CN110974849A - 一种具有降血糖活性的复合海参提取物及制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有降血糖活性的复合海参提取物及制备方法与应用，包括以下步骤：以两种低食用价值干海参为原料，按比例混合后，温水泡发后绞碎，加水酶解，高温酸提，超滤去杂，分级醇沉，沉淀复溶，减压浓缩，最后冷冻干燥，得到一种具有降血糖作用的复合海参提取物。该提取物多糖类物质>30％，硫酸基含量>10％，在动物水平上具有良好的降血糖功效。本发明提取工艺简单，整个工艺流程均可达到食品级要求，可应用于药品、保健品和食品等领域。
Description
技术领域
本发明属于海参深加工、高值化领域，具体涉及一种具有降血糖活性的复合海参提取物及其制备方法与应用。
背景技术
糖尿病是一种与遗传因素和多种环境因素相关的慢性全身代谢性疾病，以2型糖尿病最为复杂，且患病率最高，在我国患病人群中占90％以上。目前，我国约有1.1亿糖尿病患者，是世界上糖尿病患者人数最多的国家。因此，开发具有降血糖活性且无毒副作用的保健食品与药品具有显著的社会经济效益。
海参是海洋中重要的药食两用资源，位列海八珍之首，更是滋补佳品，是开发具有降血糖功效的保健食品及药品的良好资源。世界上大约有1250种海参，其中约20种具有较高的食用价值，其中仿刺参是公认的最有价值的商业海参。我国海参种类主要有北方的刺参和南方的梅花参、茄参等，营养价值较高的是北方刺参，价格较贵，市场占有率也较高，南方海参主要分布于中低端消费市场。据报道，硫酸多糖(岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素)是海参体壁的主要功能成分之一，具有良好的降血糖活性。海参岩藻聚糖硫酸酯是由L-岩藻糖所构成的直链多糖，据报道能够提高2型糖尿病小鼠胰岛素敏感性，促进肝糖原合成，降低血糖水平。海参硫酸软骨素是一种主要由N-乙酰基-D-氨基半乳糖、D-葡萄糖醛酸、L-岩藻糖组成的带岩藻糖支链的分支杂多糖，据报道能够降低2型糖尿病小鼠的血糖水平，抑制胰岛细胞凋亡，促进葡萄糖摄取相关关键基因表达，维持正常的糖代谢。
不同品种海参中硫酸多糖的组成、含量不同，不同海参多糖对机体健康的促进作用及其作用机制不同。因此，从中筛选、制备具有良好降血糖作用的海参多糖对于具有降血糖功效的海参保健食品及药品的开发具有重要的指导意义。目前以仿刺参等价格昂贵的海参品种为原料，从中提取具有降血糖活性多糖的报道较多。然而，原料成本过高是制约海参活性多糖产业化生产的关键因素。世界范围内产量大、口感不佳的低食用价值海参蕴含丰富的活性多糖，是开发降血糖活性多糖的潜在资源，也是实现海参活性多糖商品化的重要突破口，但受关注度低，高值化加工不足，资源利用不充分，开发程度不够。此外，根据不同海参中多糖结构特征，将不同低食用价值海参进行复配，利用现代食品加工技术，实现岩藻聚糖硫酸酯、硫酸软骨素含量高、降血糖活性好的复合海参多糖的高效提取，是突破具有降血糖功效的海参保健食品及药品产业化过程中原料成本高、提取物中多糖含量低且组成单一、提取物降血糖活性不突出等技术瓶颈的新方法。
已有研究(专利CN103110659A，海参硫酸多糖在制备抗Ⅱ型糖尿病药物或制品中的应用)探讨了海参硫酸多糖在改善或治疗2型糖尿病方面的应用，其中海参硫酸软骨素和岩藻聚糖硫酸酯为市售或者分别提取，但存在海参品种不清晰，提取工艺繁琐、耗时长，研究中缺乏对不同结构的海参多糖进行复配等问题。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种具有降血糖活性的复合海参提取物及制备方法与应用。
本发明以低食用价值海参为原料，提供一种具有降血糖活性的复合海参提取物及其制备方法，得到具有良好降血糖活性的复合海参提取物。该提取物通过动物实验验证具有良好的降血糖功效。本发明提取工艺简单、整个工艺流程均可达食品级要求，可应用于药品、保健品和食品等领域当中。
本发明的目的是通过以下技术方案之一实现的。
本发明提供了一种具有降血糖活性的复合海参提取物的制备方法，其包括以下步骤：以两种低食用价值干海参为原料，按比例混合后，温水泡发后绞碎，加水酶解，高温酸提，超滤去杂，分级醇沉，沉淀复溶，减压浓缩，最后冷冻干燥，得到一种具有降血糖作用的复合海参提取物。本发明提供的制备方法中，采用的原材料干海参(干梅花参和干叶瓜参)，这两种海参都是产量大、口感差、食用价值低、市场流通广且售价不超过600元/kg的海参，成本低廉。
