CN110988175A - 一种测定西咪替丁中基因毒性杂质丙酮醛的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种测定西咪替丁中基因毒性杂质丙酮醛的方法，在高效液相色谱仪上，用反相色谱柱进行分析，以酸水溶液和有机溶剂为流动相，对丙酮醛的样品溶液进行等度洗脱，按外标法计算丙酮醛的含量；本发明所述分析方法稀释剂与丙酮醛衍生物无干扰，该方法专属性良好，系统适应性良好。

Description

一种测定西咪替丁中基因毒性杂质丙酮醛的方法
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及一种测定西咪替丁中基因毒性杂质丙酮醛的方法。
背景技术
丙酮醛(2-0xopropanal)是一种作为西咪替丁的重要中间体4-甲基咪唑的原料，其CAS号为：78-98-8，分子式为C3H4O2，分子量为：72.06，化学结构为：
Figure BDA0002321388320000011
丙酮醛是一种醛类化合物，又称甲基乙二醛，形态为黄色或黄棕色略粘性液体，有辛辣气味，具有吸湿性。用作医药、农药中间体及生化试剂，仅用于研发，不作为药品、家庭或其它用途。
丙酮醛主要作为西咪替丁的重要中间体4-甲基咪唑的合成原料，并可应用于乳酸或乳酸甲酯，适用于止痛药、抗癌、抗高血压药、杀菌抗病毒药物、橡胶制品中的抗氧化剂、化妆品和烟草工业的香料等，作为西咪替丁、乳酸、丙酮酸、止痛药、抗癌、抗高血压药、脱敏剂、化妆品等原料使用。本发明主要旨在提供一种丙酮醛的质量控制方法，用于检测西咪替丁原料药中丙酮醛作为基因毒性杂质的纯度及其含量。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种准确且高效的测定西咪替丁中基因毒性杂质丙酮醛的方法。
技术方案：本发明所述的一种测定西咪替丁中基因毒性杂质丙酮醛的方法，在高效液相色谱仪上，用反相色谱柱进行分析，以酸水溶液和有机溶剂为流动相，对丙酮醛的样品溶液进行等度洗脱，按外标法计算丙酮醛的含量，其中，洗脱如下：
洗脱时间(min) 酸水溶液(％) 有机溶剂(％)
0 100-50 0-50
A 100-50 0-50
其中，0＜A≤10min。
进一步的，所述的洗脱如下；
洗脱时间(min) 酸水溶液(％) 有机溶剂(％)
0 80-60 20-40
A 80-60 20-40
其中，0＜A≤10min。
进一步的，所述的反相色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，粒径为3.5-5μm，使空白溶剂不干扰主峰及杂质检测，杂质与主峰之间分离度符合要求。
进一步的，所述色谱柱长5-25cm，色谱柱直径为2.1-5cm，色谱柱优选为AgilentEclipse XDB-C18(4.6cm*15cm，5μm)。
进一步的，所述的酸水溶液为三氟乙酸水溶液、甲酸水溶液、磷酸水溶液、甲烷磺酸水溶液中的一种或几种，优选为甲酸水溶液；
进一步的，所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、四氢呋喃中的一种或几种。
进一步的，所述酸水溶液的体积浓度为0.01％-90％。
进一步的，所述酸水溶液为体积浓度是0.1％的甲酸水溶液。
进一步的，分析方法优选为：样品配制成西咪替丁30mg/ml，含丙酮醛0.3μg/ml的供试品溶液，按照高效液相色谱法在配有DAD检测器的反相高效液相色谱仪上进行检测，用以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，色谱柱长15cm，色谱柱直径为4.6cm的色谱柱进行分析，所述硅胶粒径为5μm，在以甲酸水为流动相A，以乙腈为流动相B的流动相体系下进行等度洗脱，洗脱如下：
洗脱时间(min) A相(％) B相(％)
0 70 30
10 70 30
检测波长为318nm，柱温30℃，流速为1.0ml/min，取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算丙酮醛的纯度。
具体操作：
丙酮醛作为西咪替丁的一种基因毒性杂质，根据西咪替丁在各类型以及剂型中用法用量的统计：
a.(1)十二指肠溃疡或病理性高分泌状态：每次300mg，每天4次，或800mg睡前一次服用。疗程一般为4～6周。治疗卓-艾综合征时用量可达每天2g。(2)预防溃疡复发：睡前每次服用400mg。(3)反流性食管炎：每天800～1600mg，疗程为4～8周，必要时可延长4周。(4)反流性食管炎的对症治疗：出现烧灼感和(或)有反胃时可服用200mg；最大剂量为每次200mg，每天3次。疗程不得超过2周。
b.肌内注射：每次200mg，每6小时1次。
c.静脉注射：将西咪替丁用葡萄糖注射剂或葡萄糖氯化钠注射剂20ml稀释后缓慢静注(长于5min)，每次200mg，每4～6小时1次。每天剂量不宜超过2g。
