CN110891972B

CN110891972B - 对ror1和cd3的双特异性抗体

Info

Publication number: CN110891972B
Application number: CN201880045360.XA
Authority: CN
Inventors: 阿米特·纳什瓦尼; 萨蒂恩·戈希尔; 马可·德拉佩鲁塔
Original assignee: UCL Business Ltd
Current assignee: UCL Business Ltd
Priority date: 2017-07-05
Filing date: 2018-07-05
Publication date: 2023-05-30
Anticipated expiration: 2038-07-05
Also published as: US11306142B2; JP2020529839A; DK3645565T3; US20200157218A1; GB201710838D0; ES2906361T3; EP3985026A1; CA3068200A1; AU2018295479A1; MX2019015349A; EP3645565A1; EP3645565B1; US20220204621A1; CN110891972A; WO2019008379A1

Abstract

描述了选择性地结合受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)和T细胞受体(TCR)的CD3亚基的双特异性抗体，它们的生产和用途。还描述了双特异性抗体在癌症治疗中的用途。

Description

对ROR1和CD3的双特异性抗体

本发明涉及选择性地结合受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(Receptor TyrosineKinase Like Orphan Receptor,ROR1)和T细胞受体(T-Cell Receptor,TCR)的CD3亚基的双特异性抗体。

背景技术

受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)(也称为神经营养性酪氨酸激酶，受体相关1，NTRKR1)是在胚胎形成过程中表达的癌胚胎抗原，但在正常成人组织中表达有限。但是，它在许多血液和实体恶性肿瘤上表达：慢性淋巴细胞白血病(Chronic LymphocyticLeukaemia,CLL)、急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukaemia,ALL)、套细胞白血病、毛细胞白血病、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤、睾丸癌、子宫癌、肾上腺癌、乳腺癌、肺癌、黑素瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、肾癌。此外，ROR1在癌症干细胞的一个子集上表达。

因此，ROR1是有吸引力的治疗靶标。此外，仍然需要可用于治疗上述癌症的试剂。

发明内容

本发明的第一方面涉及双特异性抗体分子，其包含选择性结合受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)的第一抗原结合结构域，其中所述第一抗原结合结构域结合包含氨基酸Gln-261的ROR1的表位；以及

第二抗原结合结构域，其选择性地结合T细胞受体(TCR)的CD3亚基。

在第一实施例中，第一抗原结合结构域包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述轻链可变结构域包含轻链互补决定区(light chain complementaritydetermining region,LCDR)1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列；以及，LCDR3包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列；其中重链可变结构域包含重链互补决定区(heavy chain complementaritydetermining region,HCDR)1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列；以及HCDR3包含SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列；其中每个互补决定区的序列可以在最多两个氨基酸位置上与给定序列不同。

本发明还涉及一种组合物，其包含有效量的上述抗体与药学上可接受的载体的组合。

此外，本发明涉及编码上述抗体的分离的核酸分子。

另外，本发明涉及一种用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者给药治疗有效量的所述抗体或编码所述抗体的核酸，从而治疗癌症。本发明还涉及用于治疗癌症的抗体或核酸。此外，本发明涉及所述抗体或所述核酸在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

所公开的单克隆抗体特异性结合ROR1多肽。在其它实施例中，单克隆抗体以约6×10^-9M或更小的平衡常数(K_D)特异性结合ROR1多肽。在一些实施例中，单克隆抗体以约1.6×10^-9M或更小，约2×10^-9M或更小，约3×10^-9M或更小，约4×10^-9或更小或大约5×10^-9或更小的K_D特异性结合ROR1多肽。

具体实施方式

术语

除非另有说明，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常用术语的定义可以在Benjamin Lewin,Genes V,牛津大学出版社出版,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(编辑),The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell ScienceLtd.出版,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(编辑),Molecular Biologyand Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)中找到。除非另有说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。

给药：通过选择的途径将组合物引入受试者。给药可以是局部的，也可以是全身的。例如，如果选择的途径是静脉注射，则通过将组合物引入受试者的静脉中来给药组合物。在一些示例中，将公开的抗体给药于受试者。

试剂：对达到目的或结果有用的任何物质或物质的任何组合；例如，可用于预防或治疗癌症的物质或物质组合。试剂包括但不限于蛋白质、核酸分子、化合物、小分子、有机化合物、无机化合物或其他感兴趣的分子。试剂可以包括治疗剂(例如抗病毒剂)、诊断剂或药剂。在一些实施例中，该试剂是多肽试剂(例如中和抗体)。本领域技术人员将理解，特定的试剂可能用于实现多于一个的结果。

氨基酸取代：将肽中的一个氨基酸用不同的氨基酸替换。

扩增：一种增加核酸分子(例如RNA或DNA)拷贝数的技术。扩增的示例是聚合酶链式反应，其中在引物能够与样品中的核酸模板杂交的条件下，使生物样品与一对寡核苷酸引物接触。引物在合适的条件下扩展，与模板解离，然后重新退火、扩展和解离，以扩增核酸的拷贝数。扩增的产物可以通过电泳、限制性核酸内切酶切割模式、寡核苷酸杂交或连接和/或使用标准技术的核酸测序来表征。扩增的其他示例包括如专利号为5,744,311的美国专利中所公开的链置换扩增，如专利号为6,033,881的美国专利中所述的无转录等温扩增；如公开号为WO 90/01069的PCT申请中所公开的修复链反应扩增；如公开号EP-A-320308的欧洲专利中所公开的连接酶链反应扩增；如专利号为5,427,930的美国专利所公开的间隙填充连接酶链反应扩增；以及如专利号为6,025,134的美国专利中所公开的NASBA^TM RNA无转录扩增。

动物：活的多细胞脊椎动物有机体，一种包括例如哺乳动物和鸟类的类别。术语哺乳动物包括人类和非人类哺乳动物。类似地，术语“受试者”包括人类受试者和兽医受试者。

抗体：一种基本上由一个免疫球蛋白基因或多个免疫球蛋白基因或其抗原结合片段编码的多肽，其特异性结合并识别分析物(抗原)，例如ROR1多肽或其免疫原性片段。免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。

抗体例如以完整的免疫球蛋白形式存在，和以各种肽酶消化产生的许多特征明确的片段形式存在。例如，特异性结合ROR1多肽或该多肽的片段的Fab、Fv、scFv是特异性结合剂。scFv蛋白是一种融合蛋白，在其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通过一个接头(linker)结合，而在dsFv中，这些链已发生突变以引入二硫键来稳定链的缔合。该术语还包括基因工程形式，例如嵌合抗体和异源缀合抗体(heteroconjugateantibody)，例如双特异性抗体。还参见Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(PierceChemical Co.,Rockford,IL)；Kuby,Immunology,第3版,W.H.Freeman&Co.,New York,1997。

抗体片段包括但不限于以下：(1)Fab，该片段包含通过用木瓜蛋白酶消化整个抗体产生完整的轻链和一个重链的一部分而产生的抗体分子的单价抗原结合片段；(2)Fab'，其是通过用胃蛋白酶处理整个抗体，然后还原产生完整的轻链和部分重链而获得的抗体分子片段；每个抗体分子获得两个Fab'片段；(3)(Fab')₂，其是通过用胃蛋白酶处理整个抗体而不进行还原而获得的抗体的片段；(4)F(ab')₂，其是通过两个二硫键连接在一起的两个Fab'片段的二聚体；(5)Fv，其为一种基因工程片段，该片段包含表达为两条链的轻链的可变区和重链的可变区；(6)单链抗体(“SCA”)，其为一种遗传工程分子，该分子包含轻链可变区、重链可变区，两者通过合适的多肽接头作为遗传融合单链分子而连接。

抗体的抗原结合片段可以通过修饰整个抗体或使用重组DNA方法从头合成的抗体来产生。在一些示例中，术语抗体包括来自移植到支架上的抗体的一个或多个CDR的氨基酸序列。

通常，天然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键互连的重(H)链和轻(L)链。有两种轻链类型，λ和κ。有五个决定了抗体分子的功能活性的主要重链类别(或亚型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。所公开的抗体可以进行类别转换。

每条重链和轻链包含一个恒定区和一个可变区(这些区也称为“结构域”)。在几个实施例中，重链和轻链可变结构域结合以特异性结合抗原。在另外的实施例中，仅需要重链可变结构域。例如，仅由重链组成的天然存在的骆驼科抗体在不存在轻链的情况下是功能性的且稳定的(参见，例如Hamers-Casterman等人，Nature，363：446-448，1993；Sheriff等人，Nat.Struct.Biol.，3：733-736，1996)。轻链和重链可变结构域包含被三个高变区中断的“框架”区，也称为“互补决定区”或“CDR”(参见，例如，Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，美国卫生和人类服务部(U.S.Department ofHealth and Human Services)，1991)。不同轻链或重链的框架区的序列在一个物种内相对保守。抗体的框架区，即组分轻链和重链的组合框架区，用于在三维空间中定位和对齐CDR。

CDR主要负责抗原结合。不同轻链或重链的框架区的序列在一个物种内相对保守。抗体的框架区，即组分轻链和重链的组合框架区，用于在三维空间中定位和对齐CDR。

每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3(从N端到C端)，通常也由特定CDR所在的链来识别。因此，V_H CDR3位于它所在的抗体的重链的可变结构域中，而V_L CDR1是来自它所在的抗体的轻链的可变结构域的CDR1。轻链CDR也可以称为CDR L1、CDR L2和CDR L3，或LCDR1、LCDR2和LCDR3。重链CDR可以称为CDR H1、CDR H2和CDR H3，或HCDR1、HCDR2和HCDR3。

“V_H”或“VH”是指免疫球蛋白重链的可变区，包括抗体片段例如Fv、scFv、dsFv或Fab的可变区。“V_L”或“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的可变区。

“单克隆抗体”是由B淋巴细胞的单个克隆或由已经转染了单个抗体的轻链和重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如通过由骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合制备杂交抗体形成细胞。这些融合细胞及其后代被称为“杂交瘤”。在一些实施例中，单克隆抗体可以是人源化单克隆抗体。在一些实施例中，单克隆抗体可以是嵌合抗体。在一些示例中，单克隆抗体是从受试者分离的。可以确定此类分离的单克隆抗体的氨基酸序列。

“人源化”抗体是包括人框架区和来自非人(例如黑猩猩、小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的一个或多个CDR的抗体。提供CDR的非人抗体称为“供体”，而提供框架的人抗体称为“受体”。在一实施例中，所有CDR都来自人源化抗体中的供体抗体。恒定区不必存在，但是如果存在，则它们必须与人抗体恒定区基本相同，例如至少约85-90％，例如约95％或更多相同。因此，可能除CDR外，人源化抗体的所有部分与天然人抗体序列的相应部分基本相同。“人源化抗体”可以包括人源化轻链和人源化重链。人源化抗体结合至与提供CDR的供体抗体相同的抗原。人源化抗体的受体框架可以具有由来自供体框架的氨基酸进行的有限数目的取代。人源化抗体或其他单克隆抗体可具有额外的保守氨基酸取代，这些取代对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本上没有影响。可以通过基因工程构建人源化免疫球蛋白(例如，参见专利号为5,585,089的美国专利)。优选地，本发明的抗体是人源化的。

“嵌合”抗体是包括来自两种不同抗体的序列的抗体，所述两种不同抗体通常是不同种类的。例如，嵌合抗体可包含衍生自第一物种的重链和轻链可变区以及衍生自第二物种的重链和轻链恒定区。轻链的可变区和恒定区可源自第一物种，而重链的可变区可源自所述第一物种并且重链的恒定区可源自第二物种。

“中和抗体”是例如通过与病毒、细菌或肿瘤上的特定抗原结合而降低病毒、细菌或肿瘤的作用的抗体。在一些示例中，对ROR1具有特异性的抗体中和了肿瘤的所述作用。

抗原：可以刺激动物体内抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质，其包括注射或吸收到动物体内的组合物。抗原与特定体液或细胞免疫的产物反应，包括由异源抗原，例如所公开的抗原诱导的那些产物。“表位”或“抗原决定簇”是指B和/或T细胞所应答的抗原区域。在一个实施例中，当表位与MHC分子结合存在时，T细胞对表位作出应答。表位可以由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时消失。表位通常以独特的空间构象包含至少3个，更通常至少5个，大约9个或大约8-10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括，例如X射线晶体学和核磁共振。

抗原的示例包括但不限于肽、脂质、多糖和包含抗原决定簇的核酸，例如被免疫细胞识别的那些。抗原可包括衍生自感兴趣的病原体或衍生自癌细胞的肽。示例性病原体包括细菌、真菌、病毒和寄生虫。在一些实施例中，抗原衍生自癌细胞，例如血液癌细胞(慢性淋巴细胞白血病-CLL、急性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤)或实体恶性肿瘤(乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤)。在一些实施例中，抗原是ROR1多肽或其抗原片段。

“靶表位”是特异性结合感兴趣的抗体(例如单克隆抗体)的抗原上的特异性表位。在一些示例中，靶表位包括与相关抗体接触的氨基酸残基，使得靶表位可以通过确定为与抗体接触的氨基酸残基而被选择。

