CN110885826A - 一种原核表达的cd20核酸适配体、筛选方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与原核表达的CD20蛋白膜外区特异性结合的核酸适配体、筛选方法及其应用，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1‑23所示的任一条DNA片段的核苷酸序列。本发明通过对CD20蛋白膜外区核酸密码子偏好性进行改造，在原核中大量表达CD20蛋白膜外区结构，从而以原核表达的CD20‑GST蛋白作为正筛物质，GST蛋白作为反筛选物质，筛选得到与原核表达的CD20蛋白膜外区特异性结合的核酸适配体SW1‑SW23(核苷酸序列为SEQ ID NO.1‑23所示)，该核酸适配体是单链DNA，由80个核苷酸组成。实验表明，本发明的适配体能特异性与CD20蛋白膜外区结合，因此该核酸适配体针对CD20蛋白具有高特异性的特点，可用于后续对CD20蛋白的快速检测及B细胞淋巴瘤检测。

Description

一种原核表达的CD20核酸适配体、筛选方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种与原核表达的CD20 蛋白膜外区特异性结合的核酸适配体、筛选方法及其应用。
背景技术
分化簇20蛋白(CD20)是B细胞特异性膜蛋白，CD20膜蛋白有279个氨基酸残基，以非糖基化形式存在，其分子量因磷酸化程度不同而不同，范围为 33-35KDa。CD20在早期B淋巴细胞和成熟的B淋巴细胞中都有所表达，但当其分化为浆细胞时，其表达停止。CD20蛋白膜外区是几种单克隆抗体的靶标，如利妥昔单抗、奥法木单抗、阿托珠单抗、替伊莫单抗和托西莫单抗，用于临床治疗CD20阳性非霍奇金淋巴瘤(NHL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。尽管利妥昔单抗取得了临床成功，但复发仍然很常见。因为抗CD20抗体具有多种效应功能，其中包括促进靶细胞中的补体依赖性细胞毒性，补体激活导致外来病原体或正常组织的快速和高度破坏，导致移植后的自身免疫疾病，如类风湿性关节炎，狼疮和移植排斥反应。为了进一步提高B细胞淋巴瘤药物的疗效，急需建立一种准确可靠、灵敏快速、广泛适用的特异性识别CD20蛋白的方法。
CD20蛋白是真核细胞的膜蛋白，为了大量获得CD20蛋白膜外区结构，急需选择一种高效的表达系统。而原核表达系统能够获得高水平的基因表达产物，并且目的蛋白纯化方法便捷，适用于表达CD20蛋白膜外区。
SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)是一个典型的多学科程序，涉及不同领域，如分子生物学，核酸化学，材料科学和针对各种目标的亲和配体的生物信息学。适配体，基于核酸的配体，是小的单链 DNA或RNA寡核苷酸，通过称为指数富集配体系统进化(SELEX)的过程在体外产生。与蛋白质抗体相比，寡核苷酸适配体具有以下显着优势：组织通透性更高、便于修饰，成本低、性质稳定。适配体与其靶分子如此紧密结合的能力是其复杂的三维结构的结果，与单克隆抗体类似，适配体通过范德华力、氢键和静电相互作用折叠成分子结构(G四联体，凸起环，假结，发夹等)与靶标结合。类似的结合机制使适配体具有与抗体相同的预期功能，促进它们在一系列药理学领域中的应用，例如药物发现，医学诊断和作为药物递送载体。CD20 蛋白特异性核酸适配体对于CD20蛋白检测，进而提高B细胞淋巴瘤的治愈率具有重要意义。
发明内容
本发明提出了原核表达的CD20核酸适配体、筛选方法及其在CD20蛋白和 B淋巴瘤检测中的应用，以解决现有技术中体外识别结合检测B细胞淋巴瘤可行性低、特异性差的问题。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一个目的是提出一种原核表达的CD20核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列为SEQ ID NO.1-23所示的任一条DNA片段的核苷酸序列，所述核酸适配体与原核表达的CD20蛋白膜外区特异性结合。
进一步地，所述适配体的两端任选地进行氨基、羧基、巯基、荧光分子、生物素、胆固醇或聚乙二醇基团修饰，经修饰后的核酸适配体分子，同样具有与CD20表位肽以及CD20阳性的肿瘤细胞相结合的功能。
本发明的第二个目的是提供筛选上述的原核表达的CD20核酸适配体的方法，包括如下步骤：
(1)提供随机单链DNA文库，所述DNA文库包括由下式表示的随机单链 DNA：5’TACCGGTCCGAGTCACTG-N40-CCGTGTGAGCTCTAGACGTTGA3’，其中N40表示中间为40bp随机序列；并且提供SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26 所示的一对引物；
(2)随机单链DNA文库变性后依次经CD20-GST蛋白正筛、GST蛋白反筛获得第一轮筛选产物；
(3)以步骤(1)所述引物对第一轮筛选产物进行不对称PCR扩增，获得第二轮核酸适配体文库；
(4)依次类推，由上一轮核酸适配体文库经变性、CD20-GST蛋白正筛、 GST蛋白反筛获得上一轮筛选产物，然后以步骤(1)所述引物对上一轮筛选产物进行不对称PCR扩增获得下一轮核酸适配体文库；共筛选9轮，最终获得原核表达的CD20蛋白膜外区核酸适配体；