本发明提供的具有降血糖活性的复合海参提取物的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)温水泡发：将干海参加入水中，按比例混合，进行浸泡处理，取出，用去离子水清洗，得到泡发后的湿海参；
(2)绞碎：将步骤(1)所述泡发后的湿海参绞碎，得到海参肉糜；
(3)加水酶解：将步骤(2)所述海参肉糜加入去离子水中，搅拌均匀，然后加入蛋白酶，在恒温搅拌的状态下进行酶解处理，得到混悬液；
(4)高温酸提：往步骤(3)所述混悬液中加入去离子水，搅拌均匀，得到混合液，调节所述混合液的pH值为5.2-5.8(优选柠檬酸调节)，然后在搅拌状态下将所述混合液升温进行高温浸提处理，离心取上清液，弃去残渣，得到提取液1；
(5)超滤去杂：采用超滤膜对步骤(4)所述提取液1进行超滤分离，收集大分子截留液，得到提取液2；
(6)分级醇提：往步骤(5)所述提取液2中加入无水乙醇，第一次搅拌处理，得到体系1，进行第一次离心处理，去除沉淀(去除大分子多糖、蛋白质及色素)，得到上清液A；将所述上清液A减压浓缩后，加入无水乙醇，第二次搅拌处理，得到体系2，然后进行第二次离心处理，得到沉淀1；将沉淀1与去离子水混合，升温进行第三次搅拌处理，然后加入无水乙醇，第四次搅拌处理，得到体系3，进行第三次离心处理，得到沉淀2；
(7)沉淀复溶：将沉淀2与去离子水混合，升温进行搅拌处理，得提取液3；
(8)减压浓缩：将提取液3减压浓缩，得提取液4；
(9)冷冻干燥：将提取液4进行冷冻干燥处理，得到所述具有降血糖活性的复合海参提取物。
进一步地，步骤(1)所述海参为干梅花参和干叶瓜参；所述干梅花参和干叶瓜参的质量比为3:2-1:4；所述浸泡处理的温度为50-60℃，浸泡处理的时间为8-10h；所述水的质量为干海参质量的20-30倍；清洗所用的水温为40-50℃，清洗的次数为2-4次。
优选地，步骤(1)所述清洗的时间为浸泡清洗；清洗的时间为20-30min。
进一步地，步骤(3)所述海参肉糜与水的料液比为1:1-1:3g/mL；步骤(3)所述蛋白酶的加入量为步骤(1)所述干海参质量的0.5-2.5％，步骤(3)所述蛋白酶为木瓜蛋白酶；所述酶解处理的温度为52-58℃，酶解处理的时间为3-6h，步骤(3)所述搅拌的速率为120-180r/min。
优选地，步骤(3)所述蛋白酶为木瓜蛋白酶，购自广州裕立宝生物科技公司。
进一步地，步骤(4)所述水的加入量为步骤(2)所述海参肉糜质量的2-4倍；所述调节混合液的pH值，可以使用柠檬酸进行调节，调节后的混合液的pH值为5.2-5.8；所述在搅拌状态下的搅拌速率为120-180r/min；所述高温浸提处理的温度为95-105℃，高温浸提处理的时间为80-120min。
优选地，步骤(4)所述搅拌均匀的搅拌速率为120-180r/min，搅拌均匀的时间为15-30min。
优选地，步骤(4)所述离心的离心力大小为6000-8000g，离心的时间为15-25min。
进一步地，步骤(5)所述超滤膜的截留分子量为10000Da；所述超滤的次数为4-8次，所述大分子截留液的分子量>10000Da；所述提取液2中的固形物含量为5-10wt％。
进一步地，步骤(6)所述无水乙醇为预冷至4-8℃的无水乙醇；所述体系1中的乙醇含量为5-15wt％；所述第一次搅拌处理的速率为60-100r/min，第一次搅拌处理的时间为2-4h；所述第一次离心处理的离心力为6000-8000g，第一次离心处理的时间为10-20min；所述上清液A经过减压浓度后，固形物含量为14-22wt％；所述体系2中的乙醇含量为40-60wt％；所述第二次搅拌处理的速率为60-100r/min，第二次搅拌处理的时间为4-8h；第二次离心处理的离心力为6000-8000g，第二次离心处理的时间为10-20min。
进一步地，步骤(6)所述水的质量为沉淀1质量的3-5倍；所述第三次搅拌处理的温度为40-50℃，第三次搅拌处理的速率为120-180r/min，第三次搅拌处理的时间为30-60min；所述体系3中的乙醇含量为70-80wt％；所述第四次搅拌处理的转速为60-100r/min，第四次搅拌处理的时间为2-4h；第三次离心处理的离心力为6000-8000g，第三次离心处理的时间为10-20min。