结合亲和力：抗体或其抗原结合片段对抗原的亲和力。在一个实施例中，亲和力是通过Frankel等人(Mol.Immunol.，16：101-106，1979)描述的Scatchard方法的改进来计算的。在另一个实施例中，结合亲和力通过抗原/抗体的解离速率来测量。在另一个实施例中，通过竞争放射免疫测定法测量了高结合亲和力。在几个示例中，高结合亲和力是至少约1×10^-8M。在其他实施例中，高结合亲和力是至少约1.5×10^-8，至少约2.0×10^-8，至少约2.5×10^-8，至少约3.0×10^-8，至少约3.5×10^-8，至少约4.0×10^-8，至少约4.5×10^-8，至少约5.0×10^-8，或至少约1×10^-8。

共轭物：两个分子连接在一起的复合物，例如通过共价键连接在一起。在一个实施例中，抗体与效应分子连接；例如，与ROR1多肽特异性结合的抗体，该抗体与效应分子或毒素共价连接。连接可以是通过化学或重组方式。在一个实施例中，连接是化学的，其中抗体部分和效应分子之间的反应已经产生了共价键，其在两个分子之间形成以形成一个分子。肽接头(短肽序列)可以任选地包含在抗体和效应分子之间。因为缀合物可以由具有独立功能的两个分子(例如抗体和效应分子)制备，所以它们有时也被称为“嵌合分子”。在一个实施例中，与效应分子连接的抗体进一步与脂质或与连接到蛋白质或肽的其他分子连接，以增加其在体内的半衰期。

对照：参考标准。在一些实施例中，对照是从健康患者获得的样品。在其他实施例中，对照是从诊断患有癌症的患者获得的组织样品，其用作阳性对照。在其他实施例中，对照是历史对照或标准参考值或值的范围(例如先前测试的对照样品，例如具有已知预后或结果的一组感染患者，或代表基线或正常值的一组样品)。

测试样品和对照之间的差异可以是增加或相反地可以是减少。该差异可以是定性差异或定量差异，例如统计上的显著差异。在一些示例中，差异是相对于对照增加或减少至少约5％，例如至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约100％，至少约150％，至少约200％，至少约250％，至少约300％，至少约350％，至少约400％，至少约500％或大于500％。

可检测的标记：可检测的分子(也称为标签)，其可直接或间接与第二个分子(例如抗体)缀合，以利于第二个分子的检测。例如，可检测标记能够通过ELISA、分光光度法、流式细胞仪、显微镜或诊断成像技术(例如CT扫描、MRI、超声、光纤检查和腹腔镜检查)进行检测。可检测标记的非限制性示例包括荧光团、荧光蛋白、化学发光剂、酶接合、放射性同位素和重金属或化合物(例如用于通过MRI检测的超顺磁性氧化铁纳米晶体)。在一个示例中，“标记的抗体”是指在抗体中掺入另一种分子。例如，标记是可检测的标记，例如放射性标记的氨基酸的掺入或到通过标记的亲和素(例如，含有荧光标记的链霉亲和素(streptavidin)或可通过光学或比色法检测的酶活性)可检测到的生物素基部分(biotinyl moieties)的多肽的附着。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的并且可以使用。用于多肽的标签的示例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如³⁵S或¹³¹I)、荧光标记(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、镧系元素磷)、酶标记(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记、生物素基、由二级报道分子(secondary reporter)识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)或磁性剂，例如钆螯合物。在一些实施例中，标签被各种长度的间隔臂附着以减少潜在的空间位阻。例如，在Sambrook等人(Molecular Cloning:ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，纽约，1989)和Ausubel等人(In CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，纽约，1998)中讨论了使用可检测标记物的方法和选择适合各种目的的可检测标记的指导。在本发明的特定实施例中，抗体或其片段可以用可检测的标记来标记。

检测：识别某物的存在、出现或事实。检测的一般方法是技术人员已知的(参见，例如，专利号为7,635,476的美国专利)，并且可以补充本文公开的方案和试剂。例如，本文包括检测受试者中表达ROR1多肽的细胞的方法。

表位：抗原决定簇。这些是具有抗原性，即引起特异性免疫应答的分子上的特定化学基团或肽序列。抗体特异性结合多肽上的特定抗原表位。在一些示例中，公开的抗体特异性结合ROR1表面上的表位。

框架区：插入CDR之间的氨基酸序列。该术语包括可变轻框架区和可变重框架区。框架区用于将CDR保持在适合抗原结合的方向上。

Fc多肽：包含除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的抗体的恒定区的多肽。Fc区通常是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域。Fc区还可包括到这些结构域的柔性铰链N末端的部分或全部。对于IgA和IgM，Fc区可以包含或可以不包含尾件(tailpiece)，并且可以与或可以不与J链结合。对于IgG，Fc区包含免疫球蛋白结构域C伽马2和C伽马3(Cγ2和Cγ3)以及C伽马1(Cγ1)和Cγ2之间铰链的下部。尽管Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常被定义为包含到其羧基末端的残基C226或P230，其中编号是根据EU索引。对于IgA，Fc区包含免疫球蛋白结构域C阿尔法2和C阿尔法3(Cα2和Cα3)以及C阿尔法1(Cα1)和Cα2之间铰链的下部。Fc区的定义内包含Fc区的功能上等效的类似物和变体。Fc区的功能上等效的类似物可以是变体Fc区，其相对于野生型或天然存在的Fc区包含一个或多个氨基酸修饰。变体Fc区将与天然存在的Fc区具有至少50％的同源性，例如约80％，约90％或至少约95％的同源性。Fc区的功能上等效的类似物可包含添加至蛋白质的N末端或C末端或从蛋白质的N末端或C末端缺失的一个或多个氨基酸残基，例如不超过30个或不超过10个的添加和/或缺失。Fc区的功能上等效的类似物包括可操作地连接至融合伴侣(fusion partner)的Fc区。Fc区的功能上等效的类似物必须包含构成如上定义的Fc区的所有Ig结构域的大部分；例如，本文定义的IgG和IgA Fc区必须包含编码CH₂的大部分序列和编码CH₃的大部分序列。因此，单独的CH₂结构域或单独的CH₃结构域不被认为是Fc区。Fc区可以单独地指该区域，或在Fc融合多肽的情况下的该区域。

宿主细胞：可以在其中繁殖载体并表达其DNA的细胞，例如公开的抗体可以在宿主细胞中表达。该细胞可以是原核的或真核的。该术语还包括受试者宿主细胞的任何后代。应当理解，所有后代可能与亲代细胞并不相同，因为在复制过程中可能会发生突变。然而，当使用术语“宿主细胞”时，包括了这种后代。

抑制或治疗疾病：抑制例如处于患癌症风险的受试者的疾病或病症的全面发展。“治疗”是指在疾病或病理状况开始发展后改善其征兆和症状的治疗性干预措施。关于疾病或病理状况，术语“改善”是指治疗的任何可观察到的有益作用。例如，可以通过易感受试者的疾病的临床症状的延迟发作、疾病的一些或全部临床症状的严重性降低、疾病的进展较慢、肿瘤/癌症大小的减小、受试者整体健康或身体状况的改善，或通过本领域公知的特定于特定疾病的其他参数的改善来证明所述有益作用。“预防性”治疗是给药于不表现出疾病征兆或仅表现出早期征兆的受试者的治疗，以降低发展病理的风险。

分离的：“分离的”生物学成分(诸如细胞，例如B细胞、核酸、肽、蛋白质、重链结构域或抗体)已与天然存在该成分的生物体细胞中的其他生物学成分基本分离，从天然存在该成分的生物体细胞中的其他生物学成分制备或纯化，所述其他生物学成分例如其他染色体和染色体外的DNA和RNA以及蛋白质。因此，已经“分离的”核酸、肽和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还涵盖通过在宿主细胞中的重组表达而制备的核酸、肽和蛋白质，以及化学合成的核酸。在一些示例中，抗体，例如对ROR1多肽具有特异性的抗体，可以例如从患有表达ROR1的肿瘤的受试者中分离。

K_d：给定相互作用的解离常数，例如多肽配位体相互作用或抗体抗原相互作用。例如，对于抗体(例如本文公开的任何抗体)和抗原(例如ROR1多肽)的双分子相互作用，其是双分子相互作用的各个组分的浓度除以复合物的浓度。

标签：可检测的化合物或组合物，其可直接或间接与另一个分子(例如抗体或蛋白质)缀合，以利于该分子的检测。标签的具体非限制性示例包括荧光标记、酶接合和放射性同位素。在一些示例中，所公开的抗体被标记。

核酸：由通过磷酸二酯键连接的核苷酸单元(核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物)、相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物组成的聚合物。因此，该术语包括核苷酸聚合物，其中核苷酸及其之间的连接包括非天然存在的合成类似物，例如但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)等。这样的多核苷酸可以例如使用自动化DNA合成仪合成。术语“寡核苷酸”通常是指短的多核苷酸，通常不大于约50个核苷酸。将理解的是，当核苷酸序列由DNA序列(即，A、T、G、C)表示时，其还包括其中“U”替代“T”的RNA序列(即，A、U、G、C)。

本文使用常规符号来描述核苷酸序列：单链核苷酸序列的左手端是5'端；双链核苷酸序列的左手方向称为5'方向。将核苷酸到新生RNA转录物的5'至3'添加方向称为转录方向。具有与mRNA相同的序列的DNA链称为“编码链”；DNA链上的具有与从该DNA转录的mRNA相同的序列，且位于5'至RNA转录物5'端的序列称为“上游序列”；DNA链上的具有与RNA相同的序列且为3'至编码RNA转录物3'端的序列称为“下游序列”。

“cDNA”是指与mRNA互补或相同的DNA，呈单链或双链形式。

“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列(例如基因、cDNA或mRNA)在具有确定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列的生物过程中用作合成其他聚合物和大分子的模板的固有特性，以及由此产生的生物学特性。因此，如果基因产生的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。基因或cDNA的编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供)和非编码链(用作转录模板)都可以称为编码蛋白质或该基因或cDNA的其他产物。除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。

“重组核酸”是指具有不天然连接在一起的核苷酸序列的核酸。这包括包含可用于转化合适的宿主细胞的扩增的或组装的核酸的核酸载体。包含重组核酸的宿主细胞被称为“重组宿主细胞”。然后，基因在重组宿主细胞中表达以产生例如“重组多肽”。重组核酸也可提供非编码功能(例如，启动子、复制起点、核糖体结合位点等)。

如果序列为第一序列的多核苷酸与序列为第二序列的多核苷酸特异性杂交，则第一序列相对于第二序列为“反义”。

用于描述两个或多个核苷酸序列或氨基酸序列之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“选自”、“比较窗口”、“相同”、“序列同一性百分比”、“基本相同”、“互补”和“基本互补”。

对于核酸序列的序列比较，通常一个序列用作参考序列，将测试序列与其进行比较。使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。使用默认程序参数。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过下述进行：通过Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2:482,1981的局部同源性算法、Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48:443,1970的同源性比对算法、Pearson&Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444,1988的类似方法的检索，通过对这些算法(威斯康星州遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传计算机组，575科学博士,Madison,WI)的计算机化实现或通过手动比对和目视检查(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人，编辑1995增刊))。

一种有用的算法示例是PILEUP。PILEUP使用Feng&Doolittle,J.Mol.Evol.35:351-360,1987的渐进比对方法的简化。使用的方法类似于Higgins&Sharp，CABIOS 5：151-153，1989中描述的方法。使用PILEUP，将参考序列与其他测试序列进行比较，以使用以下参数确定百分比序列同一性关系：默认间隙权重(3.00)、默认间隙长度权重(0.10)和加权末端间隙。可以从GCG序列分析软件包(例如7.0版)中获得PILEUP(Devereaux等人，Nuc.AcidsRes.12：387-395，1984。

适于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的另一个示例是BLAST和BLAST2.0算法，其描述于Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410,1990和Altschul等人，Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1977。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(ncbi.nlm.nih.gov)公开获得。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11，比对(B)为50，期望(E)为10，M＝5，N＝-4以及两条链的比较。BLASTP程序(用于氨基酸序列)默认使用字长(W)为3，期望(E)为10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915,1989)。寡核苷酸是长度最多约100个核苷酸碱基的线性多核苷酸序列。

ClustalW是一个程序，它以计算有效的方式比对三个或更多序列。比对多个序列突出了可能与比其他区域更高度保守的特定特征有关的相似性区域。因此，该程序可以对序列进行分类，以进行系统进化分析，目的是对进化过程中发生的取代进行建模，并得出序列之间的进化关系。ClustalW多序列比对网络表格可从EMBL-EBI(ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)的互联网上获得，另请参见Larkin等人，Bioinformatics 2007 23(21)：2947-2948。

多核苷酸或核酸序列是指长度至少10个碱基的核苷酸的聚合形式。重组多核苷酸包括这样的多核苷酸：与在其派生自的天然存在的生物基因组中其紧邻的两个编码序列(一个在5'端，一个在3'端)不直接相邻。因此，该术语包括，例如，掺入载体中的重组DNA；进入自主复制质粒或病毒的重组DNA；或进入原核生物或真核生物的基因组DNA的重组DNA，或以独立于其他序列的独立分子(例如cDNA)存在的重组DNA。核苷酸可以是核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸或任一核苷酸的修饰形式。该术语包括DNA的单链和双链形式。

