CN110946882A - 基于Veillonella菌的小鼠用胶囊的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于胶囊制备技术领域，公开了一种基于Veillonella菌的小鼠用胶囊的制备方法，所述制备方法包括：Veillonella菌株的采集、筛选及纯化；胶囊的制作；将冷冻的Veillonella菌包裹于胶囊中，即得。本发明制备的胶囊可以提升乳酸分解能力，丰富乳酸代谢途径，使运动过程中肌肉活动产生的乳酸尽可能进入胃肠道腔并被细菌代谢，并且乳酸可以越过上皮屏障进入场腔，Veillonella菌依此提升乳酸的代谢能力。并且Veillonella菌通过增强丙酸盐的能力也直接性的增强运动能力，通过探究小鼠的改变和反应来研究Veillonella菌对改善人体的运动能力，提升运动表现的作用。

Description

基于Veillonella菌的小鼠用胶囊的制备方法
技术领域
本发明属于胶囊制备技术领域，尤其涉及一种基于Veillonella菌的小鼠用胶囊的制备方法。
背景技术
目前，最接近的现有技术：耐力运动对人体健康会产生有益的影响，可以进行对大脑功能的一个改善，也可以在促进减肥，调节情绪，甚至是改善抑郁症等等产生一系列的正面作用。但耐力运动调节机制尚不清楚。
人肠道包含各种微生物如细菌、真菌、寄生虫和病毒，有超过100兆的细菌驻留在人类胃肠道，是体内真核细胞数量的10-100倍。经过与人体多年的共同发展，肠道微生物与人体已经达到互惠共生的状态。肠道微生物能够调节肠道的运动，肠道屏障系统和脂肪的分布通过发展肠道相关的淋巴组织和防止病原菌的定植来影响免疫功能，它还能影响宿主的能量代谢和线粒体的功能。而中枢神经细胞(CNS)和胃肠道有着紧密的联系，并且对于调节肠道的功能和稳态有着重要作用。脑肠轴除了对这些功能的影响关系外，对心理健康也有一定的影响。因肠道微生物群和宿主的复杂关系，学者们提出了一种新的理念微生物一脑一肠轴。有研究发现，肠道微生物可以不仅可以通过脑肠轴作用于中枢系统，影响糖代谢，进而对2型糖尿病产生影响，也可以通过脑肠轴对大脑的机制产生一定的影响，进而改善记忆力，调节情绪等等。
运动对微生物脑肠轴的影响机制鲜有报道。近期有研究显示，顶级马拉松运动员和普通人的差距，仅仅在于肠道菌群的不同。在高强度的运动训练之后，往往会出现肌肉酸痛的现象，这是因为运动超过了有氧运动强度，导致葡萄糖通过无氧呼吸在体内代谢产生了乳酸，乳酸堆积会引起局部肌肉酸痛。出现乳酸积累后，往往要通过持续有氧运动和热水熏蒸等方法加入乳酸排泄，解除肌肉酸痛，而目前研究发现，顶尖马拉松运动员比赛后，肠道中的Veillonella细菌迅速增加，将乳酸分解成丙酸，促进新陈代谢。在研究中，第一次从顶尖马拉松运动员的粪便中提取出了肠道菌群Veillonella菌，发现Veillonella菌可以改善耐力运动员的乳酸清除能力。
Veillonella菌的中文是韦荣氏球菌属，是革兰氏阴性厌氧性微小球菌，生长要求二氧化碳。严格厌氧，寄生在人和动物的口腔、肠道和呼吸道中。产生内毒素，因此在各种混合感染中起作用。常从软组织脓肿及血液中检出。它缺乏酵解糖类和多元醇的能力，在动物和人的自然腔道中大量存在，是分布于口腔、咽部、呼吸道、消化道的正常菌群，它能消耗乳酸。研究证明Veillonella属细菌可以促进乳酸分解，提高运动能力。
在目前的研究中，肠道菌群对肥胖现象的干预研究，肠道菌群对渐冻症的研究等等小鼠模型已经建立，而在肠道菌群的Veillonella菌株胶囊对小鼠体内乳酸代谢所产生的影响有待于我们进一步研究，基于Veillonella菌对乳酸的代谢作用，我们需要研发一种与马拉松运动员乳酸代谢相关肠道细菌Veillonella菌的小鼠用胶囊，通过将此类胶囊喂食给小鼠来观察小鼠体内肠道菌群产生的影响，以此来探究Veillonella菌胶囊对人体所产生的影响和变化。
