的任何后代。应当理解，所有后代可能与亲代细胞并不相同，因为在复制过程中可能会发生突变。稳定转移的方法是指外源DNA在宿主中连续地保持，这是本领域已知的。

编码本文所述分离的蛋白质的核酸的表达可通过将DNA可操作地连接至启动子(其为组成型或诱导型)，然后掺入表达盒中来实现。该启动子可以是任何感兴趣的启动子，包括巨细胞病毒启动子和人T细胞淋巴细胞营养性病毒启动子(HTLV)-1。任选地，增强子，例如巨细胞病毒增强子包括在构建体中。所述盒可以适合于在原核生物或真核生物中复制和整合。典型的表达盒包含可用于调节编码蛋白质的DNA表达的特定序列。例如，表达盒可包括合适的启动子、增强子、转录和翻译终止子、起始序列、在蛋白质编码基因前面的起始密码子(即ATG)、内含子的剪接信号、用于维持该基因正确阅读框以允许mRNA正确翻译的序列，和终止密码子。载体可以编码可选择的标记物，例如编码药物抗性的标记物(例如，氨苄青霉素或四环素抗性)。

为了获得克隆基因的高水平表达，期望构建表达盒，所述表达盒至少包含指导转录的强启动子、用于翻译起始的核糖体结合位点(内部核糖体结合序列)和转录/翻译终止子。对于大肠杆菌，它包括启动子(例如T7、trp、lac或lambda启动子)、核糖体结合位点，和优选转录终止信号。对于真核细胞，控制序列可以包括衍生自例如免疫球蛋白基因、HTLV、SV40或巨细胞病毒，和聚腺苷酸化序列的启动子和/或增强子，并且还可以包括剪接供体和/或受体序列(例如CMV和/或HTLV剪接受体和供体序列)。所述盒可以通过众所周知的方法转移到选定的宿主细胞中，所述方法例如为用于大肠杆菌和磷酸钙处理的转化或电穿孔，用于哺乳动物细胞的电穿孔或脂质转染。由盒转化的细胞可以通过对盒中包含的基因(例如amp、gpt、neo和hyg基因)赋予的抗生素抗性来选择。

当宿主是真核生物时，可以使用这样的DNA转染方法，诸如磷酸钙共沉淀、常规的机械方法(例如显微注射、电穿孔)、装入脂质体中的质粒插入，或病毒载体。真核细胞还可以与(编码抗原结合结构域、标记的抗原结合结构域，或其功能片段的)多核苷酸序列，以及编码可选择表型的第二外源DNA分子(例如单纯疱疹胸苷激酶基因)一起共转化。另一种方法是使用真核病毒载体，例如猿猴病毒40(SV40)或牛乳头瘤病毒，以瞬时感染或转化真核细胞并表达该蛋白(例如，参见Eukaryotic Viral Vectors,Cold Spring HarborLaboratory,Gluzman ed.,1982)。本领域技术人员可以容易地使用表达系统，例如质粒和载体，以用于在细胞中产生蛋白质，所述细胞包括高等真核细胞，例如COS、CHO、HeLa和骨髓瘤细胞系。

可以对编码本文所述多肽的核酸进行修饰而不会降低其生物学活性。可以进行一些修饰以促进靶向分子的克隆、表达或插入进融合蛋白中。这样的修饰是本领域技术人员众所周知的，并且包括例如终止密码子、在氨基末端添加以提供起始位点的甲硫氨酸、位于任一末端上以产生方便定位的限制性位点的其他氨基酸，或有助于纯化步骤的其他氨基酸(例如聚组氨酸)。除了重组方法之外，本公开的免疫缀合物、效应物部分和抗原结合结构域还可以使用本领域众所周知的标准肽合成来全部或部分地构建。

一旦表达，重组的免疫缀合物、抗原结合结构域和/或效应分子可以根据本领域的标准程序进行纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱色谱法等(通常参见R.Scopes,PROTEINPURIFICATION,Springer-Verlag,N.Y.,1982)。抗原结合结构域、免疫缀合物和效应分子不必是100％纯的。一旦被纯化，部分纯化或根据需要达到同质，如果要用于治疗，则多肽应基本上不含内毒素。

已经描述了从细菌例如大肠杆菌表达抗体和/或将其重折叠成合适的活性形式(包括单链抗体)的方法，这些方法是众所周知的，并且适用于本文公开的抗原结合结构域。参见Buchner等人,Anal.Biochem.205:263-270,1992；Pluckthun,Biotechnology 9:545,1991；Huse等人,Science 246:1275,1989和Ward等人,Nature 341:544,1989。

组合物和治疗方法

还公开了包含以上讨论的用于治疗受试者的癌症的抗原结合结构域的细胞，其中向受试者给药包含ROR1选择性CAR的细胞以引起恶性细胞的选择性消耗，以及用于治疗受试者的癌症的方法(包括向受试者给药包含上述抗原结合结构域的细胞，以引起恶性细胞的选择性消耗)。

优选地，癌症是白血病(例如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、套细胞白血病或毛细胞白血病)、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌、恶性胶质瘤、睾丸癌、子宫癌、肾上腺癌、乳腺癌、肺癌、黑素瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、肾癌。此外，ROR1在癌症干细胞的子集上表达。

为了使CAR T细胞有效，并不需要完全消除癌症或肿瘤。例如，与不存在组合物相比，CAR T细胞可将肿瘤减少所需的量，例如减少至少10％、至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或100％。

本发明的CAR T细胞给药可导致5％、10％、20％、50％、75％、90％、95％或99％的消耗，即恶性细胞的减少。

在另一个实例中，还可以向受试者给药有效量的其他试剂，例如化学治疗剂。该方法可包括给药一种或多种本领域已知的其他试剂。所述试剂可以缀合至CAR T细胞。所述试剂可以是化学治疗实体。所述化疗实体可以是细胞毒性药物。所考虑的化学治疗剂包括但不限于：烷基化剂、亚硝基脲、亚乙基亚胺/甲基三聚氰胺、烷基磺酸盐，抗代谢物、嘧啶类似物、表鬼臼毒素、酶(如L-天冬酰胺酶)、生物反应调节剂(如IFNa、IL-2、G-CSF和GM-CSF)、铂配位配合物(例如顺铂和卡铂)、蒽二酮、取代的尿素(例如羟基脲)、甲基肼衍生物(包括N-甲基肼(MIH)和甲基苄肼)、肾上腺皮质激素抑制剂(例如米托烷(o,p'-DDD)和氨基谷氨酰胺)、激素和拮抗剂(包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂，如泼尼松及其等效物、地塞米松和氨基戊二酰亚胺)、孕激素(例如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲孕酮)、雌激素(例如己烯雌酚和炔雌醇的等效物)、抗雌激素(例如他莫昔芬)、雄激素(包括丙酸睾丸酮和氟甲睾酮/等效物)、抗雄激素(例如氟他胺、促性腺激素释放激素类似物和亮丙瑞林)、和非甾体类抗雄激素(例如氟他胺)。

ROR1特异性CAR T细胞的治疗有效量取决于疾病的严重程度和患者健康状况。如临床医生或其他合格的观察者所指出的，治疗有效量的CAR T细胞可提供症状的主观缓解或客观可识别的改善。如上所述，这些组合物可以与另一种治疗剂同时或依次给药。对于任何应用，CAR T细胞均可与化学疗法联合使用。