d.静脉滴注：将西咪替丁用葡萄糖注射剂或葡萄糖氯化钠注射剂稀释后静脉滴注，每次200～600mg。每天剂量不宜超过2g。
综上可得，西咪替丁最大日剂量不超过2g，服药时间最长为4～12周。本品属于间歇性用药，ICH M7中对短于终生用药情形中基因毒性杂质限量的确定，结果如下：
Figure BDA0002321388320000031
以进药期1-12个月计，丙酮醛日摄入限度为20μg/天。按西咪替丁最大日剂量2g，丙酮醛限度＝20μg/天÷2g/天＝10ppm(0.001％)。
取丙酮醛对照品溶液进行衍生化反应，按不低于基线噪音的10倍响应值确定定量限，定量限浓度为0.09μg/ml；按不低于基线噪音的3倍响应值确定检测限，检测限浓度为0.014μg/ml。
按定量限与限度推算，可以检出限度浓度丙酮醛的供试品浓度约为9mg/ml。根据供试品在稀释剂中的溶解性以及丙酮醛衍生物的响应，将供试品浓度定为30mg/ml(定量限浓度相当于供试品浓度的0.0003％，检测限相当于供试品浓度的0.00005％)。
拟定验证的分析方法:
色谱条件：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6*150mm,5μm)色谱柱或等效柱适用，检测波长为318nm,流速为1.0ml/min，柱温为30℃，进样量为20μl。
流动相：0.1％甲酸水:乙腈＝70:30为流动相
稀释剂：水:乙腈＝70:30
样品制备：
邻苯二胺衍生化试剂用量选择色谱条件，因其衍生化时间太长，故通过提高衍生化试剂的浓度和衍生化温度来加快衍生化速率。在西咪替丁样品中加入一定量的对照品，将邻苯二胺浓度与西咪替丁浓度分别以1:0.5、1:1、1:1.5、1:2四种比例混合，同时在对照品中加入相同梯度的邻苯二胺溶液，60℃水浴加热20min后冷却。结果显示，邻苯二胺与西咪替丁的比例为1:0.5回收率最高，因此暂定邻苯二胺与西咪替丁的比例为1:0.5。试验结果如下表。
Figure BDA0002321388320000032
邻苯二胺储备液：精密称取3g邻苯二胺，至100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为邻苯二胺储备液。
对照溶液：精密称取丙酮醛适量，至10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为丙酮醛母液。精密量取邻苯二胺储备液10ml，丙酮醛母液适量，至20ml容量瓶中，用稀释剂稀释成每ml含丙酮醛0.3μg(这里指纯的丙酮醛)的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液：精密称取西咪替丁600mg，加适量稀释剂溶解，精密量取邻苯二胺储备液10ml，至20ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为供试品溶液。
供试品加样溶液：精密称取西咪替丁约600mg，至20ml量瓶中，加适量稀释剂溶解，精密量取邻苯二胺10ml，丙酮醛母液适量，用稀释剂稀释成每ml含西咪替丁30mg、丙酮醛0.3μg(这里指纯的丙酮醛)的溶液。
操作程序：精密量取对照溶液，供试品溶液和供试品加样溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法计算含量。
对丙酮醛进行方法学验证：
验证项目有专属性，系统适用性，定量限，检测限，溶液稳定性，线性和范围，准确度，重复性，中间精密度和耐用性。
专属性要求：空白应无干扰，供试品溶液中被测物主峰的保留时间应与对照品溶液中主峰的保留时间一致。
系统适用性要求：将对照品溶液连续进样6次，所得被测物峰面积和保留时间的相对标准偏差(RSD％)应不大于1％。
定量限要求：被测物主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。另外，将同一定量限溶液，重复进样6次，被测物主峰保留时间的相对标准偏差(RSD％)应不大于1％，各被测物主峰峰面积的相对标准偏差(RSD％)应不大于10.0％。
检测限要求：主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。
溶液稳定性要求：分别在0h、3h、4h、6h、8h、12h以及24h进样。所得被测物峰面积的相对标准偏差(RSD％)应不大于10.0％，保留时间的相对标准偏差(RSD％)应不大于2.0％；
线性和范围要求：以定量限浓度为起点至少制备5个浓度，R2不得小于0.999，被测物主峰峰面积A与样品浓度间呈现良好的线性关系。
准确度要求：各浓度下的平均回收率应在70％-130％之间，测定结果相对标准偏差应不大于10.0％。
重复性要求：配制6份相同浓度的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试品溶液中被测物测定结果的相对标准偏差(RSD)应不大于10％。
