CN110951833A - 一种同时检测多种喷施雾滴飘失或沉积检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种同时检测多种喷施雾滴飘失或沉积检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种同时检测多种喷施雾滴飘失或沉积特性试剂盒及检测方法，本发明的检测试剂盒含有固化有固定探针的检测膜、能够与固定探针特异结合的过渡探针、能够与过渡探针特异结合且生物素标记的显色探针。将过渡探针加到喷施液中作为示踪剂，喷施后过渡探针与检测膜上的固定探针特异性结合；将带有生物素标记的显色探针通过杂交技术结合在过渡探针上，经过显色处理后，根据颜色深浅测定雾滴量，根据显色点的位置和大小确定雾滴沉积参数。本发明方法能够利用特征序列的脱氧核糖核酸结合的特异性，通过在不同的喷施液里添加不同的过渡探针示踪剂，一次性检测多个不同喷施液的雾滴特性，从而实现对农业复杂喷施情况的一次性检测。

Description

一种同时检测多种喷施雾滴飘失或沉积检测试剂盒及检测 方法
技术领域
发明涉及农业喷施雾滴检测技术领域，具体地，涉及针对多种农药、肥料、水等喷施雾滴沉积定性和定量同时检测，开发的反向斑点杂交技术试剂盒以及检测方法。
背景技术
如何利用最少的耕地面积去生产更多优质的作物是农业发展过程中一直存在的问题，尤其是在耕地面积逐渐减少的今天。根据统计，仅仅从2015到2016年一年的时间，全国耕地面积净减少115.3 万亩。为了保证农产品稳产增收，合理的浇水、施肥和施药是现代农业中最为重要的环节。“植保一体化”是现在农业中最新提出的种植方案之一，其是指在整个作物的种植栽培过程中，从种子的选育、萌发，再到后期的浇水、施肥、施药，最后的采摘都采用合理的、程序化的、可监控的方式进行，从而优质农产品生产。如何通过简单高效的方法同时地监控浇水、施肥、施药等复杂的过程，对种植有着指导意义；而以上所述的三个过程，多数是通过农用植保机械喷洒雾滴的方式进行，那么对于雾滴的粒径大小、分布情况、飘失/ 沉积量的监控测定方法有很高的要求。常用的雾滴检测方式主要包括直接测定法、示踪剂法和雾滴直接观测法三类。
其中，直接观测法是指在经过喷施过程后，对样品进行采集，然后通过萃取、净化、浓缩等一系列步骤后，通过HPLC-MS、GC-MS 等器对样品上的原药量检测，从而计算出沉积量。虽然该方法精度高，并且可以一次性检测多个原药，但是对于某些无机的肥料却无法用该方式检测，另外，该方法也只能用于沉积量的检测，却无法给出雾滴的粒径、分布情况等信息。
示踪剂法就是在喷施液中加入示踪剂，在喷施结束后，对样品进行回收，通过仪器分析测定靶标上的示踪物含量，推算出靶标上的农药沉积量。常用的示踪剂包括柠檬黄、诱惑红等水溶性染料以及Brilliant sulphoflavine(BSF)、Pyranin等荧光示踪剂，该方法测试快速，费用低，对药品保存要求不高，是目前农药沉积检测的常用方法之一，但该方法检测准确性受到示踪剂性质的影响，精准度差，且由于示踪剂为有色染料，喷施过程中易对农作物和检测人员造成颜色污染。与此同时，由于以上的示踪剂没有特异性检测方法，识别度低，无法实现同时检测多个不同的喷施液或是混合液。
雾滴直接观测法是通过水敏纸、油敏纸、卡罗米特纸卡等接收沉积雾滴，通过图像处理的方法观测在沉积区域中的雾滴的粒径、分布情况等信息；或者在利用激光粒径仪等直接观测仪器对雾滴性质进行直接观测。其中，水敏纸测试法是目前行业中应用较多的检测喷雾方法之一，该方法能够在现场直观观测雾滴沉积分布状态，但水敏纸遇水变色，易受环境影响，雨天或空气湿度很大的情况下不能使用，且无法对雾滴进行定量分析。该方法是检测喷施的分散液(水或油)，没有特异性，同样无法实现多个不同样品的同时检测。
通过上述三种方法不难看出，在现有的方法中没有任何一种方法可以即可以得到雾滴的粒径、分散情况等信息的同时，又可以准确定量飘失/沉积量，同时还能实现多种样本同时检测。