本文所公开的包括CAR T细胞的组合物的单次或多次给药取决于患者所需要和耐受的剂量和频率。无论如何，该组合物应提供足够量的本文公开的至少一种抗体以有效治疗患者。该剂量可以给药一次，但是可以定期给药，直到获得治疗效果或直到副作用需要终止治疗。在一个实例中，每隔一天输注一剂CAR T细胞三十分钟。在该实例中，可以每隔一天给药约一至约十剂，例如可以每隔一天给药三剂或六剂。在另一个实例中，连续输注给药约五至约十天。可以定期(例如每月)对受试者进行治疗，直到获得所需的治疗效果。通常，该剂量足以治疗或缓解疾病的症状或体征，而不会对患者产生不可接受的毒性。

还公开了在载体中包含CAR T细胞的组合物。所述组合物可以以单位剂型制备，以给药受试者。给药的量和时间由主治医生决定以实现所需目的。抗体和/或核酸可以被配制用于全身或局部给药。在一实例中，CAR T细胞配制用于肠胃外给药，例如静脉内给药。在一些实施方案中，给药是肌肉内的。

活性成分也可以被包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基甲基丙烯酸酯)微胶囊)中，所述微胶囊在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或大乳剂中。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。具体地，含有免疫原或抗体的脂质体可以通过这样的方法来制备，所述这样的方法描述在Epstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688(1985)；Hwang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4030(1980)和美国专利4,485,045和4,544,545中。具有延长的循环时间的脂质体在美国专利No.5,013,556中公开。反相蒸发方法可以与包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物一起使用。通过具有确定孔径的过滤器挤出脂质体，以产生具有所需直径的脂质体。本发明的多肽可以通过二硫键交换反应与例如Martin et al.,J.Biol.Chem.,257:286-288(1982)中描述的脂质体缀合。

用于给药的组合物可以包括溶解在药学上可接受的载体(例如水性载体)中的CART细胞的溶液。可以使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。这些组合物可以通过常规的、众所周知的灭菌技术进行灭菌。所述组合物可包含近似生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中的CAR T细胞的浓度可以在很大范围内变化，并且根据所选择的特定给药方式和受试者的需求，主要根据体液量、粘度、体重等进行选择。在一些实施方案中，给药是静脉内的。

控释肠胃外制剂可以制成为植入物、油性注射剂或颗粒系统。对于蛋白质递送系统的广泛概述，参见Banga,A.J.,Therapeutic Peptides and Proteins:Formulation,Processing,和Delivery Systems,Technomic Publishing Company,Inc.,Lancaster,PA,(1995)。颗粒系统包括微球、微粒、微胶囊、纳米胶囊、纳米球和纳米颗粒。微胶囊包含治疗蛋白，例如细胞毒素或药物，作为中央核心。在微球中，治疗剂分散在整个颗粒中。小于约1μm的颗粒、微球和微胶囊通常分别称为纳米颗粒、纳米球和纳米胶囊。毛细管的直径约为5μm，因此纳米颗粒只能通过静脉注射给药。微粒的直径通常在100μm左右，并通过皮下或肌肉内给药。参见，例如，Kreuter,J.,Colloidal Drug Delivery Systems,J.Kreuter,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY,pp.219-342(1994)和Tice&Tabibi,Treatise onControlled Drug Delivery,A.Kydonieus,ed.,Marcel Dekker,Inc.New York,NY,pp.315-339,(1992)。

聚合物可用于离子控制本文公开的CAR T细胞的释放。用于受控药物递送的各种可降解和不可降解的聚合物基质在本领域中是已知的(Langer,Accounts Chem.Res.26:537-542,1993)。例如，嵌段共聚物(polaxamer 407)在低温下以粘性但可流动的液体形式存在，但在体温下形成半固体凝胶。已经证明它是配制和持续递送重组白介素2和脲酶的有效载体(Johnston等人,Pharm.Res.9:425-434,1992；and Pec et al.,J.Parent.Sci.Tech.44(2):58-65,1990)。或者，羟基磷灰石已被用作微载体以控制蛋白质的释放(Ijntema等人,Int.J.Pharm.112:215-224,1994)。在另一方面，脂质体用于脂质包封的药物的控释以及药物靶向(Betageri等人,Liposome Drug Delivery Systems,Technomic Publishing Co.,Inc.,Lancaster,PA(1993))。

用于静脉内给药的典型药物组合物包括约1×10⁶至1×10⁸T细胞/kg。可替代地，这可以是大约1×10⁶至1×10⁸T细胞/平方米。制备可给药组合物的实际方法对于本领域技术人员来说是已知的或显而易见的，并且在诸如Remington's Pharmaceutical Science,19th ed.,Mack Publishing Company,Easton,PA(1995)的出版物中有更详细的描述。

提供以下示例以说明某些特定特征和/或实施方式。这些示例不应被解释为将本公开限制为所描述的特定特征或实施方式。应结合以下附图阅读所述示例：

图1：αβT细胞受体/CD3复合物的示意图。T细胞受体由6条不同的蛋白质链形成，这些蛋白质链必须在内质网中组装以在细胞表面上表达。CD3复合物的四种蛋白质(CD3ζ、CD3γ、CD3ε和CD3δ)套护T细胞受体(TCR)。该TCR注入具有特定抗原特异性的复合物，并由两条链组成：TCRα和TCRβ。每个TCR链在膜的远侧具有可变组分，在膜的近侧具有恒定组分。

图2：健康的供体T细胞被转导以表达第二代CAR(具有41BB和CD3zeta细胞内信号传导结构域)，所述CAR具有由发明人生成的10种新型ScFv结合物(称为克隆体G5、A、B、F、Pi、Mu、I、O、V和R)和已公开的R12 ScFv和CD19fmc63 ScFv。它们与SKW6.4细胞以2：1的效应物：靶标进行培养。通过基于FACS的杀伤试验来评估24小时内活靶细胞的数目，并将其标准化为与未转导的T细胞一起剩余的活细胞。(测试的个体供体的数量)。误差棒表示均值的标准差。

图3：健康的供体T细胞被克隆体A和F的CAR构建体转导，克隆体A和F的区别在于细胞外间隔子结构域。克隆体A表现出最佳的细胞毒性，具有较短的间隔子，例如铰链和连接器，而克隆体F表现出较好的毒性，具有中等长度的间隔子，例如CD8茎和铰链。

图4：对于所有上述基于ScFv的CAR构建体的铰链间隔子，CD8α间隔子被取代，并且来自单个健康供体的T细胞被转导以表达CAR。T细胞与SupT1-ROR1阴性和SupT1-ROR1阳性细胞系共培养(A)，这表明除克隆体V外，所有克隆体均导致SupT1-ROR1靶标的几乎完全消除。与以前的CD8间隔子构建体相比，当在SKW6.4细胞上评估时，所有构建体均显示出改善的细胞毒性。靶细胞和效应物细胞以1：1的比例铺板。

图5：在基于FACS的杀伤试验中，效应物与靶的比率为1:1时，克隆体A和F对R12表现出优异的杀伤力，V和Mu对SKW6.4细胞系表现出优异的杀伤力。当相同的T细胞靶向表达ROR1的原代CLL细胞时，细胞毒性的差异较小，但仍观察到细胞毒性。

