CN1109109C

CN1109109C - 多元蛋白芯片及其制法和用途

Info

Publication number: CN1109109C
Application number: CN99119486A
Authority: CN
Inventors: 靳刚
Original assignee: Institute of Mechanics of CAS
Current assignee: Institute of Mechanics of CAS
Priority date: 1999-09-20
Filing date: 1999-09-20
Publication date: 2003-05-21
Anticipated expiration: 2019-09-20
Also published as: CN1288955A

Abstract

本发明涉及一种可直接同时检测多种生物分子相互作用和生物分子活性的多元蛋白芯片和制备方法。该芯片由在固体基片上，经加工形成矩阵式分布的表面单元；再经处理形成亲或疏水极化层，后在其各个单元面积内，分别滴加具有生物活性的溶液形成多种生物分子的感应表面层组成。本发明对待测分析物无特殊要求，无需任何标记物，检测灵敏度高，样品用量少，操作简单，检测速度快可直接、快速地同时检测多种生物分子活性。

Description

多元蛋白芯片及其制法和用途

本发明涉及一种生物检测用的实验片，特别是涉及一种可直接同时检测多种生物分子相互作用和生物分子活性的多元蛋白芯片及其制法和用途。

免疫荧光技术是一种免疫分子检测技术，以荧光染料为待测分子标记物，识别和测定免疫分子活性。该方法特异性强，速度快(染色步骤和显微镜检查能在1-2小时内完成)，敏感性高。但是也有缺点如：非特异性染色问题未解决、结果判定的客观性不足、技术程序也比较复杂、需要特殊的昂贵设备，即荧光显微镜。而且染色标本只能作短期观察，不能长期保存。荧光的强度随PH值和荧光染料与抗体的比例而改变，而且对荧光强度的判定带有一定的主观性。如文献1：杨宜为编著，“免疫检测技术”，科学出版社，158(1991)，一书中介绍的。又如文献2：朱培坤，“免疫酶技术”，山东科学技术出版社，3(1983)，一书中所介绍的免疫酶技术，是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合的免疫分子检测技术，敏感性和特异性同免疫荧光技术相当，不需特殊的荧光显微镜，应用范围广泛。其中使酶与抗体(或抗原)交联起来的方法与条件，直接影响酶标抗体(或抗原)的活性，从而影响免疫酶技术的使用。只有获得一定数量的纯化酶才能用于对抗体(或抗原)的标记，或者在非标记免疫酶技术中作为抗原使用。在免疫酶技术的固相载体方法中；固相载体的选择是否合适，会直接影响实验结果。在免疫酶技术的组织化学方法中，则要注意消除组织中内源酶染色与非特异性染色的干扰，否则会使实验达不到预期的目的。

在文献1一书中还介绍了放射免疫测定方法，该方法是目前使用最广泛的免疫分子检测方法，它有特异性强，灵敏度高，能够精确地测定体液中的微量活性物质的优点。但是，严重的缺点是，不得不使用放射性物质为分子标记物，同时需要特殊的检测仪器和安全防护器材。实验设备昂贵，实验操作要求严格，实验室中各种试剂、各种仪器、各个步骤等方面的细微变化，都可能造成测定误差。该技术是使用放射性物质，易对环境和操作者造成污染和伤害。

此外在与本发明相关的发明名称为：“生物活性探针及制法和用途”的专利申请文件中，公开了一种新的快速、灵敏检测生物活性分子的探针和方法，但是这种探针只能一次实时观测一种生物分子，因而有极大的局限性。另外，如检测多种生物分子混合溶液时，需用多种生物活性分子的探针一个一个的检测，既费工又费时造成浪费。

本发明的目的在于：克服上述已有技术的缺点，为了节约时间和人工；为了实时观测在研究或生产过程中所使用的含有多种生物分子混合溶液中，部分或全部种类的生物分子与芯片感应表面上的对应分子之间的相互作用过程，以进行生物分子动力学研究和多种生物化学样品检查；从而建立一种操作简单，结果直观，检测费用低廉，并且无需任何标记物，可对一生物分子混合溶液直接同时检测多种生物分子相互作用和生物分子活性的多元蛋白芯片及制法和用途。