药学上可接受的载体：药学上可接受的载体的使用是常规的。E.W.Martin,MackPublishing Co.,Easton,PA，1995年第19版的Remington’s Pharmaceutical Sciences描述了适用于药物递送本文公开的抗体的组合物和制剂。

通常，载体的性质将取决于所采用的特定给药方式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射的流体作为载体，所述流体包括药学上和生理上可接受的流体，其包括但不限于水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。对于固体组合物(例如粉末、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规的无毒固体载体可包括例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物学中性载体外，待施用的药物组合物可包含少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

药剂：当适当地给药于受试者或细胞时能够引起期望的治疗或预防作用的化学化合物或组合物。在一些示例中，药剂包括一种或多种公开的抗体。

多肽：任何氨基酸链，无论长度或翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)如何。在一个实施例中，该多肽是ROR1多肽。在一个实施例中，该多肽是公开的抗体或其片段。“残基”是指通过酰胺键或酰胺键模拟物而掺入多肽的氨基酸或氨基酸模拟物。多肽具有氨基末端(N末端)和羧基末端。提供功能上相似的氨基酸的保守氨基酸取代表是本领域普通技术人员所公知的。以下六组是被认为是彼此的保守替代的氨基酸的示例：

1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；

2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；和

6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。

纯化的：术语“纯化的”不需要绝对的纯度。相反，它旨在作为一个相对术语。因此，例如，纯化的肽制品是其中肽或蛋白质(例如抗体)比在细胞中天然环境中的肽或蛋白质更富集的制品。在一个实施例中，对制品纯化，使得蛋白质或肽占制品的总肽或蛋白质含量的至少50％。

重组：重组核酸是一种具有非天然存在的序列或具有由两个原本分离的序列片段人工组合而成的序列的核酸。这种人工组合通常通过化学合成或更普遍地通过人工操作分离的核酸片段，例如通过基因工程技术来完成。

序列同一性：氨基酸序列之间的相似性以序列之间的相似性表示，也称为序列同一性。序列同一性经常用百分比同一性(或相似性或同源性)来测量；百分比越高，两个序列越相似。当使用标准方法比对时，多肽的同源物或变体将具有较高程度的序列同一性。

用于比较的多肽序列的比对方法是本领域公知的。如上所述，可以使用各种程序和比对算法。Altschul等人，Nature Genet.6:119,1994提出了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。NCBI基本本地比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)(Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403,1990)可从多种渠道获得，包括美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI，Bethesda,MD)和互联网(以及如何使用此程序确定序列同一性的说明)。

特异性结合多肽的抗体的V_L或V_H的同源物和变体通常特征在于在与相关氨基酸序列的全长比对中，具有至少约75％，例如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的计数的序列同一性。当通过这种方法评估时，与参考序列具有更高相似性的蛋白质将显示出增加的同一性百分比，例如至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％的序列同一性。当少于整个序列进行序列同一性比较时，取决于它们与参考序列的相似性，同源物和变体通常在10-20个氨基酸的短窗口内具有至少80％的序列同一性，并且可能具有至少85％或至少90％或95％的序列同一性。本领域的技术人员将意识到，这些序列同一性范围仅用于指导；完全有可能获得落入所提供范围之外的非常重要的同源物。

“选择性杂交”或“选择性结合”的核酸在排除了无关核苷酸序列的中度或高度严格的条件下进行杂交或结合。在核酸杂交反应中，用于达到特定严格水平的条件将变化，这取决于所杂交核酸的性质。例如，在选择杂交条件时，可以考虑核酸的杂交区域的长度、互补程度、核苷酸序列组成(例如，GC相对于AT含量)和核酸类型(例如，RNA对DNA)。另一个考虑因素是核酸之一是否固定在例如过滤器上。

逐步提高严格性条件的一个具体示例如下：大约室温下2 x SSC/0.1％SDS(杂交条件)；大约室温下0.2 x SSC/0.1％SDS(低严格条件)；在约42℃下0.2 x SSC/0.1％SDS(中度严格条件)；在约68℃下0.1 x SSC(高严格条件)。本领域技术人员可以容易地确定这些条件的变异(例如，《分子克隆：实验室手册》，第二版，第1-3卷，Sambrook等人，ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)。可以仅使用这些条件中的一种(例如高严格性条件)进行洗涤，或者可以使用这些条件中的每一种，例如以上述顺序分别进行10-15分钟，并重复列出的任何或所有步骤。但是，如上所述，最佳条件将根据所涉及的特定杂交反应而变化，并且可以凭经验确定。

特异性结合：涉及抗体时，是指在蛋白质和其他生物制剂的异质群体存在下确定目标蛋白质、肽或多糖的存在的结合反应。因此，在指定条件下，抗体优先结合特定的靶蛋白、肽或多糖(诸如存在于肿瘤表面的抗原，例如ROR1)，而不会大量结合样本或受试者中存在的其他蛋白或多糖。特异性结合可以通过本领域已知的方法来确定。关于抗体抗原复合物，抗原和抗体的特异性结合具有小于约10^-7摩尔的K_d，例如小于约10^-7摩尔，10^-8摩尔，10^-9或甚至小于约10^-10摩尔。

治疗剂：在一般意义上使用，其包括处理治疗剂、预防剂和替代剂。

治疗有效量或有效量：足以在被治疗的受试者中达到所需效果的特定物质(诸如公开的抗体)的量。例如，这可以是抑制肿瘤生长所需的量。在几个实施例中，治疗有效量是减轻疾病症状所需的量。当给药于受试者时，通常将使用达到目标组织浓度的剂量，该剂量已显示达到所需的体外效果。

载体：可以通过载体将核酸分子引入宿主细胞，从而产生转化的宿主细胞。载体可以包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包括一个或多个可选择的标记基因和本领域已知的其他遗传元素。

除非上下文另外明确指出，否则单数术语“一”、“一个”和“所述”包括复数指代。类似地，除非上下文另外明确指出，否则单词“或”旨在包括“和”。还应理解，针对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子重量或分子质量值均为近似值，并且是用于描述的。尽管类似于或等同于本文描述的那些的方法和材料可以用于本公开的实践或测试中，但是下面描述了合适的方法和材料。术语“包含”意指“包括”。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用全文并入本文。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括术语解释)为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并不旨在限制性的。

特异性结合ROR1和CD3的双特异性抗体

本文公开了特异性结合ROR1和CD3的临床上有用的抗体。

在一些实施例中，所述抗体以约6×10^-9M或更小的平衡常数(K_d)特异性结合ROR1多肽。在一些实施例中，所述抗体以约1.6×10^-9M或更小，约2×10^-9M或更小，约3×10^-9M或更小，约4×10^-9M或更小或约5×10^-9M或更小的K_d特异性结合ROR1多肽。

抗体可以是任何同种型。抗体可以是例如IgM或IgG抗体，如IgG₁或IgG₂。特异性结合ROR1的抗体可以与另一种切换。一方面，编码V_L或V_H的核酸分子使用本领域熟知的方法分离，使得其不包含分别编码轻链或重链恒定区的任何核酸序列。然后将编码V_L或V_H的核酸分子可操作地连接至编码来自不同类别的免疫球蛋白分子的C_L或C_H的核酸序列。如本领域中已知的，这可以使用包含C_L或C_H链的载体或核酸分子来实现。例如，可以将特异性结合最初为IgM的ROR1的抗体类别转换为IgG。类别转换可用于将一个IgG子类别转换为另一个子类别，例如从IgG₁转换为IgG₂。

本文公开的抗体可以是大鼠抗体，并且可以包括大鼠框架区。在一些优选的实施例中，抗体是人源化的，因此包括一个或多个人框架区。在一些实施例中，本文公开的抗体是嵌合抗体。在一些实施例中，抗体包括大鼠区和人区。

该抗体可以特异性结合ROR1多肽。优选地，所述抗体可以特异性结合人ROR1多肽。抗体优选包含重链和轻链，并且优选每个V_H和V_L由三个CDR和四个FWR组成，三个CDR和四个FWR从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FWR1，CDR1，FWR2，CDR2，FWR3，CDR3，FWR4，如上所述。

在第一实施例中，与受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)选择性结合的第一抗原结合结构域包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中该轻链可变结构域包含轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列；并且LCDR3包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列；其中重链可变结构域包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列；并且HCDR3包含SEQ IDNO：57所示的氨基酸序列；其中每个互补决定区的序列可以在最多两个氨基酸位置上与给定序列不同。

该抗体特异性结合ROR1多肽，并且特异性结合CD3。第一和/或第二抗原结合结构域可以是单克隆抗体或其抗原结合片段。在特定的实施例中，第一和第二抗原结合结构域都是单克隆抗体或其抗原结合片段。

如上所述，每个CDR的序列可以在多达两个氨基酸位置处与给定序列不同。这意味着与给定序列相比，CDR可以包含一个或两个氨基酸取代。但是，如果一个或多个CDR确实包含氨基酸取代，则抗体仍可以选择性结合ROR1。优选地，氨基酸取代是保守取代。

优选地，每个CDR的序列可以在一个氨基酸位置与给定序列不同。这意味着与给定序列相比，CDR可包含一个氨基酸取代。优选地，氨基酸取代是保守取代。

在一些实施例中，重链互补决定区3(HCDR3)包含选自SEQ ID NO：27、36、44和49中任何一个所示的序列的氨基酸序列。优选地，HCDR3包含选自SEQ ID NO：36、44和49中任何一个所示的序列的氨基酸序列。

第一抗原结合结构域可具有轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：轻链框架区(LCFR)1，其包含如SEQ ID NO：15、29、50和53之一所示的氨基酸序列；LCFR2，其包含如SEQ ID NO：17、30、38和46之一所示的氨基酸序列；LCFR3，其包含如SEQ ID NO：19、31、39、47和54之一所示的氨基酸序列；LCFR4，其包含如SEQ ID NO：21、32和40之一所示的氨基酸序列。

优选地，第一抗原结合结构域具有轻链可变结构域，其包含：LCFR1，其包含如SEQID NO：29、50和53之一所示的氨基酸序列；LCFR2，其包含如SEQ ID NO：30、38和46之一所示的氨基酸序列；LCFR3，其包含如SEQ ID NO：31、39、47和54之一所示的氨基酸序列；以及LCFR4，其包含如SEQ ID NO：32和40之一所示的氨基酸序列。

第一抗原结合结构域可具有重链可变结构域，其包含：重链框架区(HCFR)1，其包含如SEQ ID NO：22、33、41和55之一所示的氨基酸序列；HCFR2，其包含如SEQ ID NO：24、34、42和51之一所示的氨基酸序列；HCFR3，其包含如SEQ ID NO：26、35、43、48、52和56之一所示的氨基酸序列；以及HCFR4，其包含如SEQ ID NO：28、37和45之一所示的氨基酸序列。

优选地，第一抗原结合结构域可具有重链可变结构域，该重链可变结构域包含：HCFR1，其包含如SEQ ID NO：33、41和55之一所示的氨基酸序列；HCFR2，其包含如SEQ IDNO：34、42和51之一所示的氨基酸序列；HCFR3，其包含如SEQ ID NO：35、43、48、52和56之一所示的氨基酸序列；以及HCFR4，其包含如SEQ ID NO：37和45之一所示的氨基酸序列。

如下所示，上面提到的每个框架区的序列可以与给定序列不同。例如，它可能在最多10个氨基酸位置上有所不同，尽管优选的是存在少于10个氨基酸取代，以便最多可以有9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代。或者，如序列表中所示，每个框架区可包含与氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

优选地，轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：3、4、5、6、7和8之一所示的氨基酸序列。更优选地，轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：4、5、6、7和8之一所示的氨基酸序列。

优选地，重链可变结构域包含如SEQ ID NO：9、10、11、12、13和14之一所示的氨基酸序列。更优选地，重链可变结构域包含如SEQ ID NO：10、11、12、13和14之一所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4、5、6、7和8是人源化轻链可变区。SEQ ID NO：10、11、12、13和14是人源化轻链可变区。发明人尝试了这些轻链和重链区的所有组合，得到了25种不同的构建体。

因此，在一些实施例中，轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含如SEQ ID NO：10、11、12、13和14之一所示的氨基酸序列。在一个特定实施例中，轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含如SEQ ID NO：10、12和13之一所示的氨基酸序列。

在其他实施例中，轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含如SEQ ID NO：10、11、12、13和14之一所示的氨基酸序列。。

在另外的实施例中，轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含如SEQ ID NO：10、11、12、13和14之一所示的氨基酸序列。

在替代实施例中，轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含如SEQ ID NO：10、11、12、13和14之一所示的氨基酸序列。

在各种实施例中，轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含如SEQ ID NO：10、11、12、13和14之一所示的氨基酸序列。

类似地，在一些实施例中，重链可变结构域包含如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，而轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：4、5、6、7和8之一所示的氨基酸序列。