图6：利用被转导以表达萤火虫荧光素酶的Jeko1细胞在鼠模型中以CAR格式新开发的ScFv序列的体内功能。小鼠被注射0.5x10⁶ Jeko1细胞，并在5天后通过尾静脉注射4x10⁶ CAR T细胞。在适当的时间点用D-萤光素进行生物发光成像。

图7：在人ROR1的Fz结构域的位置254和261处产生点突变。使用的特定突变是I(254)V和Q(261)H。结果表明，Q(261)H取代减少了或终止了克隆体F抗体与ROR1-Fz结构域结合，而I(254)V取代似乎不影响结合。此外，Q(261)H和I(254)V的组合也阻止了抗体结合。

图8：人源化克隆体F ROR1-CAR T细胞(hF)对一组ROR1阳性细胞系的细胞毒性，其持续表达代表ALL(697，Kasumi2)、淋巴瘤(Jeko1，Raji)和CLL(SKW，PCL12)的ROR1，与ROR1ScFvs CD19、R12和4A5相比。

图9：与原代CLL细胞共培养的hF、CD19fmc63、R12和4A5 ROR1 CAR T细胞的细胞毒性，所述原代CLL细胞已CFSE标记并使用B-CLL分离试剂盒(Miltenyi Bioscience)按4:1效应物：靶标比率进行分离。

图10：针对ROR1阳性神经母细胞瘤细胞系的细胞毒性。

图11：与针对ROR1阳性(1643、PANC1和NB-7)细胞系的CD19 CAR T细胞相比，克隆FROR1 CAR T细胞导致明显的IFNg分泌。

实施例1

材料和方法

分子生物学

使用标准实验室方案进行DNA克隆。限制性酶、Phusion Taq聚合酶、快速连接酶和DH5α感受态细胞获自New England Biolabs。DNA根据预期的条带大小在1-2％TBE琼脂糖凝胶上电泳，并用溴化乙锭(Sigma-Aldrich)、SybrSafe凝胶染色剂(Life Technologies)或核酸凝胶染液(Lonza)染色。使用SV Wizard凝胶和纯化试剂盒(Promega)进行凝胶提取和PCR纯化。

细菌在Lennox肉汤或Terrific肉汤(Fisher Scientific)中生长；小型制备、中型制备和巨型制备质粒纯化试剂盒来自Mancherey Nagel，而大量制备根据制造商的说明使用Qiagen试剂盒。用Nanodrop(Thermo Scientific)评估DNA浓度，并通过SourceBioscience或Beckman Coulter Genomics进行测序。寡核苷酸引物和G-Block寡核苷酸获自Integrated DNA Technologies，基因合成由Genscript进行。

组织培养

Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM)，Iscove的改良的Dulbecco培养基(IMDM)和Roswell Park Memorial Institute培养基(RPMI)以及胎牛血清(FCS)均购自Gibco,LifeTechnologies。DMEM，IMDM和RPMI均补充10％FCS和谷氨酰胺，RPMI补充HEPES。常规培养中不使用抗生素，但流式分选使用诺莫霉素(Invivogen)。

Nalm-6、SupT1、K562和SKW6.4细胞已在实验室中长期建立，所有细胞均在含10％FCS的RPMI中生长。HEK293T细胞从主库存中解冻，然后在IMDM和10％FCS中生长。

抗原结合能力测量

使用制造商的说明(Dako,Agilent Technologies)，使用Qifikit珠评估每个细胞的靶抗原数量。简言之，将感兴趣的细胞与相同浓度的未缀合的鼠抗人ROR1或CD19抗体一起培养，用PBS洗涤两次，然后用与FITC或APC连接的抗鼠FC缀合的抗体染色。以相同的方式对具有已知结合位点数目的校准珠进行染色，从而构建标准曲线，并进行与每个细胞的绝对抗原有关的平均荧光强度测量。

慢病毒生产

使用标准实验室方案生产第二代慢病毒。简言之，在第1天将1.7x10⁶个HEK293T细胞接种在10cm皿中，然后在第3天用与转移载体、包装载体pCMVdR8.74和VSVG假型包膜载体pMD.G2组合的GeneJuice试剂(Merck Millipore)进行转染。在第5天收集上清液，并将其在800G下离心5分钟以去除污染的细胞物质，并通过0.2微米PES过滤器(Merck Millipore)过滤，然后直接用于转导或冷冻并在-80℃下保存以备后用。使用pMDLg/RRE、pMDG2和pRSV/Rev质粒生产了第三代慢病毒载体。

T细胞转导

利用EDTA抗凝作用收集健康的志愿者外周血，并通过Ficoll-Paque Plus(GEHealthcare)离心法来分离外周血单核细胞(PBMC)。将PBMC以2x10⁶/ml重悬浮，并以1ml接种于每24孔板，用0.5mg/ml的MACS GMP CD3和CD28抗体(Miltenyi Biotec)或CD3/28珠(Invitrogen)激活。第二天，向新鲜的R10中加入IL-2至终浓度为100IU/ml(如果抗体被激活)，并在6小时后收获细胞，计数并以0.6x10⁶/ml重悬浮，并将0.5ml接种到涂有目的比较纤维连接蛋白(Takara Bio)的24ml孔板中。将1.5ml慢病毒上清液加入到每个孔中，并在1000G下旋转40分钟。两天后，收获细胞，以0.5x10⁶/ml重悬浮，再扩展两天，然后用于共培养和FACS实验。通过CD56珠消耗(Miltenyi Biotec)去除自然杀伤细胞。

截短的ROR1细胞系

合成ROR1的完整细胞外结构域，并对各个结构域(免疫球蛋白、卷曲蛋白和环状结构域(Kringle))进行PCR扩增。这些引物以及完整的细胞外结构域具有相容的末端，并插入SFG转移质粒中，并转导至SupT1细胞中。用融合到eGFP的跨膜结构域将细胞外结构域栓到膜上。

流式细胞术

用于流式细胞术的抗体是从Biolegend或eBioscience获得的，CD107a(BDBioscience)除外。流式细胞术在BD Accuri，BD Facsverse，BD LRSII Fortessa或BeckmanCoulter Cyan上进行。在FlowJo软件上分析数据。在MoFlo(Beckman Coulter)或FACS Aria(BD Bioscience)上进行荧光激活细胞分选(FACS)。

CAR检测

为了对CAR表达进行染色，与鼠IgG2a Fc结构域融合的嵌合ROR1蛋白被利用，并在稳定转导的K562细胞中产生。通过使用与兔Fc融合的嵌合CD19来检测CD19 CAR表达。用来自Jackson Immunolabs的非交叉反应性抗Fc抗体进行二次染色。

基于FACS的杀伤试验

使用eGFP转导靶细胞以充当标记物，并使用标准方案，用CFSE标记原代CLL细胞，所述原代CLL细胞以25,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。将它们与效应物细胞以各种效应物/靶标比率进行培养至最终体积为200μl，并在400oG下离心5分钟，然后在37℃和5％CO₂下培养。第二天，取出100μl上清液用于细胞因子ELISA，将板用CD3抗体和可固定活力染料(eBioscience)染色，并将样本转移到FACS管中，并用等量的Flowcheck微球计数珠(Beckman Coulter)。通过流式细胞术对计数珠门中的1000个事件进行数据采集。

cDNA末端的5'快速扩增(RACE)