进一步地，步骤(7)所述水的质量为沉淀2质量的12-16倍；步骤(7)所述搅拌处理的速率为120-180r/min，步骤(7)所述搅拌处理的时间为30-60min，搅拌处理的温度为40-50℃；步骤(8)所述减压浓缩的温度为50-60℃，步骤(8)所述提取液4中的固形物含量为15-25wt％。
本发明提供一种由上述的制备方法制得的具有降血糖活性的复合海参提取物。
本发明提供的具有降血糖活性的复合海参提取物能够应用在制备降血糖保健食品和药品中。
本发明提供的制备方法，将2种产量大、价格低廉的低食用价值海参(叶瓜参和梅花参)进行复配，有针对性地提取这两种海参中的岩藻聚糖硫酸酯以及硫酸软骨素，实现叶瓜参多糖和梅花参多糖协同增效作用，通过动物实验论证复合海参提取物的体内降血糖活性，实现低值海参的高值化加工，并为具有降血糖功效的海参保健食品及药品产业化生产提供新的思路与方法。该提取物多糖类物质>30％，硫酸基含量>10％，在动物水平上具有良好的降血糖功效。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明的制备方法制备得到一种含海参多糖的具有良好降血糖作用的复合海参提取物；采用酸法提取海参多糖，避免了高温提取过程中糖类物质与肽类物质的美拉德反应，降低了多糖的粘度，提取物颜色浅，分散性及水溶性好，多糖类物质＞30％，硫酸基含量>10％；
(2)本发明提供的制备方法，将活性多糖含量高且结构特征不同的海参原料进行复配，有针对性地提取这两种海参中的岩藻聚糖硫酸酯以及硫酸软骨素，制备方法简单，通过叶瓜参多糖和梅花参多糖协同增效作用，实现海参多糖降血糖活性的提升；
(3)本发明提供的制备方法，选用价格低廉的低值海参来制备海参提取物，大大降低原料成本；采用原料复合手段缩短复合海参多糖提取工艺流程，有利于工业化生产，实现低值海参的高值化利用；
(4)本发明提供的制备方法，整个制备工艺流程均可达食品级要求；
(5)本发明所得复合海参提取物经过糖尿病大鼠动物实验模型验证具有良好的降血糖活性，能够有效地降低高血糖大鼠的血糖水平。
附图说明
图1为海参提取物对2型糖尿病大鼠葡萄糖耐量的影响柱状图；
图2为海参提取物对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗指数的影响柱状图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1
本实施例提供了一种具有降血糖活性的复合海参提取物，其制备方法具体包括如下步骤：
(1)混合干海参：以干梅花参和干叶瓜参为原料，所述干梅花参和干叶瓜参的质量比为3:2；
(2)温水泡发：将步骤(1)所得干海参用温水浸泡，去离子水加入量为干海参质量的20倍，水温为50℃，浸泡时间为8h；清洗海参的去离子水的加入量为干海参质量的20倍，水温为40℃，浸泡洗涤时间为20min，清洗次数为2次，得到湿海参；
(3)绞碎：将步骤(2)所得湿海参绞碎，得到海参肉糜；
(4)加水酶解：将步骤(3)所得海参肉糜与去离子水按料液比为1:1g/mL混合，搅拌均匀，加入木瓜蛋白酶，加入量为干海参质量的0.5％，在52℃下120r/min匀速搅拌，酶解3h，得混悬液A1；
(5)高温酸提：在混悬液A1中加入去离子水，水加入量为步骤(3)所述海参肉糜质量的2倍，在120r/min下搅拌15min；搅拌均匀后加入柠檬酸使混合液pH为5.2，升温至95℃，在120r/min下搅拌提取80min；采用6000g离心15min后，取上清液，得提取液B11；
(6)超滤去杂：采用超滤膜超滤分离提取液B11，超滤膜分子量为10000Da，超滤次数为4次，收集大分子截留液，得固形物含量为5wt％的提取液B12。
(7)分级醇沉：第一步，向提取液B12加入预冷至4℃无水乙醇，使体系中乙醇含量达到5wt％，在60r/min下搅拌2h，采用6000g离心10min，弃去沉淀，将上清液减压浓缩使固形物含量为14wt％，得醇沉液C1；第二步，向醇沉液C1加入预冷至4℃无水乙醇，使体系中乙醇含量达到40wt％，在60r/min下搅拌4h，采用6000g离心10min，收集沉淀D11；第三步，在沉淀D11中加入其质量3倍的去离子水，升温至40℃，在120r/min下搅拌溶解30min，加入预冷至4℃无水乙醇，使体系中乙醇含量达到70wt％，在60r/min下搅拌2h，采用6000g离心10min，收集沉淀D12；