在其他实施例中，重链可变结构域包含如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，而轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：4、5、6、7和8之一所示的氨基酸序列。

在另外的实施例中，重链可变结构域包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，而轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：4、5、6、7和8之一所示的氨基酸序列。

在替代实施例中，重链可变结构域包含如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，而轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：4、5、6、7和8之一所示的氨基酸序列。

在各种实施例中，重链可变结构域包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，而轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：4、5、6、7和8之一所示的氨基酸序列。

在特定的实施例中，

(a)轻链可变结构域包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；

(b)轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；

(c)轻链可变结构域包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；

(d)轻链可变结构域包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列；

(e)轻链可变结构域包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；或

(f)轻链可变结构域包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。

如下所述，上述每个轻链可变结构域和重链可变结构域的序列可以与给定序列不同。例如，轻链/重链可变结构域可包含与序列表中列出的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。替代地，轻链/重链可变结构域序列可以在最多10个氨基酸位置处不同，但是优选存在少于10个氨基酸取代，使得最多可以有9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代。

如上所述，在一些实施例中，轻链框架区、重链框架区、轻链可变结构域和重链可变结构域包含与上述氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。例如，轻链框架区、重链框架区、轻链可变结构域和重链可变结构域在如上所述的氨基酸序列中可以包括最多10个，最多9个，最多8个，最多7个，最多6个，最多5个，最多4个，最多3个，最多两个或最多一个的氨基酸取代。在轻链可变结构域和重链可变结构域的序列存在变化的情况下，CDR中优选不具有任何氨基酸取代。特别地，上述抗体的轻链框架区和/或重链框架区可包含与上述氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。此外，轻链框架区和/或重链框架区在如上所述的氨基酸序列中可包括最多10个，最多9个，最多8个，最多7个，最多6个，最多5个，最多4个，最多3个，最多两个或最多一个的氨基酸取代。优选地，氨基酸取代如上所述是保守取代。例如，框架区可包含这样的取代以便使序列人源化。优选地，框架区是人源化的。

在第二实施例中，与受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)选择性结合的第一抗原结合结构域包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述轻链可变结构域包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列；LCDR3包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列；并且其中，重链可变结构域包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列；其中每个互补决定区的序列可以在最多两个氨基酸位置上与给定序列不同。

优选地，每个CDR的序列可以在一个氨基酸位置与给定序列不同。这意味着与给定序列相比，CDR可包含一个氨基酸取代。优选地，氨基酸取代是保守取代。更优选地，每个CDR的序列与给定序列没有不同。

如以上关于第一实施例所述，发明人尝试了轻链可变结构域(SEQ ID NO：4、5、6、7和8)和重链可变结构域(SEQ ID NO：10、11、12、13和14)的所有组合，得到25中不同的构建体。因此，以上关于这些序列的组合的描述也适用于上述第二实施例。

在特定的实施例中，

(a)轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；

(c)轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；

(d)轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列；

(e)轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；或

(f)轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。

以上提及的每个轻链可变结构域和重链可变结构域的序列可以与给定序列不同。例如，轻链/重链可变结构域可包含与该序列表中列出的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。替代地，轻/重链可变结构域序列可以在最多10个氨基酸位置处不同，但是优选存在少于10个氨基酸取代，使得最多可以有9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代。

对于上述所有实施例，本领域技术人员将意识到，任何取代将保留对于在V_H和V_L区之间正确折叠和稳定所必需的关键氨基酸残基，并且将保留这些残基的电荷特征以保留抗体的低pI和低毒性。因此，本领域技术人员可以容易地回顾上述序列、鉴定保守取代并使用公知的分子技术产生保守变体。

已经针对上述抗原结合结构域进行了表位作图。已经发现人ROR1的残基Gln-261对于抗原结合结构域是必不可少的。因此，还提供了与ROR1的表位结合的抗原结合结构域，其中该表位包含氨基酸Gln-261。

选择性结合T细胞受体(TCR)的CD3亚基的第二抗原结合结构域可以是任何合适的抗原结合结构域，并且这种结合结构域是本领域技术人员所公知的。例如，CD3单克隆抗体可获自ThermoFisher Scientific。此外，结合肿瘤抗原和CD3的双特异性抗体在本领域中也是已知的，例如，如Baeuerle和Reinhardt(Cancer Res(2009)；69(12)：4941-4944)、Chames和Baty(MAbs.(2009)；1(6)：539-547)和Hoffman等人(Int.J.Cancer(2005)115，98-104)中所述。

选择性地结合T细胞受体(TCR)的CD3亚基的第二抗原结合结构域可以包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：63、64、65、66、67和68之一所示的氨基酸序列，其中重链可变结构域包含如SEQ ID NO：69、70、71、72、73和74之一所示的氨基酸序列。优选地，轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：64、65、66、67和68之一所示的氨基酸序列，并且重链可变结构域包含如SEQ ID NO：70、71、72、73和74之一所示的氨基酸序列。

在第二抗原结合结构域的特定实施例中，

(a)轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列；

(b)轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含如SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列；

(c)轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列；

(d)轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含如SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列；

(e)轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含SEQ ID NO：73所示的氨基酸序列；或

(f)轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列，而重链可变结构域包含SEQ ID NO：74所示的氨基酸序列。

上述第二抗原结合结构域的每个轻链可变结构域和重链可变结构域的序列可以与给定序列不同。例如，轻链/重链可变结构域可包含与序列表中列出的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。替代地，轻链/重链可变结构域序列可以在最多10个氨基酸位置处不同，但是优选存在少于10个氨基酸取代，使得最多可以有9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代。优选地，重链/轻链的CDR中不存在取代。

第一抗原结合结构域可以具有抗体片段的结构，例如Fab、F(ab')₂和Fv，其包括重链和轻链可变区并且能够结合ROR1上的表位决定簇。类似地，第二抗原结合结构域可以具有抗体片段的结构，例如Fab、F(ab')₂和Fv，其包括重链和轻链可变区并且能够结合CD3上的表位决定簇。这些抗体片段保留了与抗原选择性结合的能力，并且其如上所述。制备这些片段的方法是本领域已知的(参见，例如，Harlow和Lane，Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1988)。

在另一组实施例中，抗原结合结构域可以具有Fv抗体的结构，其通常为约25kDa，并且包含每个重链和每个轻链具有三个CDR的完整的抗原结合位点。为了产生这些抗体，可以从宿主细胞中的两个单独的核酸构建体表达V_H和V_L。如果V_H和V_L非连续表达，则Fv抗体的链通常通过非共价相互作用保持在一起。然而，这些链在稀释时趋于解离，因此已经开发了通过戊二醛、分子间二硫化物或肽接头使链交联的方法。因此，在一个示例中，Fv可以是二硫键稳定的Fv(dsFv)，其中重链可变区和轻链可变区通过二硫键化学连接。

在另一个示例中，Fv片段包含通过肽接头连接的V_H和V_L链。通过构建包含编码通过寡核苷酸连接的V_H和V_L结构域的DNA序列的结构基因来制备这些单链抗原结合蛋白(scFv)。将结构基因插入表达载体，随后将其引入宿主细胞，例如大肠杆菌。重组宿主细胞合成具有桥接两个V结构域的接头肽的单个多肽链。示例性的接头包括氨基酸序列GGGGS(SEQ IDNO.1)和GGGGSGGGGS(SEQ ID NO.2)。产生scFv的方法是本领域已知的(参见Whitlow等人，Methods:a Companion to Methods in Enzymology,第2卷,97页,1991；Bird等人，Science242：423，1988；美国专利No.4,946,778；Pack等人，Bio/Technology 11：1271，1993；和Sandhu，同上)。也考虑了单链抗体(scFV₂)的二聚体。

可以通过抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌中表达编码该片段的DNA来制备包含抗原结合结构域的抗体片段。可以通过常规方法通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体来获得抗体片段。例如，抗体片段可以通过用胃蛋白酶酶促切割抗体以提供表示为F(ab')₂的5S片段来产生。该片段可以使用硫醇还原剂和任选地由二硫键的断裂产生的巯基的保护基而进一步断裂，以产生3.5S Fab'单价片段。或者，使用胃蛋白酶的酶促切割直接产生两个单价Fab'片段和一个Fc片段(参见专利号为4,036,945的美国专利和专利号为4,331,647的美国专利，以及其中包含的参考文献；Nisonhoff等人，Arch.Biochem.Biophys.89：230，1960；Porter，Biochem.J.73：119，1959；以及Edelman等人，Methods in Enzymology，第1卷，第422页，Academic Press，1967；和Coligan等人,2.8.1-2.8.10节和2.10.1-2.10.4节)。

也可以使用切割抗体的其他方法，例如分离重链以形成单价轻-重链片段，进一步切割片段，或其他酶促、化学或遗传技术，只要这些片段与可被完整抗体识别的抗原结合。

本文公开的抗体可以被衍生化或连接至另一分子(诸如另一种肽或蛋白质)。通常，抗体被衍生化，使得与ROR1多肽和CD3亚基的结合不会受到衍生化或标记的不利影响。例如，抗体可以例如通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或另外与一个或多个其他分子实体(例如另一抗体、检测剂、药剂和/或可介导抗体与另一个分子(例如链霉亲和素核心区或多组氨酸标签)缔合的蛋白质或肽)而进行功能连接。

双特异性抗体可以通过交联两个或更多个抗体(相同类型或不同类型)而产生。合适的交联剂包括异源双功能(具有两个被适当的间隔基隔开的不同反应性基团(例如间-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯))或同源双官能(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)的那些。这类接头可从例如Pierce Chemical Company(Rockford，IL)获得。

在特定的实施例中，ROR1抗原结合结构域可以是scFv抗体。在一些实施例中，CD3抗原结合结构域是scFv抗体。在各种实施例中，ROR1抗原结合结构域和CD3抗原结合结构域均为scFv抗体。这两种scFv抗体可以使用5至20个氨基酸之间的短肽接头共价连接。

在一些实施例中，双特异性抗体包含SEQ ID NO.75或76的序列，或与其具有至少90％序列同一性的序列。所述序列可具有与其至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施例中，双特异性抗体包含SEQ ID NO.75或76的序列。

可以用可检测部分或标记标记抗体，如上所述。

抗体也可以用放射性标记的氨基酸来标记。放射性标记的示例包括但不限于以下放射性同位素或放射性核苷酸：³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I。放射性标记可用于诊断和治疗目的。

检测此类标记的方法是本领域技术人员所公知的。因此，例如，可以使用摄影胶片或闪烁计数器来检测放射性标记，可以使用光检测器来检测发射的照明而检测荧光标记。通常通过向酶提供底物并检测由酶在底物上的作用而产生的反应产物来检测酶标记，并且比色标记通过简单地可视化有色标记来检测。

抗体也可以用化学基团例如聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、甲基或乙基或碳水化合物基团衍生。这些基团可用于改善抗体的生物学特性，例如增加血清半衰期或增加组织结合。

多核苷酸及其表达

还提供了编码双特异性抗体的核苷酸序列，以及提供在细胞中的有效表达的表达载体。

抗原结合结构域的重组表达通常需要构建含有编码抗体或抗体片段的多核苷酸的表达载体。提供了可复制的载体，包括与启动子可操作连接的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码抗体分子、抗体的重链或轻链、抗体或其部分的重链或轻链可变结构域、或重链或轻链CDR。这样的载体可以包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见，例如，专利号为5,981,216、5,591,639、5,658,759和5,122,464的美国专利)，并且可以将抗体的可变结构域克隆到这种载体中以表达整个重链、整个轻链或整个重链和轻链。

编码本文提供的抗体(包括但不限于抗原结合结构域)的核酸分子(也称为多核苷酸)可由本领域技术人员容易地生产。例如，可以使用本文提供的氨基酸序列(例如CDR序列、重链和轻链序列)、本领域可获得的序列(例如框架序列)和遗传密码来产生这些核酸。

本领域技术人员可以容易地使用遗传密码来构建多种功能上等效的核酸，例如序列不同但编码相同抗体序列，或编码包括V_L和/或V_H核酸序列的缀合物或融合蛋白的核酸。

可以通过任何合适的方法来制备编码与ROR1多肽和CD3特异性结合的抗原结合结构域的核酸序列，包括例如克隆合适的序列，或者通过诸如Narang等人(Meth.Enzymol.68:90-99,1979)的磷酸三酯法、Brown等人(Meth.Enzymol.68:109-151,1979)的磷酸二酯法、Beaucage等人(Tetra.Lett.22:1859-1862,1981)的四乙基亚磷酰胺法、Beaucage和Caruthers(Tetra.Letts.22(20):1859-1862,1981)描述的固相亚磷酰胺三酯法直接化学合成，例如，使用例如在Needham-VanDevanter等人，Nucl.Acids Res.12:6159-6168,1984中所述的自动合成仪，以及美国专利第4,458,066号的固相支撑方法。化学合成产生单链寡核苷酸。通过与互补序列杂交或通过使用单链作为模板用DNA聚合酶聚合，可以将其转化为双链DNA。技术人员将认识到，尽管DNA的化学合成通常限于约100个碱基的序列，但可以通过连接较短的序列来获得较长的序列。