通过有限稀释或将单细胞分选到96孔板中，将来自Aldevron GmBH的寡克隆杂交瘤分为单细胞克隆体，克隆生长直至汇合(约2周)。针对ROR1阳性和阴性细胞系筛选上清液，以确保存在特异性抗ROR1抗体，并使用大鼠免疫球蛋白同型分型试剂盒(eBioscience或BD Bioscience)将其用于同型分型。

克隆体生长至6孔板或10cm板中汇合，然后沉淀成RNAlater(LifeTechnologies)，然后使用RNA MiniPlus Kit(Qiagen)提取RNA。使用Quantitect逆转录酶(Qiagen)将RNA逆转录为cDNA。用GAPDH引物评估该cDNA的等分试样，该引物能够区分基因组和cDNA，以确保样本的质量。cDNA具有添加了末端转移酶(New England Biolabs)的polyC尾巴，并使用对轻链同种型和重链同种型特异的引物进行了嵌套PCR反应(PhusionTaq；New England Biolabs或Platinum Taq High Fidelity:Life Technologies)以鉴定重链和轻链可变区。

PCR产物在1％TBE凝胶上电泳，并用核酸凝胶染液(Lonza)进行后染色。正确大小的条带被提取并发送以进行直接测序，或其被插入Topo亚克隆载体(Life Technologies)中用于后续测序。为了使我们直接对PCR产物进行测序，引物被设计为使得它们在恒定区内进一步结合，并允许在不省略末端可变区的情况下通读测序反应，从而避免对Topo亚克隆的需要。

序列数据与大鼠种系免疫球蛋白序列的IMGT V-QUEST数据库和获得的共有序列(其是有效的(productive)并且具有框架内信号序列)进行比较(Brochet等人,2008,Alamyar等人,2012)。设计重叠延伸引物以扩增重链和轻链，同时引入GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.1)连接器序列以生成ScFv构建体。分泌形式的ScFv是通过使用NcoI和BamHI位点(或如果需要的话，兼容的BglII或BclI位点)将ScFv序列克隆进具有鼠IgG2a恒定区的框架中来生成，并使用SalI和BamHI位点克隆进pCCL.PGK慢病毒主链(其包括细胞外间隔子、41BB和CD3ζ)而产生。抗体通过将重链可变序列克隆进具有人恒定区和具有kappa恒定区的轻链的框架中生成。

实施例2

ROR1在原代CLL细胞上表达

通过流式细胞术分析来自新诊断和治疗患者的外周血的原代CLL细胞用于ROR1表达。在所有分析的样本(Biolegend Clone 2A2)中均可检测到ROR1。抗原密度通过Qifikit(Dako，安捷伦科技公司)评估。ROR1的中位抗原结合能力(ABC)为2304分子/细胞，范围为800-4828，CD19的表达水平更高，中位水平为12583(范围5894-23652)。请参阅下面的表1。

实施例3

大鼠免疫和ROR1抗体产生

用全长人ROR1蛋白和DNA免疫3只大鼠后，我们获得了38个寡克隆杂交瘤。使用5'RACE解决了其中的17个，以鉴定重链和轻链的可变区。我们获得了编码13种新抗体的序列(4个克隆体导致获得了相同的序列)，其中10种以单链可变片段(ScFv)格式结合。(通过RACE克隆杂交瘤cDNA，Andrew Bradbury)请参见下表2。

表2：

从上面可以看出，克隆体F结合了卷曲结构域。所有其他克隆体(V除外)都结合了免疫球蛋白结构域。现有技术的抗体R12和4A5也结合免疫球蛋白结构域。因此，与现有技术的抗体R12和4A5相比，克隆体F显示出不同且有区别的结合特性。

实施例4

从杂交瘤中分离抗ROR1抗体序列

通过cDNA末端的5'快速扩增获得抗体序列。通过稀释或将单细胞分选到96孔板中，将来自Aldevron GmBH的寡克隆杂交瘤分离为单细胞克隆体，克隆生长直至汇合(大约2周)。针对ROR1阳性和阴性细胞系筛选上清液，以确保存在特异性抗ROR1抗体，并使用大鼠免疫球蛋白同型分型试剂盒(eBioscience或BD Bioscience)将所述上清液用于同型分型。

使克隆体生长直至在6孔板或10cm板中汇合，然后沉淀成RNAlater(LifeTechnologies)，然后使用RNA MiniPlus Kit(Qiagen)提取RNA。使用Quantitect逆转录酶(Qiagen)将RNA逆转录为cDNA。用GAPDH引物评估该cDNA的等分试样，该引物能够区分基因组和cDNA，以确保样本的质量。cDNA具有添加了末端转移酶(New England Biolabs)的polyC尾巴，并使用对轻链同种型和重链同种型特异的引物进行了嵌套PCR反应(PhusionTaq；New England Biolabs或Platinum Taq High Fidelity:Life Technologies)以鉴定重链和轻链可变区。

PCR产物在1％TBE凝胶上电泳，并用核酸凝胶染液(Lonza)进行后染色。正确大小的条带被提取并发送以进行直接测序，或其被插入Topo亚克隆载体(Life Technologies)中用于后续测序。

序列数据与大鼠种系免疫球蛋白序列的IMGT V-QUEST数据库和获得的共有序列(其是有效的并且具有框架内信号序列)进行比较(Brochet等人,2008,Alamyar等人,2012)。设计重叠延伸引物以扩增重链和轻链，同时引入连接器序列以生成ScFv构建体。

分泌形式的ScFv是通过使用NcoI和BamHI位点(或如果需要的话，兼容的BglII或BclI位点)将ScFv序列克隆进具有鼠IgG2a恒定区的框架中产生。

ROR1抗体是通过将可变序列克隆进具有人或鼠重链恒定区和具有相应人或鼠kappa恒定区的轻链的框架中生成。

实施例5

大鼠scFvs的人源化

基于优异的细胞毒性和功能，选择克隆体A和F进行人源化。针对人IgG种系数据库搜索大鼠scFv的可变结构域序列。选择与每种大鼠抗体具有高度同源性的五个人框架序列作为轻链和重链CDR的人受体。将每种大鼠抗体的CDR直接移植到人受体框架后，获得五个人源化VL和人源化VH的序列。

实施例6

新型基于ScFv的CAR T细胞的细胞毒性

将转导以表达CAR的T细胞与SupT1-ROR1细胞共培养，无论使用何种ScFv，均会产生明显的细胞毒性，这在相应的ROR1阴性细胞系中未见。我们同时针对SKW6.4细胞测试了相同的T细胞，其表达了与CLL细胞相似的低水平ROR1，而SupT1-ROR1细胞系与之相反，其已被转导为表达高水平的ROR1。在这种情况下，只有承载了T细胞的克隆体F能够杀死与基于CD19的CAR T细胞相当范围内的靶细胞。参见图2。

实施例7

CD107a脱粒分析

为了证实共培养数据，我们进行了CD107a分析，其评估了溶酶体相关膜蛋白(LAMP-1)的表面表达，所述溶酶体相关膜蛋白通常存在于细胞质颗粒膜中，但在激活时T细胞活化后转移到细胞表面。针对ROR1高细胞系(SupT1_ROR1)，CD107a脱粒与ScFv无关。然而，针对SKW细胞(ROR1低)，克隆体F始终显示较高水平的CD07a表达(F为43％，Pi为14％，UT为2％)，这意味着更高水平的靶杀伤作用部分是由改善的细胞毒性颗粒释放来介导的。