(8)沉淀复溶：将沉淀D12与去离子水混合，去离子水的加入量为沉淀质量的12倍，升温至40℃，在120r/min下搅拌溶解30min，得提取液B13；
(9)减压浓缩：将提取液B13在50℃下减压浓缩，得固形物含量为15wt％的提取液B14；
(10)冷冻干燥：将提取液B14进行冷冻干燥，得到所述具有降血糖活性的复合海参提取物。将实施例1制得的具有降血糖活性的复合海参提取物标记为复合海参提取物1。
实施例2
本实施例提供了一种具有降血糖活性的复合海参提取物，其制备方法具体包括如下步骤：
(1)混合干海参：以干梅花参和干叶瓜参为原料，所述干梅花参和干叶瓜参的质量比为2:3。
(2)温水泡发：将步骤(1)所得干海参用温水浸泡，去离子水加入量为干海参质量的25倍，水温为55℃，浸泡时间为9h；清洗海参的去离子水的加入量为干海参质量的25倍，水温为45℃，浸泡洗涤时间为25min，清洗次数为3次，得到湿海参；
(3)绞碎：将步骤(2)所得湿海参绞碎，得到海参肉糜；
(4)加水酶解：将步骤(3)所得海参肉糜与去离子水按料液比为1:2g/mL混合，搅拌均匀，加入木瓜蛋白酶，加入量为干海参质量的1.5％，55℃下150r/min匀速搅拌，酶解4.5h，得混悬液A2；
(5)高温酸提：在混悬液A2中加入去离子水，水加入量为步骤(3)所述海参肉糜质量的3倍，在150r/min下搅拌25min；搅拌均匀后加入柠檬酸使混合液pH为5.5，升温至100℃，在150r/min下搅拌提取100min；采用7000g离心20min后，取上清液，得提取液B21；
(6)超滤去杂：采用超滤膜超滤分离提取液B21，超滤膜分子量为10000Da，超滤次数为6次，收集大分子截留液，得固形物含量为7wt％的提取液B22。
(7)分级醇沉：第一步，向提取液B22加入预冷至6℃无水乙醇，使体系中乙醇含量达到10wt％，在80r/min下搅拌3h，采用7000g离心15min，弃去沉淀，将上清液减压浓缩使固形物含量为18wt％，得醇沉液C2；第二步，向醇沉液C2加入预冷至6℃无水乙醇，使体系中乙醇含量达到50wt％，在80r/min下搅拌6h，采用7000g离心15min，收集沉淀D21；第三步，在沉淀D21中加入其质量4倍的去离子水，升温至45℃，在150r/min下搅拌溶解45min，加入预冷至6℃无水乙醇，使体系中乙醇含量达到75wt％，在80r/min下搅拌3h，采用7000g离心15min，收集沉淀D22。
(8)沉淀复溶：将沉淀D22与去离子水混合，去离子水的加入量为沉淀质量的14倍，升温至45℃，在150r/min下搅拌溶解45min，得提取液B23。
(9)减压浓缩：将提取液B23在55℃下减压浓缩，得固形物含量为20wt％的提取液B24；
(10)冷冻干燥：将提取液B24进行冷冻干燥，得到所述具有降血糖活性的复合海参提取物。将实施例2制得的具有降血糖活性的复合海参提取物标记为复合海参提取物2。
实施例3
本实施例提供了一种具有降血糖活性的复合海参提取物，其制备方法具体包括如下步骤：
(1)混合干海参：以干梅花参和干叶瓜参为原料，所述干梅花参和干叶瓜参的质量比为1:4。
(2)温水泡发：将步骤(1)所得干海参用温水浸泡，去离子水加入量为干海参质量的30倍，水温为60℃，浸泡时间为10h；清洗海参的去离子水的加入量为干海参质量的30倍，水温为50℃，浸泡洗涤时间为30min，清洗次数为4次，得到湿海参；
(3)绞碎：将步骤(2)所得湿海参绞碎，得到海参肉糜；
(4)加水酶解：将步骤(3)所得海参肉糜与去离子水按料液比为1:3g/mL混合，搅拌均匀，加入木瓜蛋白酶，加入量为干海参质量的2.5％，58℃下180r/min匀速搅拌，酶解6h，得混悬液A3；
(5)高温酸提：在混悬液A3中加入去离子水，水加入量为步骤(3)所述海参肉糜质量的4倍，在180r/min下搅拌30min；搅拌均匀后加入柠檬酸使混合液pH为5.8，升温至105℃，在180r/min下搅拌提取120min；采用8000g离心25min后，取上清液，得提取液B31；
(6)超滤去杂：采用超滤膜超滤分离提取液B31，超滤膜分子量为10000Da，超滤次数为8次，收集大分子截留液，得固形物含量为10wt％的提取液B32。