反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是常用的DNA检测技术，是指利用DNA序列特异性结合的特点，将目标待测DNA的互补链固定在基底材料上，与提取并扩增后的DNA待测样本作用，捕获扩增后带有生物素标记的待测DNA从而实现对待测物检测。反向斑点杂交在现有的应用中主要检测的是天然核酸短链，而人工设计合成的特征序列的单链脱氧核糖核酸却并未被使用在该技术中。在田间喷施检测过程中，由于田间环境的复杂性，天然的核酸短链可能出现干扰，导致检测中出现假阳性或假阴性的情况，并且会影响定量的测定，并不能够适用于田间喷施检测。
发明内容
本发明的目的在于利用反向斑点杂交技术开发一种可用于同时检测多种农业喷施雾滴沉积特性的试剂盒，从而同时实现快速、准确性高、易于操作、成本低廉、并且同时对多个待测药液雾滴分布特性检测。
本发明首先提供一种可用于同时检测多种喷施雾滴沉积量的方法，如图1所示，整个流程可以分为制膜、喷施液配制、喷施、标准曲线建立、显色等5个流程。具体流程如下：利用不同特征序列的单链脱氧核糖核酸结合具有的特异性，设计出一系列不同特征序列的单链脱氧核糖核酸作为固定探针固定在基底材料上制成不同的靶标膜。接着，将对应的不同特征序列的单链脱氧核糖核酸作为示踪剂加入到不同的喷施液中去，在喷施后，回收基底材料，通过放大信号显色后，得到不同的喷施液的雾滴粒径、雾滴分布等信息。最后通过计算机图像处理软件处理即可计算出对应的沉积量。
具体地，本发明提供的一种同时检测多种喷施雾滴飘失或沉积量的方法，包括以下步骤：
(1)将不同的过渡探针分别加到多种喷施液中作为示踪剂，每种喷施液中只加一种过渡探针；
(2)喷施后，喷施液中的过渡探针能与检测膜上的所对应的固定探针特异性结合，所述检测膜为固定有固定探针的基底材料；
(3)将带有生物素标记的显色探针通过杂交技术结合在对应的过渡探针上，显色处理后，根据颜色深浅测定雾滴量，根据显色点的位置和大小确定多种雾滴飘失或沉积量。
所述过渡探针不经生物素修饰，具有能够分别与其对应的固定探针和显色探针互补配对的核苷酸序列，并且固定探针与显色探针不特异结合，不同的过渡探针之间不特异结合。
所述过渡探针和固定探针均为特征序列的单链脱氧核糖核酸；其中过渡探针的长度为24-50nt，固定探针的长度为12-25nt，固定探针的一端为氨基修饰，另一端与基底材料的羧基裸露端共价结合。
本发明的方法中，显色探针与过渡探针的互补配对碱基为15-40 nt；若固定探针是5’标记，则显色探针为3’生物素标记，若固定探针是3’标记，则显色探针为5’生物素标记。
本发明的方法中，固定探针的长度优选为18-20nt，过渡探针与固定探针的互补配对碱基优选为15-25nt。
步骤(2)中，主要用到试剂为：0.1-0.3M(优选为0.1M)的 HCl溶液，10-20％(优选为15％)EDC溶液(1-(3-二甲基氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺)，0.025-0.2μM(优选为0.03μM)固定探针溶液，0.3-1.0 M(优选为0.5M)的NaHCO3溶液，0.05-0.5M(优选为0.2M)的 NaOH溶液。
步骤(2)所述检测膜，是通过以下方式制备得到的：根据需要的大小裁剪基底材料，0.1-0.3M的HCl处理后清洗；加入10-20％的EDC溶液浸泡后再清洗；加入含有0.025-0.2μM固定探针的0.3-1.0 M NaHCO3溶液中浸泡处理；再加入NaOH溶液浸泡膜，清洗，晾干即得。
优选地，所述检测膜是通过以下方式制备得到的：根据需要的大小裁剪基底材料，0.1M的HCl处理后清洗；加入15％EDC浸泡 0.5-1h后再清洗；加入含有0.03μM固定探针的0.5M NaHCO3溶液中浸泡10-20min；再加入0.05-0.5M的NaOH溶液浸泡膜5-15min，清洗，晾干即得。
所述基底材料为硝酸纤维素膜、尼龙膜、羧基化改性的有机玻璃或羧基化改性的聚丙烯塑料薄膜。
步骤(2)的喷施液为农药制剂、液体肥料、其他液体制剂或水。喷施液配方为：在喷施液配制流程中，喷施液中主要含有：0-60％的农药制剂或液体肥料(也可直接使用水)，0.025-0.1μM(优选为0.60 μM)的过渡探针，0-0.045mol/L的离子缓冲液，0-0.15％的表面活性剂(若是使用农药或肥料制剂，由于本身含有表面活性剂和离子缓冲液，直接添加过渡探针即可；若是直接用水作为喷施液，则需添加一定量的离子缓冲液和表面活性剂)，主要剂型为水基制剂和油基制剂。
所述的农药剂型包括水剂、油剂、可湿性粉剂、微胶囊剂、水悬浮剂、油悬浮剂等；其中农药类型包括杀虫剂、杀菌剂、除草剂、杀螨剂、杀线虫剂等。
