CN110917212A - 靶向dna大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱及其制法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向DNA大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱及其制法和用途，所述靶向DNA大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱作为抗癌活性成分，其包括仅几个纳米尺寸、具有平面结构的石墨烯骨架和位于所述石墨烯骨架周围的氮杂环簇。该生物活性纳米粒子的石墨烯碱，结构简单、易于合成，其不仅拥有对核DNA大沟的精准靶向功能，而且具有对拓扑异构酶I和II的高效抑制活性，尤其是在不含小分子药物成分且不含嫁接的特殊靶向分子的情况下纳米粒子本身就能显示高于化疗药物的抗癌活性。

Description

靶向DNA大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱及其制法和用途
技术领域
本发明涉及药物化学领域，尤其涉及一种靶向DNA大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱及其制法和用途。
背景技术
DNA和拓扑异构酶(Topo)是抗癌药物的重要靶标。已广泛临床应用及正在开发的拓扑异构酶抑制剂均为DNA插入剂，主要通过DNA碱基嵌入方式间接干扰拓扑异构酶I或II的功能，导致DNA损伤和细胞凋亡。近年来，为克服单一拓扑酶抑制剂的耐药性局限，发现了一些靶向作用于TopoⅠ和TopoⅡ的双重抑制剂，如吲哚基喹啉衍生物TAS-103、灵菌红素、姜黄素等。但是发现的小分子双重Topo抑制剂毒副作用大且临床试验效果不佳。
开发DNA大沟靶向的新型抗癌药物具有特别重要意义，因为除拓扑异构酶靶标结合于DNA大沟外，很多重要的其它核蛋白靶标如聚合酶、转录因子和DNA修复蛋白等也能特异性地结合于DNA大沟。特别是，DNA大沟靶向药物可与多个大沟结合蛋白竞争DNA大沟位点，直接干扰它们的功能，极有可能实现多靶点的抗癌作用。然而，小分子药物和染料主要通过碱基插入或小沟结合的方式与DNA发生相互作用，只有若干个染料被发现具有结合DNA大沟的特性，但并发现它们的抗癌功效。
综上所述，DNA嵌入类型的小分子化疗药物存在作用靶点单一，易产生多药耐药性，且毒副作用大等缺陷。因而迫切需要开发靶向DNA大沟并同时抑制拓扑异构酶I和II的高效、安全性好、不易产生耐药性的多靶点抗癌药物。
发明内容
本发明为解决现有技术中的上述问题，提出一种靶向DNA大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱及其制法和用途。
本发明提供一种结构简单、易于合成的生物活性纳米粒子石墨烯碱，所述纳米粒子石墨烯碱不仅拥有对核DNA大沟的精准靶向功能，而且具有对拓扑异构酶I和II的高效抑制活性，尤其是在不含小分子药物成分且不含嫁接的特殊靶向分子的情况下纳米粒子本身就能显示高于化疗药物的抗癌活性。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个方面是提供一种靶向DNA大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱，包含纳米尺度的石墨烯平面结构，有别于小分子生物碱的平面结构，所述石墨烯平面结构的尺寸为1～10nm，厚度为0.34～3.4nm。
进一步地，所述石墨烯平面结构的尺寸为3.5±0.5nm，厚度为0.34～1.0nm。
进一步地，所述石墨烯碱的准分子量为2000～20000。
进一步优选地，所述石墨烯碱的准分子量为6000～10000。
进一步地，除石墨烯平面结构外，所述石墨烯碱还含有氮杂环簇结构，其共价键合于石墨烯石墨烯平面结构的边缘。
进一步优选地，所述氮杂环簇结构中包含吡啶环、吡咯环、苯酚环或其组合。
进一步较为优选地，所述氮杂环簇结构包括10～50个杂环的组合。
进一步更为优选地，所述氮杂环簇结构包括15～30个杂环的组合。
进一步较为优选地，所述吡啶环结构中的N、吡咯环结构中的N和石墨N环结构中的N的比例为吡啶N：吡咯N：石墨N(原子比)＝(2.0～5.0)：(0.1～0.8)：1。
进一步地，所述石墨烯碱中N的含量为5～20at％，at％是指原子百分比。
进一步优选地，所述石墨烯碱中N的含量为7.8～15.6at％，at％是指原子百分比。
进一步较为优选地，所述石墨烯碱中N的含量为10.4±0.5at％，at％是指原子百分比。
进一步地，在生理pH(pH＝6.5～7.4)下和/或在0.01～1.0mg/mL的浓度范围内，所述石墨烯碱的Zeta电位为+33.2～+72.3eV。
进一步地，所述石墨烯生物碱的水溶液最大吸收位于430～480nm处，和/或荧光发射位于530～560nm处。
本发明的第二个方面是提供一种如上述任一项所述靶向DNA大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱的制备方法，包括步骤：
(a)一步反应：在催化剂的存在下，在醇类溶剂中，使前驱体经一步反应形成所述石墨烯碱；
其中，所述前驱体为久洛利定(Julolidine)；所述催化剂为有机酸和/或其酸酐、和/或含磷化合物。
进一步地，步骤(a)中，所述有机酸催化剂选自乙酸、丙酸、丁酸、乙二酸、丙二酸、丁二酸、己二酸、马来酸、酒石酸、苯甲酸、苯乙酸、邻苯二甲酸中的一种或几种的组合。
进一步地，步骤(a)中，所述含磷化合物选自五氧化二磷、三氯氧磷、五氯化磷中的一种或几种的组合。
进一步地，步骤(a)中，所述醇类溶剂选自乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异戊醇中的一种或几种的组合。
进一步地，步骤(a)中，所述前驱体与醇类溶剂的质量体积比(mg：ml)为(2.0～3.0):1。
进一步优选地，步骤(a)中，所述前驱体与醇类溶剂的质量体积比(mg：ml)为(2.0～2.5):1。
进一步地，步骤(a)中，当所述催化剂为液体时，所述催化剂与醇类溶剂的体积比为1:(4～40)。
进一步优选地，步骤(a)中，当所述催化剂为液体时，所述催化剂与醇类溶剂的体积比为1:(10～40)。
进一步地，步骤(a)中，当所述催化剂为固体时，所述催化剂与醇类溶剂的质量体积(mg:ml)比为1：(40～400)。