(7)分级醇沉：第一步，向提取液B32加入预冷至8℃无水乙醇，使体系中乙醇含量达到15wt％，在100r/min下搅拌4h，采用8000g离心20min，弃去沉淀，将上清液减压浓缩使固形物含量为22wt％，得醇沉液C3；第二步，向醇沉液C3加入预冷至8℃无水乙醇，使体系中乙醇含量达到60wt％，在100r/min下搅拌8h，采用8000g离心20min，收集沉淀D31；第三步，在沉淀D31中加入其质量5倍的去离子水，升温至50℃，在180r/min下搅拌溶解60min，加入预冷至8℃无水乙醇，使体系中乙醇含量达到80wt％，在100r/min下搅拌4h，采用8000g离心20min，收集沉淀D32。
(8)沉淀复溶：将沉淀D32与去离子水混合，去离子水的加入量为沉淀质量的16倍，升温至50℃，在180r/min下搅拌溶解60min，得提取液B33。
(9)减压浓缩：将提取液B33在60℃下减压浓缩，得固形物含量为25wt％的提取液B34；
(10)冷冻干燥：将提取液B34进行冷冻干燥，得到所述具有降血糖活性的复合海参提取物。将实施例3制得的具有降血糖活性的复合海参提取物标记为复合海参提取物3。
对比例1
本对比例提供了一种海参提取物，其制备方法具体包括如下步骤：
(1)温水泡发：将干梅花参用温水浸泡，去离子水加入量为干海参质量的25倍，水温为55℃，浸泡时间为9h；清洗海参的去离子水的加入量为干海参质量的25倍，水温为45℃，浸泡洗涤时间为25min，清洗次数为3次。
(2)绞碎：将步骤(1)所得湿海参绞碎，得到海参肉糜；
(3)加水酶解：将步骤(2)所得海参肉糜与去离子水按料液比为1:2g/mL混合，搅拌均匀，加入木瓜蛋白酶，加入量为干海参质量的1.5％，55℃下150r/min匀速搅拌，酶解4.5h，得混悬液A4；
(4)高温酸提：在混悬液A4中加入去离子水，水加入量为步骤(2)所述海参肉糜质量的3倍，在150r/min下搅拌25min；搅拌均匀后加入柠檬酸使混合液pH为5.5，升温至100℃，在150r/min下搅拌提取100min；采用7000g离心20min后，取上清液，得提取液B41；
(5)超滤去杂：采用超滤膜超滤分离提取液B41，超滤膜分子量为10000Da，超滤次数为6次，收集大分子截留液，得固形物含量为7wt％的提取液B42。
(6)分级醇沉：第一步，向提取液B42加入预冷至6℃无水乙醇，使体系中乙醇含量达到10wt％，在80r/min下搅拌3h，采用7000g离心15min，弃去沉淀，将上清液减压浓缩使固形物含量为18wt％，得醇沉液C4；第二步，向醇沉液C4加入预冷至6℃无水乙醇，使体系中乙醇含量达到50wt％，在80r/min下搅拌6h，采用7000g离心15min，收集沉淀D41；第三步，在沉淀D41中加入其质量4倍的去离子水，升温至45℃，在150r/min下搅拌溶解45min，加入预冷至6℃无水乙醇，使体系中乙醇含量达到75wt％，在80r/min下搅拌3h，采用7000g离心15min，收集沉淀D42。
(7)沉淀复溶：将沉淀D42与去离子水混合，去离子水的加入量为沉淀质量的14倍，升温至45℃，在150r/min下搅拌溶解45min，得提取液B43。
(8)减压浓缩：将提取液B43在55℃下减压浓缩，得固形物含量为20wt％的提取液B44；
(9)冷冻干燥：将提取液B44进行冷冻干燥，得到所述海参提取物。将对比例1制得的海参提取物标记为海参提取物4。
对比例2
本对比例提供了一种海参提取物，其制备方法具体包括如下步骤：
(1)温水泡发：将干叶瓜参用温水浸泡，去离子水加入量为干海参质量的25倍，水温为55℃，浸泡时间为9h；清洗海参的去离子水的加入量为干海参质量的25倍，水温为45℃，浸泡洗涤时间为25min，清洗次数为3次。
(2)绞碎：将步骤(1)所得湿海参绞碎，得到海参肉糜；
(3)加水酶解：将步骤(2)所得海参肉糜与去离子水按料液比为1:2g/mL混合，搅拌均匀，加入木瓜蛋白酶，加入量为干海参质量的1.5％，55℃下150r/min匀速搅拌，酶解4.5h，得混悬液A5；
(4)高温酸提：在混悬液A5中加入去离子水，水加入量为步骤(2)所述海参肉糜质量的3倍，在150r/min下搅拌25min；搅拌均匀后加入柠檬酸使混合液pH为5.5，升温至100℃，在150r/min下搅拌提取100min；采用7000g离心20min后，取上清液，得提取液B51；