可以通过克隆技术制备示例性核酸。合适的克隆和测序技术的示例，以及足以指导技术人员进行许多克隆练习的说明，可在上文的Sambrook等人、上文的Berger和Kimmel(编辑)和上文的Ausubel中找到。来自生物试剂和实验设备的制造商的产品信息也提供了有用的信息。此类制造商包括SIGMA化学公司(Saint Louis,MO)、R&D Systems(Minneapolis,MN)、Pharmacia Amersham(Piscataway,NJ)、CLONTECH Laboratories公司(Palo Alto,CA)、Chem Genes Corp.、Aldrich化学公司(Milwaukee,WI)、Glen Research公司、GIBCO BRL Life Technologies公司(Gaithersburg,MD)、Fluka Chemica-BiochemikaAnalytika(Fluka Chemie AG,Buchs,Switzerland)、Invitrogen(Carlsbad,CA)和应用生物系统(Foster City,CA)以及技术人员已知的许多其他商业资源。

核酸也可以通过扩增方法来制备。扩增方法包括聚合酶链反应(polymerasechain reaction,PCR)、连接酶链反应(ligase chain reaction,LCR)、基于转录的扩增系统(transcription-based amplification system,TAS)、自持序列复制系统(self-sustained sequence replication system,3SR)。多种克隆方法、宿主细胞和体外扩增方法是技术人员所公知的。

本文公开的编码任何抗原结合结构域、V_H和/或V_L(或其片段)的任何核酸均可在重组工程细胞如细菌、植物、酵母、昆虫和哺乳动物细胞中表达。这些抗体可以表达为单独的V_H和/或V_L链，或者可以表达为融合蛋白。也可以表达免疫粘附素。因此，在一些示例中，提供了编码V_H和/或V_L的核酸以及免疫粘附素。核酸序列可以任选地编码前导序列。

为了产生单链抗体，将(scFv)，即V_H和/或V_L编码DNA片段可操作地连接至另一个编码柔性接头的片段，例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)₃的片段，从而使V_H和V_L序列可以表达为连续的单链蛋白，其中V_H和V_L结构域通过柔性接头连接(参见，例如，Bird等人，Science242：423-426，1988；Huston等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 85：5879-5883，1988；McCafferty等人，Nature 348:552-554，1990)。任选地，切割位点可包含在接头中，例如弗林蛋白酶切割位点。为了从两个scFv抗体产生双特异性抗体，可将scFv DNA片段与编码包含5至20个氨基酸的柔性接头的另一个片段可操作连接，以使两个scFv序列表达为连续的单链蛋白，其中所述两个scFv抗体通过柔性接头连接。

编码V_H和/或V_L的核酸可任选地编码Fc结构域(免疫粘附素)。Fc结构域可以是IgA、IgM或IgG Fc结构域。Fc结构域可以是优化的Fc结构域，如申请号为20100/093979的美国公开专利中所述，该文献通过引用并入本文。在一个示例中，免疫粘附素为IgG₁ Fc。

预期本领域技术人员在众多可用于表达蛋白质的表达系统方面知识丰富，这些蛋白质包括大肠杆菌、其他细菌宿主、酵母菌以及各种高级真核细胞，例如COS、CHO、HeLa和骨髓瘤细胞系。一旦通过常规技术将表达载体转移至宿主细胞，则通过常规技术培养转染的细胞，以例如产生抗体。因此，提供了包含编码与异源启动子可操作连接的抗原结合结构域或其重链或轻链或其一部分的多核苷酸的宿主细胞。在表达双链抗原结合结构域的某些实施例中，编码重链和轻链的载体可以在宿主细胞中共表达以表达整个免疫球蛋白分子，如下文详述。

可用作表达重组抗体的宿主的哺乳动物细胞系是本领域所公知的，并且包括许多可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)获得的永生化细胞系，其包括但不限于中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(baby hamster kidney,BHK)细胞、猴肾细胞(monkey kidney cell,COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、人上皮肾293细胞和许多其他细胞系。不同的宿主细胞具有蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征和特定机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保抗体或其被表达的部分的正确修饰和加工。为此，可以使用具有用于适当加工基因产物的初级转录物、糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(不内源产生任何功能性免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、SP20、CRL7O3O和HsS78Bst细胞。在一个实施例中，使用人细胞系。在一个实施例中，可以使用人细胞系PER.C6(Crucell，荷兰)。可用作表达重组抗体的宿主的其他细胞系包括但不限于昆虫细胞(例如Sf21/Sf9，Trichoplusia ni Bti-Tn5b1-4)或酵母细胞(例如酿酒酵母，毕赤酵母，专利号为7,326,681的美国专利)、植物细胞(美国公开专利申请No.20080066200)；和鸡细胞(PCT公开No.WO2008142124)。

宿主细胞可以是革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌(Bacillus)、链球菌(Streptococcus)、链霉菌(Streptomyces)、葡萄球菌(Staphylococcus)、肠球菌(Enterococcus)、乳杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、梭菌(Clostridium)、土芽孢杆菌(Geobacillus)和海洋杆菌(Oceanobacillus)。在革兰氏阳性细菌例如乳杆菌中表达蛋白质的方法是本领域所公知的，参见例如美国公开专利申请No.20100/080774。乳杆菌的表达载体描述于例如美国专利No.6,100,388和美国专利No.5,728,571。可以包括前导序列以在乳杆菌中表达。革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌(Pseudomonas)、沙门氏菌(Salmonella)、弯曲杆菌(Campylobacter)、螺杆菌(Helicobacter)、黄杆菌(Flavobacterium)、梭杆菌(Fusobacterium)、条杆菌(Ilyobacter)、奈瑟氏球菌(Neisseria)和脲原体(Ureaplasma)。

可以通过将DNA转移到合适的宿主细胞中而在体外表达编码抗原结合结构域的一种或多种DNA序列。该术语还包括受试者宿主细胞的任何后代。应当理解，所有后代可能与亲代细胞并不相同，因为在复制过程中可能会发生突变。稳定转移的方法(其是指外源DNA在宿主中连续保持)是本领域已知的。

编码本文所述分离的抗体的核酸的表达可通过将DNA可操作地连接至启动子(其为组成型或诱导型)，然后掺入表达盒中来实现。该启动子可以是任何相关启动子，包括巨细胞病毒启动子和人T细胞淋巴细胞营养性病毒启动子(human T cell lymphotrophicvirus promoter,HTLV)-1。可选择地，构建体中包括增强子，例如巨细胞病毒增强子。所述盒可以适合于在原核生物或真核生物中复制和整合。典型的表达盒包含可用于调节编码蛋白质的DNA的表达的特定序列。例如，表达盒可包括合适的启动子、增强子、转录和翻译终止子、初始序列、在蛋白质编码基因前面的起始密码子(即ATG)、内含子的剪接信号、维持该基因正确阅读框以允许mRNA的正确翻译的序列，以及终止密码子。载体可以编码可选择标记，例如编码药物抗性的标记(例如，氨苄青霉素或四环素抗药性)。

为了获得克隆基因的高水平表达，期望构建表达盒，其至少包含进行直接转录的强启动子、用于引发翻译的核糖体结合位点(内部核糖体结合序列)，和转录/翻译终止子。对于大肠杆菌，它包括启动子，例如T7、trp、lac或λ启动子，核糖体结合位点，以及优选地转录终止信号。对于真核细胞，对照序列可以包括衍生自例如免疫球蛋白基因、HTLV、SV40或巨细胞病毒和多腺苷酸化序列的启动子和/或增强子，并且还可以包括剪接供体和/或受体序列(例如CMV和/或HTLV剪接受体和供体序列)。所述盒可以通过公知的方法转移到选定的宿主细胞中，所述方法例如用于大肠杆菌的转化或电穿孔和磷酸钙处理，用于哺乳动物细胞的电穿孔或脂质转染。可以通过由盒中包含的基因(例如amp、gpt、neo和hyg基因)赋予的对抗生素的抗性来选择由所述盒转化的细胞。

当宿主是真核生物时，可以使用诸如磷酸钙共沉淀之类的DNA转染方法，诸如显微注射、电穿孔、包裹在脂质体中的质粒的插入等常规机械方法，或病毒载体。真核细胞还可以与编码抗原结合结构域、标记的抗原结合结构域或其功能片段的多核苷酸序列，以及编码可选择表型(例如单纯疱疹胸苷激酶基因)的第二外源DNA分子，一起共转化。另一种方法是使用真核病毒载体，例如猿猴病毒40(SV40)或牛乳头瘤病毒，瞬时感染或转化真核细胞并表达该蛋白(例如，参见Eukaryotic Viral Vectors,Cold Spring Harbor Laboratory,Gluzman ed.,1982)。本领域技术人员可以容易地使用表达系统，例如质粒和载体，以用于在细胞中产生蛋白质，所述细胞包括高等真核细胞，例如COS、CHO、HeLa和骨髓瘤细胞系。

可以对编码本文所述抗体的核酸进行修饰而不会降低其生物学活性。可以进行一些修饰以促进将靶向分子克隆、表达或并入融合蛋白。这样的修饰是本领域技术人员所公知的，并且包括例如终止密码子、在氨基末端添加用以提供起始的甲硫氨酸、位点、位于任一末端上以产生方便定位的限制性位点的其他氨基酸，或辅助纯化步骤的其他氨基酸(例如多组氨酸)。除了重组方法之外，还可以使用本领域公知的标准肽合成来全部或部分地构建本公开的免疫缀合物、效应物部分和抗原结合结构域。

一旦被表达，抗原结合结构域和/或抗体就可以根据本领域的标准程序进行纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱色谱法等(通常参见R.Scopes,PROTEIN PURIFICATION,Springer-Verlag,N.Y.,1982)。抗原结合结构域和抗体不必是100％纯的。一旦被纯化，根据需要来部分纯化或达到均质，如果要用于治疗，抗体应基本不含内毒素。

已经描述了从细菌例如大肠杆菌表达抗体和/或将其重折叠成合适的活性形式(包括单链抗体)的方法，这些方法是公知的，并且适用于本文公开的抗原结合结构域。参见，Buchner等人，Anal.Biochem.205:263-270,1992；Pluckthun，Biotechnology 9:545,1991；Huse等人，Science 246:1275,1989，和Ward等人，Nature 341：544，1989。

通常，从包涵体中分离出来自大肠杆菌或其他细菌的功能性异源蛋白，并且所述功能性异源蛋白所述需要使用强变性剂进行增溶，然后进行重折叠。如本领域所公知的，在增溶步骤中，必须存在还原剂以分离二硫键。具有还原剂的示例性缓冲剂是：0.1M三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH 8、6M胍、2mM EDTA、0.3M DTE(二硫赤藓糖醇(dithioerythritol))。如Saxena等人，Biochemistry 9：5015-5021，1970，特别是如上Buchner等人所述，二硫键的再氧化可以在还原和氧化形式的低分子量硫醇试剂存在下发生。

复性通常通过将变性和还原的蛋白质稀释(例如100倍)到重折叠缓冲液中来完成。示例性的缓冲剂是0.1M Tris、pH 8.0、0.5M L-精氨酸、8mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)和2mM EDTA。

作为对两条链抗体纯化方案的修改，分别溶解并还原重链和轻链区，然后合并在重折叠溶液中。当这两种蛋白质以摩尔比混合使得一种蛋白质相对于另一种蛋白质不超过5倍的摩尔过量时，获得示例性的产率。氧化还原往返(redox-shuffling)完成后，可以将过量的氧化型谷胱甘肽或其他氧化型低分子量化合物添加到重折叠溶液中。

除了重组方法之外，还可以使用标准肽合成来全部或部分地构建本文公开的抗体。长度小于约50个氨基酸的多肽的固相合成可以通过将序列的C末端氨基酸连接到不溶性支持物上，然后依次添加序列中剩余的氨基酸来完成。固相合成技术在Barany&Merrifield，The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.第2卷:Special Methods inPeptide Synthesis,Part A.3-284页；Merrifield等人，J.Am.Chem.Soc.85:2149-2156,1963年，和Stewart等人，Solid Phase Peptide Synthesis,第2版,Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.,1984中有所描述。更长的蛋白质可以通过较短片段的氨基和羧基末端的缩合来合成。通过活化羧基末端(例如通过使用偶联剂N，N'-二环己基碳二亚胺(N,N'-dicylohexylcarbodimide))形成肽键的方法是本领域众所周知的。一旦产生抗体分子，就可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法对抗体分子进行纯化，例如通过色谱法(例如，离子交换、亲和力，特别是通过对特定抗原蛋白A或蛋白G的亲和力，以及分级柱色谱)、离心、差别溶解度，或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术。此外，抗体或其片段可以与上述或本领域已知的异源多肽序列(在本文中称为“标签”)融合以促进纯化。

组合物和治疗方法

还公开了一种用于治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者给药治疗有效量的所公开的抗体和/或编码该抗体的核酸，从而治疗癌症。