进一步优选地，步骤(a)中，当所述催化剂为固体时，所述催化剂与醇类溶剂的质量体积(mg:ml)比为1：(100～400)。
进一步地，步骤(a)中，反应温度为100～300℃，反应时间为0.05～24h。
进一步地，所述靶向DNA大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱的制备方法，还包括步骤：
(b)后处理：对一步反应形成的所述石墨烯碱进行分离和/或提纯。
进一步地，所述后处理步骤为：(i)基于石油醚萃取的后处理、(ii)基于柱层析分离的后处理、和/或(ii)基于盐沉降离心分离的后处理。
本发明的第三个方面是提供一种如上述任一项所述靶向DNA大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱的用途，(i)用于制备抑制拓扑异构酶的抑制剂；和/或(ii)用于制备用于治疗和/或预防癌症的药物或其组合物。
进一步地，所述拓扑异构酶包括拓扑异构酶I和II两种类型。
进一步地，所述药物组合物包括所述的石墨烯碱和药学上可接受的载体或小分子药物或抗体或免疫药物。
进一步地，所述癌症包括：结肠癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、大肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、肝癌、脑癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、慢性粒细胞性白血病、血液肿瘤、淋巴肿瘤中的一种或几种。
本发明的第四个方面是提供一种抑制拓扑异构酶I和/或拓扑异构酶II的方法，包括步骤：使如上述所述石墨烯碱与对象接触从而抑制拓扑异构酶I和/或拓扑异构酶II。
进一步地，所述对象包括：细胞。较佳地，所述细胞包括：MCF-7人乳腺癌细胞、人成骨肉瘤MG-63、人胰腺癌PANC-1、人肝癌HepG2、人肺癌A549、小鼠乳腺癌4T1、胃癌Hgc-27、人结肠癌HCT-8、恶性黑色素瘤A375、人类宫颈癌Hela中的一种或几种。
本发明的第五个方面是提供一种治疗和/或预防疾病的方法，包括步骤：向需要的对象施用如上述所述石墨烯碱。
进一步地，所述疾病选自：癌症、与拓扑异构酶I和/或拓扑异构酶II活性过高相关的疾病或其组合。
进一步地，所述对象为动物。较佳地，所述对象为哺乳动物；更佳地，所述对象为人类。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
(a)本发明的石墨烯生物碱不易引起治疗对象的耐药性；(b)本发明的石墨烯生物碱毒副作用少；(c)本发明的石墨烯生物能够直接靶向肿瘤组织，尤其是能靶向核酸或核酶；(d)本发明的石墨烯生物碱能够克服细胞内多重生物障碍；(e)本发明的石墨烯生物碱结构稳定、易溶解；(f)本发明的石墨烯生物碱制备简单易控制。
附图说明
图1显示了石墨烯碱GA的结构模型；
图2中a)GA的TEM图片；b)GA的HRTEM图片；c)GA的AFM图片；
图3中a)石墨烯碱GA的X射线衍射图谱；b)石墨烯生物碱药物的拉曼光谱图；
图4中a)石墨烯生物GA的XPS总谱；b)石墨烯碱GA的C1s谱图；c)石墨烯生物碱的N1s谱图；d)石墨烯碱GA的O1s谱图；
图5中a)石墨烯碱GA在不同pH条件下的Zeta电位；b)石墨烯碱GA不同浓度下Zeta电位；
图6中a)石墨烯碱GA乙醇溶液的荧光图片、紫外可见吸收光谱及荧光激发和发射光谱；b)石墨烯碱GA水溶液的紫外可见吸收光谱及荧光激发和发射光谱；c)石墨烯碱GA乙醇溶液和水溶液在持续紫外光辐照下荧光的稳定性测试；
图7中a)石墨烯碱GA对多种类型癌细胞株的细胞存活率的影响；b)石墨烯碱GA对不同类型癌细胞株的半致死浓度(IC50)；
图8比较了石墨烯碱GA与小分子拓扑酶抑制剂DOX、CPT和VP-16对Hela细胞的半致死浓度(IC50)；
图9显示了不同浓度石墨烯碱GA对大沟结合染料甲基绿结合ct-DNA产生的特征圆二色谱峰的影响；
图10显示了石墨烯碱GA抑制拓扑异构酶I活性的评估结果；
图11显示了石墨烯碱GA抑制拓扑异构酶II活性的评估结果；
图12显示了石墨烯碱GA在体内通过瘤内注射对MCF-7肿瘤的治疗效果；其中，阿霉素DOX作为阳性对照；
图13显示了石墨烯碱GA在体内通过静脉注射对Hela、HepG-2、4T1和A549肿瘤的治疗效果(阿霉素DOX作为阳性对照)；
图14显示了经石墨烯碱GA治疗后鼠体重的变化(阿霉素作为阳性对照)；
图15显示了石墨烯碱GA在体内通过静脉注射治疗4T1肿瘤后，肿瘤在肺部的转移数量(阿霉素DOX作为阳性对照)；
图16显示了小鼠单次尾静脉注射石墨烯碱GA后的血药浓度-时间曲线；
图17显示了石墨烯碱GA通过静脉注射后被动靶向肿瘤的体内成像；
图18显示了通过静脉注射后的体内成像，探究石墨烯碱GA给药后在体内器官中的分布情况；
图19显示了石墨烯碱GA的长期毒性评估，其中静脉注射石墨烯碱GA后在不同时间点取出主要器官进行组织学分析；
图20显示了石墨烯碱GA的长期毒性评估，其中静脉注射石墨烯碱GA后在不同时间点取出全血进行血常规分析和血生化分析；
图21显示了石墨烯碱GA的溶血实验。
具体实施方式
本发明经过广泛而深入的研究，首次意外地开发了一种具有新颖结构的石墨烯碱抗癌药物GA，所述的GA具有优异的拓扑异构酶I和II的抑制活性。此外，研究还表明，本发明的GA药物具有超薄纳米石墨烯的平面型结构。在此基础上完成了本发明。
如本文所用，“石墨烯生物碱”、“石墨烯生物碱药物”、“石墨烯碱”、“石墨烯碱药物”、“石墨烯碱纳米药物”、“石墨烯碱抗癌药物”和“石墨烯量子点药物等可以互换使用，都是指平面型超薄纳米石墨烯生物碱GA。
如本文所述，本发明纳米药物或活性成分是指第一方面所述的石墨烯碱。
石墨烯碱药物
本发明提供了一种靶向作用于细胞核DNA大沟并同时抑制拓扑异构酶I和II的非小分子型抗癌药物，其活性抗癌成分为石墨烯生物碱(GA)，它是拓扑异构酶I和II的双重抑制剂。
本发明的石墨烯生物碱的分子结构大致如图1所示。
此外，与传统小分子药物相比，本发明的石墨烯碱抗癌药物具有显著不同的结构特点、理化特性及药理特性。
在一个具体实施例中，本发明中作为活性成分的石墨烯碱具有下述特征之一至之四的中的一个或多个特征：
特征之一：石墨烯碱是石墨烯的一种衍生物，可看作一种超稳定π共轭平面型大分子，由几十个以上的苯环和氮杂环融合而成，平均分子量与多肽分子相当。该药物即使在特殊生理环境下(如胃酸、肝脏、细胞溶酶体)也能保持化学稳定性和生物活性，不会被生物降解而失效。