目前的研究中主要采用灌肠的方式对人体进行菌群定植，此方法操作繁琐且不易进行，对操作要求较高不易实行。而本发明主要采用经多项严格条件筛选的Veillonella菌株，并制成胶囊，通过口服肠道菌群胶囊进行菌群移植，达到对运动表现能力进行一个提升的目的具有无毒害性、可以定量进行服用、长期有效性、易操作等多项优点。本次在对增强运动能力的研究中使用的菌群是益生元菌，不涉及到兴奋剂，不会出现药物依赖，不会对细胞器官产生危害。本发明采用以肠道菌群改善人体内环境的方法，通过增加Veillonellaatypica菌株来增强乳酸分解能力，增加乳酸回流，增强丙酸盐的作用来实现对运动能力的提升，实现无毒副作用的微生态疗法。在目前的药物研究中，大多数胶囊类药物都存在着易脆易附着的缺点，这造成了药物不容易进入体内，且不容易被人吸收消化。而本发明采用了新型胶囊的形式，则解决了上述的问题这种新型胶囊解决了胶囊易脆易粘附的特点，服用本发明对运动员的运动能力提升和改善具有良好的效果。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)现有采用灌肠的方式对人体进行菌群定植，此方法操作繁琐且不易进行，对操作要求较高不易实行。
(2)利用现有技术制备的胶囊类药物都存在着易脆易附着的缺点，这造成了药物不容易进入体内，且不容易被人吸收消化。
解决上述技术问题的难度：
1.前采用的灌肠技术操作难度较高，适用范围较为狭隘，对人体进行灌肠方式需对人体进行检查且进行手术准备，采用的灌肠液也需特殊制备，操作较为繁琐，对灌肠液的温度剂量要求较高，灌肠时的压力等等技术问题也需解决。
2.现有的胶囊类药物，制备胶囊材料单一，普遍存在易脆易附着的特点，且胶囊材料不易被人消化吸收，所以一种适合人体吸收且包裹性较好的胶囊材料是解决技术问题的重点。
解决上述技术问题的意义：本发明通过采用新型胶囊技术对人体进行肠道菌群定植，可以避免采用灌肠技术，可以避免繁琐复杂的制备流程和手术流程，可以更为简便有效的对人体内进行肠道菌群移植。而采用新型胶囊制备的药物可以避免现有胶囊药物易脆易附着的缺点，可以使人体更好的吸收，且对人体无毒害作用，使Veillonella菌更有效的在人体内发挥作用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于Veillonella菌的小鼠用胶囊的制备方法。
本发明是这样实现的，一种基于Veillonella菌的小鼠用胶囊的制备方法，所述小鼠用胶囊的制备方法包括以下步骤：
步骤一，Veillonella菌株的采集、筛选及纯化。
步骤二，胶囊的制作。
步骤三，将冷冻的Veillonella菌包裹于胶囊中，即得基于Veillonella菌的小鼠用胶囊。
进一步，步骤一中，所述Veillonella菌株的采集方法包括：
(1)提供重庆国际马拉松赛的一个优秀运动员一个15ml的离心管，里面插着1ml的吸管针尖。
(2)参与者被指示将吸管的针尖浸入粪便的卫生纸中，然后把它们放回到管子里，用收集的日期和时间给管子贴上标签。
(3)样品被保存在4℃处进行短期储存，直到样品收集完毕。立即放置在干冰上，然后转移到-80℃冰箱进行长期储存。
进一步，步骤一中，所述Veillonella菌株筛选方法包括：
(1)粪便样品在冰上解冻，再悬浮在2-5ml的PBS中，其中250ml用于使用MoBioPowerSoil高通量DNA提取试剂盒进行DNA提取。
(2)对于16S rDNA文库的构建，用1～5-1的纯化DNA，用Q5热启动聚合酶(NEB)对V4可变区进行PCR扩增，筛选出Veillonella菌株。
(3)将Veillonella菌株在250ml BHIL(每升含60％乳酸钠10ml)和MRS肉汤中培养。
(4)监测600nm(OD600)波长下的光密度(光密度0.4-0.6)，细胞经5000g冷冻离心10min制粒。
(5)用PBS洗涤球粒，用2ml剩余PBS重悬。
(6)将100ml的等份样品在-80℃下冷冻，并通过在BHIL琼脂平板上的连续稀释测量每毫升的菌落形成单位(c.f.u.)数量。
进一步，步骤一中，所述Veillonella菌株的纯化方法包括：
(1)用3倍柱体积的无菌水冲洗Ni2+亲和柱中的树脂，再用3倍柱体积的结合缓冲液(pH＝7.8)平衡树脂，放置待用。
(2)取冻存的100ml细菌培养液的细胞沉淀置于4ml结合缓冲液(pH＝7.8)中。
(3)加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml，冰上放置30min。