中间精密度要求：换人换仪器于不同天配制6份样品进行试验，与重复性共12份测定结果比较，RSD不得大于20％；
耐用性要求：分别改变色谱条件中的流速、不同检测波长、不同流动相比例、不同柱温以及不同色谱柱，所得被测物结果数据的相对标准偏差(RSD)应不大于50.0％，加样供试品测得结果的相对标准偏差(RSD)应不大于20％。
验证结果：
溶液稳定性要求：对照溶液在24h内保留时间RSD％为0.24％，峰面积RSD％为1.38％；供试品溶液在24h内保留时间RSD％为0.33％，峰面积RSD％为1.84％，符合要求，稳定性良好。
线性和范围要求：丙酮醛溶液在当浓度在0.1136ug/ml～0.5680ug/ml范围内浓度与峰面积成显著线性关系，线性方程：y＝96.331x-0.619，相关系数R2＝0.999。
准确度要求：各浓度下的平均回收率为77.97％，测定结果RSD为2.35％，符合验证要求。
重复性要求所得6份加样供试品溶液中被测物测定结果平均值为0.98％，RSD％为2.69％，符合验证要求。
中间精密度要求：所得12份溶液测定结果平均值为1.01％，RSD为3.79％，符合验证要求。
耐用性要求：不同色谱条件下，供试品中被测物测定结果平均值为0.0001％，RSD％为34.31％；加样供试品测定结果平均值为0.939％，RSD％为14.41％。
有益效果：本发明所述分析方法稀释剂与丙酮醛衍生物无干扰，该方法专属性良好，系统适应性良好，丙酮醛的定量限浓度为0.09μg/ml，丙酮醛的检测限浓度为0.014μg/ml，符合验证要求，丙酮醛溶液当浓度在验证范围内浓度与峰面积成显著线性关系，稳定性良好，丙酮醛回收率符合要求，重复性良好，中间精密度良好，耐用性条件下，不影响对丙酮醛的检测，该方法耐用性符合要求。鉴于目前尚无公开的关于西咪替丁基因毒性杂质丙酮醛的质量控制方法，本发明提供的技术方案，在发明过程中，显示出对丙酮醛作为西咪替丁中基因毒性杂质进行规范检测的优势，故本发明可以为丙酮醛的纯度及其含量的测定提供了一种准确的、高效的检测方法。
附图说明
图1为方法学验证其专属性西咪替丁溶液图谱，其中丙酮醛RT＝4.148min；
图2为方法学验证其系统适应性溶液图谱，其中丙酮醛RT＝4.169min；
图3为方法学验证其定量限图谱，其中丙酮醛RT＝4.163min；
图4为方法学验证其检测限图谱，其中丙酮醛RT＝4.181min；
图5为方法学验证其溶液稳定性西咪替丁溶液24h图谱，其中丙酮醛RT＝4.139min；
图6为方法学验证其线性范围150％浓度图谱，其中丙酮醛RT＝4.156min；
图7为方法学验证其准确度100％回收率图谱，其中丙酮醛RT＝4.170min；
图8为方法学验证其重复性加丙酮醛样品溶液图谱，其中丙酮醛RT＝4.158min；
图9为方法学验证其中间精密度加丙酮醛样品溶液图谱，其中丙酮醛RT＝4.137min；
图10为方法学验证其耐用性加丙酮醛样品溶液调柱温35℃图谱，其中丙酮醛RT＝4.124min。
具体实施方式
为进一步了解本发明的内容，结合附图及实施例对本发明作详细描述。
实施例1
操作程序：精密称取3g邻苯二胺，至100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为邻苯二胺储备液；精密称取丙酮醛适量，至10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为丙酮醛储备液。精密量取邻苯二胺储备液10ml，丙酮醛母液适量，至20ml容量瓶中，用稀释剂稀释成每ml含丙酮醛0.3μg的溶液，作为对照品溶液。精密称取西咪替丁600mg，加适量稀释剂溶解，精密量取邻苯二胺储备液10ml，至20ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为供试品溶液。精密称取西咪替丁约600mg，至20ml量瓶中，加适量稀释剂溶解，精密量取邻苯二胺10ml，丙酮醛1ml，加稀释剂稀释并定容至刻度，混匀，作为供试品加样溶液。
高效液相色谱仪：Agilent 1260-DAD检测器
流动相：A相：0.1％甲酸水溶液
B相：乙腈
洗脱方法如下：
洗脱时间(min) A相(％) B相(％)
0 70 30
10 70 30
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6cm*15cm，5μm)
检测波长：318nm
流速：1.0m1/min
柱温：30℃
进样量：20μl
稀释剂：水：乙腈＝70：30
样品溶液配制：精密称取样品约600mg，置于20ml量瓶中，加初始流动相溶液稀释刻度，摇匀。样品配制成含丙酮醛约0.3μg/ml的供试品溶液。
检测结果：记录色谱图如附图1-10，信息如下表
保留时间/min 峰面积/mAU*S 峰高/mAU 对称因子 峰宽min
图1 4.148 3.42159 4.79E-01 1.14 0.116