特征之二：石墨烯碱属于一种人工合成的类生物碱活性药物。不同于天然生物碱药物，石墨烯碱的药效团是环绕在石墨烯平面框架的周界并与石墨烯基面紧密融合的碱性氮杂环簇，主要由六元吡啶环、五元吡咯环和苯酚环所组成。
特征之三：石墨烯碱尺寸可调，使得药物靶向作用于肿瘤组织细胞核而正常组织细胞却不受影响成为可能。石墨烯碱横向尺寸可限定在2～10纳米范围，其尺寸上限允许纳米粒子顺利穿越核孔(直径～10nm)，靶向作用于肿瘤细胞核的DNA双链。尺寸下限设置是考虑到正常组织与肿瘤组织在微血管结构及通透性方面的显著差异性。对非病变正常组织，微血管完整，内皮细胞排列紧密，间隙小到～1-2纳米，小分子药物容易渗透，易产生毒副作用，而纳米药物不易透过，可降低毒副作用。实体瘤组织则不同：血管结构完整性差，内皮细胞间隙异常增宽，淋巴回流缺失，造成对纳米药物的高通透性和滞留性(EPR效应)。利用纳米粒子的EPR效应，可实现石墨烯药物对实体瘤的被动靶向。
特征之四：石墨烯碱选择性靶向作用于细胞核DNA的大沟区，为拓扑异构酶I和II的双重抑制剂。石墨烯碱形状不规则，边缘多有细小棱角，会选择性靶向插入DNA大沟底部。石墨烯棱角尖端部分含有若干带正电荷的氮杂环，与带负电荷的DNA磷酸二酯键骨架发生强静电作用，同时药物尖端含有氢键给体和受体，能与DNA大沟中碱基的受体或给体发生氢键作用。DNA的大沟区域是各种DNA结合蛋白如拓扑异构酶I和II及蛋白转录因子的结合部位，插入DNA大沟的石墨烯碱平面会阻断拓扑异构酶对DNA单链断点或双链断点的再连接，造成DNA不可逆损伤。而且插入DNA大沟的石墨烯生物碱进一步阻碍细胞对DNA损伤的修复，导致细胞发生凋亡。这种独特的石墨烯-DNA-蛋白质纳米界面作用构成了石墨烯碱平面药物作为拓扑异构酶I和II双重抑制剂的药理基础。
制备方法
本发明的第二个目的在于提供所述石墨烯碱的一种合成方法。
本发明提供的石墨烯碱合成的方法是基于一种有机相催化的分子融合法，其中，以一种氮杂环芳香化合物(久洛利定(Julolidine))为药物前驱体，在醇溶剂中通过一步溶剂热催化反应及随后的分离提纯，最终获得可室温长期稳定储存而不发生团聚的石墨烯碱溶液产品(水溶液或其生理盐水注射液)。与传统有机小分子化疗药物合成相比，该合成方法具有合成步骤少(仅单步合成)、反应温和安全(120℃)、合成时间短(1h)、合成过程绿色环保(只使用无毒性的乙醇和乙酸)、重复性好、合成成本低、总产率高(～55％)等优点。
在另一优选例中，在实施上述反应中，醇溶剂可用乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异戊醇替换。催化剂可用乙酸、丙酸、丁酸、辛酸、己二酸、乙二酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、酒石酸、苯甲酸、苯乙酸、邻苯二甲酸或酸酐，也可用三氯氧磷、五氯化磷、五氧化二磷代替。
在实施上述合成中，溶剂热反应在反应釜(如泰富龙反应釜)中进行，也可在微波辅助的条件下进行，或在高沸点溶剂中常压下回流反应。优选地，采用溶剂热合成的方法(是指泰富龙反应釜或工业用反应釜中进行的)，该方法易于大规模生产且成本更低。
在实施分离提纯产物过程中，用石油醚萃取去除脂溶性小分子杂质。产物分离也可采用层析柱分离法和盐沉降离心分离法。
在一个具体实施例中，本发明提供了一种石墨烯碱纳米药物的制备方法，所述制备包括如下步骤：
a.久洛利定(Julolidine)为前驱体，先溶解于醇溶剂,再加入催化剂一起搅拌，然后转入聚四氟乙烯高压反应釜，在120～230℃的加热条件下保温反应1～12h；
b.待自然冷却后先用220nm滤膜过滤除去不溶性杂质，再进一步分离提纯，除去非抗癌活性的有机小分子杂质。
在另一优选例中，步骤a中，所述醇溶剂可选用乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异戊醇的其中之一。优选地，选用乙醇作溶剂。
在另一优选例中，步骤a中，所述催化剂可选用乙酸、丙酸、丁酸、乙二酸、丙二酸、丁二酸、己二酸、马来酸、酒石酸、苯甲酸、苯乙酸、邻苯二甲酸、有机酸干、五氧化二磷、三氯氧磷、五氯化磷的其中之一，优选地，选用乙酸作催化剂。
在另一优选例中，醇溶剂中的前驱体浓度为2.0～2.5mg/mL，溶剂与催化剂的体积比为4～40。
在另一优选例中，步骤b中，通过萃取提纯法进行提纯，包括步骤：用石油醚萃取，多次除去残留小分子杂质。
在另一优选例中，步骤b中，通过层析柱分离法进行分离，包括步骤：先将石墨烯碱分散于三氯甲烷溶液中，随后加入到中性三氧化二铝层析柱中，用三氯甲烷、环己烷、乙醇的混合溶液作为淋洗液，根据石墨烯生物碱药物在紫外灯下发出黄色荧光的特性，收集分离的石墨烯碱溶液。
在另一优选例中，步骤b中，通过盐沉降离心分离法进行分离，包括步骤：先用旋蒸法除去石墨烯碱乙醇溶液中的溶剂，再分散于20mL水中，随后加入0.2g硝酸盐溶解，待溶液静置10分钟后，石墨烯碱从溶液中析出，再通过离心将析出的石墨烯生物碱分离。
在一个具体实施例中，本发明还提供了另一种石墨烯碱纳米药物的制备方法，包括如下步骤：将0.1g久洛利定(Julolidine)加入到40mL异戊醇、正辛醇或十二醇等高沸点溶剂中，之后再向溶液中加入1～3mL乙酸，或0.02～0.1g乙酸酐，或0.02～0.1g五氧化二磷(或三氯氧磷、五氯化磷等)。待全部溶解后转入到100mL三口烧瓶中，在油浴锅中回流加热130～170℃，并保温40～120min。反应结束后，用硝酸盐选择沉降法进行分离提纯。
在一个具体实施例中，本发明还提供了另一种石墨烯碱纳米药物的制备方法，包括如下步骤：将久洛利定(Julolidine)(0.1g)溶解于10mL无水乙醇，并加入0.1～1mL的乙酸，搅拌10min。然后将该溶液转入到微波反应器的35mL反应管中，在120～200℃的微波加热条件下反应5～60min。反应结束后，用硝酸盐选择沉降石墨烯碱，进行分离提纯。
本发明的石墨烯碱的用途
本发明的第三个目的在于提供上述石墨烯生物碱的抗癌用途。
GA或含其的抗癌药物结合了石墨烯生物碱的独特生物活性以及生物碱化合物的独特药理活性。体内外抗癌活性研究表明，该药物优于蒽环类抗生素、顺铂、紫杉醇等传统小分子抗癌药物，且能够有效抑制输运蛋白P-gp调控的耐药机制，而系统毒性明显低于小分子药物(如无心脏毒性、无免疫抑制副作用等)。该药物采用了稳定的石墨烯结构和碱性氮杂环设计，克服了小分子药物的结构不稳定性、低的水溶性等问题，适合应用于静脉注射或滴注、体腔注射、口服等全身给药及肝动脉灌注、膀胱灌注、肺动脉灌注等介入治疗模式。该超薄石墨烯生物碱的比表面积巨大，含有各种面内和边缘活性位点，因而可进一步进行结构优化和表面功能化，允许负载小分子药物、基因药物，接上靶向分子以及PEG分子等，也可负载到常用纳米药物载体中，改善该药物的药代动力学以及治疗指数，促进组合药物治疗以及个性化治疗等治疗方案的多种选择。