所述的液体肥料包括清液型、悬浮型、叶面肥料等；其中肥料类型为氮肥、磷肥、钾肥中的一种或者两种、多种复合肥料。
所述的过渡探针为24-50nt(优选为36-40nt)的特征序列的单链脱氧核糖核酸。
所述的离子缓冲液是一种或多种无机盐、有机盐配成的缓冲溶液，其中溶液阴离子为碳酸根、碳酸氢根、磷酸根、磷酸氢根、磷酸二氢根、柠檬酸根、柠檬酸二氢根等的一种或几种，阳离子为钾离子、钠离子、锂离子、钙离子等的一种或几种。
所述的表面活性剂是烷基磺酸钠、拉开粉、茶枯粉、皂角粉、 SDS(十二烷基硫酸钠)、Morwet EFW(丁基萘磺酸钠)、Morwet 1004 等的一种或几种。
本发明方法的步骤(3)中，使用的试剂有：杂交液、洗液、0.05-0.20 μM(0.20μM)显色探针溶液、过氧化氢酶液、TMB单组分液。
所述的杂交液主要成分为0.02-0.045mol/L的离子缓冲液， 0.06-0.15％的表面活性剂。
所述的洗液主要成分为5.0-10.0mol/L的离子缓冲液，0.02-0.20％的表面活性剂。
所述的离子缓冲液是一种或多种无机盐、有机盐配成的缓冲溶液，其中溶液阴离子为碳酸根、碳酸氢根、磷酸根、磷酸氢根、磷酸二氢根、柠檬酸根、柠檬酸二氢根等的一种或几种，阳离子为钾离子、钠离子、锂离子、钙离子等的一种或几种。
所述的表面活性剂是烷基磺酸钠、拉开粉、茶枯粉、皂角粉、 SDS(十二烷基硫酸钠)、Morwet EFW(丁基萘磺酸钠)、Morwet 1004 等的一种或几种。
所述的显色探针为12-25nt(优选为18-20nt)的特征序列的单链脱氧核糖核酸。
所述的TMB单组分液的主要成分为：0.5-2.0mM(优选为1.0 mM)TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)，0.5-2.0mM(优选为1.0mM)氧化剂，150-300mM(优选为200mM)离子缓冲液，0.1-0.5mM稳定剂。具体配置如下：a液：称取TMB和稳定剂，加入DMSO将其溶解；B液：用去离子水溶解配成离子缓冲液，加入氧化剂后,用盐酸调节pH至4.0-6.0。配置好后，使用前按一定比例将a、b两液配制得到TMB单组分液。
所述的氧化剂是过氧化氢、尿素过氧化氢、过氧乙酸、叔丁基过氧化氢、二甲基二氧杂环丙烷等一种或几种。
所述的离子缓冲液是一种或多种无机盐、有机盐配成的缓冲溶液，其中溶液阴离子为碳酸根、碳酸氢根、磷酸根、磷酸氢根、磷酸二氢根、柠檬酸根、柠檬酸二氢根等的一种或几种，阳离子为钾离子、钠离子、锂离子、钙离子等的一种或几种。
所述的稳定剂是硼氢化钠、氰基硼氢化钠、四丁基硼氢化铵 (TBABH)、三仲丁基硼氢化锂、硼氢化锂等的一种或几种。
本发明的实施例中，同时检测多种喷施雾滴飘失或沉积量的方法具体流程如下：
1)、制备检测膜：根据需要的大小裁剪羧基化改性的尼龙膜， 0.1M的HCl处理后清洗；加入15％EDC浸泡0.5-1h后再清洗；加入含有0.03μM固定探针的0.5M NaHCO3溶液中浸泡10-20min；再加入0.05-0.5M的NaOH溶液浸泡膜5-15min，清洗，晾干即得。
2)、喷施流程：喷施液配制，在药箱中加入农药制剂、液体肥料或者水，然后加入0.025-0.1μM过渡探针，最后根据农药制剂或喷施设备需要，加入0-0.15％表面活性剂和0-0.045mol/L离子缓冲液配制成过渡探针喷施液。在待喷施的靶标作物上布好含有不同固定探针的检测膜，经过喷施后，分别回收检测膜后，待显色。
3)、显色流程：喷施有过渡探针喷施液的检测膜在杂交液中， 30-40℃孵育25-40min，加入50ml杂交液预处理2min；加入含有显色探针的杂交液中30-40℃条件下反应5-15min；加入50ml洗液清洗检测膜3次；杂交液冲洗2min；取15uL过氧化氢酶液加入到杂交液中配置酶液，37℃酶联反应15-20min；杂交液冲洗后，加入TMB单组分液进行显色反应，TMB单组分显色液会被检测膜上结合的辣根过氧化氢酶催化显色，从而在检测膜上显色。3min后清水冲洗，终止反应，将膜晾干。通过显色可以直接观测到雾滴覆盖密度、雾滴粒径大小等信息。最后利用拍照或扫描得到图片文件，通过图像处理软件(例如：Photoshop、Image J等)获取单位面积的灰度值，并计算选取面积下的总灰度值。通过标准曲线换算出沉积量。