图2 4.169 25.88816 3.74225 0.86 0.1067
图3 4.163 8.68444 1.26177 0.83 0.1067
图4 4.181 1.20478 1.76E-01 1.04 0.1067
图5 4.139 3.17889 5.06E-01 0.97 0.1093
图6 4.156 54.08211 8.01319 0.81 0.105
图7 4.17 33.6813 4.96065 0.84 0.108
图8 4.158 28.25396 4.28058 0.85 0.1053
图9 4.137 23.0736 3.387 0.86 0.1067
图10 4.124 29.22406 4.77075 0.9 0.1
按外标法计算丙酮醛的含量为0.0007。
实施例2
操作程序：精密称取3g邻苯二胺，至100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为邻苯二胺储备液；精密称取丙酮醛适量，至10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为丙酮醛储备液。精密量取邻苯二胺储备液10ml，丙酮醛母液适量，至20ml容量瓶中，用稀释剂稀释成每ml含丙酮醛0.3μg的溶液，作为对照品溶液。精密称取西咪替丁600mg，加适量稀释剂溶解，精密量取邻苯二胺储备液10ml，至20ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为供试品溶液。精密称取西咪替丁约600mg，至20ml量瓶中，加适量稀释剂溶解，精密量取邻苯二胺10ml，丙酮醛1ml，加稀释剂稀释并定容至刻度，混匀，作为供试品加样溶液。
高效液相色谱仪：Agilent 1260-DAD检测器
流动相：A相：0.1％甲酸水溶液
B相：乙腈
洗脱方法如下：
洗脱时间(min) A相(％) B相(％)
0 80 20
10 80 20
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(2.1cm*25cm，3.5μm)
检测波长：318nm
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
进样量：20μl
稀释剂：水∶乙腈＝80∶20
样品溶液配制：精密称取样品约600mg，置于20ml量瓶中，加初始流动相溶液稀释刻度，摇匀。样品配制成含丙酮醛约0.3μg/ml的供试品溶液。
利用本实施例中所述高效液相色谱仪进行测试，记录色谱图，按外标法计算丙酮醛的含量。
实施例3
操作程序：精密称取3g邻苯二胺，至100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为邻苯二胺储备液；精密称取丙酮醛适量，至10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为丙酮醛储备液。精密量取邻苯二胺储备液10ml，丙酮醛母液适量，至20ml容量瓶中，用稀释剂稀释成每ml含丙酮醛0.3μg的溶液，作为对照品溶液。精密称取西咪替丁600mg，加适量稀释剂溶解，精密量取邻苯二胺储备液10ml，至20ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为供试品溶液。精密称取西咪替丁约600mg，至20ml量瓶中，加适量稀释剂溶解，精密量取邻苯二胺10ml，丙酮醛1ml，加稀释剂稀释并定容至刻度，混匀，作为供试品加样溶液。
高效液相色谱仪：Agilent 1260-DAD检测器
流动相：A相：0.1％三氟乙酸水溶液
B相：甲醇
洗脱方法如下：
洗脱时间(min) A相(％) B相(%)
0 60 40
10 60 40
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(5*5cm，4μm)
检测波长：318nm
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
进样量：20μl
稀释剂：水∶甲醇＝60∶40
样品溶液配制：精密称取样品约600mg，置于20ml量瓶中，加初始流动相溶液稀释刻度，摇匀。样品配制成含丙酮醛约0.3μg/ml的供试品溶液。
利用本实施例中所述高效液相色谱仪进行测试，记录色谱图，按外标法计算丙酮醛的含量。
实施例4
操作程序：精密称取3g邻苯二胺，至100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为邻苯二胺储备液；精密称取丙酮醛适量，至10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为丙酮醛储备液。精密量取邻苯二胺储备液10ml，丙酮醛母液适量，至20ml容量瓶中，用稀释剂稀释成每ml含丙酮醛0.3μg的溶液，作为对照品溶液。精密称取西咪替丁600mg，加适量稀释剂溶解，精密量取邻苯二胺储备液10ml，至20ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为供试品溶液。精密称取西咪替丁约600mg，至20ml量瓶中，加适量稀释剂溶解，精密量取邻苯二胺10ml，丙酮醛1ml，加稀释剂稀释并定容至刻度，混匀，作为供试品加样溶液。
