CN110879294A - 蛋白标志物在诊断肠易激综合征的产品中的用途和用于诊断肠易激综合征的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种蛋白标志物在诊断肠易激综合征的产品中的用途和用于诊断肠易激综合征的试剂盒。本公开利用配体联合检测样本中的Thymosinβ4蛋白，可以有效对肠易激综合征患者进行辅助诊断，有利于指导肠易激综合征患者的临床用药，使患者得到最佳的受益。
Description
技术领域
本公开涉及分子生物学、临床检测技术领域，具体地，涉及蛋白标志物在诊断肠易激综合征的产品中的用途和通过蛋白标志物诊断肠易激综合征的试剂盒。
背景技术
肠易激综合征(Irritable Bowel Syndrome，IBS)是一种以腹痛或腹部不适伴排便习惯改变的功能性肠病。我国IBS患病率约为5-6％，美国则高达22％。IBS已成为全球性疾病，因严重影响了患者的生活质量而倍受关注。迄今为止，对于IBS的研究进展仍然非常有限，对其病因和发病机制还知之甚少，IBS发病的具体分子机制尚未阐明，寻找与之密切相关的分子标志物并阐述具体作用机制，仍是当前的主要研究方向。
2011年多国IBS专家联手发布了基于临床症状的IBS严重程度分级标准，但是尚缺乏形态学、检验、影像学及内镜等客观的诊断指标，也没有一个指标获得全球学者绝对一致性的评价。
鉴于此，本领域迫切需要研发出可用于IBS辅助诊断的蛋白标志物或标志物组合，以期在临床治疗前，能够准确判断疾病的严重程度，评估疾病的治疗效果。
发明内容
本公开的目的是提供一种检测蛋白标志物的配体在制备用于诊断肠易激综合征的产品中的用途和用于诊断肠易激综合征的试剂盒。
为了实现上述目的，本公开第一方面：提供一种检测蛋白标志物的配体在制备用于诊断肠易激综合征的产品中的用途，其中，所述蛋白标志物为Thymosinβ4蛋白。
可选地，所述配体为核酸和/或多肽，所述多肽包括抗体，所述抗体为人抗体、嵌合抗体、重组抗体、人源化抗体、单克隆抗体、单克隆抗体的抗原结合片段或多克隆抗体。
可选地，检测蛋白标志物是通过以下步骤进行的：
1)获得肠易激综合征患者的生物样本，所述生物样本为肠组织样本、血浆样本、肠液样本和粪便样本中的一种或多种；
2)确定生物样本中蛋白标志物的表达水平。
可选地，步骤2)的方法为免疫组织化学方法和/或酶联免疫吸附测定方法。
本公开第二方面：提供一种用于诊断肠易激综合征的试剂盒，其中，所述试剂盒包括检测蛋白标志物的配体，所述蛋白标志物为Thymosinβ4蛋白。
可选地，所述配体为核酸和/或多肽，所述多肽包括抗体，所述抗体为人抗体、嵌合抗体、重组抗体、人源化抗体、单克隆抗体、单克隆抗体的抗原结合片段或多克隆抗体。
通过上述技术方案，本公开利用配体联合检测样本中的Thymosinβ4蛋白，可以有效对肠易激综合征患者进行诊断。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是通过IHC方法检测IBS大鼠与IBS患者的肠组织样本的表征结果，其中，A为IBS大鼠，B为IBS患者，Control代表对照组。
图2为通过ELISA方法检测得到的IBS患者的血清、肠液和粪便样本中的Thymosinβ4蛋白表达量，其中，A为血清样本，P＝0.014；B为肠液样本，P＝0.011；C为粪便样本，P＝0.001；NC代表对照组。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开第一方面：提供检测蛋白标志物的配体在制备用于诊断肠易激综合征的产品中的用途，其中，所述蛋白标志物为Thymosinβ4蛋白。