每轮筛选中所述CD20蛋白膜外区核酸序列进行密码子偏好性改造，改造后CD20蛋白膜外区核酸序列如SEQ ID NO.24所示。
进一步地，所述随机单链DNA文库与CD20-GST-Glutathione Sepharose 4 FastFlow孵育的时间为15min。
进一步地，所述PCR扩增条件为：95℃5min；94℃30sec，50℃30sec， 72℃30sec，22次循环后延伸；72℃7min。
本发明的第三个目的是提供如上述任一所述的原核表达的CD20核酸适配体在制备用于检测人CD20蛋白的试剂中的用途。
本发明的第四个目的是提供上述任一所述的原核表达的CD20核酸适配体在制备用于检测和/或治疗B细胞淋巴瘤制剂中的用途。
因此，与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明通过对CD20蛋白膜外区核酸密码子偏好性进行改造，在原核中大量表达CD20蛋白膜外区结构，在筛选适配体时，以原核表达的CD20-GST蛋白作为正筛物质，GST蛋白作为反筛选物质，筛选得到与原核表达的CD20蛋白膜外区特异性结合的核酸适配体SW1-SW23(核苷酸序列为SEQ ID NO.1-23所示)，该核酸适配体是单链DNA，由80个核苷酸组成。基于病理切片和流式细胞术进行核酸适配体特异性、亲和力评估，显示本发明的适配体能特异性与 CD20蛋白膜外区结合，因此该核酸适配体针对CD20蛋白具有高特异性的特点，可用于后续对CD20蛋白的快速检测和B细胞淋巴瘤的检测。
附图说明
图1是Bio标记实施例1提供的核酸适配体SEQ ID NO.9和SEQID NO.11 免疫组织化学染色图片。图1A、图1B、图1C分别为乳腺癌组织的HE染色对照、bio-SEQ ID NO.9和bio-SEQ ID NO.11染色结果(10×)；图1D、图1E、图1F分别为肺癌组织的HE染色对照、bio-SEQID NO.9和bio-SEQ ID NO.11 染色结果(40×)；图1G、图1H、图1J分别为淋巴瘤组织的HE染色对照、bio- SEQ ID NO.9和bio-SEQ ID NO.11染色结果(40×)。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1、原核表达的CD20蛋白膜外区核酸适配体的筛选
一、原核表达的CD20蛋白膜外区
1、CD20蛋白膜外区核酸序列进行密码子偏好性改造
CD20蛋白膜外区核酸序列为： ATTAAAATTTCCCATTTTTTAAAAATGGAGAGTCTGAATTTTATTAGAGCTC ACACACCATATATTAACATATACAACTGTGAACCAGCTAATCCCTCTGAGAAAAACTCCCCATCTACCCAATACTGTTAC，改造后核酸序列如SEQ ID NO.24 所示。
2、重组质粒pGEX-4T-CD20的构建
2.1以改造后的DNA为模板，进行目的基因PCR扩增，PCR反应体系如下：
表1
Figure RE-GDA0002344600410000051
反应条件：
A.95℃，5min
B.94℃，30sec；55℃，1min；72℃，15s；25个循环
C.72℃，7min
2.2用3％琼脂糖凝胶电泳，回收分子量大小为132bp的PCR产物。
2.3以BamHI和XhoI为限制性内切酶，对质粒载体pGEX-4T-1进行酶切：
表2酶切反应体系
Figure RE-GDA0002344600410000061
酶切反应条件为：37℃水浴4小时。
2.4回收酶切反应产物中分子量大小为4.9kb的pGEX-4T-1的目的片断。
2.5连接反应体系：
表3
Figure RE-GDA0002344600410000062
连接反应条件为：16℃孵育4小时。
2.6制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
2.7大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞转化
(1)从低温冰箱中取出已制备好的感受态细胞，冰浴15分钟。
(2)待感受态细胞刚开始融化时，加入连接产物10μl，轻轻混匀，冰浴 30分钟。
(3)将EP管放入42℃水浴90秒，勿震荡。
(4)冰浴5分钟。
(5)加入700μl LB液体培养基，37℃低速震荡45分钟。
(6)产物涂在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的无菌LB平板上37℃，16小时。
(7)挑取单个克隆，加入到3ml含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB中， 37℃，16小时。
(8)提取质粒DNA。
(9)酶切鉴定克隆，方法同上，所用限制性内切酶为BamHI和XhoI。
(10)将鉴定正确的14个克隆送至上海生工公司测序。
3、pGEX-4T-CD20的原核表达和纯化
3.1挑取含有pGEX-4T-CD20(CD20-GST融合蛋白的原核表达载体)的大肠杆菌BL21(DE3)于3ml含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基中，对照组接种含有pGEX-4T-1(GST蛋白的原核表达载体)的大肠杆菌BL21(DE3)， 37℃培养12～16小时。