(4)混合物于4℃摇床上孵育10min。
(5)加入TritonX-100、DNase和RNase，终浓度分别为1％、5ug/ml、5ug/ml，再于4℃摇床上孵育10min。
(6)在4℃、5000rpm的条件下离心30min，去除不溶性细胞碎片。上清转移到一只新管中，得到纯化的Veillonella菌。
进一步，步骤二中，所述胶囊的制作方法包括：
(1)先活化Veillonella菌，然后按照体积比为4％的接种量把种子液接种到培养基中，放入30℃恒温培养箱中静置培养6d。
(2)取出生成的细菌纤维素膜，放入NaOH溶液中浸泡处理，再用流动的蒸馏水冲洗，直至冲洗液的pH接近中性。
(3)将步骤(2)得到的细菌纤维素膜放入打浆机中，12000rpm打磨10分钟。
(4)将步骤(3)所得糊状细菌纤维素进行灭菌处理。
(5)将步骤(4)灭菌后的糊状细菌纤维素浇灌到胶囊外壳模具中，干燥、冷却、风干成型。
(6)将药品灌入一个胶囊外壳内，将另一个胶囊外壳套在已灌入药品的胶囊外壳口处，用以封闭胶囊。
通过此采集筛选和纯化方法可以得到无杂质的较为纯净的目标菌即所需的Veillonella菌，而通过细菌纤维素制备的胶囊外壳更容易在体内分解，且无毒无害。制备容易分解的胶囊外壳使Veillonella菌更容易溶解在体内，有益于Veillonella菌在肠道中的吸收，增进Veillonella菌的转化和代谢。
本发明的另一目的在于提供一种由所述基于Veillonella菌的小鼠用胶囊的制备方法制备的胶囊，此胶囊的本质是一种可以通过调控肠道菌群来提高运动能力的Veillonella菌，主要用来提高人体的运动表现能力。
本发明的另一目的在于提供一种所述胶囊在提升运动能力中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述胶囊在调控肠道菌群中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明Veillonella菌株的肠道菌群胶囊在提升运动能力方面的应用，通过调控肠道菌群，将运动过程中产生的乳酸穿过肠腔并被代谢，在结肠中转化成丙酸，进而促进运动表现。通过提供一种替代的乳酸处理方法将体内的乳酸转化，从而重新进入循环并提高运动能力。本发明用于小鼠的肠道菌群胶囊以此提升运动表现能力，通过使细菌乳酸发酵的产物，即短链脂肪酸丙酸盐，从肠腔回流到循环中，实现对运动表现的提高，并通过观察小鼠的情况来探究Veillonella菌的作用。
本发明制备的胶囊可以提升乳酸分解能力，丰富乳酸代谢途径，使运动过程中肌肉活动产生的乳酸尽可能进入胃肠道腔并被细菌代谢，并且乳酸可以越过上皮屏障进入场腔，Veillonella菌依此提升乳酸的代谢能力。并且Veillonella菌通过增强丙酸盐的能力也直接性的增强运动能力，通过探究小鼠的改变和反应来研究Veillonella菌对改善人体的运动能力，提升运动表现的作用。
附图说明
图1是本发明实施例提供的基于Veillonella菌的小鼠用胶囊的制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的Veillonella菌株的纯化方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于Veillonella菌的小鼠用胶囊的制备方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的一种用于小鼠的肠道菌群胶囊以此来提升运动表现能力，通过使细菌乳酸发酵的产物，即短链脂肪酸丙酸盐，从肠腔回流到循环中，实现对运动表现的提高，并通过观察小鼠的情况来探究Veillonella菌的作用。
如图1所示，本发明实施例提供的基于Veillonella菌的小鼠用胶囊的制备方法包括以下步骤：
S101：Veillonella菌株的采集、筛选及纯化。
S102：胶囊的制作。
S103：将冷冻的Veillonella菌包裹于胶囊中，即得基于Veillonella菌的小鼠用胶囊。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例1