4)标准曲线建立：选5张含有固定探针的检测膜，用移液枪吸取0.5μL的过渡探针喷施液，依次分别在5张检测膜上点1-5个点， 5张检测膜片上探针溶液体积分别为0.5μL，1.0μL，1.5μL，2.0μL， 2.5μL。另取一张检测膜，作为背景。利用拍照或扫描得到图片文件，最后通过图像处理软件(例如：Photoshop、Image J等)获取单位面积的灰度值，并计算选取面积下的总灰度值。最后以药液体积作为横坐标，总灰度值作为纵坐标，绘制标准曲线，并计算出相应的线性方程。
基于本发明的检测方法，本发明还提供一种能够同时检测多种喷施雾滴飘失或沉积量的试剂盒，含有检测膜，过渡探针、显色探针；且检测膜，过渡探针、显色探针的数量均≥2，且均不相同；
所述检测膜为固定有固定探针的基底材料，固定探针长度为 12-25nt，其一端加氨基修饰，另一端与基底材料的羧基裸露端共价结合，所述基底材料为羧基裸露的材料；
所述过渡探针的长度为24-50nt；所述显色探针3’或5’端标记生物素，且显色探针能够与过渡探针特异结合，不能与固定探针特异结合。
所述的显色探针的长度为12-25nt。
所述的辣根过氧化物酶溶液。
所述的TMB单组分液的主要成分为：0.5-2.0mM(优选为1.0 mM)TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)，0.5-2.0mM(优选为1.0mM)氧化剂，150-300mM(优选为200mM)离子缓冲液，0.1-0.5mM稳定剂。具体配置如下：a液：称取TMB和稳定剂，加入DMSO将其溶解；B液：用去离子水溶解配成离子缓冲液，加入氧化剂后,用盐酸调节pH至4.0-6.0。配置好后，使用前按一定比例将a、b两液配制得到TMB单组分液。
所述的氧化剂是过氧化氢、尿素过氧化氢、过氧乙酸、叔丁基过氧化氢、二甲基二氧杂环丙烷等一种或几种。
所述的离子缓冲液是一种或多种无机盐、有机盐配成的缓冲溶液，其中溶液阴离子为碳酸根、碳酸氢根、磷酸根、磷酸氢根、磷酸二氢根、柠檬酸根、柠檬酸二氢根等的一种或几种，阳离子为钾离子、钠离子、锂离子、钙离子等的一种或几种。
所述的稳定剂是硼氢化钠、氰基硼氢化钠、四丁基硼氢化铵(TBABH)、三仲丁基硼氢化锂、硼氢化锂等的一种或几种。
本发明方法克服了现有的喷施雾滴检测方法中无法实验同时对多个喷施液喷施情况进行检测的局限性。利用不同特征序列的单链脱氧核糖核酸结合的特异性，当含有不同的过渡探针喷施液雾滴作用检测膜上时，仅仅会和其对应的互补的固定探针的相结合，而不会同其他的检测膜结合。接着我们利用不同的显色探针对不同的检测膜进行显色检测后，通过计算机软件即可同时得到不同雾滴性质的各个信息。本发明检测方法的有益效果主要体现在：(1)能解决现有示踪剂没有特异性和选择性问题；(2)能同时对多个农药依次喷施、农药和肥料混用等多种复杂情况；(3)本发明方法引入过渡探针为示踪剂，无色无味，解决了水溶性染料、荧光示踪剂对环境的颜色污染问题，对环境无污染；(4)本发明方法可以仅通过一次检测，同时获取喷施雾滴的沉积特性定性、定量信息。
总之，本发明可以解决现代农业生产过程水、肥、药喷施的复杂情况的检测，利用不同特征序列的单链脱氧核糖核酸结合的特异性，通过一次检测即可获取到所有的喷施雾滴的特性信息，并且通过计算机软件处理后，实现沉积定量检测。
附图说明
图1为本发明的三段式反向斑点杂交用于检测多种喷施雾滴喷施沉积量的原理流程图。
图2A为5张含有固定探针的检测膜的检测图片结果，图2B为本发明检测方法标准曲线建立结果。
图3为实施例2两种探针同时检测雾滴性质实验。
图4为实施例3三种探针同时检测雾滴性质实验。
图5为实施例4四种探针同时检测雾滴性质实验。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1同时检测多种喷施雾滴飘失或沉积量的方法
如图1所示，整个流程可以分为制膜、喷施液配制、喷施、标准曲线建立、显色等5个流程。具体流程如下：利用不同特征序列的单链脱氧核糖核酸结合具有特异性，设计出一系列不同特征序列的单链脱氧核糖核酸作为固定探针固定在基底材料(本实施例所用的基底材料为尼龙膜)上制成不同的靶标膜。接着，将对应的不同特征序列的单链脱氧核糖核酸作为示踪剂加入到不同的喷施液中去，在喷施后，回收基底材料，通过放大信号显色后，得到不同的喷施液的雾滴粒径、雾滴分布等信息。最后通过计算机图像处理软件处理即可计算出对应的沉积量。