实施例8

细胞外间隔子的优化

先前生成的构建体包含CD8α间隔子(81个氨基酸(AA))，所述CD8α间隔子被全长IgG间隔子(239AA)、IgG1铰链仅间隔子(19AA)或短连接器序列(9AA)取代，其包括氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO.2)，以试图使ScFv在细胞表面膜上具有柔性。参见图3。

用这些不同的间隔子序列转导的T细胞在它们杀死靶细胞的能力上显示出明显的差异，这与表达高和低水平的ROR1的细胞系一致。有趣的是，克隆体A和克隆体F与最长的IgG间隔子表现出相互关系，而IgG间隔子对克隆体F仍然显示出中等效力，但对克隆体A的杀伤力很差，这与最短的连接子间隔子相反。毫无疑问，这与靶细胞抗原表位与T细胞CAR结构之间产生的最佳距离有关。

考虑到更换间隔子会导致细胞毒性差异，并且发现铰链间隔子似乎对克隆体A和F均是最佳的，因此我们将铰链间隔子替换进所有ScFv构建体中，并重复了细胞毒性评估。

用铰链间隔子构建体转导的T细胞对SupT1 ROR1阴性细胞显示无细胞毒性，但导致在24小时几乎完全杀死SupT1 ROR1阳性细胞，但克隆体V除外，这在重复实验中是一致的。

有趣的是，即使效应物与靶标比率降低至1：1，铰链间隔子仍改善了所有ScFv构建体对SKW6.4细胞的细胞毒性。例如，对于R12 ScFv，用CD8α间隔子保留的靶细胞的平均百分比为80％，而用铰链间隔子为40％。参见图4。

实施例9

对原代CLL细胞的细胞毒性

生成具有铰链间隔子和41BB和CD3zeta细胞内信号传导结构域的ROR1 CAR T细胞以表达图5的ScFv序列。

在基于FACS的杀伤试验中，效应物与靶标比率为1：1时，克隆体A和F对R12表现出优异的杀伤力，克隆体V和Mu对SKW6.4细胞系表现出优异的杀伤力。

实施例10

与基于CD19 ScFv的CAR的比较

表达针对ROR1的第二代CAR的T细胞(克隆体A和克隆体F)与CD19 ScFv CAR(基于fmc63 ScFv)一起产生。1：1效应物：靶标基于FACS的杀伤试验表明，与基于CD19的ScFv相比，克隆体A和F具有相似水平的细胞毒性。这是一个重要发现，因为在SKW细胞(以及原代CLL细胞)中，ROR1的表达水平比CD19低得多。

实施例11

ROR1 CAR T细胞的体内建模

为了评估我们新开发的CAR格式的ScFv序列的体内功能，我们利用被转导以表达萤火虫荧光素酶的Jeko1细胞来进行鼠模型研究。通过尾静脉将0.5x10⁶个细胞注入NSG小鼠NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ。在第7天，通过尾静脉注射4x10⁷转导的T细胞，仅表达mCherry转导标记物、R12 ScFv CAR、克隆体A ScFv CAR、克隆体F ScFv CAR、CD19fmc63CAR或非特异性GD2 CAR。

具有基于克隆体A和F的ScFv的CAR T细胞的治疗提供了与R12一致的针对肿瘤进展的保护。参见图6。

实施例12

表位作图

为了评估产生的抗体的表位，我们制备了具有截短的ROR1的细胞系：这些细胞系包含SUPT1细胞，其表达全长ROR1(免疫球蛋白结构域、卷曲结构域和环状(Kringle)结构域)、仅免疫球蛋白SupT1、仅卷曲SupT1、仅环状结构域SupT1及其组合(Ig，和卷曲SupT1，和卷曲和环状结构域SupT1)。这表明克隆体F与卷曲结构域结合，克隆体V结合在Ig和卷曲结构域之间，所有其他克隆体都结合Ig结构域。

为了进一步表征克隆体F特异性结合的表位，我们将大鼠ROR1与人ROR1进行了比较，以评估这两个物种之间的氨基酸差异。我们制备了许多突变的人ROR1构建体，其包括到假定氨基酸的单个氨基酸取代，这些抗体可以与所述假定氨基酸结合以进一步表征所讨论的表位。

对于克隆体F，在人ROR1的位置254和261的Fz结构域中产生了点突变。使用的特定突变是I(254)V和Q(261)H。

发现Q(261)H取代减少或终止了克隆体F抗体与ROR1-Fz结构域结合，而I(254)V取代似乎不影响结合。此外，Q(261)H和I(254)V的组合也阻止了抗体结合。因此，Gln-261对于抗体结合必不可少。结果可见图7。

实施例13

由于序列同源性，克隆体F对于产生的其他抗体(鼠和兔)是独特的

使用基于Uniprot网络的软件(http://www.uniprot.org/align/)对人、鼠、兔和大鼠ROR1蛋白序列进行比对，并突出显示了不同物种之间的差异。Uniprot登记号：人(Q01973)、鼠(Q9Z139)和兔(G1U5L1)。对于大鼠ROR1，使用NCBI参考序列NP_001102141.1，因为相应的Uniprot序列仅部分完成。

克隆体F与Q261结合，这可能是由于该位置处的大鼠氨基酸与人氨基酸之间的差异所致(位置261处的人氨基酸为谷氨酰胺(Q)，而大鼠中此位置处的相应氨基酸为组氨酸(H))。当用人ROR1免疫大鼠时，该氨基酸差异被认为是相对于大鼠ROR1序列的免疫原，针对此产生抗体。

已知的抗体R12(兔)和鼠ROR1结合物在此位点处显示与人ROR1的同源性(即它们在此位置处均具有谷氨酰胺(Q))。结果，用人ROR1免疫兔或小鼠不会导致针对该位置的抗体产生，因为它不具有免疫原性。鉴于此，克隆体F结合该表位的能力是独特的。

实施例14

基于人源化ScFv的CAR T细胞的细胞毒性

我们生成了克隆体F的人源化变体，并获得了5条新颖的人源化轻链(hVL1-5)和5条新颖的人源化重链(hVH1-5)。使用重叠延伸PCR，我们将这些构建体克隆为ScFv格式(信号肽、重链、连接器和轻链)，得到克隆体F的25个构建体，其中每个轻链与每个重链配对。这些人源化的ScFv序列在框架中克隆至鼠IgG2a恒定区，以产生包含具有鼠IgG2a恒定区的ScFv的融合蛋白。我们将其克隆到SFG逆转录病毒盒中，并生成含有克隆体F的ScFv融合蛋白的上清液。

我们针对仅表达ROR1的卷曲结构域(克隆体F与之结合)的细胞系，筛选了含有ScFv融合蛋白的上清液。将上清液添加到上述细胞(其可以通过它们的GFP表达来区分(免疫球蛋白细胞GFP阴性和卷曲细胞GFP阳性))的混合物中。将上清液静置30分钟，然后洗涤细胞并添加APC抗鼠IgG(以检测融合蛋白的IgG2a成分)。

在25种人源化构建物中，有3种结合特别好。将这三种人源化构建体以及对照克隆到慢病毒骨架中，并产生病毒上清液以生成表达这些新型人源化ScFv的CAR T细胞。将这些T细胞与SupT1细胞(ROR1阴性)以及SupT1-ROR1、SKW和Jeko1细胞共培养，并评估CD107a脱粒。我们利用mCherry标记物来确保仅在转导的细胞中评估CD107a脱粒。