所述Thymosinβ4蛋白在NCBI数据库中的参考编号为NP_066932；Thymosinβ4基因在NCBI数据库中的参考编号为7114。
根据本公开，所述Thymosinβ4蛋白具有以下特征：
在肠易激综合征患者肠组织样本中的水平相对较高；
在肠易激综合征患者肠液样本中的水平相对较高；
在肠易激综合征患者粪便样本中的水平相对较低；
在肠易激综合征患者血浆样本中的水平相对较低；
根据本公开，所述配体为可以与Thymosinβ4蛋白特异性结合，用于检测所述蛋白的配体，例如可以为核酸和/或多肽。其中，所述多肽包括抗体，所述抗体例如为人抗体、嵌合抗体、重组抗体、人源化抗体、单克隆抗体、单克隆抗体的抗原结合片段或多克隆抗体。可以使用本领域技术人员熟知的标准技术产生抗体，或者可以使用购买的抗体。
根据本公开，检测蛋白标志物是通过以下步骤进行的：
1)获得肠易激综合征患者的生物样本，所述生物样本为肠组织样本、血浆样本、肠液样本和粪便样本中的一种或多种；
2)确定生物样本中蛋白标志物的表达水平。
其中，步骤2)的方法为免疫组织化学方法和/或酶联免疫吸附测定方法。
例如可以使用免疫测定的方法定量检测蛋白标志物的存在。所述免疫测定通常包括将生物样本与抗体一起孵育，并通过本领域技术人员所熟知的技术如免疫组织化学实验(IHC)或酶联免疫吸附测定实验(ELISA)检测结合抗体。
在本公开的一种具体实施方式中，制备样本方法、IHC方法和阳性判断标准如下：
(1)制备样本：
将30min之内的经肠镜获取的活检样本或者手术组织投入中性福尔马林固定液中固定过夜，流水冲洗，经过脱水、透明和浸蜡，制备组织蜡块。以临床症状为依据，根据ROMEⅢ标准进行IBS疾病的诊断。每位患者选取3个肠道组织，制作成石蜡蜡块并制备4μm切片。
(2)IHC具体检测方法如下：
将切片正面迎风置于65℃烘烤箱中烘烤40min，使样本贴附更好，浸入二甲苯洗缸I、II、III中，分别置于25℃恒温水浴箱中10min，转入100％、85％、75％乙醇中各3min梯度水化，然后转入PBS缓冲液I、II、III中，每次5min，置于3％过氧化氢洗缸中15min，封闭内源性过氧化酶。浸入加热后的枸橼酸钠缓冲液中，微波炉中低火20min。浸入PBS缓冲液I、II、III中，每次3min。用PAP Pen免疫组化石蜡笔沿切片组织边缘画出其范围，将稀释后的一抗溶液或抗体工作液用200μL微量加样器铺满所画范围内的组织表面并置于湿盒之中，37℃恒温培养箱中孵育2h或4℃冰箱中过夜。在纸巾上去除多余一抗，将组织芯片依次浸入PBS缓冲液I、II、III中，每次3min。加二步法免疫组化检测试剂盒中的试剂Ⅱ，确保铺满所画范围内的组织表面并置于湿盒之中，37℃恒温培养箱中孵育15min。在纸巾上去除多余试剂，将组织芯片依次浸入PBS缓冲液I、II、III中，每次3min。加二步法免疫组化检测试剂盒中的试剂Ⅲ(Polyperoxidase-anti-mouse/rabbit IgG)，确保铺满所画范围内的组织表面并置于湿盒之中，37℃恒温培养箱中孵育30min。在纸巾上去除多余试剂，将组织芯片依次浸入PBS缓冲液I、II、III中，每次3min。取DAB试剂盒取适量试剂，按1mLDAB稀释液加50μLDAB浓缩液的比例混匀；用200μL微量加样器将稀释后的DAB溶液铺满所画范围内的组织表面进行显色，各张切片保持显色时间一致；在镜下观察显色效果直至同一切片内部及不同切片之间形成较显著的对比后在纸巾上去除多余DAB溶液并置于蒸馏水中；显色时间为60s，不同抗体间显色时间有所差异。将苏木素染液用1000μL微量加样器迅速铺满所画范围内的组织阵列表面，10s后用缓慢的流水立刻冲去；将染色后的芯片置于1％氨水中。将切片依次浸入75％、85％、100％乙醇中各3min梯度脱水。浸入二甲苯洗缸中，10min，脱去PAP Pen免疫组化石蜡笔画出的笔迹，将切片置于通风处晾干，用快干封片剂封片。