1、探针的确定
固定探针的长度为12-25nt，优选18-20nt，固定探针的一端为氨基修饰，另一端与基底材料的羧基裸露端共价结合。
过渡探针为24-50nt(优选为36-40nt)的特征序列的单链脱氧核糖核酸，不经生物素修饰。过渡探针与固定探针的互补配对碱基为 15-25nt。
显色探针为12-25nt(优选为18-20nt)的特征序列的单链脱氧核糖核酸。显色探针与过渡探针的互补配对碱基为15-40nt；若固定探针是5’标记，则显色探针为3’生物素标记，若固定探针是3’标记，则显色探针为5’生物素标记。
显色探针能够与过渡探针特异结合，不能与固定探针特异结合。表1中的三种探针序列为实施例所用的探针序列，作为示例，除了表1中探针的核苷酸序列外，凡是能满足上述要求的单链脱氧核糖核酸序列都可以用于本申请中的探针。
表1
Figure BDA0001811197070000111
2、制备检测膜
根据需要的大小裁剪表面富含羧基的尼龙膜，0.1M的HCl处理后清洗；加入15％EDC溶液浸泡0.5-1h后再清洗；加入含有0.03 μM固定探针的0.5M NaHCO3溶液中浸泡10-20min；再加入0.2M 的NaOH溶液浸泡膜5-15min，清洗，晾干即得。制备好的检测膜置于待喷施的靶标上，用于收集喷施雾滴和后续检测。
3、喷施液的配制和喷施
在药箱中加入待喷施的制剂(农药制剂、液体肥料、其他液体制剂或者水)，然后加入过渡探针(溶剂为水)，使喷施液中的过渡探针终浓度为0.60μM。不同的喷施液只加入一种过渡探针，且各个过渡探针均不相同。最后根据农药制剂、液体肥料或喷施设备需要，加入表面活性剂和离子缓冲液配制成过渡探针喷施液(0.02-0.045 mol/L的离子缓冲液，0.06-0.15％的表面活性剂)，主要剂型为水基制剂和油基制剂。经过喷施后，分别回收检测膜后，待显色。
4、本发明标准曲线的建立
选5张含有固定探针的检测膜，用移液枪吸取0.5μL的过渡探针喷施液，依次分别在5张检测膜上点1-5个点，5张检测膜片上探针溶液体积分别为0.5μL，1.0μL，1.5μL，2.0μL，2.5μL。另取一张检测膜，作为背景。利用拍照或扫描得到图片文件(图2A)，最后通过图像处理软件(例如：Photoshop、Image J等)获取单位面积的灰度值，并计算选取面积下的总灰度值。最后以药液体积作为横坐标，总灰度值作为纵坐标，绘制标准曲线，并计算出相应的线性方程，结果于图2B所示。
5、显色
将喷施有过渡探针喷施液的检测膜收集后，在加入50mL杂交液中，30-40℃孵育25-40min；去掉孵育杂交液后，重新加入50ml 杂交液洗涤2min；接着加入含有显色探针的杂交液中30-40℃条件下反应5-15min后，再加入50ml洗液清洗检测膜3次；50mL杂交液冲洗2min。取15uL过氧化氢酶液加入到杂交液中配置酶液，加入到之前清洗好的检测膜，37℃酶联反应15-20min；接着用50 mL杂交液冲洗后，加入TMB单组分液进行显色反应，TMB单组分显色液会被检测膜上结合的辣根过氧化氢酶催化显色，从而在检测膜上显色。3min后清水冲洗，终止反应，将膜晾干。通过显色可以直接观测到雾滴覆盖密度、雾滴粒径大小等信息。最后利用拍照或扫描得到图片文件，通过图像处理软件(例如：Photoshop、Image J 等)获取单位面积的灰度值，并计算选取面积下的总灰度值。
实施例2天车模拟田间喷施——两种探针同时检测实验
采用实施例1的方法分别制备含有固定探针的检测膜(以下称为检测膜A和检测膜B)，按照实施例1喷施液配制方法，配制含有上述固定探针的对应过渡探针喷施液(喷施液A和喷施液B)。在喷雾天车运行轨迹下方的铁架台上放置培养皿，每个培养皿中含有2 片检测膜(A和B各一片)。处于喷雾天车运行轨迹正中间。在压力 3bar下，使用喷雾天车(速度：5km/h、高度：0.5m)安装Lechler ST110-03常规扇形雾喷头对供试检测膜进行喷雾(喷施液A和B 各喷一次)。待喷雾结束后分别收集实验材料，按照上述的显色方法对检测膜分别用配套的显色探针进行显色。通过仪器分别读出检测膜和水敏纸上的雾滴覆盖面积后，计算出雾滴数和覆盖率。通过拍照或扫描等方法得到数字化的图像后，利用图像处理软件(例如： Photoshop、Image J等)获取单位面积的灰度值，并计算选取面积下的总灰度值。通过标准曲线换算出沉积量。具体结果见图3、表2，从图3的结果来看，2组探针之间不存在干扰，可以同时检测多种不同喷施方式的雾滴；同时表2结果显示对雾滴沉积量进行准确定量。