高效液相色谱仪：Agilent 1260-DAD检测器
流动相：A相：0.01％甲烷磺酸水溶液
B相：异丙醇
洗脱方法如下：
洗脱时间(min) A相(％) B相(％)
0 50 50
1 50 50
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6cm*15cm，5μm)
检测波长：318nm
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
进样量：20μl
稀释剂：水∶异丙醇＝50∶50
样品溶液配制：精密称取样品约600mg，置于20ml量瓶中，加初始流动相溶液稀释刻度，摇匀。样品配制成含丙酮醛约0.3μg/ml的供试品溶液。
利用本实施例中所述高效液相色谱仪进行测试，记录色谱图，按外标法计算丙酮醛的含量。
实施例5
操作程序：精密称取3g邻苯二胺，至100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为邻苯二胺储备液；精密称取丙酮醛适量，至10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为丙酮醛储备液。精密量取邻苯二胺储备液10ml，丙酮醛母液适量，至20ml容量瓶中，用稀释剂稀释成每ml含丙酮醛0.3μg的溶液，作为对照品溶液。精密称取西咪替丁600mg，加适量稀释剂溶解，精密量取邻苯二胺储备液10ml，至20ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为供试品溶液。精密称取西咪替丁约600mg，至20ml量瓶中，加适量稀释剂溶解，精密量取邻苯二胺10ml，丙酮醛1ml，加稀释剂稀释并定容至刻度，混匀，作为供试品加样溶液。
高效液相色谱仪：Agilent 1260-DAD检测器
流动相：A相：90％甲烷磺酸水溶液
B相：50％乙醇
洗脱方法如下：
洗脱时间(min) A相(％) B相(％)
0 100 0
8 100 0
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6cm*15cm，5μm)
检测波长：318nm
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
进样量：20μl
稀释剂：水∶乙醇＝95∶5
样品溶液配制：精密称取样品约600mg，置于20ml量瓶中，加初始流动相溶液稀释刻度，摇匀。样品配制成含丙酮醛约0.3μg/ml的供试品溶液。
利用本实施例中所述高效液相色谱仪进行测试，记录色谱图，按外标法计算丙酮醛的含量。

Claims (7)

1.一种测定西咪替丁中基因毒性杂质丙酮醛的方法，其特征在于，在高效液相色谱仪上，用反相色谱柱进行分析，以酸水溶液和有机溶剂为流动相，对丙酮醛的样品溶液进行等度洗脱，按外标法计算丙酮醛的含量，其中，洗脱如下表：
洗脱时间(min) 酸水溶液(％) 有机溶剂(％) 0 100-50 0-50 立 100-50 0-50
其中，0＜A≤10min。
2.根据权利要求1所述的一种测定西咪替丁中基因毒性杂质丙酮醛的方法，其特征在于，所述的洗脱如下表；
洗脱时间(min) 酸水溶液(％) 有机溶剂(％) 0 80-60 20-40 A 80-60 20-40
其中，0＜A≤10min。
3.根据权利要求1所述的一种测定西咪替丁中基因毒性杂质丙酮醛的方法，其特征在于，所述的反相色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，所述填料粒径为3.5-5μm。
4.根据权利要求3所述的一种测定西咪替丁中基因毒性杂质丙酮醛的方法，其特征在于，所述色谱柱长5-25cm，色谱柱直径为2.1-5cm。
5.根据权利要求1所述的一种测定西咪替丁中基因毒性杂质丙酮醛的方法，其特征在于，所述的酸水溶液为三氟乙酸水溶液、甲酸水溶液、磷酸水溶液和甲烷磺酸水溶液中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的一种测定西咪替丁中基因毒性杂质丙酮醛的方法，其特征在于，所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇和四氢呋喃中的一种或几种。
7.根据权利要求5所述的一种测定西咪替丁中基因毒性杂质丙酮醛的方法，其特征在于，所述酸水溶液的体积浓度为0.01％-90％。
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