(5)超滤去杂：采用超滤膜超滤分离提取液B51，超滤膜分子量为10000Da，超滤次数为6次，收集大分子截留液，得固形物含量为7wt％的提取液B52。
(6)分级醇沉：第一步，向提取液B52加入预冷至6℃无水乙醇，使体系中乙醇含量达到10wt％，在80r/min下搅拌3h，采用7000g离心15min，弃去沉淀，将上清液减压浓缩使固形物含量为18wt％，得醇沉液C5；第二步，向醇沉液C5加入预冷至6℃无水乙醇，使体系中乙醇含量达到50wt％，在80r/min下搅拌6h，采用7000g离心15min，收集沉淀D51；第三步，在沉淀D51中加入其质量4倍的去离子水，升温至45℃，在150r/min下搅拌溶解45min，加入预冷至6℃无水乙醇，使体系中乙醇含量达到75wt％，在80r/min下搅拌3h，采用7000g离心15min，收集沉淀D52。
(7)沉淀复溶：将沉淀D52与去离子水混合，去离子水的加入量为沉淀质量的14倍，升温至45℃，在150r/min下搅拌溶解45min，得提取液B53。
(8)减压浓缩：将提取液B53在55℃下减压浓缩，得固形物含量为20wt％的提取液B54；
(9)冷冻干燥：将提取液B54进行冷冻干燥，得到所述海参提取物。将对比例2制得的海参提取物标记为海参提取物5。
海参提取物组成分析
表1为海参提取物的总糖含量、硫酸基含量及单糖组成数据表。由表1可知，复合海参提取物1-3和海参提取物4-5的多糖含量均>30％，硫酸基含量均>10％。由单糖组成分析可知，复合海参提取物1-3和海参提取物4-5中多糖均由6种单糖组成，其中含量最高的是岩藻糖，岩藻糖是岩藻聚糖硫酸酯和海参硫酸软骨素的重要组成成分。海参提取物4中岩藻糖含量高达80.77％，说明其主要含有岩藻聚糖硫酸酯；海参提取物5中，岩藻糖和葡萄糖含量略高于其他单糖，各单糖含量相对接近，说明其主要含有硫酸软骨素。复合海参提取物1-3富含岩藻聚糖硫酸酯和海参硫酸软骨素。
表1
利用2型糖尿病大鼠模型研究海参提取物体内降血糖功效
(1)实验动物：雄性SD大鼠，21d龄，100～110g，购于广东省医学实验动物中心。
(2)动物饲养环境：室温25±1℃，相对湿度55±15％，每日光照黑暗各12小时，饮用水采用反渗透紫外灭菌水。
(3)动物实验：适应性饲养7天结束后，随机分为8组(每组12只大鼠)：正常组、模型组、二甲双胍组、复合海参提取物1组(200mg/kg)、复合海参提取物2组(200mg/kg)、复合海参提取物3组(200mg/kg)、海参提取物4组(200mg/kg)、海参提取物5组(200mg/kg)。模型组、二甲双胍组、海参提取物组连续12周以高脂饲料喂养，在第5周时腹腔注射低剂量链脲佐菌素(25mg/kg,3天)进行造模。正常组连续12周以正常饲料喂养，第5周腹腔注射等量生理盐水。造模后连续8周，海参提取物/二甲双胍组大鼠每日口服相应剂量的海参提取物/二甲双胍。模型组大鼠造模后连续8周口服生理盐水。在造模后第0周、4周、8周时，禁食12小时后，尾静脉采集血液，用血糖仪和血糖试纸按制造商(欧姆龙)说明测量空腹血糖浓度。在造模后第7周时，禁食12小时后，灌胃葡萄糖溶液(1.5g/kg)，用血糖仪和血糖试纸测定口服葡萄糖后0、30、60、90、120和180min时的血糖值，评价大鼠的葡萄糖耐受能力。在造模后8周时，禁食12小时后，腹主动脉采血，采用ELISA试剂盒(南京建成)测定血清胰岛素水平，计算胰岛素抵抗指数。
动物实验结果分析
二甲双胍主要通过减少肝葡萄糖输出和改善外周胰岛素抵抗而降低血糖，具有良好的单药及联合治疗疗效和安全性，是2型糖尿病患者控制高血糖的一线、全程和基本用药。
表2为海参提取物对2型糖尿病大鼠空腹血糖水平的影响数据表。由表2可知，在造模后，模型组、二甲双胍组和5个海参提取物组的大鼠空腹血糖水平要显著高于正常组(n＝12，p＜0.05)，且这七组的空腹血糖水平无显著性差异(n＝12，p＞0.05)。在造模后4周时，相比于模型组，二甲双胍组和复合海参提取物1、2、3组的空腹血糖水平明显下降，海参提取物4、5组的空腹血糖水平均呈现下降趋势，但血糖水平相较于模型组无显著性差异。说明短期干预时，复合海参提取物以及二甲双胍能有效调控2型糖尿病大鼠血糖水平，相较于单一海参提取物，在调控血糖方面具有更大的优势和效果。