本发明的目的是这样实现的：

利用具有生物活性的矩阵式分布的多元蛋白感应表面及生物分子的特异结合性，形成在椭偏成像观察下的，可以直接同时测定一生物分子混合溶液中多种生物分子活性的蛋白芯片。

本发明的提供的可直接同时检测多种生物分子活性的多元蛋白芯片，其组成包括三层结构：第一层为在固体基片上，经光刻加工，形成矩阵式分布的多表面单元；第二层为在第一层多表面单元上经亲或疏水化学极化处理，形成亲或疏水极化表面层；第三层为在第二层的各个单元表面上，分别滴加各种具有生物活性的分子溶液，以形成可以同时探测多种生物分子活性的感应表面层。

当检测时将多元蛋白芯片的感应表面放入含有待测分子的溶液中，由于生物分子的特异结合性，溶液中的活性分子与感应表面上的相应活性分子相结合，而形成复合分子，使感应表面的相应单元的表面形貌发生变化，即出现表面复合膜层或复合分子进入溶液使多元蛋白芯片的原表面的感应膜层部分或全部消失；而不发生特异性生物分子反应的单元的表面形貌保持不变。此表面形貌的变化可以通过椭偏成像系统观察到，并且同时观测溶液中多种生物分子的存在和多元分子的反应过程。

本发明提供的多元蛋白芯片的制作方法，依下列步骤进行：

1、固体基片表面处理，按常规半导体工艺将固体基片表面作成矩阵式

分布的多表面单元；

(1).光刻

a.按常规方法在制版玻璃上镀Cr膜；由图形发生器生成所需矩阵图案；经感光、显影，制成矩阵式掩膜版；

b.按常规CVD法，在固体基片上生成SiO₂膜层；

c.按常规方法在SiO₂膜层上涂感光胶、固化、加掩膜、光照、显影，以去除矩阵间隔部分的SiO₂的基片；

d.按常规方法将上述步骤c.制成的基片上用碱腐蚀，使间隔部分(没有SiO₂的地方)绒面化；其中NaOH碱腐蚀液浓度为20％，在80℃ 条件下，腐蚀10分钟；

e.缓冲氢氟酸(BHF∶HF∶NH₄F∶H₂O)，去除原始SiO₂；

f.CVD生长SiO₂减反射层，约150纳米，以观察生长SiO₂颜色至深蓝为止；

g.经常规方法去除矩阵格点处的SiO₂；

h.用H₂SO₄∶H₂O₂，5∶1 V/V的清洁液，清洁表面；

2、表面亲水化处理：

a.将上述步骤(1)得到的表面矩阵化的固体基片先在清洗液1中清洗5分钟，再在清洗液2中清洗5分钟，制备出在表面矩阵化的固体基片上具有亲水极化层；

其中清洗液1为：H₂O∶H₂O₂(浓度30％wt)∶NH₄OH(浓度25％wt)＝5∶1∶1(V/V)

清洗液2为：H₂O∶H₂O₂(浓度30％wt)∶HCl(浓度37％wt)＝6∶1∶1(V/V)

b.或者表面疏水化：

c.将上述步骤获得的具有亲水极化层的固体基片表面放入硅烷溶液，其配比为硅烷∶三氯乙烯＝1∶4(V/V)，浸泡5分钟时间，制备出在表面矩阵化的固体基片上具有疏水极化层；

3、活性生物分子感应膜层制备

将上述步骤处理好的固体基片矩阵化表面上各个格点表面上，分别用加样枪滴加不同种类的活性生物分子溶液，使不同生物分子自然吸附在各格点表面上，持续30分钟，然后用去离子水洗净，即得活性生物分子感应膜层；

其中所述的固体基片包括：各种半导体基片如：硅片、锗片等；玻璃，金属，塑料和固体复合材料，如：半导体表面镀金属膜等。

其中所述的生物分子包括：各种具有特异性结合的生物分子。

本发明的多元蛋白芯片进行生物分子的活性探测采用如下步骤：

将一制好的多元蛋白芯片感应表面浸入待测的混合物溶液，经一定反应时间后，溶液中的生物分子与感应表面上相应格点上的特定分子特异性结合，形成分子复合物。使感应表面上相应格点的形貌发生变化，即出现表面复合膜层或复合分子进入溶液，使原表面的感应膜层部分或全部消失。而不发生特异性分子结合的格点处的表面形貌保持不变。此表面形貌的变化可以通过椭偏成像系统观察到，以此同时观测多种生物分子的相互作用或待测物中的各种活性生物分子存在情况。