3.2将小试管中的菌液分别转移到200ml含有氨苄青霉素(50μg/ml)的 LB液体培养基中，37℃培养到OD600为0.6～0.8。
3.3加入100mM IPTG，使其终浓度为0.1mM，16℃诱导20小时。
3.4将诱导以后的菌液分装到500ml的离心管中，4℃，8000rpm，离心5 min，弃上清。
3.5沉淀用PBS洗涤3次，4℃，8000rpm，离心5min，弃上清。
3.6将沉淀重悬于8ml含1mM PMSF的PBS中。
3.7将菌液放置冰中，超声碎菌。
3.8每EP管中加入1ml超声降解的菌液，4℃，12000rpm，离心15min，取上清。
3.9各EP管加入20μl 50％Glutathione-Sepharose 4Fast Flow，室温轻混1 h。
3.10 4℃，500g，离心5min，弃上清。
3.11每个EP管各加入100μl 0.01M PBS洗涤，洗涤后将含有 Glutathione-Sepharose 4Fast Flow的悬浊液收集于一管，4℃，500g，离心5 min，弃上清，共洗涤3次。
3.12加入与Glutathione-Sepharose 4Fast Flow等量的1mM还原性谷胱甘肽(GSH)，室温轻混10min。4℃，500g，离心5min，取上清。
3.13重复12步骤2次。
3.14收集的上清则为所需蛋白。
4、原核表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测
4.1安装玻璃板。
4.2配制分离胶溶液，一旦加入TEMED，马上快速旋动混合物。
4.3迅速在玻璃板间隙中注入分离胶溶液，小心在溶液上覆盖一层水压平胶溶液。
4.4待分离胶聚合完全后，倒出覆盖层液体，尽可能排去未聚合的丙烯酰胺及胶上面的液体，用滤纸吸净残留液体。
4.5制备浓缩胶，并加入到已聚合的分离胶上，立即在其中插入干净的梳子，将凝胶放置聚合。
4.6将样品加入等量的2×SDS凝胶加样缓冲液，在100℃加热10分钟以使蛋白质变性。
4.7浓缩胶聚合完全以后，小心移出梳子，将凝胶固定于电泳装置上，电泳槽加入1×SDS电泳缓冲液。
4.8按照预定顺序加样，每样品加20μl。
4.9将电泳装置与电源相接，加电压100V，当染料前沿进入分离胶时，把电压提高到120V，继续电泳直至溴酚蓝泳出分离胶底部后，关闭电源。
4.10从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。
4.11用考马斯亮蓝染色，放在水平摇床上于室温染色4小时以上。
4.12移出并回收染液以备后用，将凝胶浸泡于脱色液中，平缓摇动2～3小时，期间更换脱色液2～3次。
4.13脱色后，将胶用凝胶成像仪成像，并保存结果。
5、pGEX-4T-CD20原核表达产物的免疫印迹(Western Blot)鉴定
5.1戴手套，剪裁6张滤纸和聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)，大小与凝胶大小吻合。
5.2PVDF膜先用无水甲醇激活15s，然后浸泡于一盘去离子水上，借毛细作用使之从下往上湿润后，浸泡于水中，大约5分钟以上以驱除残留于滤膜上的气泡。
5.3在一个浅托盘中加入少量的转移缓冲液，将6张滤纸浸泡其中。
5.4戴上手套，按照以下方法安装转移装置：
(1)平放底部电极(+)，石墨一边在下。
(2)在这一电极上放置3张用转移缓冲液浸泡过的3mm滤纸，逐张叠放，精确对齐，然后用一个玻璃移液管作滚筒以挤出所有气泡。
(3)PVDF膜放在3mm滤纸上。
(4)凝胶转移到一盘去离子水中，漂洗一下，放于PVDF膜上。
(5)再放上3张3mm的滤纸。
(6)连接电源(将阳极导线或者红色导线接于石磨电极)，300mA，90 min。
(7)将PVDF膜从转印夹中取出，浸入封闭液中，室温封闭1小时。
(8)加入一抗(为兔抗GST抗体1：1000)，室温下孵育2小时，洗膜4 次，每次15min。
(9)加入二抗(HRP标记的羊抗鼠抗体1：5000)，将PVDF膜放入其中，室温下孵育1小时，洗膜4次，每次15min。
(10)用邻苯二胺底物显色，轻轻摇动PVDF膜。
(11)用凝胶扫描分析系统扫描PVDF膜，分析结果。结果表明，所表达的CD20-GST融合蛋白能够特异性与GST蛋白抗体结合，说明CD20蛋白膜外区以一种融合蛋白形式在大肠杆菌中表达。
二、单链DNA随机文库的构建和扩增
随机核酸适配体文库为：5’-TACCGGTCCGAGTCACTG-N40-CCGTGTGAGCTCTAGACGTTGA-3’(80nt)，其中5’端固定核酸序列18bp，3’固定核酸序列22bp，中间为40bp随机序列，N代表A、C、T或G。
上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。
SEQ ID NO.25：5’-TACCGGTCCGAGTCACTG-3’
SEQ ID NO.26：5’-TCAACGTCTAGAGCTCACACGG-3’
将得到的DNA进行不对称PCR，反应体系如下：
表4
Figure RE-GDA0002344600410000111