在造模后8周时，二甲双胍组和5个海参提取物组的空腹血糖水平均显著低于模型组(n＝12，p＜0.05)，说明海参提取物能显著降低高血糖大鼠空腹血糖水平，具有良好的降血糖活性。在造模后8周时，海参提取物4组的空腹血糖水平与二甲双胍组没有显著差异，复合海参提取物1、2、3组和海参提取物5组空腹血糖水平显著低于二甲双胍组，说明复合海参提取物比二甲双胍的降血糖活性更好。此外，相比于海参提取物4、5，复合海参提取物1、2、3能够更显著的降低空腹血糖水平，说明长期干预时，复合海参提取物相对于单一海参提取物具有更好的降血糖活性，叶瓜参多糖和梅花参多糖具有协同增效的作用。
表2
不同字母表示同一时期组间具有显著性差异p＜0.05，相同字母表示组间没有显著性差异p＞0.05
葡萄糖耐受性实验是目前公认的诊断糖尿病的标准之一，葡萄糖耐量是反映短时期内血糖值变化的良好指标，以葡萄糖曲线下面积(AUCOGTT)表示，AUCOGTT越大，表明个体对葡萄糖的耐受能力越小。由图1可知，相比于正常组，模型组大鼠葡萄糖耐受能力显著降低(n＝12，p＜0.05)。与模型组相比，二甲双胍组和5个海参提取物组的大鼠葡萄糖耐受能力显著提高，说明长期干预时，二甲双胍、5个海参提取物均能改善2型糖尿病大鼠葡萄糖耐受能力，有效改善2型糖尿病。与二甲双胍组相比，海参提取物4、5组大鼠的葡萄糖耐受能力没有显著差异；复合海参提取物1、2、3组大鼠的葡萄糖耐受能力显著高于二甲双胍组。此外，相比于海参提取物4、5，复合海参提取物1、2、3能够更显著的提高2型糖尿病大鼠葡萄糖耐受能力；复合海参提取物相对于单一海参提取物具有更好改善2型糖尿病大鼠葡萄糖耐受能力的作用，叶瓜参多糖和梅花参多糖具有协同增效的作用。
胰岛素抵抗是2型糖尿病的病理生理基础，是指器官、组织或细胞对胰岛素的敏感性或反应性降低，胰岛素不能发挥正常作用，葡萄糖摄取和利用的效率降低。二甲双胍是提高胰岛素的敏感性而增加外周葡萄糖的利用，改善胰岛素抵抗的一线口服降糖药。
由图2可知，造模后8周，模型组的大鼠胰岛素抵抗指数显著高于正常组(n＝12，p＜0.05)，说明出现了胰岛素抵抗。相比于模型组，二甲双胍组的大鼠胰岛素抵抗指数出现降低但效果不显著，海参提取物5组的胰岛素指数没有降低，复合海参提取物1、2、3组及海参提取物4组的大鼠胰岛素抵抗指数显著降低。相比于二甲双胍组，海参提取物4组的大鼠胰岛素抵抗指数出现降低，但无显著差异。复合海参提取物1、2、3组的大鼠胰岛素抵抗指数显著低于二甲双胍组，说明复合海参提取物比二甲双胍以及单一海参提取物，具有更好的改善胰岛素抵抗的功效，叶瓜参多糖和梅花参多糖具有协同增效的作用。
从空腹血糖水平、葡萄糖耐量水平和胰岛素抵抗指数可以看出，复合海参提取物具有良好的降血糖活性、提高葡萄糖耐受性以及改善胰岛素抵抗的作用。相比于海参提取物4、5，复合海参提取物1、2、3组体现出更好的改善2型糖尿病的功效，说明两种不同结构特征的海参多糖经过复配后，出现了协同增效的作用。
采用本技术利用叶瓜参多糖和梅花参多糖协同增效作用，实现海参多糖降血糖活性的提升，制备良好降血糖活性的复合海参提取物，在降低原料成本的前提下，采用原料复合手段缩短复合海参多糖提取工艺流程，有利于工业化生产，实现低值海参的高值化利用。本发明实施例可见，整个制备工艺流程简单、各环节均可达食品级要求，制备成本低。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种具有降血糖活性的复合海参提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)温水泡发：将干海参加入水中，进行浸泡处理，取出，用水清洗，得到泡发后的湿海参；
(2)绞碎：将步骤(1)所述泡发后的湿海参绞碎，得到海参肉糜；
(3)加水酶解：将步骤(2)所述海参肉糜加入水中，搅拌均匀，然后加入蛋白酶，在恒温搅拌的状态下进行酶解处理，得到混悬液；
(4)高温酸提：往步骤(3)所述混悬液中加入水，搅拌均匀，得到混合液，调节所述混合液的pH值为5.2-5.8，然后在搅拌状态下将所述混合液升温进行高温浸提处理，离心取上清液，弃去残渣，得到提取液1；
(5)超滤去杂：采用超滤膜对步骤(4)所述提取液1进行超滤分离，收集大分子截留液，得到提取液2；