根据对普通人群与顶尖马拉松运动员肠道菌群的差异，分析差异菌群分解乳酸的作用，设计针对提升运动能力的Veillonella菌株胶囊，以实现提升乳酸分解能力，帮助乳酸回流等作用，通过这些作用来提升运动能力甚至改善一些疾病。
1、Veillonella菌株的采集、筛选及纯化
1.1提供重庆国际马拉松赛的一个优秀运动员一个15ml的离心管，里面插着1ml的吸管针尖。参与者被指示将吸管的针尖浸入粪便的卫生纸中，然后把它们放回到管子里，用收集的日期和时间给管子贴上标签。样品被保存在4℃处进行短期储存，直到样品收集完毕。立即放置在干冰上，然后转移到-80℃冷冻机进行长期储存。
1.2粪便样品在冰上解冻，再悬浮在2-5ml的PBS中，其中250ml用于使用MoBioPowerSoil高通量DNA提取试剂盒进行DNA提取。对于16S rDNA文库的构建，用1～5-1的纯化DNA，用Q5热启动聚合酶(NEB)对V4可变区进行PCR扩增，筛选出Veillonella菌株。
1.3将Veillonella菌株在250ml BHIL(每升含60％乳酸钠10ml)和MRS肉汤中培养。监测600nm(OD600)波长下的光密度(光密度0.4-0.6)，细胞经5000g冷冻离心10min制粒。用PBS洗涤球粒，用2ml剩余PBS重悬。将100ml的等份样品在-80℃下冷冻进行长期储存，并通过在BHIL琼脂平板上的连续稀释测量每毫升的菌落形成单位(c.f.u.)数量。
1.4Veillonella菌株的纯化(如图2所示)
1.4.1用3倍柱体积的无菌水冲洗Ni2+亲和柱中的树脂，再用3倍柱体积的结合缓冲液(pH＝7.8)平衡树脂，放置待用。
1.4.2取冻存的100ml细菌培养液的细胞沉淀置于4ml结合缓冲液(pH＝7.8)中。
1.4.3加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml，冰上放置30min。
1.4.4混合物于4℃摇床上孵育10min。
1.4.5加入Triton X-100、DNase和RNase，终浓度分别为1％、5ug/ml、5ug/ml，再于4℃摇床上孵育10min。
1.4.6在4℃、5000rpm的条件下离心30min，去除不溶性细胞碎片。上清转移到一只新管中，得到纯化的Veillonella菌。
2、胶囊的制作
2.1先活化Veillonella菌，然后按照体积比为4％的接种量把种子液接种到培养基中，放入30℃恒温培养箱中静置培养6d。然后取出生成的细菌纤维素膜，放入NaOH溶液中浸泡处理，再用流动的蒸馏水冲洗，直至冲洗液的pH接近中性。
2.2将2.1得到的细菌纤维素膜放入打浆机中，12000rpm打磨10分钟；
2.3将2.2所得糊状细菌纤维素进行灭菌处理。
2.4将灭菌后的糊状细菌纤维素浇灌到胶囊外壳模具中，干燥、冷却、风干成型；
2.5将药品灌入一个胶囊外壳内，将另一个胶囊外壳套在已灌入药品的胶囊外壳口处，用以封闭胶囊。
3、Veillonella菌胶囊的制备
将冷冻的Veillonella菌包裹于胶囊中，通过口服进入小鼠的肠道，提升乳酸分解能力，丰富乳酸代谢途径，使运动过程中肌肉活动产生的乳酸尽可能进入胃肠道腔并被细菌代谢，并且乳酸可以越过上皮屏障进入场腔，Veillonella菌依此提升乳酸的代谢能力。并且Veillonella菌通过增强丙酸盐的能力也直接性的增强运动能力，通过探究小鼠的改变和反应来研究Veillonella菌对改善人体的运动能力，提升运动表现的作用。
实施例2
本发明实施例先活化Veillonella菌，然后按照体积比为3％的接种量把种子液接种到培养基中，放入30℃恒温培养箱中静置培养7d。然后取出生成的Veillonella菌膜，放入Na OH溶液中浸泡处理，再用流动的蒸馏水冲洗，直至冲洗液的p H接近中性；将上述得到的Veillonella菌膜放入打浆机中，12000rpm打磨7分钟；将上述所得糊状细菌膜进行灭菌处理。将灭菌后的糊状细菌膜浇灌到胶囊外壳模具中，干燥、冷却、风干成型；将药品灌入一个胶囊外壳内，将另一个胶囊外壳套在已灌入药品的胶囊外壳口处，用以封闭胶囊。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于Veillonella菌的小鼠用胶囊的制备方法，其特征在于，所述基于Veillonella菌的小鼠用胶囊的制备方法包括以下步骤：