表2 两种探针同时检测雾滴性质实验
探针 A B
沉积量μL/cm<sup>2</sup> 2.40 2.06
理论沉积量μL/cm<sup>2</sup> 2.86 2.86
比率(计算值/理论值) 0.84 0.72
实施例3天车模拟田间喷施——三种探针同时检测实验
如上所述分别制备含有不同固定探针的检测膜(以下称为检测膜A、B、C)，按照上述喷施液配制方法，配制含有上述固定探针的对应过渡探针喷施液(喷施液A、B、C)。在喷雾天车运行轨迹下方的铁架台上放置培养皿，每个培养皿中含有3片检测膜(A、B、 C各一片)。处于喷雾天车运行轨迹正中间。在压力3bar下，使用喷雾天车(速度：5km/h、高度：0.5m)安装Lechler ST110-03常规扇形雾喷头对供试检测膜进行喷雾(喷施液A、B、C各喷一次)。待喷雾结束后分别收集实验材料，按照上述的显色方法对检测膜分别用配套的显色探针进行显色。通过仪器分别读出检测膜和水敏纸上的雾滴覆盖面积后，计算出雾滴数和覆盖率。通过拍照或扫描等方法得到数字化的图像后，利用图像处理软件(例如：Photoshop、 Image J等)获取单位面积的灰度值，并计算选取面积下的总灰度值。通过标准曲线换算出沉积量。(具体结果见图4，表3)，从图4的结果来看，3组的探针之间不存在干扰，可以同时检测多种不同喷施方式的雾滴；同时表3结果显示对雾滴沉积量进行准确定量。
表3 三种探针同时检测雾滴性质实验
Figure BDA0001811197070000141
实施例4天车模拟田间喷施——四种探针同时检测实验
如上所述分别制备含有固定探针的检测膜(以下称为检测膜A、 B、C、D)，按照上述喷施液配制方法，配制含有上述固定探针的对应过渡探针喷施液(喷施液A、B、C、D)。在喷雾天车运行轨迹下方的铁架台上放置培养皿，每个培养皿中含4片检测膜(A、B、C、 D各一片)。处于喷雾天车运行轨迹正中间。在压力3bar下，使用喷雾天车(速度：5km/h、高度：0.5m)安装Lechler ST110-03常规扇形雾喷头对供试检测膜进行喷雾(喷施液A、B、C、D各喷一次)。待喷雾结束后分别收集实验材料，按照上述的显色方法对检测膜分别用配套的显色探针进行显色。通过仪器分别读出检测膜和水敏纸上的雾滴覆盖面积后，计算出雾滴数和覆盖率。通过拍照或扫描等方法得到数字化的图像后，利用图像处理软件(例如：Photoshop、ImageJ等)获取单位面积的灰度值，并计算选取面积下的总灰度值。通过标准曲线换算出沉积量。(具体结果见图5，表4)从图5的结果来看，4组的探针之间不存在干扰，可以同时检测多种不同喷施方式的雾滴；同时表3结果显示对雾滴沉积量进行准确定量。
表4 四种探针同时检测雾滴性质实验
Figure BDA0001811197070000151
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种同时检测多种喷施雾滴飘失或沉积检测试剂盒及检测方法
<130> KHP181113901.5
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atcaagaagg tggtgaa 17
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgctcagtgt agcccattca ccaccttctt gat 33
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgggctacac tgagca 16
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atcaagaagg tggtgaa 17
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgactgcgag tagtagccat tcaccacctt cttgat 36