这表明克隆体F的所有三种人源化ScFv对靶细胞的反应均具有明显的脱粒，这是由高于背景的转移所证实。我们将亲本大鼠ScFv构建体作为比较子，以及不结合ROR1的作为对照人源化构建体。

实施例15

针对实体肿瘤细胞系的细胞毒性

代表一系列恶性肿瘤的ROR1阳性实体瘤细胞系与ROR1 CAR T细胞共培养24小时。在24小时用MTS测定评估细胞毒性，并测量IFNγ。候选克隆体F对靶细胞表现出明显的细胞毒性，并随之产生IFNγ分泌。此外，观察到候选细胞的T细胞聚集和增殖，但针对PANC-1细胞的未转导或对照CAR T细胞未观察到。

基于CD107a脱粒试验，选择导致CD107a脱粒的ScFv构建体用于针对SKW6.4、PCL12、Raji和Jeko1细胞的正式细胞毒性试验，所有这些均如上所述表达ROR1。

与亲本克隆体F相比，表达人源化构建体中的一个的T细胞共培养显示出相似水平的细胞毒性。将经转导以表达GD2特异性CAR的T细胞作为对照比较细胞毒性。

为了比较靶毒性与人源化F，我们用PANC1细胞(ROR1阳性)和MCF7细胞(ROR1阴性)进行了长时间共培养。我们利用CD19 fmc63 CAR作为内部对照。hF能够如预期的那样杀死PANC1细胞。

我们使用我们最佳的人源化F克隆体生成了ROR1-CAR T细胞，并比较了其对一组ROR1阳性细胞系的细胞毒性，所述ROR1阳性细胞系持续表达代表ALL(697，Kasumi2)、淋巴瘤(Jeko1，Raji)、CLL(SKW，PCL12)的ROR1，并且与比较ROR1 ScFvs(R12和4A5)相比，显示了更好的细胞毒性。参见图8。

如前所述生成CD19fmc63和hF、R12、4A5 ROR1 CAR T细胞。将它们与已被CFSE标记的原代CLL细胞共培养，并使用B-CLL分离试剂盒(Miltenyi Bioscience)以4：1效应物：靶标比率进行分离。通过将共培养物中剩余的活CLL细胞与和对照GD2 CAR共培养的CLL细胞进行比较，在24小时评估细胞毒性。

与R12和4A5 ROR1 CAR T细胞相比，hF导致更高的细胞毒性。与CD19 CAR T细胞相比，细胞毒性较低，同时与CD19相比，ROR1的抗原密度较低。参见图9。

实施例16

克隆体F ROR-1CAR T细胞导致ROR1阳性神经母细胞瘤细胞系的明显细胞毒性

ROR1 CAR T细胞在24和48小时在靶与效应物比率为5：1和10：1时会导致NB-1643和NB-7ROR1+神经母细胞瘤细胞系的明显细胞毒性，但不会对Rh30 ROR1阴性细胞系产生细胞毒性(见图10)。

实施例17

克隆体F ROR-1CAR T细胞与CD19 CAR T细胞比较

与针对ROR1阳性(1643，PANC1和NB-7)细胞系(而非Rh30 ROR1阴性细胞)的对照非靶向CD19 CAR T细胞相比，克隆体F ROR1 CAR T细胞在24小时导致大量IFNg分泌(见图11)。

实施例18

克隆体F CAR T细胞显示与已知CAR T细胞相比的优越性

对靶向ROR1的CAR的首次描述利用了2A2 scFv(Hudecek等，2010)，随后将其与R11和R12 scFv衍生的CAR T细胞进行比较，其中R12是最好的(Hudecek等，2013)。我们已示出，就细胞毒性和具有不同的细胞因子释放模式而言，该组克隆体F优于R12前导构建体。因此，克隆体F构建体也优于2A2和R11。

UCSD组产生了ROR1抗体D10、H10和4A5。它们的前导构建体是4A5，并且该数据已经发表(Deniger等人，2015)。我们的克隆体F CAR已与4A5进行了比较，显示出优异的细胞毒性和细胞因子分泌。鉴于此，克隆体F构建体也优于D10和H10。此外，D10和H10抗体是在鼠免疫后产生的，因此不会与克隆体F相同的表位结合。

实施例19

克隆体F的人源化与非人源化比较子构建体(comparator constructs)相比具有优越性

与CD19相反，靶向ROR1的基本原理之一是保留了正常的ROR1阴性B细胞群体。然而，与此同时，正常CD19+B细胞的持续存在允许针对大鼠衍生的scFv的免疫反应。在鼠scFv中已经看到了这一点，并导致了临床上显著结果，包括使用mRNA修饰的间皮素CAR T细胞的过敏反应(Maus等人，2013)或使用α-叶酸受体或碳酸酐酶IX特异性CAR T细胞的抗体反应(Lamers等人，2006；Kershaw等人，2006)。由于CAR成分在MHC上的交叉展示，T细胞介导的免疫反应也是可能的。相比之下，CD19 CAR T细胞通过消灭正常的B细胞群体，从本质上消除了基于抗体的免疫反应的风险，而B细胞重现与更高风险的疾病复发相关。

通过对克隆体F进行人源化，我们降低了针对CAR的免疫反应的可能性，从而导致持久性增强和免疫原性降低。

序列表

下面列出的氨基酸序列使用标准的一个字母表示氨基酸。该序列用于克隆体F和已开发的五个人源化可变序列。

上述克隆体F的重链和轻链的可变区以及该克隆体的人源化版本如下：

克隆体F轻链可变区

DIQMTQSPSFLSASVGDRVTINCKASQNIDRYLNWYQQKLGEAPKRLLYNTNKLQTGIPSRFSGSGSATDFTLTISSLQPEDFATYFCLQYNSLPLTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO.3)

人源化1轻链可变区

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIDRYLNWYQQKPGKAPKRLIYNTNKLQTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYNSLPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO.4)

人源的2轻链可变区

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIDRYLNWFQQKPGKAPKSLIYNTNKLQTGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYNSLPLTFGQGTRLEIK(SEQ ID NO.5)

人源化3轻链可变区

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIDRYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNKLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYNSLPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO.6)

人源化4轻链可变区

DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNIDRYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNKLQTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYNSLPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO.7)

人源化5轻链可变区

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKASQNIDRYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNKLQTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCLQYNSLPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO.8)

克隆体F重链可变区

EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFIFSEHNMAWVRQAPKKGLEWVATISDDGRNTYYRDSMRGRFTISRENARSTLYLQLDSLRSEDTATYYCASHRYNLFDSWGQGVMVTVSS(SEQ ID NO.9)

人源化1重链可变区

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSEHNMAWVRQAPGKGLEWVATISDDGRNTYYRDSMRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTSHRYNLFDSWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO.10)

人性化2重链可变区

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFSEHNMAWVRQAPGKGLEWVSTISDDGRNTYYRDSMRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHRYNLFDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.11)

人源化3重链可变区

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFSEHNMAWVRQAPGKGLEWVATISDDGRNTYYRDSMRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHRYNLFDSWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO.12)

人源化4重链可变区

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFSEHNMAWVRQAPGKGLVWVSTISDDGRNTYYRDSMRGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHRYNLFDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.13)