本发明的多元蛋白芯片有以下用途：

1)优化免疫测定；

2)筛选，鉴定受体或配体；

3)免疫特异识别机理的研究；

4)内分泌激素检测；

5)生物活性探测；

6)药物筛选；

7)常规门诊免疫检查；

可用于内分泌学、免疫病理学、血液学、寄生虫学、微生物学、人体及动物病毒学、植物病毒学、兽医学、肿瘤学、细胞生物学、遗传学、生物化学、分子生物学、医学及药物学、食品卫生学等学科的研究。

可用于医院临床疾病和健康状况诊断。

本发明的优点及效果：

1、本发明克服了已有检测技术的缺点，对待测分析物无特殊要求，提供可直接、快速地同时检测多种生物分子活性的多元蛋白芯片。

2、应用本发明的多元蛋白芯片进行检测时，检测样品无需任何标记物，这样避免许多麻烦和污染问题，检测灵敏度高，同放射免疫法相当。

3、直接测量非纯化的多种生物分子的混合物。

4、样品用量少，操作简单，检测速度快，即使对于检测多种生物分子的混合物溶液一般仅需30分钟。5、实时检测多元生物分子相互作用的动态过程。6、具有分辨和排除干扰信号能力。7、适用范围广，可在气、液相中检测。8、结果直观，其表面形貌的变化可以通过椭偏成像系统直接观察到。

下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明：

图1是本发明的多元蛋白芯片结构示意图

图2是本发明的多元蛋白芯片经过浸进测试液后的变化图

图3是本发明的多元蛋白芯片实时检测图

实施例1

(1)固体基片(1)表面处理：固体基片(1)采用p型<100>晶向，5-10Ω-cm，2英寸直径的双抛光面硅片，在硅片上进行光刻，制备矩阵化表面：

a.在制版玻璃上：Cr膜+感光胶；由图形发生器生成1.5×1.5mm方格，间隔1mm矩阵周期2.5mm图案；感光、显影，制成矩阵式掩膜；

b.CVD法，在固体基片上生成250nmSiO2膜层；

c.在SiO2膜层上涂感光胶、固化、加掩膜、光照、显影，以去除矩阵间隔部分的SiO2；

d.碱腐蚀(NaOH 20％，80℃，10分钟)，使间隔部分绒面化；

e.缓冲氢氟酸(BHF∶HF∶NH₄F∶H₂O)，去除原始SiO₂；

f.CVD生长SiO₂减反射层，约150纳米，以观色至深蓝；

g.去掩膜、光照、显影，去除矩阵格点处的SiO₂；

h.用H₂SO₄∶H₂O₂，5∶1 V/V，清洁表面；

i.立体镜观测表面，并切成4×10矩阵网格式表面备用。

(2)表面亲水极化处理：

将表面矩阵化的硅片先在清洗1液中清洗，再在清洗2液中清洗，即可。其中所用清洗液配方如下：

清洗1液：H₂O∶H₂O₂(浓度30％ wt)∶NH₄OH(浓度25％ wt)＝5∶1∶1(V/V)

清洗2液：H₂O∶H₂O₂(浓度30％ wt)∶HCl(浓度37％ wt)＝6∶1∶1(V/V)

3)活性生物分子感应膜层制备

将上述经过表面疏水化的、具有如下矩阵化表面的固体基片：

(1，1)，(1，2)，(2，1)和(2，2)；

(1，3)，(1，4)，(2，3)和(2，4)；

(3，1)，(3，2)，(4，1)和(4，2)；

(3，3)，(3，4)，(4，3)和(4，4)；

在其格点表面上分别滴加BSA，IgG，Fib，HSA等蛋白质溶液(1mg/ml)，使不同蛋白分子自然吸附在上述对应格点表面上，持续30分钟时间，然后洗净，即形成了检测上述四种蛋白抗体的多元蛋白芯片。