石墨烯生物碱药物可方便制成高浓度稳定分散的水溶性注射液(约3.2mg mL-1)，无需添加有机助溶剂。该注射液可在室温下长期保存，无需低温避光保存。该注射液还能高效杀灭各种细菌和病原虫，因而使用前勿需消毒处理。该注射剂适用的肿瘤类型广，包括但不限于：结肠癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、大肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、肝癌、脑癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、慢性粒细胞性白血病、血液肿瘤、淋巴肿瘤。
该注射剂将在如下肿瘤治疗中显示特效，尽管还需要大量临床试验证据：
(1)原发瘤转移抑制。由于石墨烯生物碱药物能杀灭潜伏期的癌细胞如肿瘤干细胞，在抑制原发癌细胞的扩散与迁移上会显示特效。特别适用于经手术切除后需要辅助化疗以防止原发瘤转移的肿瘤患者。
(2)瘤内注射的新辅助化疗和介入治疗。该纳米药物除应用于全身给药模式(静脉注射与腔体注射)外，在瘤内注射治疗方面也明显优于传统小分子药物，能够显著减少瘤块体积，甚至使肿瘤完全消失，因而特别适合于介入治疗或肿瘤的新辅助化疗(为便于手术切除，预先用化疗减小瘤块体积)。局部治疗的优势得益于石墨烯生物碱可在长达24-36小时的时间内保持较高的瘤内浓度。
在一个具体实施例中，本发明提供了一种石墨烯生物碱的抗癌应用，其中，石墨烯生物碱纳米粒子作为一种高效的拓扑异构酶I和II双重抑制剂，可制成药理上可接受的抗癌药物或剂型。
在另一优选例中，本发明的石墨烯生物碱的抗肿瘤谱广，可用于下述疾病包括但不限于：结肠癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、大肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、肝癌、脑癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、慢性粒细胞性白血病、血液肿瘤、淋巴肿瘤。
在另一优选例中，所述石墨烯生物碱适合应用于静脉注射或滴注、体腔注射、口服等全身给药及肝动脉灌注、膀胱灌注、肺动脉灌注等介入治疗模式。
药物组合物和施用方法
由于本发明化合物具有优异的对拓扑异构酶I和/或拓扑异构酶II的抑制活性，因此，本发明的化合物(即石墨烯生物碱)以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解由拓扑异构酶I和/或拓扑异构酶II介导的疾病。根据现有技术，本发明化合物可用于治疗以下疾病：癌症。所述的癌症包括但不限于：结肠癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、大肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、肝癌、脑癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、慢性粒细胞性白血病、血液肿瘤、淋巴肿瘤等。
本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-1000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有10-500mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如
Figure BDA0002184688740000111
)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～1000mg，优选20～600mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
要说明的是，纳米活性药物在药物结构定义上与小分子细胞毒性药物不同。后者都有限定的分子结构式或结构通式给与严格的保护说明，而纳米毒性药物没有限定的化学结构式或结构通式，只能通过描述其主要组成、结构特征和理化特性予以保护。本发明中石墨烯生物碱药物由发明内容中描述的主要结构特征和实施方案中描述的主要理化特性所定义。
实施例1—石墨烯生物碱的酸催化溶剂热合成及石油醚提纯
久洛利定(Julolidine)(0.1g)溶解于40mL无水乙醇，并加入1～3mL的乙酸(作为催化剂)，搅拌10min。然后将该溶液转入到100mL聚四氟乙烯高压反应釜中，在120～230℃的加热条件下保温反应1～12h。待自然冷却后取出石墨烯生物碱溶液，进行石油醚分离提纯。先用220nm滤膜过滤除去不溶于水的杂质，将含石墨烯生物碱的滤液转移到烧瓶中旋转蒸发除去溶剂，然后向烧瓶中加入20mL石油醚，在超声辅助下溶解水溶性差但酯溶性好的未反应前驱物以及小分子杂质，经离心分离除去石油醚溶解的小分子杂质，如此重复提纯步骤5次以上，可得纯净的石墨烯生物碱药物。加入一定体积的去离子水，配成高浓度的水溶液(3.2mg mL-1)。
上述溶解热合成中，乙醇可用正丙醇、异丙醇、正丁醇、异戊醇等分子量较小的醇类溶剂替代；乙酸可用丙酸、丁酸、乙二酸、丙二酸、丁二酸、己二酸、马来酸、酒石酸、苯甲酸、苯乙酸、邻苯二甲酸等有机酸或响应的有机酸干替代。
对上述合成药物GA的理化特性进行分析，结果如下：
形貌观测与结构分析：由电子显微观测(图2a)，石墨烯碱量子点分散性好，横向粒径为2.0～8.0纳米，平均粒径3.5±0.5nm。由原子力显微观测(图2b)，石墨烯厚度多数在1.5纳米以下，表明石墨烯生物碱为单原子层或少层结构。由高分辨电子显微观测(图2c)，石墨烯碱平面具有完整的石墨烯结构，大约由几十到上百个苯环融合而成，面内缺陷少，石墨烯形状不规则，边缘多有细小棱角。由XRD谱图可知(图3a)，石墨烯碱为碳材料，(002)晶面距为
Figure BDA0002184688740000141
由拉曼谱图可知(图3b)，石墨烯生物碱显示碳材料特有的G峰和D峰，G峰强于D峰，表明石墨烯生物碱结晶化良好。