反应条件：
A.95℃，5min
B.94℃，30sec；50℃，30sec；72℃，10s；22个循环
C.72℃，7min
三、筛选原核表达的CD20蛋白膜外区的单链DNA适配子
采用合成的单链DNA文库，以CD20-GST-Glutathione Sepharose 4Fast Flow作为正筛选介质，GST-Glutathione Sepharose 4Fast Flow作为反筛选介质，采用SELEX技术筛选CD20蛋白膜外区特异性核酸适配体。具体步骤为：
1.合成并纯化DNA随机文库。
2.取CD20-GST-Glutathione Sepharose 4Fast Flow适量(蛋白量大于 0.2mg)，用筛选缓冲液反复洗涤。
3.将合成纯化的200-500pmol的DNA随机文库稀释于500μl的筛选缓冲液中，85℃，10min孵育后立即置于冰上10mim，随后加入到 CD20-GST-Glutathione Sepharose 4FastFlow中，室温下轻振15分钟。
4.离心(5000rpm，5min)。
5.弃上清，再加入500μl筛选缓冲液，于85℃变性10min。
6.离心(5000rpm，5min)，取上清，将与CD20-GST-Glutathione Sepharose 4FastFlow结合的DNA随机适配体文库置于85℃孵育10min，然后立即置于冰上10min。
7.将GST-Glutathione Sepharose 4Fast Flow取适量(蛋白量大于0.2mg)，用筛选缓冲液反复洗涤。
8.加入已经处理好的、与CD20-GST-Glutathione Sepharose 4Fast Flow结合的DNA随机适配体文库，室温下轻振15分钟。
9.离心，5000rpm，5min，取上清。
10.纯化DNA上清液，获得第一轮筛选产物。
11.以SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26为引物对第一轮筛选出的核酸文库进行不对称PCR扩增，作为第二轮核酸适配体筛选文库。
12.以上一轮筛选产物为模板进行不对称PCR扩增，重复步骤2-10进行下一轮筛选，共筛选9轮，将所得产物连接到pMD-18T，经克隆测序分析，最终得到SEQ ID NO.1-23所示的核酸适配体。其序列见表5。
表5 CD20蛋白膜外区特异性核酸适配体SW1-SW23序列
Figure RE-GDA0002344600410000131
Figure RE-GDA0002344600410000141
用Mfold软件对本实施例23个适配体对应的序列进行二级结构模拟，综合这些二级结构的结构特点，发现它们富含环状结构和茎状结构，这些二级结构在与靶标结合的过程中发挥重要作用。
实施例2、核酸适配体SW1-SW23的特异性、亲和力
一、核酸适配体SW1-SW23特异性检测
1.取乳腺癌、肺癌、B细胞淋巴瘤患者的肿瘤组织制作病理切片。
2.切片常规脱蜡至水(二甲苯20min，二甲苯20min，无水乙醇10min，95％乙醇10min，90％乙醇10min，85％乙醇10min)。
3.30％H2O2 1份+蒸馏水10份混合，室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4.热修复抗原：将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)，电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔5-10分钟后，反复1-2次。冷却后PBS(pH 7.2-7.6) 洗涤1-2次。
5.滴加5％BSA封闭液，室温20分钟。甩去多余液体，不洗。
6.滴加适当稀释的生物素化适配体，37℃1小时。PBS(pH7.2-7.6)洗2 分钟×3次。
7.滴加免疫组化试剂盒中试剂SABC，37℃20分钟。PBS(pH7.2-7.6)洗 5分钟×4次。
8.DAB显色：使用DAB显色试剂盒。取1ml蒸馏水，加试剂盒中A，B， C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5-30 分钟之间。也可自配显色剂显色。蒸馏水洗涤。
选取本发明实施例中单适配体SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11分别测定CD20 蛋白膜外区结合特异性。在特异性检测中，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11虽然都能特异性与乳腺癌、肺癌、淋巴瘤组织结合，但是相较于乳腺癌、肺癌组织， SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11与B细胞淋巴瘤组织有最强的的结合能力，并且与B细胞淋巴瘤组织结合能力显著高于与乳腺癌、肺癌组织的结合能力(见图 1)。
二、流式细胞仪测定适配体的亲和力
选取本发明实施例中单适配体SEQ ID NO.1-23分别测定解离常数。先用 FITC标记的引物扩增出相应的单适配体，然后将带有荧光标记的单适配体分别与Raji细胞作用。用流式细胞仪检测各轮FITC标记的单适配体与Raji细胞结合的荧光强度。实验重复三次，计算测得的数据，根据下列公式计算解离常数 Kd值。