(6)分级醇提：往步骤(5)所述提取液2中加入无水乙醇，第一次搅拌处理，得到体系1，进行第一次离心处理，去除沉淀，得到上清液A；将所述上清液A减压浓缩后，加入无水乙醇，第二次搅拌处理，得到体系2，然后进行第二次离心处理，得到沉淀1；将沉淀1与水混合，升温进行第三次搅拌处理，然后加入无水乙醇，第四次搅拌处理，得到体系3，进行第三次离心处理，得到沉淀2；
(7)沉淀复溶：将沉淀2与水混合，升温进行搅拌处理，得提取液3；
(8)减压浓缩：将提取液3减压浓缩，得提取液4；
(9)冷冻干燥：将提取液4进行冷冻干燥处理，得到所述具有降血糖活性的复合海参提取物。
2.根据权利要求1所述的具有降血糖活性的复合海参提取物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述海参为干梅花参和干叶瓜参；所述干梅花参和干叶瓜参的质量比为3:2-1:4；所述浸泡处理的温度为50-60℃，浸泡处理的时间为8-10h；所述水的质量为干海参质量的20-30倍；清洗所用的水温为40-50℃，清洗的次数为2-4次。
3.根据权利要求1所述的具有降血糖活性的复合海参提取物的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述海参肉糜与水的料液比为1:1-1:3g/mL；步骤(3)所述蛋白酶的加入量为步骤(1)所述干海参质量的0.5-2.5％，步骤(3)所述蛋白酶为木瓜蛋白酶；所述酶解处理的温度为52-58℃，酶解处理的时间为3-6h，步骤(3)所述搅拌的速率为120-180r/min。
4.根据权利要求1所述的具有降血糖活性的复合海参提取物的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述水的加入量为步骤(2)所述海参肉糜质量的2-4倍；所述调节混合液的pH值，可以使用柠檬酸进行调节；所述在搅拌状态下的搅拌速率为120-180r/min；所述高温浸提处理的温度为95-105℃，高温浸提处理的时间为80-120min。
5.根据权利要求1所述的具有降血糖活性的复合海参提取物的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述超滤膜的截留分子量为10000Da；所述超滤的次数为4-8次，所述大分子截留液的分子量>10000Da；所述提取液2中的固形物含量为5-10wt％。
6.根据权利要求1所述的具有降血糖活性的复合海参提取物的制备方法，其特征在于，步骤(6)所述无水乙醇为预冷至4-8℃的无水乙醇；所述体系1中的乙醇含量为5-15wt％；所述第一次搅拌处理的速率为60-100r/min，第一次搅拌处理的时间为2-4h；所述第一次离心处理的离心力为6000-8000g，第一次离心处理的时间为10-20min；所述上清液A经过减压浓度后，固形物含量为14-22wt％；所述体系2中的乙醇含量为40-60wt％；所述第二次搅拌处理的速率为60-100r/min，第二次搅拌处理的时间为4-8h；第二次离心处理的离心力为6000-8000g，第二次离心处理的时间为10-20min。
7.根据权利要求1所述的具有降血糖活性的复合海参提取物的制备方法，其特征在于，步骤(6)所述水的质量为沉淀1质量的3-5倍；所述第三次搅拌处理的温度为40-50℃，第三次搅拌处理的速率为120-180r/min，第三次搅拌处理的时间为30-60min；所述体系3中的乙醇含量为70-80wt％；所述第四次搅拌处理的转速为60-100r/min，第四次搅拌处理的时间为2-4h；第三次离心处理的离心力为6000-8000g，第三次离心处理的时间为10-20min。
8.根据权利要求1所述的具有降血糖活性的复合海参提取物的制备方法，其特征在于，步骤(7)所述水的质量为沉淀2质量的12-16倍；步骤(7)所述搅拌处理的速率为120-180r/min，步骤(7)所述搅拌处理的时间为30-60min，搅拌处理的温度为40-50℃；步骤(8)所述减压浓缩的温度为50-60℃，步骤(8)所述提取液4中的固形物含量为15-25wt％。
9.一种由权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的具有降血糖活性的复合海参提取物。
10.权利要求9所述的具有降血糖活性的复合海参提取物在制备降血糖保健食品和药品中的应用。
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