元素组分和官能团的光电子能谱分析：元素组分和官能团的光电子能谱分析：氮掺杂位于石墨烯碱的边缘，包括吡啶N、吡咯N和石墨N三种类型。石墨烯碱含N:10.39at％，含氧：4.69at％(图4)。
石墨烯碱Zeta电位分析：在pH＝7.4和pH＝6.5时分别为+45.4eV和+59.9eV(图5a)，表明石墨烯碱在中性生理介质及肿瘤弱酸微环境中被质子化，携带大量正电荷。另外，石墨烯碱Zeta电位还随它的浓度增加而升高，在0.01～1.0mg/mL的浓度范围内，Zeta电位的变化范围为+33.2～+72.3eV(图5b)。
光学性质表征：石墨烯生物碱易溶于水，也溶于乙醇、甲苯等有机溶剂，分配系数为0.48。石墨烯碱溶液的吸收、荧光、激发和瞬时荧光的光谱测量表明，石墨烯碱具有半导体胶态量子点的光谱特征(图6)：可见光区吸收带峰值位于～460nm,荧光发射峰值位于～550nm，激发波长范围宽，最佳激发波长～470nm。石墨烯碱在不同pH条件下荧光强度几乎不变。在连续3小时紫外光照射下，石墨烯生物碱水溶液的荧光强度几乎不变，未观察到光漂白效应，表明石墨烯碱具有高的荧光稳定性。
实施例2—石墨烯生物碱药物的层析柱分离
合成步骤同实施例1，不同的是将石油醚分离提纯替换成中性三氧化二铝层析柱分离法。分离步骤包括：将制备好的石墨烯生物碱溶液(实施例中经过220nm滤膜过滤后的滤液)通过旋蒸方法将溶剂除去后，再分散于三氯甲烷溶液中。随后加入到中性三氧化二铝层析柱中，用三氯甲烷、环己烷、乙醇的混合溶液作为淋洗液，根据石墨烯生物碱药物在紫外灯下发出黄色荧光的特性，收集分离的石墨烯生物碱溶液，再用旋蒸方法将溶剂除去，加入一定体积的去离子水，配成高浓度的水溶液(3.2mg mL-1)。
经测试，理化特性与实施例1制备的石墨烯生物碱一致。
实施例3—石墨烯生物碱药物的硝酸盐选择沉降分离
酸/醇溶剂热合成步骤同实施例1，不同的是将石油醚分离提纯替换为硝酸根离子选择沉降分离法。分离步骤包括：将制备好的40mL石墨烯生物碱乙醇溶液通过旋蒸除去溶剂后，再分散于20mL水溶液中，随后加入0.2g硝酸镍溶解，待溶液静置10分钟后，石墨烯生物碱从溶液中析出，溶液变浑浊，再通过离心将析出的石墨烯生物碱分离，而水溶液中的有机小分子杂质还留在上清液中被除去。然后将一次分离的石墨烯生物碱再溶于乙醇中，进行二次分离。重复分离三次即可获得纯净石墨烯生物碱药物。
经测试，理化特性与实施例1制备的石墨烯生物碱一致。
实施例4—石墨烯生物碱非酸催化剂的溶剂热合成
与实施例1的酸催化合成相似，不同的是选用五氧化二磷、三氯氧磷、五氯化磷等非有机酸催化剂。具体步骤如下：将久洛利定(Julolidine)(0.1g)溶解于40mL无水乙醇，并加入0.02～0.1g五氧化二磷(或0.1～1mL三氯氧磷或五氯化磷等)，搅拌10min。然后将该溶液转入到100mL聚四氟乙烯高压反应釜中，在120～230℃的加热条件下保温反应1～12h。反应结束后，用硝酸根离子选择沉降法进行分离提纯。
经测试，理化特性与实施例1制备的石墨烯生物碱一致。
实施例5—石墨烯生物碱的冷凝回流合成
将0.1g久洛利定(Julolidine)加入到40mL异戊醇、正辛醇或十二醇等高沸点溶剂中，之后再向溶液中加入1～3mL乙酸，或0.02～0.1g乙酸酐，或0.02～0.1g五氧化二磷(三氯氧磷、五氯化磷等)。待全部溶解后转入到100mL三口烧瓶中，在油浴锅中回流加热130～170℃，并保温40～120min。反应结束后，用硝酸根离子选择沉降法进行分离提纯。
经测试，理化特性与实施例1制备的石墨烯生物碱一致。
实施例6—石墨烯生物碱的微波合成
将久洛利定(Julolidine)(0.1g)溶解于10mL无水乙醇，并加入0.1～1mL的乙酸，搅拌10min。然后将该溶液转入到35mL反应管中，在120～200℃的加热条件下反应5～60min。反应结束后，用硝酸根离子选择沉降法进行分离提纯。
经测试，理化特性与实施例1制备的石墨烯生物碱一致。
实施例7—石墨烯生物碱的体外抗癌活性评估
通过MTT法测定石墨烯生物碱药物对肿瘤细胞的细胞存活率的影响，细胞存活率表示为总细胞中活细胞的百分比。将5×103个/孔的MCF-7人乳腺癌细胞、Hela人宫颈癌细胞、4T1小鼠乳腺癌细胞、Hgc-27人胃癌细胞、A549人肺癌细胞和HepG-2人肝癌细胞分别接种于96孔板，所有的细胞培养至少24小时后将不同浓度的石墨烯生物碱药物与细胞共同培养24小时或48小时。随后在每个孔中加入20μL MTT溶液(5mg mL-1)，37℃下孵育4小时后用150μL DMSO代替培养基，并使用酶标仪测量490nm处各孔的吸光度。石墨烯生物碱药物的剂量为1.5、3、6、12和24μg mL-1。
实施例8—石墨烯生物碱对荷瘤鼠的瘤内给药治疗
为评估石墨烯生物碱的药效，建立裸鼠移植瘤模型(MCF-7)，并与小分子药物(DOX)进行对比。首先用小动物成像仪评估瘤内给药后药物瘤内驻留时间。然后评估瘤内给药治疗效果。将100μL的107个MCF-7细胞皮下接种于3-5周的雌性裸鼠背部。接种后7天左右肿瘤体积达到100mm3，将15只荷瘤裸鼠随机分为3组：PBS处理组(阴性对照组)、DOX处理组(阳性对照组)、石墨烯生物碱药物处理组。分别将一定体积的PBS、DOX和石墨烯生物碱药物瘤内注射到肿瘤内部(每隔7天注射一次)，每隔一天测量肿瘤的体积大小和裸鼠的体重。
实施例9—石墨烯生物碱对荷瘤鼠的静脉给药治疗
为评估石墨烯生物碱对多种肿瘤类型的系统给药疗效，分别将100μL的107个MCF-7细胞、5×106个Hela细胞、106个4T1细胞、5×106个HepG-2细胞和5×106个A549细胞皮下接种于3-5周的雌性裸鼠腋窝处。将裸鼠随机分组：PBS处理组(阴性对照组)、DOX处理组(阳性对照组)、石墨烯生物碱药物处理组。接种后7天左右肿瘤体积达到100mm3，开始静脉给药，每隔3天注射一次，每隔一天测量肿瘤的体积大小和裸鼠的体重。4T1肿瘤的转移数量通过测量裸鼠肺部转移数量来评估。
实施例10—石墨烯生物碱体内毒性评估、药代动力学分析与被动靶向分析体内毒性评估：将12只Balb/c小鼠分为3组，每组4只。将200μL浓度为500μg mL-1的石墨烯生物碱药物静脉注射于12只Balb/c小鼠体内。另外12只小鼠静脉注射200μL的PBS作为阴性对照组。分别在第1、7、21天处死小鼠(每个时间点4只)，通过眼球处取血用于血常规和血生化检测，同时将心、肝、脾、肺、肾等器官取出，组织切片后染色、拍照，进行组织学分析。