人源化5重链可变区

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFIFSEHNMAWVRQAPGKGLEWVSTISDDGRNTYYRDSMRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKHRYNLFDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.14)

上面的每个可变区中的三个CDR序列都用下划线标出。这些CDR序列是根据来自IMGT(国际ImMunoGeneTics信息系统)数据库中有关框架区和CDR的信息确定的(请参见www.imgt.org)。

与上述序列有关的其他序列及其相关的序列标识符号(SED ID NO)如下：

标记CDR的另一种方法是使用Kabat系统，这可能会产生稍微不同的结果。然而，这可以由本领域技术人员容易地确定。为避免疑问，基于Kabat系统的可变区中的CDR序列如下，其中Kabat CDR以粗体显示：

克隆体F轻链可变区

人源化1轻链可变区

人源化2轻链可变区

人源化3轻链可变区

人源化4轻链可变区

人源化5轻链可变区

克隆体F重链可变区

人源化1重链可变区

人性化2重链可变区

人源化3重链可变区

人源化4重链可变区

人源化5重链可变区

因此，使用Kabat系统确定的CDR如下：

序列	说明	SEQ ID NO:
			KASQNIDRYLN	轻链CDR1	58
NTNKLQT	轻链CDR2	59
			LQYNSLPLT	轻链CDR3	20
EHNMA	重链CDR1	60
			TISDDGRNTYYRDSMRG	重链CDR2	61
HRYNLFDS	重链CDR3	62

序列表

<110> UCL商业公开有限公司(UCL BUSINESS PLC)

<120> ROR1 CAR T-细胞

<130> P532708PCTJW

<150> GB 1710836.6

<151> 2017-07-05

<160> 62

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 连接器

<400> 1

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 连接器

<400> 2

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 3

<211> 107

<212> PRT

<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 3

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asp Arg Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Arg Leu Leu

35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Lys Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln Tyr Asn Ser Leu Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人源化轻链可变区

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asp Arg Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Lys Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asn Ser Leu Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人源化轻链可变区

<400> 5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asp Arg Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Lys Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asn Ser Leu Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人源化轻链可变区

<400> 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asp Arg Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Lys Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asn Ser Leu Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人源化轻链可变区

<400> 7

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asp Arg Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Lys Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asn Ser Leu Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人源化轻链可变区

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asp Arg Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Lys Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asn Ser Leu Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 117

<212> PRT

<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Glu His

20 25 30

Asn Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Asp Asp Gly Arg Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Met

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Arg Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser His Arg Tyr Asn Leu Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Val Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人源化重链可变区

<400> 10

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Glu His

20 25 30

Asn Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Asp Asp Gly Arg Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Met

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser His Arg Tyr Asn Leu Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 11

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人源化重链可变区

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Glu His

20 25 30

Asn Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Asp Asp Gly Arg Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Met

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys His Arg Tyr Asn Leu Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人源化重链可变区

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Glu His

20 25 30

Asn Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Asp Asp Gly Arg Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Met

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Arg Tyr Asn Leu Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 13

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人源化重链可变区

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Glu His

20 25 30

Asn Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Asp Asp Gly Arg Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Met

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Arg Tyr Asn Leu Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人源化重链可变区

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Glu His

20 25 30

Asn Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Asp Asp Gly Arg Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Met

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys His Arg Tyr Asn Leu Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 15

<211> 26

<212> PRT

<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 15

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 16

<211> 6

<212> PRT

<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 16

Gln Asn Ile Asp Arg Tyr

1 5

<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 17

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Arg Leu Leu

1 5 10 15

Tyr

<210> 18

<211> 3

<212> PRT

<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 18

Asn Thr Asn

1

<210> 19

<211> 36

<212> PRT

<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 19

Lys Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Ala

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala

20 25 30

Thr Tyr Phe Cys

35

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 20

Leu Gln Tyr Asn Ser Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 21

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 22

<211> 25

<212> PRT

<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 22

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 23

<211> 8

<212> PRT

<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 23

Gly Phe Ile Phe Ser Glu His Asn

1 5

<210> 24

<211> 17

<212> PRT

<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 24

Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1 5 10 15

Thr

<210> 25

<211> 8

<212> PRT

<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 25

Ile Ser Asp Asp Gly Arg Asn Thr

1 5

<210> 26

<211> 38

<212> PRT

<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 26

Tyr Tyr Arg Asp Ser Met Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn

1 5 10 15

Ala Arg Ser Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 27

Ala Ser His Arg Tyr Asn Leu Phe Asp Ser

1 5 10

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 28

Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 29

<211> 26

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 29

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 30

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 31

<211> 36

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 31

Lys Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala

20 25 30

Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 32

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 32

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 33

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 33

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 34

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 34

Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1 5 10 15

Thr

<210> 35

<211> 40

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 35

Tyr Tyr Arg Asp Ser Met Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser

35 40

<210> 36

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人源化重链 CDR3

<400> 36

Thr Ser His Arg Tyr Asn Leu Phe Asp Ser

1 5 10

<210> 37

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 37

Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 38

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 38

Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 39

<211> 36

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 39

Lys Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala

20 25 30

Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 40

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 40

Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 41

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 41

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 42

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 42

Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10 15

Thr

<210> 43

<211> 40

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 43

Tyr Tyr Arg Asp Ser Met Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

35 40

<210> 44

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人源化重链 CDR3

<400> 44

Ala Lys His Arg Tyr Asn Leu Phe Asp Ser

1 5 10

<210> 45

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 45

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 46

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 46

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 47

<211> 36

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 47

Lys Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala

20 25 30

Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 48

<211> 40

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 48

Tyr Tyr Arg Asp Ser Met Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

35 40

<210> 49

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人源化重链CDR3

<400> 49

Ala Arg His Arg Tyr Asn Leu Phe Asp Ser

1 5 10

<210> 50

<211> 26

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 50

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 51

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 51

Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val Ser

1 5 10 15

Thr

<210> 52

<211> 40

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 52

Tyr Tyr Arg Asp Ser Met Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

35 40

<210> 53

<211> 26

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 53

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 54

<211> 36

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 54

Lys Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala

20 25 30

Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 55

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 55

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 56

<211> 40

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 56

Tyr Tyr Arg Asp Ser Met Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys

35 40

<210> 57

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 重链CDR3

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可以是 Ala或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa 可以是Ser, Lys或Arg

<400> 57

Xaa Xaa His Arg Tyr Asn Leu Phe Asp Ser

1 5 10

<210> 58

<211> 11

<212> PRT

<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 58

Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asp Arg Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 59

<211> 7

<212> PRT

<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 59

Asn Thr Asn Lys Leu Gln Thr

1 5

<210> 60

<211> 5

<212> PRT

<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 60

Glu His Asn Met Ala

1 5

<210> 61

<211> 17

<212> PRT

<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 61

Thr Ile Ser Asp Asp Gly Arg Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Met Arg

1 5 10 15

Gly

<210> 62

<211> 8

<212> PRT

<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 62

His Arg Tyr Asn Leu Phe Asp Ser

1 5

Claims (31)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含与受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)选择性结合的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域与包含氨基酸Gln-261的ROR1的表位结合。

2.根据权利要求1所述的CAR，其中，所述抗原结合结构域包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述轻链可变结构域包含轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列；和LCDR3包含SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列，并且其中所述重链可变结构域包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO：57中所示的氨基酸序列，其中每个互补决定区的序列可以在最多两个氨基酸位置处与给定序列不同。