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tggctactac tcgcagtca 19
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atcaagaagg tggtgaa 17
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tctcaggtac cattcaccac cttcttgat 29
<210> 9
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tggtacctga ga 12
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccaccgtttt tcctcag 17
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgctcagtgt agcccactga ggaaaaacgg tgg 33
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgggctacac tgagca 16
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccaccgtttt tcctcag 17
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgactgcgag tagtagccac tgaggaaaaa cggtgg 36
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tggctactac tcgcagtca 19
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccaccgtttt tcctcag 17
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tctcaggtac cactgaggaa aaacggtgg 29
<210> 18
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tggtacctga ga 12
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atcttaaatc gcaaggt 17
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tgctcagtgt agcccaacct tgcgatttaa gat 33
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tgggctacac tgagca 16
<210> 22
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atcttaaatc gcaaggt 17
<210> 23
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tgactgcgag tagtagccaa ccttgcgatt taagat 36
<210> 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tggctactac tcgcagtca 19
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atcttaaatc gcaaggt 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tctcaggtac caaccttgcg atttaagat 29
<210> 27
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tggtacctga ga 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atcaagaagg tggtgaa 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgctcagtgt agcccactga ggaaaaacgg tgg 33
<210> 30
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tggtacctga ga 12

Claims (10)

1.一种同时检测多种喷施雾滴飘失或沉积量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将不同的过渡探针分别加到多种喷施液中作为示踪剂，每种喷施液中只加一种过渡探针；
(2)喷施后，喷施液中的过渡探针能与检测膜上的所对应的固定探针特异性结合，所述检测膜为固定有固定探针的基底材料；
(3)将带有生物素标记的显色探针通过杂交技术结合在对应的过渡探针上，显色处理后，根据颜色深浅测定雾滴量，根据显色点的位置和大小确定多种雾滴飘失或沉积量；
所述过渡探针不经生物素修饰，具有能够分别与其对应的固定探针和显色探针互补配对的核苷酸序列，并且固定探针与显色探针不特异结合，不同的过渡探针之间不特异结合。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过渡探针和固定探针均为特征序列的单链脱氧核糖核酸；其中过渡探针的长度为24-50nt，固定探针的长度为12-25nt，固定探针的一端为氨基修饰，另一端与基底材料的羧基裸露端共价结合。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，显色探针与过渡探针的互补配对碱基为15-40nt；若固定探针是5’标记，则显色探针为3’生物素标记，若固定探针是3’标记，则显色探针为5’生物素标记。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，固定探针的长度为18-20nt，过渡探针与固定探针的互补配对碱基为15-25nt。
5.如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述检测膜，是通过以下方式制备得到的：根据需要的大小裁剪基底材料，0.1-0.3M的HCl处理后清洗；加入10-20％的EDC溶液浸泡后再清洗；加入含有0.025-0.2μM固定探针的0.3-1.0M NaHCO3溶液中浸泡处理；再加入NaOH溶液浸泡膜，清洗，晾干即得。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述检测膜是通过以下方式制备得到的：根据需要的大小裁剪基底材料，0.1M的HCl处理后清洗；加入15％EDC浸泡0.5-1h后再清洗；加入含有0.03μM固定探针的0.5M NaHCO3溶液中浸泡10-20min；再加入0.05-0.5M的NaOH溶液浸泡膜5-15min，清洗，晾干即得。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基底材料为硝酸纤维素膜、尼龙膜、羧基化改性的有机玻璃或羧基化改性的聚丙烯塑料薄膜。
8.如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，步骤(2)喷施液中过渡探针的最终浓度为0.025-0.1μM。
9.一种能够同时检测多种喷施雾滴飘失或沉积量的试剂盒，其特征在于，含有检测膜，过渡探针、显色探针；且检测膜，过渡探针、显色探针的数量均≥2，且均不相同；
所述检测膜为固定有固定探针的基底材料，固定探针长度为12-25nt，其一端加氨基修饰，另一端与基底材料的羧基裸露端共价结合，所述基底材料为羧基裸露的材料；
所述过渡探针的长度为24-50nt；所述显色探针3’或5’端标记生物素，且显色探针能够与过渡探针特异结合，不能与固定探针特异结合。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述显色探针3’或5’端标记生物素，3,3',5,5'-四甲基联苯胺TMB单组分液，辣根过氧化物酶。
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