药代动力学参数测定：首先绘制石墨烯生物碱在血液中的血药浓度-荧光强度标准曲线。取小鼠新鲜全血0.5mL,加入1mL不同浓度的石墨烯生物碱药物水溶液,血液中石墨烯生物碱药物的终浓度分别为5.00、10.0、20.0、40.0、80.0μg mL-1，充分混合后离心(10000rmin-1)分离10min，取上清液0.2mL分别加入一定量的PBS溶液，测定荧光强度,并扣除空白值，从而测得血药浓度-荧光强度关系。由标准曲线可得回归方程为y＝16.34x+15.471。结合回收率、精密度、稳定性等测定结果表明血药浓度在0～100μg mL-1范围内有良好的线性关系。然后测量石墨烯生物碱药代动力学参数。取10只正常Balb/c小鼠，,按200μL浓度为500μg mL-1的剂量尾部静脉注射药物，分别于给药前、给药后1、3、5、10、20、40、60、120、180、240min摘眼球取血,1h内离心(10000rmin-1，10min)，分离血清后取0.2mL血清样品分别加入一定量的PBS溶液，测定荧光强度，并扣除空白值，得到其血药浓度。依据血清荧光强度测定值由血药浓度-荧光强度回归方程计算出在不同时间点小鼠体内的血药浓度,绘制药时曲线,由药物代谢动力学软件计算T1/2、AUC、CL等参数。
溶血实验：将从志愿者获得的5mL新鲜的乙二胺四乙酸(EDTA)稳定的人全血加入到10mL不含钙和镁的PBS中。离心10分钟并重复5次后从血清中分离出红细胞。用50mL PBS中稀释后，将红细胞悬浮液(0.2mL)加入到石墨烯生物碱药物水溶液(0.8mL)中。石墨烯生物碱药物水溶液的最终浓度范围为25-100μg mL-1。阳性对照组和阴性对照组分别为去离子水和PBS。37℃孵育3小时后离心3分钟。随后测量血红蛋白在540nm处的吸光度，以655nm作为参考。使用公式计算溶血百分比。
被动靶向评估：HepG-2、Hela和4T1肿瘤模型建立后大约7天左右，当肿瘤体积达到200mm3时，静脉注射250μg mL-1,100μL的石墨烯生物碱药物，用体内成像系统进行观察和拍照。激发波长为480nm，荧光收集波长为570nm。分别在注射后0min、5min、30min、1h、2h、4h、8h和24h时拍照。同时在静脉注射石墨烯生物碱药物0、2、4、8和24h后处死裸鼠，将主要器官取出用体内成像系统进行荧光拍照。
实施例11—石墨烯碱药物结合与DNA大沟区域的研究
首先将30μg mL-1的DNA与30μg mL-1的甲基绿共同孵育20min后，用圆二色谱测量甲基绿与DNA结合的三个特征峰。随后将不同浓度的GA药物加入甲基绿与DNA的混合溶液中，测其圆二色谱，观察三个特征峰的强度随着GA药物浓度的增加的变化情况。
实施例12—石墨烯生物碱对DNA的损伤评估
取正常的Hela细胞，分别用完全培养基培养。待细胞生长状态良好，根据实验分组，给药组分别按照IC50和4×IC50的药物浓度加入培养基中，并设一组空白对照。处理48h后进行彗星实验。
实施例13—石墨烯生物碱对拓扑异构酶I和II的抑制效果评估
在反应体系(Topo I：pBR322 DNA,Tris,DTT,MgCl2,KCl和BSA；Topo IIα：pBR322DNA,ATP,Tris,NaCl,MgCl2,KCl,EDTA和BSA)中，加入稀释好浓度的石墨烯生物碱药物(1.5、3、6、12和24μg mL-1)或100μM的阳性对照(Topo I：CPT，Topo IIα：VP-16)，混匀后加入1unit Topo I/Topo IIα，小心吹打混匀后于37℃水浴30min，加入1μL 10％SDS终止反应，与1.0％(w/v)琼脂糖凝胶以5Vcm-1条件下电泳1h，用0.5μg mL-14sGreen核酸染料避光染色15min后使用凝胶成像仪拍照观察。
对上述石墨烯生物碱GA进行MTT细胞毒性检测(测试方法参见实施例)，结果如下：
GA对任意选择的人源肿瘤(骨肉瘤、胰腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、胃癌、结直肠癌、黑色素瘤等)都具有广泛的抗癌活性，即广谱性特征。特别对恶性程度高的难治癌症如骨肉瘤(MG63)、胰腺癌(Panc-1)和肝癌(HepG-2)和死亡率最高的肺癌(A549)却显示更高的抗癌活性(图7a,7b)。
建立裸鼠移植瘤模型，对上述合成药物的体内抗癌药效进行评估(测试方法参见实施例8-9)，结果如下：
瘤内给药的药效分析：GA瘤内给药治疗效果明显优于传统小分子药物。对比GA和DOX瘤内注射给药的药效发现，低剂量给药(0.75mg kg-1)，GA对MCF-7肿瘤抑制率为100％，而高剂量的阳性对照组阿霉素(1.25mg kg-1)抑制率仅为72.4％(图12)。此结果表明GA比小分子抗癌药更适合应用于局部治疗模式，如肝动脉灌注、膀胱灌注、肺动脉灌注等介入治疗或腹腔灌注。
静脉注射的药效分析：GA对多种实体瘤的安全治疗效果也明显优于传统小分子药物(相关数据见下表)。先比较GA与阿霉素的体内疗效和毒性。当GA安全有效剂量为5.0mgkg-1时，HepG-2、A549、Hela和4T1肿瘤的生长抑制率分别为73.1％、71.8％、68.5％、69.8％，且鼠重与未治疗组相比没有降低，有的给药组反而增加(图13)。当阿霉素剂量降为GA的一半时(2.5mg kg-1)，鼠重的下降率达20％，显示高的毒副作用(主要是心脏毒性)。由于制约于剂量限制性毒性，阿霉素对HepG-2、A549、Hela和4T1的生长抑制率仅分别为40.9％、38.7％、39.1％、33.7％，远低于GA的安全治疗效果。对于4T1肿瘤，GA肺转移抑制率达97.5％，而阿霉素仅为35.9％。此结果与体外癌细胞迁移抑制实验结果相符：在GA存在的条件下，癌细胞迁移在24h内被完全阻断，而DOX药物与对照组相似，几乎完全不能抑制癌细胞迁移(图15)。然后比较GA与其它一线临床药物紫杉醇和顺铂。在与GA相同剂量的条件下，紫杉醇对4T1肿瘤的生长抑制率仅为28.5％，远低于GA的69.8％。在最高安全剂量(2.0mg kg-1)的条件下，顺铂对4T1肿瘤的生长抑制率为59.9％，也低于GA的抑制率。最后，为检验GA对耐药细胞株的体内有效性，还比较了GA和紫杉醇对耐药细胞株HCT-8/PTX的疗效，发现紫杉醇对耐药结直肠癌不敏感(治疗无效)，而GA不受耐药限制，抑制率为60.2％。综合这些结果，与小分子化疗药物相比，低毒性GA在治疗肿瘤原发灶、转移灶及耐药肿瘤方面显示强大优势。
Figure BDA0002184688740000201
对上述合成药物的药代动力学特性进行检测(测试方法参见实施例)，结果如下：
GA结构稳定，不会被代谢降解，但由于尺寸小，易被肾脏和肝脏排出体外，因此GA半衰期短，仅为62分钟(图16)。体内成像显示，静脉注射的石墨烯生物碱药物在肿瘤区域有重要的富集，显示出一定的被动靶向能力(图17)。