公开的抗体可以对癌细胞具有细胞毒性。

优选地，所述癌症是白血病(例如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、套细胞白血病或毛细胞白血病)、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤、睾丸癌、子宫癌、肾上腺癌、乳腺癌、肺癌、黑素瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、肾癌。此外，ROR1在癌症干细胞的一个子集上表达。

本发明还涉及公开的抗体用于治疗癌症的用途。此外，本发明还涉及所公开的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

就组合物有效而言，不需要完全消除癌症或肿瘤。例如，抗体可以使肿瘤减少期望的量，例如与不存在该组合物相比，减少至少10％，至少20％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％或100％。

给药本发明的抗体可导致5％、10％、20％、50％、75％、90％、95％或99％的耗竭，即恶性细胞的减少。

在另一个示例中，还可以向受试者给药有效量的其他试剂，例如化学治疗剂。该方法可包括给药一种或多种本领域已知的其他试剂。

抗体(或编码抗体的核酸)的治疗有效量将取决于疾病的严重程度和患者一般健康状况。治疗有效量的抗体可以提供症状的主观缓解或临床医生或其他有资质的观察者所指出的客观可识别的改善。如上所述，这些组合物可以与另一种治疗剂联合地同时或依次给药。对于任何应用，抗体都可以与化学疗法联合使用。

本文所公开的包含抗体的组合物的单次或多次给药取决于患者所需和耐受的剂量和频率。无论如何，该组合物应提供足够量的至少一种本文公开的抗体以有效治疗患者。该剂量可以施用一次，但是可以定期施用，直到达到治疗效果或直到由于副作用需要终止治疗为止。在一个示例中，每隔一天输注一剂抗体三十分钟。在该示例中，可以给药约一至约十剂，例如可以每隔一天给药三剂或六剂。在另一个示例中，连续输注给药约五至约十天。可以定期(例如每月)对受试者进行治疗，直到获得所需的治疗效果。通常，该剂量足以治疗或缓解疾病的症状或体征，而不会对患者产生不可接受的毒性。

还公开了在载体中包含抗体或编码抗体的核酸的组合物。所述组合物可以以单位剂型制备，以给药于受试者。给药的量和时间由主治医师决定以实现所需目的。抗体和/或核酸可以被配制用于全身或局部给药。在一个示例中，配制所述抗体或编码所述抗体的核酸用于肠胃外给药，例如静脉内给药。在一些实施例中，进行肌内给药。

活性成分也可以被包埋在例如在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或大乳剂中分别通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲基酯)微胶囊)。这样的技术已在Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.Ed.(1980)公开。具体地，可以通过如Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688(1985)；Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4030(1980)；和美国专利No.4,485,045和No.4,544,545所述的方法制备含有抗体的脂质体。具有延长的循环时间的脂质体在美国专利No.5,013,556中公开。反相蒸发法可用于包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-derivatized phosphatidylethanolamine,PEG-PE)的脂质组合物。通过具有确定孔径的过滤器挤出脂质体，以产生具有所需直径的脂质体。本发明的多肽可以通过二硫键互换反应与脂质体缀合，例如，在Martin等人在J.Biol.Chem.,257:286-288(1982)中所述。

用于给药的组合物可以包括抗体溶解在药学上可接受的载体例如水性载体中所得的溶液。可以使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。这些组合物可以通过常规的、公知的灭菌技术进行灭菌。所述组合物可包含近似生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中抗体的浓度可以在很大范围内变化，并且将主要根据所选择的特定给药方式和受试者的需要，基于体液量、粘度、体重等来选择。在一些实施例中，进行静脉内给药。

控制释放型肠胃外制剂可以制成植入物、油性注射剂或颗粒系统。对于蛋白质递送系统的广泛概述，参见Banga,A.J.,Therapeutic Peptides and Proteins:Formulation,Processing,and Delivery Systems,Technomic Publishing Company,Inc.,Lancaster,PA,(1995)。微粒系统包括微球、微粒、微胶囊、纳米胶囊、纳米球和纳米颗粒。微胶囊包含治疗蛋白，例如细胞毒素或药物，作为中心核。在微球中，治疗剂分散在整个颗粒中。小于约1μm的颗粒、微球和微胶囊通常分别称为纳米颗粒、纳米球和纳米胶囊。毛细管的直径约为5μm，因此纳米颗粒只能通过静脉内给药。微粒的直径通常在100μm左右，其通过皮下或肌肉内给药。参见，例如，Kreuter,J.,Colloidal Drug Delivery Systems,J.Kreuter编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY,pp.219-342(1994)；和Tice&Tabibi,Treatise on Controlled Drug Delivery,A.Kydonieus编辑,Marcel Dekker,Inc.NewYork,NY,第315-339页,(1992)。

聚合物可用于离子控制释放本文公开的抗体。用于受控药物递送的各种可降解和不可降解的聚合物基质在本领域中是已知的(Langer，Accounts Chem.Res.26：537-542，1993)。例如，嵌段共聚物polaxamer 407在低温下以粘性但可流动的液体形式存在，但在体温下形成半固体凝胶。已经证明它是配制和持续递送重组白介素-2和脲酶的有效载体(Johnston等人，Pharm.Res.9:425-434,1992；和Pec等人，J.Parent.Sci.Tech.44(2):58-65,1990))。或者，羟基磷灰石已被用作微载体用以控制蛋白质的释放(Ijntema等人，Int.J.Pharm.112:215-224,1994)。在另一方面，脂质体用于脂质包封药物的控制释放以及药物靶向(Betageri等人，Liposome Drug Delivery Systems,Technomic PublishingCo.,Inc.,Lancaster,PA(1993))。

用于静脉内给药的典型药物组合物包含每天约0.1-10mg/kg抗体，或每天0.5-15mg/kg抗体。可使用每位受试者每天0.1至约100mg/kg的剂量，特别是当将药剂给药于隐蔽的位点，并且不是进入循环系统或淋巴系统，例如进入体腔或器官腔中时。示例性剂量包括1-10mg/kg，例如2-8mg/kg，例如3-6mg/kg。制备可给药组合物的实际方法对于本领域技术人员来说是已知的或显而易见的，并且在诸如Remington's Pharmaceutical Science,第19版,Mack Publishing Company,Easton,PA(1995)出版物中有更详细的描述。

抗体可以冻干形式提供，并在给药前用无菌水再水化，但是它们也以已知浓度的无菌溶液提供。然后将抗体溶液添加到含有0.9％氯化钠(USP)的输液袋中，并通常以0.1-10mg/kg体重或0.5-15mg/kg体重的剂量给药。示例性剂量包括1-10mg/kg，例如2-8mg/kg，例如3-6mg/kg。自1997年

获批以来，在已经投放美国市场的抗体药物的给药方面本领域已有相当丰富的经验。抗体可以通过缓慢输注来给药，而不是通过静脉推注或大丸剂来给药。在一示例中，给药较高的负载剂量，随后维持剂量以较低的水平给药。例如，可以在大约90分钟的时间内注入4mg/kg的初始负载剂量，如果之前的剂量耐受良好，则可以每周维持在30分钟内注入2mg/kg的剂量，达4-8周

可以向需要其的受试者给药治疗有效量的编码抗体的核酸。给药核酸的一种方法是用质粒DNA，例如用哺乳动物表达质粒，直接免疫。可将编码抗体的核苷酸序列置于启动子的控制下以增加分子的表达。通过核酸构建体的免疫是本领域所公知的，并且在例如美国专利No.5,643,578，美国专利No.5,593,972和美国专利No.5,817,637中给出了教导。美国专利No.5,880,103描述了将核酸递送至生物体的几种方法。所述方法包括核酸的脂质体递送。

在使用核酸的另一种方法中，抗体也可以通过减弱的病毒宿主或载体或细菌载体(其可以给药于受试者)表达。重组痘苗病毒、腺伴随病毒(adeno-associated virus,AAV)、疱疹病毒、逆转录病毒、巨细胞病毒、痘病毒或其他病毒载体可用于表达抗体。例如，牛痘载体在美国专利No.4,722,848中进行了描述。BCG(卡介苗(Bacillus Calmette Guerin))提供了另一种用于表达所公开抗体的载体(参见Stover，Nature 351：456-460，1991)。

在一个实施例中，将编码抗体的核酸直接引入细胞中。例如，可以通过标准方法将核酸加载到金微球上，并通过诸如Bio-Rad的

基因枪之类的设备将其引入皮肤。核酸可以是“裸”的，由在强启动子控制下的质粒组成。

通常，DNA也可以注入肌肉，但是其也可以直接注入其他部位。注射剂量通常为约0.5mg/kg至约50mg/kg，并且通常为约0.005mg/kg至约5mg/kg(参见例如美国专利No.5,589,466)。

在一些示例中，例如使用受试者的细胞机制，向受试者给药编码抗体的DNA以提供体内抗体的产生。通过核酸构建体进行的免疫是本领域公知的，并且在例如美国专利No.5,643,578、美国专利No.5,593,972和美国专利No.5,817,637中给出了教导。美国专利No.5,880,103描述了几种将编码核酸递送至生物体的方法。所述方法包括脂质体递送核酸。本领域普通技术人员可以将此类方法应用于抗体或其抗体结合片段的制备。

给药核酸的一种方法是用质粒DNA，例如用哺乳动物表达质粒直接给药。可以将编码公开的抗体的核苷酸序列置于启动子的控制下以增加表达。

提供以下实施例以说明某些特定特征和/或实施方案。这些实施例不应被解释为将本公开限制为所描述的特定特征或实施方案。应结合以下附图阅读实施例：

图1：在未刺激的T细胞共培养实验中，ROR1xCD3介导的针对胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)细胞系的特异性细胞毒性。(a)MTS分析表明，ROR1xCD3和T细胞对PANC-1细胞系具有明显的细胞毒性，而单独的T细胞或CD19xCD3则无。(b)在存在ROR1xCD3的情况下，T细胞响应于PANC-1细胞而分泌特异性IL-2和IFNγ。(c)使用一组ROR1阳性PDAC细胞系在共培养试验中滴定ROR1xCD3，ROR1xCD3在低至0.1ng/ml的浓度下仍保持其细胞毒性活性。数据表示使用不同供体T细胞进行的2次独立实验的数据。

图2：ROR1xCD3的体内评估。(a)腹膜内植入：给药2x10⁶ PANC-1.Luc细胞/小鼠，随后腹腔内注射纯化的人T细胞(8x10⁶ CTRL BiTE组；分别为8x10⁶和4x10⁶ ROR1xCD3 BiTE组1和组2)。每天以10μg/kg/小鼠的剂量注射ROR1xCD3和CD19xCD3。在注射后第3、5和8天，通过体内生物发光成像(bioluminescent imaging,BLI)评估PANC-1.Luc的植入。(b)建立异种移植模型：将PANC-1细胞系(5x10⁶)注入免疫受损的无胸腺裸鼠的右侧腹，并建立异种移植，最小尺寸为100mm³。小鼠接受单次静脉注射纯化的T细胞(5x10⁶)，并每天以10μg/kg/天的剂量用ROR1xCD3、CD19xCD3或PBS静脉注射(iv)治疗7天，并通过卡尺测量肿瘤的大小。(c)建立的异种移植模型：这些动物的随访结果显示，与第28天的对照组相比，ROR1xCD3处理的小鼠的肿瘤体积更小。

图3：对ROR1阳性神经母细胞瘤细胞系的细胞毒性。

实施例

材料和方法

ScFv生成

用Aldevron GmBH对大鼠进行全长ROR1免疫，对来自随后杂交瘤的寡克隆克隆进行单细胞分选，并使用标准实验室方案通过cDNA末端的5'反向扩增分离出可变序列。将生产序列克隆到抗体中并评估其与ROR1的特异性结合，然后再将其转化为重链-接头-轻链形式的单链可变片段。

细胞系和试剂

PANC-1、SKOV-3和HEK293T细胞获自美国典型培养物保藏中心(ATCC；Teddington，Middlesex，英国)。SUIT-2、CFPAC1、HPAF-II MiaPaCa-2，PSN-1细胞系由Aldo Scarpa教授(意大利维罗纳大学和医院信托基金病理和诊断科(Department of Pathology andDiagnostics,University and Hospital Trust of Verona,Verona,Italy))友情提供。HEK293T细胞在补充了10％胎牛血清(kindly provided,FBS)(ThermoScientific)的Iscove's Modified Dulbecco培养基(ThermoScientific，Paisley，UK)中培养。将所有其他细胞系保持在补充有10％FBS的RPMI-1640培养基(ThermoScientific)中。细胞在37℃，5％CO2下培养。通过流式细胞仪用抗ROR1克隆2A2抗体(Biolegend，UK)染色来评估细胞系的ROR1表达。

ROR1xCD3生成

使用gBlocks(Integrated DNA Technologies，Leuven，Belgium)通过短氨基酸接头将ROR1和对照CD19 fmc63 ScFv偶联到抗人CD3 ScFv(克隆OKT3)，并使用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs，Ipswich,UK)重叠延伸PCR。通过NcoI/MluI限制性消化，将BiTE开放阅读框(open reading frame,ORF)克隆到GFP ORF上游的SFG逆转录病毒载体中。这两个ORF由IRES区而分开，以获得SFG.ROR1xCD3.IRES.GFP或SFG.CD19xCD3.IRES.GFP。包括N-末端的六-组氨酸标签，以进行检测和纯化。