Y＝BmaxX/(Kd+X)
其中Y代表平均荧光强度；Bmax代表所测得的最大荧光强度；Kd为解离常数；X为所加的单适配体的浓度。
解离常数Kd的测定可以表明适配体与Raji细胞的的结合能力。经检测，所获得的的适配子解离常数在28-169nM之间，显示出与Raji细胞有较好的结合能力。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 一种原核表达的CD20核酸适配体、筛选方法及其应用
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taccggtccg agtcactgca tcgcagtgac gacgtgattg agaaaacgca ccgacgcacc 60
gtgtgagctc tagacgttga 80
<210> 2
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taccggtccg agtcactggt cgctacacca tacgacgggc gccagataac caagaatgcc 60
gtgtgagctc tagacgttga 80
<210> 3
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taccggtccg agtcactgca caagcagtga cgaattccga cgcctgacag gtcttatgcc 60
gtgtgagctc tagacgttga 80
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<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taccggtccg agtcactgcg aggatccggt gtggtccgtc cgttggaaga actttgcccc 60
gtgtgagctc tagacgttga 80
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taccggtccg agtcactggt cgctagacca tgcgacggcc gctagataat caagaatgcc 60
gtgtgagctc tagacgttga 80
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taccggtccg agtcactgca caagcagtga cgctggttcc tggtcatgag gggtcaggcc 60
gtgtgagctc tagacgttga 80
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taccggtccg agtcactgcg caagcagtga cgaattccga cgcctgacag gtcttatgcc 60
gtgtgagctc tagacgttga 80
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taccggtccg agtcactggg gacgaggagc ggggatcaac ataacaagcg attgatagcc 60
gtgtgagctc tagacgttga 80
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taccggtccg agtcactgca tcgcagtgac gcagcagact ccccatccat tcggacttcc 60
gtgtgagctc tagacgttga 80
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taccggtccg agtcactggg gcctagtggc gagggccggt ttgggtcata acatggaacc 60
gtgtgagctc tagacgttga 80
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taccggtccg agtcactggg gacgaggagc ggggatcaac ataacaagca attgatagcc 60
gtgtgagctc tagacgttga 80
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taccggtccg agtcactggg cgaggagcgg tcggtcggtg ataatcttaa tatcatggcc 60
gtgtgagctc tagacgttga 80
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taccggtccg agtcactgcg caagcagtga cgaattccga cgcctgacag gccttatgcc 60
gtgtgagctc tagacgttga 80
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taccggtccg agtcactgca ccgcagtgac gcagcagact ccccatccat tcggacttcc 60