对上述合成药物的安全性进行评估，结果如下：
通过静脉注射石墨烯生物碱药物后的体内荧光成像来研究其在小鼠体内的系统毒性和代谢途径。可以看出GA主要通过肾脏和肝脏代谢排出体外，在注射药物24h后在体内基本看不到明显的GA荧光信号，说明石墨烯生物碱药物可以很快的被排出体外。随后，通过离体器官荧光成像同样可以看出其主要通过肾脏和肝脏排泄，而在其他器官中(心、脾、肺)没有明显的积累(图18)。通过组织学、血常规、血生化和溶血实验分析，看出治疗组小鼠的血生化和血常规指标均在正常范围之内，和对照组没有明显差别，没有观察到GA导致急性和慢性骨髓抑制问题(图19-21)。可见石墨烯生物碱药物对主要器官没有明显的毒副作用。
在分子和细胞水平上对上述合成药物的作用机理进行解析(方法参见实施例11-13)，结果如下：
1)圆二色谱法研究GA药物能否将结合与DNA大沟区域的小分子染料甲基绿竞争性的挤出该区域。实验发现(图9)，甲基绿与DNA相互作用后，在圆二色谱中会出现三个特征峰，而随着GA药物浓度的增加，这三个特征峰强度随之降低，说明GA药物将甲基绿竞争性挤出DNA大沟区域，从而证明GA药物结合与DNA大沟区域。
2)琼脂糖凝胶电泳法研究GA药物的拓扑异构酶抑制活性。实验发现(图10,11)，在石墨烯生物碱存在的条件下，拓扑异构酶I和II均不能够使质粒DNA解螺旋，实验结果与阳性对照喜树碱CPT(Topo I抑制剂)和依托泊苷VP-16(Topo II抑制剂)相似，说明GA是拓扑异构酶I和II的双重抑制剂。通过比较不同GA药物浓度下琼脂糖凝胶电泳的实验结果，发现GA药物可CPT浓度的1/6或VP-16浓度的1/10的低浓度下产生显著抑制活性。此结果与细胞毒性试验结果一致。
3)GA诱导DNA损伤的检测。彗星实验证实，石墨烯生物碱药物在半致死浓度的条件下可以使Hela细胞的DNA发生拖尾现象，说明石墨烯生物碱抗癌活性与DNA损伤有直接关系。
GA抗癌药物结合了石墨烯生物碱的独特生物活性以及生物碱化合物的独特药理活性。体内外抗癌活性研究表明，该药物优于蒽环类抗生素、顺铂、紫杉醇等传统小分子抗癌药物，而系统毒性明显低于小分子药物(如无心脏毒性、无免疫抑制副作用等)。该药物采用了稳定的石墨烯结构和碱性氮杂环设计，克服了小分子药物的结构不稳定性、低的水溶性等问题，适合应用于静脉注射或滴注、体腔注射、口服等全身给药及肝动脉灌注、膀胱灌注、肺动脉灌注等介入治疗模式。该超薄石墨烯生物碱的比表面积巨大，含有各种面内和边缘活性位点，因而可进一步进行结构优化和表面功能化，允许负载小分子药物、基因药物，接上靶向分子以及PEG分子等，也可负载到常用纳米药物载体中，改善该药物的药代动力学以及治疗指数，促进组合药物治疗以及个性化治疗等治疗方案的多种选择。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (28)

1.一种靶向DNA大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱，其特征在于，包含纳米尺度的石墨烯平面结构，所述石墨烯平面结构的尺寸为1～10nm，厚度为0.34～3.4nm。
2.根据权利要求1所述的靶向DNA大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱，其特征在于，所述石墨烯碱的准分子量为2000～20000。
3.根据权利要求1所述的靶向DNA大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱，其特征在于，还含有氮杂环簇结构，其共价键合于石墨烯石墨烯平面结构的边缘。
4.根据权利要求3所述的靶向DNA大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱，其特征在于，所述氮杂环簇结构中包含吡啶环、吡咯环、苯酚环或其组合。
5.根据权利要求4所述的靶向DNA大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱，其特征在于，所述氮杂环簇结构包括10～50个杂环的组合。
6.根据权利要求4所述的靶向DNA大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱，其特征在于，所述吡啶环结构中的N、吡咯环结构中的N和石墨N环结构中的N的比例为吡啶N：吡咯N：石墨N(原子比)＝(2.0～5.0)：(0.1～0.8)：1。
7.根据权利要求1所述的靶向DNA大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱，其特征在于，所述石墨烯碱中N的含量为5～20at％。
8.根据权利要求1所述的靶向DNA大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱，其特征在于，在生理pH(pH＝6.5～7.4)下和/或在0.01～1.0mg/mL的浓度范围内，所述石墨烯碱的Zeta电位为+33.2～+72.3eV。
9.根据权利要求1所述的靶向DNA大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱，其特征在于，所述石墨烯生物碱的水溶液最大吸收位于430～480nm处，和/或荧光发射位于530～560nm处。
10.一种如权利要求1～9任一项所述靶向DNA大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(a)一步反应：在催化剂的存在下，在醇类溶剂中，使前驱体经一步反应形成所述石墨烯碱；
其中，所述前驱体为久洛利定(Julolidine)；所述催化剂为有机酸和/或其酸酐、和/或含磷化合物。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述有机酸催化剂选自乙酸、丙酸、丁酸、乙二酸、丙二酸、丁二酸、己二酸、马来酸、酒石酸、苯甲酸、苯乙酸、邻苯二甲酸中的一种或几种的组合。
12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述含磷化合物选自五氧化二磷、三氯氧磷、五氯化磷中的一种或几种的组合。
13.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述醇类溶剂选自乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异戊醇中的一种或几种的组合。