HEK293T稳定的BiTE生产细胞的生成。

根据标准实验方案，使用RD114逆转录病毒包膜(retrovirus envelope,RDF)、PeqPam3gag-pol和SFG.ROR1xCD3.IRES.GFP或SFG.CD19xCD3.IRES.GFP载体，在HEK293T细胞中产生逆转录病毒上清液。转染后48和72小时，收获含有逆转录病毒的上清液，立即在干冰上冷冻并保存在-80℃下直至进一步使用。将HEK293T细胞(1.8x10⁶)铺在新鲜培养基中的10cm培养皿中，并在接种后24和48小时用2ml含有逆转录病毒的上清液转导。然后将转导的细胞在37C，5％CO2的加湿培养箱中培养72小时，基于GFP表达进行分类并测试BiTE的产生。

ROR1xCD3的制备、纯化和结合

收集含有ROR1xCD3或CD19xCD3的HEK293T培养基，并通过快速蛋白质液相色谱(fast protein liquid chromatography,FPLC)使用带有AKTA浏览器(英国GE HealthcareLife Sciences)的HiTrap Talon结合柱进行纯化。BiTE的质量在SDS-PAGE后通过Coomassie染色进行评估，并使用BSA稀释标准液(ThermoScientific)进行定量。使用ImageJ软件进行数据分析(美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)，美国马里兰州贝塞斯达)。ROR1xCD3和CD19xCD3使用HRP缀合的抗His抗体(Biolegend，UK)通过蛋白免疫印迹法(Western blot)验证。使用抗His标签抗体(Abcam，Cambridge，UK)通过流式细胞仪评估ROR1xCD3或CD19xCD3与靶细胞的特异性结合。

T细胞纯化

使用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare Life Sciences,UK)以密度梯度离心新鲜血液后，从健康供体获得外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。使用人Pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Surrey,英国)纯化T细胞，并通过流式细胞仪检查分离质量。与先前的报告一致，仅将新鲜分离的T细胞扩展用于动物工作：将T细胞以每孔1x10⁶个细胞接种在24孔板中，并使用CD3/CD28磁珠(ThermoScientific，英国)扩展，并在注射到小鼠体内之前保持培养一周。未刺激的T细胞用于所有体外实验。

流式细胞仪

在LRS Fortessa II流式细胞仪(Becton Dickinson,Oxford,UK)上捕获数据，并使用FlowJo软件(Flowjo LLC，Ashlard，Orgeon)进行分析。在FACSAria Cell Sorted(Becton Dickinson)上进行荧光激活的细胞分选。

共培养测定

如在原稿中所述，共培养试验在96孔板中进行，所述孔板包含1x10⁴个靶细胞，1x10⁴个T细胞和纯化的ROR1xCD3 BiTE(或CD19xCD3作为对照)，浓度为0.1ng/ml-1μg/ml。加入ROR1xCD3或CD19xCD3后24小时，收集上清液进行细胞因子评估，所述评估按照制造商的说明(Biolegend,UK)通过ELISA进行。为了评估细胞毒性，我们按照制造商的方案(Promega，UK)使用了

AQueous One Solution细胞增殖测定(MTS)。

统计

在用于Windows的GraphPad Prism版本6(GraphPad软件，La Jolla CaliforniaUSA)中进行了统计分析。当p<0.05且误差棒表示平均值的标准误差时，采用统计学意义。

动物研究

所有动物工作均在英国内政部项目和个人许可法规(the United Kingdom HomeOffice Project and Personal License regulations)的授权下进行，并符合伦敦大学学院的指导原则。小鼠获自Charles River Laboratories Inc。六至八周大的雌性Hsd：Athymic Nude-Foxn1^nu小鼠通过腹腔内注射接受了2x10⁶个PANC-1.Luc细胞。在第3、5、8天或14天后，使用D-萤光素(D-Luciferin)(Melford Laboratories)检测PANC-1.Luc荧光素酶的表达，D-萤光素以200μg/小鼠的剂量腹腔内(IP)注射，并使用IVIS成像系统100系列(Perkin Elmer)进行成像。使用Living Image 4.4软件来量化生物发光成像(bioluminescence imaging,BLI)信号，并创建ROI检测以进行定量以比较BLI强度。为了进行异种移植研究，在6-8周龄的Hsd：Athymic Nude-Foxn1^nu小鼠腹侧中注射了5x10⁶个PANC-1细胞。一旦建立异种移植(最小尺寸为100mm³)，就通过单次尾静脉注射使小鼠接受5x10⁶个T细胞，然后每天注射悬浮在PBS中的0.1％BSA(10μg/kg/小鼠)的PBS或ROR1xCD3/CD19xCD3。使用椭圆公式(长x宽²)/2计算肿瘤体积。

结果和讨论

从自大鼠杂交瘤文库中分离的一组抗ROR1抗体，我们确定了两个先导候选物，它们结合了ROR1的膜远端免疫球蛋白样结构域或较近端的卷曲结构域(Frizzled domain)。在与由短接头隔开的串联结构中的CD3 scFv偶联之前，将它们转化成单链可变片段(scFv)格式。在此ROR1-BiTE中，我们包括了一个N末端的六-组氨酸标签以进行检测和纯化，这不会影响每个臂独立结合CD3或ROR1的能力。两种ROR1-BiTE的直接比较显示出优异的细胞毒性，而膜近端结合BiTE对卷曲结构域具有特异性，因此选择后者进行进一步评估(ROR1xCD3)。

发明人集中于胰腺癌，并且在存在ROR1xCD3的情况下，ROR1阳性PANC-1细胞(一种胰管腺癌细胞系)与未刺激的T细胞以1：1的效应子：靶标比率(E：T)的共培养证明了与对照组CD19 BiTE(CD19xCD3)相比具有显著的细胞毒性(p<0.001)，这在24小时时通过细胞生存力测试评估得到(图1a)。与用CD19xCD3的共培养相比，细胞毒性与干扰素-γ(IFNγ)增加15倍，白介素2(IL-2)增加11倍有关(图1b)。重要的是，在单独使用T细胞或单独使用ROR1xCD3的共培养物中未观察到细胞毒性，这证实了ROR1xCD3和T细胞均是效应子功能所必需的。在包括PANC-1、SUIT-2、CFPAC1、HPAF-II、MiaPaCa2和PSN-1在内的多种阳性胰腺细胞系中均观察到ROR1xCD3的剂量依赖性细胞毒性，即使浓度为0.1ng/ml也有显著活性(图1c)。

但是，胰腺癌模型在复杂肿瘤环境中的再现受到限制，为了提供概念验证并与其他研究保持一致，在两个异种移植模型中评估了ROR1 BiTE。首先，将2x10⁶个PANC-1萤火虫荧光素酶阳性细胞(PANC-1.Luc)注射到无胸腺裸鼠的腹腔中，然后单次推注给药4x10⁶(E：T比为2：1)或8x10⁶(E：T比为4：1)个人T细胞。小鼠每天以10μg/kg/小鼠的剂量腹腔内注射ROR1xCD3或对照CD19xCD3。第8天的分析显示，通过无创生物发光成像(non-invasivebioluminescence imaging,BLI)评估，与接受CD19xCD3的动物相比，PANC-1.Luc植入以T细胞剂量依赖性方式分别在2：1和4：1组小鼠中减少了11或15倍(图2a)。

然后，进行更具挑战性的皮下模型，其中将5x10⁶个PANC-1细胞注入无胸腺裸鼠的右侧腹，并建立至最小100mm³的大小。随后，动物接受单次尾静脉给药5x10⁶个纯化的T细胞，然后在无外源细胞因子支持的情况下以每天10μg/kg/小鼠的剂量在腹腔内给药ROR1xCD3达7天。对照组以相同的剂量方案或赋形剂(PBS)接受CD19xCD3。与对照动物相比，在7天的治疗期内，用ROR1xCD3处理可将异种移植物的生长减少>50％(平均大小为62.2mm³对119.7mm³，p＝0.003)(图2b)。此外，对这些动物进行的更长的随访表明，尽管仅进行了7天的治疗，但与对照组相比，ROR1xCD3治疗的小鼠在第28天的肿瘤体积较小(平均大小为171.2mm³对361.2mm³，p＝0.037)，这表明进行ROR1xCD3短暂治疗可导致持久的抗肿瘤响应。这是在单次低剂量T细胞输注和具有相对低剂量的BiTE的情况下(图2c)。

尽管ROR1 ScFv既与人ROR1结合，也与鼠ROR1结合，但在任一这些小鼠模型中，在行为、身体外观或痛苦方面均未观察到毒性。

鉴于ROR1在一系列实体恶性肿瘤上表达，而与细胞来源无关，我们研究了使用ROR1xCD3对抗代表黑素瘤(T618A)、胶质母细胞瘤(U-251，A 172)、卵巢癌(SKOV-3、HOC-7、HEY)、前列腺癌(DU145、PC-3)、乳腺癌(MDA-MB-231)和肝癌(HUH7，SK-Hep-1))的细胞系的广泛适用性，这些细胞系都是ROR1阳性。与用CD19xCD3处理相比，ROR1xCD3能够针对所有这些细胞系驱动显著T细胞介导的细胞毒性。进一步证实了特异性，因为未观察到针对ROR1阴性乳腺癌MCF-7细胞系的细胞毒性。

总之，描述了新型BiTE的开发和表征，该BiTE在同时结合T细胞和ROR1阳性肿瘤细胞后引发肿瘤细胞毒性。这避免了不希望的T细胞活化的可能性，并使BiTE分子对ROR1表现出极高的选择性，ROR1是在包括胰腺癌在内的一系列肿瘤上高水平表达的靶标。在两种胰腺癌异种移植模型中，尽管动物仅接受单次低剂量的T细胞输注和相对低剂量的BiTE，但肿瘤负荷显著且持久地降低，进一步证实了疗效。

据我们所知，这是靶向ROR1的BiTE有效性的第一个直接证据，ROR1是一种在侵袭性肿瘤上高水平表达的分子，且与上皮-间质转化和转移有关。ROR1-BiTEs的真正吸引力在于其靶向癌症干细胞(该干细胞在卵巢癌和胶质母细胞瘤环境中表达ROR1)的潜力，并提高了靶向引发化疗/放射疗法抗药性癌症的干细胞的潜力。

ROR1特异性嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)T细胞正在针对血液和固体恶性肿瘤进行测试(NCT02194374，NCT02706392)，但是BiTE具有优势，因为它们易于大规模生产，易于管理且无需昂贵和费时的对患者特异性T细胞的操作，包括体外扩增和转导。此外，BiTE可以从体内迅速清除，从而最大程度地降低了意外不良毒性的风险。

实施例2

表位作图

为了评估产生的抗体的表位，我们制备了具有截短的ROR1的细胞系：这些细胞系包含表达全长ROR1的SUPT1细胞(免疫球蛋白结构域、卷曲结构域和Kringle结构域)，免疫球蛋白结构域仅SupT1，卷曲结构域仅SupT1，Kringle仅SupT1，及组合(Ig和卷曲结构域SupT1以及卷曲结构域和Kringle结构域SupT1)。这表明克隆F结合到卷曲结构域。这不同于结合免疫球蛋白结构域的现有技术抗体R12和4A5。因此，与现有技术的抗体R12和4A5相比，克隆F显示出不同的独特的结合特性。

为了进一步表征克隆F特异性结合的表位，我们将大鼠ROR1与人ROR1进行了比较，以评估这两个物种之间的氨基酸差异。我们制备了许多突变的人ROR1构建体，其包括对这些抗体可以结合的假定氨基酸的单个氨基酸取代，以进一步表征所讨论的表位。

对于克隆F，人ROR1的Fz结构域在254位和261位产生了点突变。使用的特定突变是I(254)V和Q(261)H。

发现Q(261)H取代减少或终止了克隆F抗体与ROR1-Fz结构域的结合，而I(254)V取代似乎不影响结合。此外，Q(261)H和I(254)V的组合也阻止了抗体结合。因此，Gln-261对于抗体结合必不可少。

实施例3

由于序列同源性，克隆F是产生的其他抗体(鼠和兔)独有的

使用基于Uniprot网络的软件(http://www.uniprot.org/align/)对人、鼠(murine)、兔和大鼠ROR1蛋白序列进行比对，并突出显示不同物种之间的差异。Uniprot登记号：人(Q01973)，鼠(Q9Z139)和兔(G1U5L1)。对于大鼠ROR1，使用NCBI参考序列NP_001102141.1，因为相应的Uniprot序列仅部分完整。

克隆F与Q261结合，这可能是由于该位置的大鼠氨基酸与人氨基酸之间的差异所致(261位的人氨基酸为谷氨酰胺(Q)，而大鼠此位置的相应氨基酸为组氨酸(H))。当用人ROR1免疫大鼠时，该氨基酸差异被认为是相对于产生抗体所针对的大鼠ROR1序列的免疫原。