3.根据权利要求2所述的CAR，其中，每个CDR的序列可以在一个氨基酸位置处与给定序列不同。

4.根据前述权利要求中任一项所述的CAR，其中，LCDR1包含SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列；和LCDR3包含SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列，并且其中HCDR1包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列；HCDR2包含SEQID NO：25中所示的氨基酸序列；和HCDR3包含SEQ ID NO：57中所示的氨基酸序列。

5.根据前述权利要求中任一项所述的CAR，其中，HCDR3包含选自SEQ ID NO：27、36、44和49中所示的任何序列的氨基酸序列。

6.根据前述权利要求中任一项所述的CAR，其中，所述抗原结合结构域具有轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含轻链框架区(LCFR)1、LCFR2、LCFR3和LCFR4，所述轻链框架区(LCFR)1包含如SEQ ID NO：15、29、50和53之一所示的氨基酸序列，所述LCFR2包含如SEQID NO：17、30、38和46之一所示的氨基酸序列，所述LCFR3包含如SEQ ID NO：19、31、39、47和54之一所示的氨基酸序列，和所述LCFR4包含如SEQ ID NO：21、32和40之一所示的氨基酸序列，其中每个框架区的序列可以在最多五个氨基酸位置处与给定序列不同。

7.根据前述权利要求中任一项所述的CAR，其中，所述抗原结合结构域具有轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含LCFR1、LCFR2、LCFR3和LCFR4，所述LCFR1包含如SEQ ID NO：29、50和53之一所示的氨基酸序列，所述LCFR2包含如SEQ ID NO：30、38和46之一所示的氨基酸序列，所述LCFR3包含如SEQ ID NO：31、39、47和54之一所示的氨基酸序列，和所述LCFR4包含如SEQ ID NO：32和40之一所示的氨基酸序列，其中每个框架区的序列可以在最多五个氨基酸位置处与给定序列不同。

8.根据前述权利要求中任一项所述的CAR，其中，所述抗原结合结构域具有重链可变结构域，所述重链可变结构域包含重链框架区(HCFR)1、HCFR2、HCFR3和HCFR4，所述重链框架区(HCFR)1包含如SEQ ID NO：22、33、41和55之一所示的氨基酸序列，所述HCFR2包含如SEQID NO：24、34、42和51之一所示的氨基酸序列，所述HCFR3包含如SEQ ID NO：26、35、43、48、52和56之一所示的氨基酸序列，和所述HCFR4包含如SEQ ID NO：28、37和45之一所示的氨基酸序列，其中每个框架区的序列可以在最多五个氨基酸位置处与给定序列不同。

9.根据前述权利要求中任一项所述的CAR，其中，所述抗原结合结构域可以具有重链可变结构域，所述重链可变结构域包含HCFR1、HCFR2、HCFR3和HCFR4，所述HCFR1包含如SEQ IDNO：33、41和55之一所示的氨基酸序列，所述HCFR2包含如SEQ ID NO：34、42和51之一所示的氨基酸序列，所述HCFR3包含如SEQ ID NO：35、43、48、52和56之一所示的氨基酸序列，所述HCFR4包含如SEQ ID NO：37和45之一所示的氨基酸序列，其中每个框架区的序列可以在最多五个氨基酸位置处与给定序列不同。

10.根据前述权利要求中任一项所述的CAR，其中，所述轻链可变结构域包含如SEQ IDNO：3、4、5、6、7和8之一所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％同一性的序列。

11.根据前述权利要求中任一项所述的CAR，其中，所述轻链可变结构域包含如SEQ IDNO：4、5、6、7和8之一所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％同一性的序列。

12.根据前述权利要求中任一项所述的CAR，其中，所述重链可变结构域包含如SEQ IDNO：9、10、11、12、13和14之一所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％同一性的序列。

13.根据前述权利要求中任一项所述的CAR，其中，所述重链可变结构域包含如SEQ IDNO：10、11、12、13和14之一所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％同一性的序列。

14.根据前述权利要求中任一项所述的CAR，其中，所述轻链可变结构域包含如SEQ IDNO：4、5、6、7和8之一所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％同一性的序列；和

所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO：10、11、12、13和14之一所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％同一性的序列。

15.根据前述权利要求中任一项所述的CAR，其中，所述轻链可变结构域包含如SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的序列，并且所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO：10、12和13之一所示的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的序列。

16.根据前述权利要求中任一项所述的CAR，其中：

(a)所述轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，和所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；

(b)所述轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，和所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；

(c)所述轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，和所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列；

(d)所述轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，和所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；或者

(e)所述轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，和所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，

其中上述每个轻链可变结构域和重链可变结构域可以与以上所述的氨基酸序列具有至少90％的同一性。

17.根据权利要求1所述的CAR，其中，所述抗原结合结构域包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述轻链可变结构域包含轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：58中所示的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：59中所示的氨基酸序列；LCDR3包含SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列；并且其中所述重链可变结构域包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：60中所示的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO：61中所示的氨基酸序列；和HCDR3包含SEQ ID NO：62中所示的氨基酸序列；其中每个互补决定区的序列可以在最多两个氨基酸位置处与给定序列不同。

18.根据权利要求17所述的CAR，其中，对于所述抗原结合结构域：

(a)所述轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，和所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；

(b)所述轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，和所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；

(c)所述轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，和所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；

(d)所述轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，和所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列；

(e)所述轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，和所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；或者

(f)所述轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，和所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，

其中上述轻链可变结构域和重链可变结构域可以与以上所述的氨基酸序列具有至少90％的同一性。

19.一种分离的核酸分子，其编码包含轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3的轻链可变结构域，其中LCDR1包含SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列；和LCDR3包含SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列，其中每个互补决定区的序列可以在最多两个氨基酸位置处与给定序列不同。

20.一种分离的核酸分子，其编码包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3的重链可变结构域，其中HCDR1包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列；和HCDR3包含SEQ ID NO：57中所示的氨基酸序列，其中每个互补决定区的序列可以在最多两个氨基酸位置处与给定序列不同。

21.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1至18中任一项所述的CAR。

22.根据权利要求21所述的分离的核酸分子，其与启动子可操作地连接。

23.一种表达载体，其包含权利要求21或权利要求22所述的分离的核酸分子。

24.一种分离的宿主细胞，其用权利要求21或22所述的核酸分子或权利要求23所述的载体进行转化。

25.一种细胞，其包含权利要求1至18中任一项所述的CAR。

26.一种根据权利要求25所述的细胞，其为T细胞。

27.一种制备根据权利要求24至26中任一项所述的细胞的方法，其包括用根据权利要求21或22所述的核酸序列或权利要求23所述的载体转导或转染细胞的步骤。

28.权利要求25或26所述的细胞在治疗受试者的癌症中的应用，其中向所述受试者给药包含所述ROR1选择性CAR的细胞以引起恶性细胞的选择性消耗。

29.根据权利要求28所述的细胞的应用，其中，所述癌症是白血病、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌、恶性胶质瘤、睾丸癌、子宫癌、肾上腺癌、乳腺癌、肺癌，黑素瘤、神经母细胞瘤、肉瘤或肾癌。

30.一种治疗癌症的方法，其包括向受试者给药根据权利要求25或26所述的细胞以引起恶性细胞的选择性消耗。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述癌症是白血病、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌、恶性胶质瘤、睾丸癌、子宫癌、肾上腺癌、乳腺癌、肺癌、黑素瘤、神经母细胞瘤、肉瘤或肾癌。

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