3)应用上述四种蛋白抗体的多元蛋白芯片进行生物分子的活性探测：

将该芯片感应表面浸入含有其中一种、两种、三种、以至四种抗体的溶液，经一定反应时间后，感应表面上相应格点上的特定生物分子与对应滴液中的抗体分子特异性结合，形成抗原-抗体分子复合物，使感应表面上相应格点出现表面复合膜层。而不发生特异性分子结合的格点处的表面形貌保持不变。此表面形貌的变化可以通过椭偏成像系统观察到，以断定溶液中有哪种抗体或哪几种抗体存在，如图1-3所示。

本实施例的多元蛋白芯片的实验方法还可用于免疫学研究及多种免疫检测。

实施例2

完全按实施例1的工艺制备出亲水极化表面的固体基片后，直接制备活性生物分子感应膜层，即可得到本发明的多元蛋白芯片。

Claims

1、一种多元蛋白芯片，其特征在于，包括三层结构：第一层为在固体基片上，经光刻加工形成矩阵式分布的多个表面单元；第二层为在多个表面单元上经亲或疏水化学极化表面层；第三层为在第二层的极化表面上，分别滴加具有生物活性的多元分子溶液形成的生物分子的感应膜层。

2、一种制备权利要求1所述的多元蛋白芯片的方法，其特征在于：依下列步骤进行：

(1)固体基片表面处理：按常规半导体工艺将固体基片表面作成矩阵式分布的多单元表面；

(2)固体基片表面极化处理：

a.将上述步骤(1)得到的表面矩阵化的固体基片进行亲水极化处理，先在由H₂O∶H₂O₂(浓度30％wt)∶NH₄OH(浓度25％wt)＝5∶1∶1(V/V)组成的清洗液1中清洗5分钟，再在由H₂O∶H₂O₂(浓度30％wt)∶HCl(浓度37％wt)组成的清洗液2中清洗5分钟；

(3)活性生物分子感应膜层的制备：

将上述步骤处理好的固体基片矩阵化表面的各个格点上，分别用加样枪滴加不同种类的活性生物分子溶液，使不同生物分子自然吸附在各格点表面上，持续30分钟，然后用离子水洗净。

3、按权利要求2所述的一种多元蛋白芯片制备方法，其特征在于：所说的固体基片表面处理按常规半导体工艺步骤如下：

a.按常规方法在制版玻璃上镀Cr膜；由图形发生器生成所需矩阵图案；经感光、显影、制成矩阵式掩膜版。

b.按常规CVD法，在固体基片上生成SiO₂膜层；

c.按常规方法在SiO₂膜层上涂感光胶、固化、加掩膜、光照、显影、以去除矩阵间隔部分的SiO₂的基片；

d.按常规方法将上述步骤c.制成的基片上用碱腐蚀，使间隔部分(没有SiO₂的地方)绒面化；其中碱腐蚀液为NaOH 20％，在80℃条件下，腐蚀10分钟；

e.缓冲氢氟酸(BHF∶HF∶NH₄F∶H₂O)，去除原始SiO₂；

g.经常规方法去除矩阵格点处的SiO₂；

h.用H₂SO₄∶H₂O₂＝5∶1 V/V的清洁液，清洁表面。

4、按权利要求2所述的一种多元蛋白芯片制备方法，其特征在于：所说的固体基片表面极化处理还包括表面疏水化处理：

将上述步骤制得的亲水表面固体基片放入4∶1(V/V)＝三氯乙烯∶硅烷液，浸泡5分钟时间。

5、应用权利要求1所述的一种多元蛋白芯片同时检测多种生物分子的活性的方法，其特征在于：采用如下步骤：

将多元蛋白芯片的感应表面浸入待测的多元分析物溶液，经一定反应时间后，溶液中的多元分子与感应表面上相应格点上的特定分子特异性结合，形成分子复合物，使感应表面上相应格点的形貌发生变化，当出现表面复合膜层或复合分子进入溶液，使原表面的感应膜层部分或全部消失；而不发生特异性分子结合的格点处的表面形貌保持不变，该表面形貌的变化通过椭偏成像系统观察，并且同时观测多元生物分子的相互作用或检测待测的多种生物分子混合物。