14.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述前驱体与醇类溶剂的质量体积比(mg：ml)为(2.0～3.0):1。
15.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，当所述催化剂为液体时，所述催化剂与醇类溶剂的体积比为1:(4～40)。
16.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，当所述催化剂为固体时，所述催化剂与醇类溶剂的质量体积(mg:ml)比为1：(40～400)。
17.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，反应温度为100～300℃，反应时间为0.05～24h。
18.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤：
(b)后处理：对一步反应形成的所述石墨烯碱进行分离和/或提纯。
19.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，所述后处理步骤为：(i)基于石油醚萃取的后处理、(ii)基于柱层析分离的后处理、和/或(ii)基于盐沉降离心分离的后处理。
20.一种如权利要求1～9任一项所述靶向DNA大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱的用途，其特征在于，(i)用于制备抑制拓扑异构酶的抑制剂；和/或(ii)用于制备用于治疗和/或预防癌症的药物或其组合物。
21.根据权利要求20所述靶向DNA大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱的用途，其特征在于，所述拓扑异构酶包括拓扑异构酶I和II两种类型。
22.根据权利要求20所述靶向DNA大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱的用途，其特征在于，所述药物组合物包括所述的石墨烯碱和药学上可接受的载体或小分子药物或抗体或免疫药物。
23.根据权利要求20所述靶向DNA大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱的用途，其特征在于，所述癌症包括：结肠癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、大肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、肝癌、脑癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、慢性粒细胞性白血病、血液肿瘤、淋巴肿瘤中的一种或几种。
24.一种抑制拓扑异构酶I和/或拓扑异构酶II的方法，其特征在于，包括步骤：
使如权利要求1～9任一项所述石墨烯碱与对象接触从而抑制拓扑异构酶I和/或拓扑异构酶II。
25.根据权利要求24所述抑制拓扑异构酶I和/或拓扑异构酶II的方法，其特征在于，所述对象包括：细胞。
26.根据权利要求25所述抑制拓扑异构酶I和/或拓扑异构酶II的方法，其特征在于，所述细胞包括：MCF-7人乳腺癌细胞、人成骨肉瘤MG-63、人胰腺癌PANC-1、人肝癌HepG2、人肺癌A549、小鼠乳腺癌4T1、胃癌Hgc-27、人结肠癌HCT-8、恶性黑色素瘤A375、人类宫颈癌Hela或其组合。
27.一种治疗和/或预防疾病的方法，其特征在于，包括步骤：
向需要的对象施用如权利要求1～9任一项所述石墨烯生物碱。
28.根据权利要求27所述的治疗和/或预防疾病的方法，其特征在于，所述疾病包括：癌症、与拓扑异构酶I和/或拓扑异构酶II活性过高相关的疾病或其组合。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111939175A (zh) * 2020-07-06 2020-11-17 浙江大学 一种可治疗白血病的石墨炔衍生物
WO2021036654A1 (zh) * 2019-08-29 2021-03-04 上海大学 靶向dna大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱及其制法和用途

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102633257A (zh) * 2012-05-04 2012-08-15 东南大学 小于10nm单层石墨烯量子点生物成像剂的合成方法
CN105793190B (zh) * 2013-03-15 2018-08-28 南洋理工大学 氧化石墨烯纳米材料和阳离子季铵化壳聚糖的复合纳米材料
CN104109534B (zh) * 2013-04-18 2015-11-25 国家纳米科学中心 一种氮掺杂石墨烯量子点双光子荧光探针的制备及其应用
CN104861967B (zh) * 2015-04-14 2016-08-17 中国工程物理研究院化工材料研究所 掺氮石墨烯量子点的制备方法及其应用
CN108485659B (zh) * 2018-02-12 2021-06-04 上海大学 双亲性石墨烯量子点材料、制备方法及其作为细胞核靶向成像荧光探针的应用
CN108276996B (zh) * 2018-02-12 2021-08-10 上海大学 基于氮硫共掺杂石墨烯量子点材料、其制备方法及其应用
CN110917212A (zh) * 2019-08-29 2020-03-27 上海烯参生物科技有限公司 靶向dna大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱及其制法和用途

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021036654A1 (zh) * 2019-08-29 2021-03-04 上海大学 靶向dna大沟并抑制拓扑异构酶的石墨烯碱及其制法和用途
CN111939175A (zh) * 2020-07-06 2020-11-17 浙江大学 一种可治疗白血病的石墨炔衍生物

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