gtgtgagctc tagacgttga 80
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<212> DNA
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taccggtccg agtcactgca caagcagtga cgctggttcc tggtcatgag gggtcaggcc 60
gtgtgagctc tagacgttga 80
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taccggtccg agtcactggg acgaggaaac cggtccgtac atcatattct ccagtttgcc 60
gtgtgagctc tagacgttga 80
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taccggtccg agtcactggg ggacgaggtc cgccaagtgt acactctgat agctaacgcc 60
gtgtgagctc tagacgttga 80
<210> 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taccggtccg agtcactggg ggacgaagga cgggggcagc tctcctgata taaatggtcc 60
gtgtgagctc tagacgttga 80
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taccggtccg agtcactggt cgctagacca tacgacggcc gctagataac caagaatgcc 60
gtgtgagctc tagacgttga 80
<210> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
taccggtccg agtcactggg gacgaggagc gggggtcaac ataacaagca attgatagcc 60
gtgtgagctc tagacgttga 80
<210> 21
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
taccggtccg agtcactgcg caagcagtga cgctggttcc tggtcatgag gggtcaggcc 60
gtgtgagctc tagacgttga 80
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taccggtccg agtcactgcg caagcagtgg cgaattccga cgcttgacag gtcttatgcc 60
gtgtgagctc tagacgttga 80
<210> 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
taccggtccg agtcactggg cgtcgaccca gtgcgaggca gtcaattgtt tcagcattcc 60
gtgtgagctc tagacgttga 80
<210> 24
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atcaagatca gccattttct gaaaatggaa agtctgaatt tcatccgcgc acataccccg 60
tatattaata tctataattg cgaaccggcc aatccgagcg aaaagaatag tccgagtacc 120
cagtattgct at 132
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
taccggtccg agtcactg 18
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tcaacgtcta gagctcacac gg 22

Claims (7)

1.一种原核表达的CD20核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列为SEQID NO.1-23所示的任一条DNA片段的核苷酸序列，所述核酸适配体与原核表达的CD20蛋白膜外区特异性结合。
2.根据权利要求1所述的一种原核表达的CD20核酸适配体，其特征在于，所述适配体的两端任选地进行氨基、羧基、巯基、荧光分子、生物素、胆固醇或聚乙二醇基团修饰。
3.筛选权利要求1所述的原核表达的CD20核酸适配体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提供随机单链DNA文库，所述DNA文库包括由下式表示的随机单链DNA：5’TACCGGTCCGAGTCACTG-N40-CCGTGTGAGCTCTAGACGTTGA3’，其中N40表示中间为40bp随机序列；并且提供SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的一对引物；