步骤一，Veillonella菌株的采集、筛选及纯化；
步骤二，胶囊的制作；
步骤三，将冷冻的Veillonella菌包裹于胶囊中，即得基于Veillonella菌的小鼠用胶囊。
2.如权利要求1所述的基于Veillonella菌的小鼠用胶囊的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述Veillonella菌株的采集方法具体包括：
(1)提供一个15ml的离心管，插着1ml的吸管针尖；
(2)将吸管的针尖浸入粪便的卫生纸中，然后放回到管子里，用收集的日期和时间给管子贴上标签；
(3)样品被保存在4℃处进行短期储存，直到样品收集完毕；放置在干冰上，然后转移到-80℃冰箱进行长期储存。
3.如权利要求1所述的基于Veillonella菌的小鼠用胶囊的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述Veillonella菌株筛选方法具体包括：
(1)粪便样品在冰上解冻，再悬浮在2-5ml的PBS中，其中250ml用于使用MoBioPowerSoil高通量DNA提取试剂盒进行DNA提取；
(2)对于16S rDNA文库的构建，用1～5-1的纯化DNA，用Q5热启动聚合酶(NEB)对V4可变区进行PCR扩增，筛选出Veillonella菌株；
(3)将Veillonella菌株在250ml BHIL和MRS肉汤中培养；
(4)监测600nm波长下的光密度，细胞经5000g冷冻离心10min制粒；
(5)用PBS洗涤球粒，用2ml剩余PBS重悬；
(6)将100ml的等份样品在-80℃下冷冻，并通过在BHIL琼脂平板上的连续稀释测量每毫升的菌落形成单位数量。
4.如权利要求1所述的基于Veillonella菌的小鼠用胶囊的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述Veillonella菌株的纯化方法具体包括：
(1)用3倍柱体积的无菌水冲洗Ni2+亲和柱中的树脂，再用3倍柱体积的结合缓冲液平衡树脂，放置待用；
(2)取冻存的100ml细菌培养液的细胞沉淀置于4ml结合缓冲液中；
(3)加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml，冰上放置30min；
(4)混合物于4℃摇床上孵育10min；
(5)加入TritonX-100、DNase和RNase，终浓度分别为1％、5ug/ml、5ug/ml，再于4℃摇床上孵育10min；
(6)在4℃、5000rpm的条件下离心30min，去除不溶性细胞碎片；上清转移到一只新管中，得到纯化的Veillonella菌。
5.如权利要求1所述的基于Veillonella菌的小鼠用胶囊的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述胶囊的制作方法具体包括：
(1)先活化Veillonella菌，按照体积比为4％的接种量把种子液接种到培养基中，放入30℃恒温培养箱中静置培养6d；
(2)取出生成的细菌纤维素膜，放入NaOH溶液中浸泡处理，再用流动的蒸馏水冲洗，直至冲洗液的pH接近中性；
(3)将步骤(2)得到的细菌纤维素膜放入打浆机中，12000rpm打磨10分钟；
(4)将步骤(3)所得糊状细菌纤维素进行灭菌处理；
(5)将步骤(4)灭菌后的糊状细菌纤维素浇灌到胶囊外壳模具中，干燥、冷却、风干成型；
(6)将药品灌入一个胶囊外壳内，将另一个胶囊外壳套在已灌入药品的胶囊外壳口处，用以封闭胶囊。
6.一种由权利要求1～5任意一项所述基于Veillonella菌的小鼠用胶囊的制备方法制备的胶囊。
7.一种如权利要求6所述胶囊在提升运动能力中的应用。
8.一种如权利要求6所述胶囊在调控肠道菌群中的应用。
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