已知的抗体R12(兔)和鼠ROR1结合物在此位点显示与人ROR1的同源性(即它们在此位置均具有谷氨酰胺(Q))。结果，用人ROR1免疫兔或小鼠不会导致针对该位置的抗体产生，因为它不具有免疫原性。鉴于此，克隆F结合该表位的能力是独有的。

实施例4

克隆F BiTE导致ROR1阳性神经母细胞瘤细胞系显著的细胞毒性

克隆F ROR1 BITE会导致ROR1阳性NB-1643和NB-7神经母细胞瘤细胞系产生显著的细胞毒性，而Rh30 ROR1阴性细胞系却不会，即使在0.01μg/ml浓度下(见图3)。

实施例5

与非人源化比较物构建体相比，克隆F的人源化具有优势

与CD19相反，靶向ROR1的基本原理之一是保留了正常的ROR1阴性B细胞群体。然而，与此同时，正常CD19+B细胞的持续存在允许针对大鼠衍生的scFv产生免疫应答。这在鼠类scFv中已经看到了，并且这导致了临床上显著的结果，包括使用mRNA修饰的间皮素CAR T细胞(Maus等人，2013)或抗体应答的过敏反应，或使用α-叶酸受体或碳酸酐酶IX特异性CART细胞的过敏反应(Lamers等人，2006；Kershaw等人，2006)。由于CAR成分在MHC上的交叉呈递，T细胞介导的免疫应答也是可能的。相比之下，CD19 CAR T细胞通过消灭正常的B细胞群体，固有地中和了基于抗体的免疫应答的风险，而B细胞重现与更高的复发风险相关。

通过对克隆F进行人源化，我们降低了针对BiTE的免疫应答的可能性，从而导致持久性增强和免疫原性降低。

序列表

下面列出的氨基酸序列使用氨基酸的标准的单字母密码。该序列用于克隆F和已开发的五个人源化可变序列。

上述克隆F的重链和轻链的可变区以及该克隆的人源化形式如下：

克隆F轻链可变区

DIQMTQSPSFLSASVGDRVTINCKASQNIDRYLNWYQQKLGEAPKRLLYNTNKLQTGIPSRFSGSGSATDFTLTISSLQPEDFATYFCLQYNSLPLTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO.3)

人源化1轻链可变区

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIDRYLNWYQQKPGKAPKRLIYNTNKLQTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYNSLPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO.4)

人源化2轻链可变区

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIDRYLNWFQQKPGKAPKSLIYNTNKLQTGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYNSLPLTFGQGTRLEIK(SEQ ID NO.5)

人源化3轻链可变区

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIDRYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNKLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYNSLPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO.6)

人源化4轻链可变区

DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNIDRYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNKLQTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYNSLPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO.7)

人源化5轻链可变区

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKASQNIDRYLNWYQQKPGKAPKLLIYNTNKLQTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCLQYNSLPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO.8)

克隆F重链可变区

EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFIFSEHNMAWVRQAPKKGLEWVATISDDGRNTYYRDSMRGRFTISRENARSTLYLQLDSLRSEDTATYYCASHRYNLFDSWGQGVMVTVSS(SEQ ID NO.9)

人源化1重链可变区

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSEHNMAWVRQAPGKGLEWVATISDDGRNTYYRDSMRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTSHRYNLFDSWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO.10)

人源化2重链可变区

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFSEHNMAWVRQAPGKGLEWVSTISDDGRNTYYRDSMRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHRYNLFDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.11)

人源化3重链可变区

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFSEHNMAWVRQAPGKGLEWVATISDDGRNTYYRDSMRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHRYNLFDSWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO.12)

人源化4重链可变区

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFSEHNMAWVRQAPGKGLVWVSTISDDGRNTYYRDSMRGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHRYNLFDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.13)

人源化5重链可变区

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFIFSEHNMAWVRQAPGKGLEWVSTISDDGRNTYYRDSMRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKHRYNLFDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.14)

上面的每个可变区中的三个CDR序列都用下划线标出。这些CDR序列是基于IMGT(国际ImMunoGeneTics信息系统)数据库(请参见www.imgt.org)中有关框架区和CDR的信息确定的。

与上述序列有关的其他序列及其相关的序列标识符号(SED ID NO)如下：

/>

/>

标记CDR的另一种方法是使用Kabat系统，这可能会产生稍微不同的结果。然而，这可以由本领域技术人员容易地确定。为避免疑问，基于Kabat系统的可变区中的CDR序列如下，其中Kabat CDR以粗体显示：

克隆F轻链可变区

人源化1轻链可变区

人源化2轻链可变区

人源化3轻链可变区

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人源化4轻链可变区

人源化5轻链可变区

克隆F重链可变区

人源化1重链可变区

人源化2重链可变区

人源化3重链可变区

人源化4重链可变区

人源化5重链可变区

因此，使用Kabat系统确定时的CDR如下：

用于结合CD3的可变区的示例性序列如下，其中CDR标有下划线：

小鼠轻链可变区

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIN(SEQ ID NO.63)

人源化1轻链可变区

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMNWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO.64)

人源化2轻链可变区

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO.65)

人源化3轻链可变区

DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO.66)

人源化4轻链可变区

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO.67)

人源化5轻链可变区

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO.68)

小鼠重链可变区

QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO.69)

人源化1重链可变区

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSRGYTNYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.70)

人源化2重链可变区

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQRLEWMGYINPSRGYTNYNQKFKDRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.71)

人源化3重链可变区

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSRGYTNYNQKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO.72)

人源化4重链可变区

QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFTRYTMHWIRQAPGKGLEWVSYINPSRGYTNYNQKFKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO.73)

人源化5重链可变区

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWVSYINPSRGYTNYNQKFKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYYDDHYCLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.74)

ROR1xCD3双特异性抗体氨基酸序列

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSEHNMAWVRQAPGKGLEWVATISDDGRNTYYRDSMRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTSHRYNLFDSWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIDRYLNWYQQKPGKAPKRLIYNTNKLQTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYNSLPLTFGQGTKLEIKSGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSRGYTNYNQKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTMVTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO.75)

具有N端六-组氨酸标签的ROR1xCD3双特异性抗体氨基酸序列

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSEHNMAWVRQAPGKGLEWVATISDDGRNTYYRDSMRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTSHRYNLFDSWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIDRYLNWYQQKPGKAPKRLIYNTNKLQTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYNSLPLTFGQGTKLEIKSGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSRGYTNYNQKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTMVTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPFTFGQGTKVEIKHHHHHH(SEQ ID NO.76)

Claims

1.一种双特异性抗体分子，其包含选择性结合受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)的第一抗原结合结构域；和

第二抗原结合结构域，其选择性地结合T细胞受体(TCR)的CD3亚基；

其中，所述第一抗原结合结构域包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述轻链可变结构域包含轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1由SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列组成；LCDR2由SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列组成；LCDR3由SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列组成；以及其中，所述重链可变结构域包含重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1由SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列组成；HCDR2由SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列组成；HCDR3由SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列组成。

2.根据权利要求1所述的抗体分子，其中，所述第一抗原结合结构域具有轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：轻链框架区(LCFR)1，其由如SEQ ID NO：15、29、50和53之一所示的氨基酸序列组成；LCFR2，其由如SEQ ID NO：17、30、38和46之一所示的氨基酸序列组成；LCFR3，其由如SEQ ID NO：19、31、39、47和54之一所示的氨基酸序列组成；以及LCFR4，其由如SEQ ID NO：21、32和40之一所示的氨基酸序列组成。

3.根据权利要求1所述的抗体分子，其中，所述第一抗原结合结构域具有轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：LCFR1，其由如SEQ ID NO：29、50和53之一所示的氨基酸序列组成；LCFR2，其由如SEQ ID NO：30、38和46之一所示的氨基酸序列组成；LCFR3，其由如SEQID NO：31、39、47和54之一所示的氨基酸序列组成；以及LCFR4，其由如SEQ ID NO：32和40之一所示的氨基酸序列组成。

4.根据权利要求1所述的抗体分子，其中，所述第一抗原结合结构域具有重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：重链框架区(HCFR)1，其由如SEQ ID NO：22、33、41和55之一所示的氨基酸序列组成；HCFR2，其由如SEQ ID NO：24、34、42和51之一所示的氨基酸序列组成；HCFR3，其由如SEQ ID NO：26、35、43、48、52和56之一所示的氨基酸序列组成；HCFR4，其由如SEQ ID NO：28、37和45之一所示的氨基酸序列组成。

5.根据权利要求1所述的抗体分子，其中，所述第一抗原结合结构域具有重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：HCFR1，其由SEQ ID NO：33、41和55之一所示的氨基酸序列组成；HCFR2，其由如SEQ ID NO：34、42和51之一所示的氨基酸序列组成；HCFR3，其由如SEQ IDNO：35、43、48、52和56之一所示的氨基酸序列组成；HCFR4，其由如SEQ ID NO：37和45之一所示的氨基酸序列组成。

6.根据权利要求1所述的抗体分子，其中，所述第一抗原结合结构域的所述轻链可变结构域由如SEQ ID NO：3、4、5、6、7和8之一所示的氨基酸序列组成。

7.根据权利要求1所述的抗体分子，其中，所述第一抗原结合结构域的所述轻链可变结构域由如SEQ ID NO：4、5、6、7和8之一所示的氨基酸序列组成。

8.根据权利要求1所述的抗体分子，其中，所述第一抗原结合结构域的所述重链可变结构域由如SEQ ID NO：9、10、11、12、13和14之一所示的氨基酸序列组成。

9.根据权利要求1所述的抗体分子，其中，所述第一抗原结合结构域的所述重链可变结构域由如SEQ ID NO：10、11、12、13和14之一所示的氨基酸序列组成。

10.根据权利要求1所述的抗体分子，其中对于所述第一抗原结合结构域，所述轻链可变结构域由如SEQ ID NO：3、4、5、6、7和8之一所示的氨基酸序列组成，且所述重链可变结构域由如SEQ ID NO：9、10、11、12、13和14之一所示的氨基酸序列组成。

11.根据权利要求1所述的抗体分子，其中，所述第一抗原结合结构域的所述轻链可变结构域由如SEQ ID NO：4、5、6、7和8之一所示的氨基酸序列组成；并且

所述第一抗原结合结构域的所述重链可变结构域由如SEQ ID NO：10、11、12、13和14之一所示的氨基酸序列组成。

12.根据权利要求1所述的抗体分子，其中，所述第一抗原结合结构域的所述轻链可变结构域由如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成，并且所述第一抗原结合结构域的所述重链可变结构域由如SEQ ID NO：10、12和13之一所示的氨基酸序列组成。

13.根据权利要求1所述的抗体分子，其中，对于所述第一抗原结合结构域：

(a)所述轻链可变结构域由如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成，而所述重链可变结构域由如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列组成；

(b)所述轻链可变结构域由如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成，而所述重链可变结构域由如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列组成；

(c)所述轻链可变结构域由如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成，而所述重链可变结构域由如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列组成；

(d)所述轻链可变结构域由如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成，而所述重链可变结构域由如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列组成；

(e)所述轻链可变结构域由如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列组成，而所述重链可变结构域由如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列组成；或者

(f)所述轻链可变结构域由如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列组成，而所述重链可变结构域由如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列组成。

14.一种双特异性抗体分子，其包含选择性结合受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)的第一抗原结合结构域；和

选择性地结合T细胞受体(TCR)的CD3亚基的第二抗原结合结构域，其中，对于所述第一抗原结合结构域：

15.根据权利要求1或14所述的抗体分子，其中所述第二抗原结合结构域包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述轻链可变结构域由如SEQ ID NO：63、64、65、66、67和68中的一个所示的氨基酸序列组成，并且其中，所述重链可变结构域由如SEQ ID NO：69、70、71、72、73和74中的一个所示的氨基酸序列组成。

16.根据权利要求1或14所述的抗体分子，其中所述第一抗原结合结构域是scFv。

17.根据权利要求1或14所述的抗体分子，其中所述第二抗原结合结构域是scFv。

18.根据权利要求1或14所述的抗体分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域是通过肽接头共价连接的scFv。

19.根据权利要求1或14所述的抗体分子，其中所述抗体是IgG或IgM，任选地其中所述抗体是IgG₁或IgG₂。

20.根据权利要求1或14所述的抗体分子，其中所述抗体分子由SEQ ID NO.75或76的序列组成。

21.一种药物组合物，其包含权利要求1-20中任一项所述的抗体分子和药学上可接受的载体。

22.一种分离的核酸分子，其编码根据权利要求1-20中任一项所述的抗体分子。

23.根据权利要求22所述的分离的核酸分子，其与启动子可操作地连接。

24.一种表达载体，其包含根据权利要求22或23所述的分离的核酸分子。

25.一种分离的宿主细胞，其被根据权利要求22或23所述的核酸分子或根据权利要求24所述的载体转化。

26.根据权利要求1-20中任一项所述的抗体分子或根据权利要求22所述的核酸分子在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

27.权利要求26所述的用途，其中所述癌症是白血病、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤、睾丸癌、子宫癌、肾上腺癌、乳腺癌、肺癌、黑素瘤、神经母细胞瘤、肉瘤或肾癌。