(2)随机单链DNA文库变性后依次经CD20-GST蛋白正筛、GST蛋白反筛获得第一轮筛选产物；
(3)以步骤(1)所述引物对第一轮筛选产物进行不对称PCR扩增，获得第二轮核酸适配体文库；
(4)依次类推，由上一轮核酸适配体文库经变性、CD20-GST蛋白正筛、GST蛋白反筛获得上一轮筛选产物，然后以步骤(1)所述引物对上一轮筛选产物进行不对称PCR扩增获得下一轮核酸适配体文库；共筛选9轮，最终获得原核表达的CD20蛋白膜外区核酸适配体；
每轮筛选中所述CD20蛋白膜外区核酸序列进行密码子偏好性改造，改造后CD20蛋白膜外区核酸序列如SEQ ID NO.24所示。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述随机单链DNA文库与CD20-GST-Glutathione Sepharose 4Fast Flow孵育的时间为15min。
5.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述PCR扩增条件为：95℃5min；94℃30sec，50℃30sec，72℃30sec，22次循环后延伸；72℃7min。
6.如权利要求1-2任一所述的原核表达的CD20核酸适配体在制备用于检测人CD20蛋白的试剂中的用途。
7.如权利要求1-2任一所述的原核表达的CD20核酸适配体在制备用于检测和/或治疗B细胞淋巴瘤制剂中的用途。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115058426A (zh) * 2022-05-16 2022-09-16 上海志药科技有限公司 一种特异性识别SARS-CoV-19的核酸分子探针及其筛选方法、检测产品和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5756291A (en) * 1992-08-21 1998-05-26 Gilead Sciences, Inc. Aptamers specific for biomolecules and methods of making
CN1299827A (zh) * 1999-12-16 2001-06-20 上海华晨生物技术研究所 新的人cd20同源分子、其编码序列及用途
CN105087596A (zh) * 2014-05-23 2015-11-25 中国医学科学院基础医学研究所 一种cd20核酸适配体及其应用
CN109321564A (zh) * 2018-10-30 2019-02-12 廖世奇 一种融合蛋白核酸适配体筛选方法及试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5756291A (en) * 1992-08-21 1998-05-26 Gilead Sciences, Inc. Aptamers specific for biomolecules and methods of making
CN1299827A (zh) * 1999-12-16 2001-06-20 上海华晨生物技术研究所 新的人cd20同源分子、其编码序列及用途
CN105087596A (zh) * 2014-05-23 2015-11-25 中国医学科学院基础医学研究所 一种cd20核酸适配体及其应用
CN109321564A (zh) * 2018-10-30 2019-02-12 廖世奇 一种融合蛋白核酸适配体筛选方法及试剂盒

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MANSOUREH HAGHIGHI ET AL.: "Selection and Characterization of Single-Stranded DNA Aptamers Binding Human B-Cell Surface Protein CD20 by Cell-SELEX", 《MOLECULES》 *
张李钰: "新型CD20核酸适配体的筛选及其淋巴瘤靶向结合特性的评估", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 *
徐小静等: "《生物技术原理与实验》", 31 July 2006, 中央民族大学出版社 *
洪海燕等: "人CD20胞外区基因在原核系统中的表达", 《免疫学杂志》 *
邹克琴主编: "《基因工程原理和技术》", 31 January 2009, 浙江大学出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115058426A (zh) * 2022-05-16 2022-09-16 上海志药科技有限公司 一种特异性识别SARS-CoV-19的核酸分子探针及其筛选方法、检测产品和应用
CN115058426B (zh) * 2022-05-16 2024-07-16 上海志药科技有限公司 一种特异性识别SARS-CoV-19的核酸分子探针及其筛选方法、检测产品和应用

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