(3)阳性判断标准：
计数20个高倍视野的免疫组化反应着色的细胞，染色强度积分为：无染色0分，弱染色1分，中等染色2分，强染色3分；染色面积积分为：着色范围≤10％为0分，>10％-25％为1分，>25％-50％为2分，>50％-75％为3分，>75％为4分。若两者积分之和≥3分则为阳性，低于3分则为阴性。
在本公开的另一种具体实施方式中，制备样本方法、ELISA检测方法如下：
(1)血浆(血清)样本的处理过程：
收集肠易激综合征患者的血浆(血清)样本(为对比，可同时收集正常人样本)，通过1000g离心15分钟，吸取上清进行后续检测。
(2)肠液样本的处理过程：
肠镜下收集肠易激综合征患者的肠液样本(为对比，可同时收集正常人样本)，通过1000g离心15分钟，吸取上清进行后续检测。
(3)粪便样本的处理过程：
肠易激综合征患者自行采集粪便样本(为对比，可同时收集正常人样本)，1个小时内送至实验室，用接种环将50mg的粪便样本加入到PE管中，向管中加入提取缓冲液(样本净重的49倍)，并盖紧管子；将样本管放入多孔涡旋混匀器，用最高速充分震荡30分钟，使样本变成匀浆；将匀浆转移到2ml的微量离心管中，3000g离心5分钟；将上清转移到干净的管内，可以直接用于后续的ELISA实验的检测。
(4)ELISA实验的具体检测流程如下：
将100μL的标准品或者血浆(血清)和粪便处理后的样本加入到孔中，37℃孵育2小时，随后弃孔中的液体，不要清洗。加入100μL生物素标记的抗体，37℃孵育1小时。洗液洗板三次，每次2分钟。加入100μL HRP-生物素，37℃孵育1小时。洗液洗板五次，每次2分钟。加入90μL TMB底物，37℃孵育15-30分钟，随后加入50μL的终止液。在450nm的酶标仪进行读数。
本公开第二方面：提供一种用于诊断肠易激综合征的试剂盒，其中，所述试剂盒包括检测蛋白标志物的配体，所述蛋白标志物为Thymosinβ4蛋白。
根据本公开，所述配体为可以与Thymosinβ4蛋白特异性结合，用于检测所述蛋白的配体，例如可以为核酸和/或多肽。其中，所述多肽包括抗体，所述抗体例如为人抗体、嵌合抗体、重组抗体、人源化抗体、单克隆抗体、单克隆抗体的抗原结合片段或多克隆抗体。可以使用本领域技术人员熟知的标准技术产生抗体，或者可以使用购买的抗体。
以下通过实施例对本公开进行进一步地详细说明。
实施例中，检测Thymosinβ4蛋白的抗体测试剂订制于Proteintech公司，货号为19850-1-AP；免疫组化二抗试剂盒购自北京中杉金桥公司，货号为PV-9000；ELISA试剂盒购自武汉华美生物公司，货号为CSB-E11910h。
实施例1
针对肠易激综合征患者的肠组织样本和正常的肠组织样本，使用IHC方法检测Thymosinβ4蛋白的水平。
(1)制备样本：
IBS大鼠样本(A)：新生大鼠自出生第二天开始在每天早上9：00至12：00这三个小时与母鼠分离，持续进行21天。随后选取3个肠道组织，制作成石蜡蜡块并制备4μm切片。对照组为同一母鼠生产的未进行母婴分离的大鼠，具体组织处理方法跟上述一致。
IBS患者样本(B)：将30min之内的经肠镜获取的IBS患者的活检样本或者手术组织投入中性福尔马林固定液中固定过夜，流水冲洗，经过脱水、透明和浸蜡，制备组织蜡块。以临床症状为依据，根据ROMEⅢ标准进行IBS疾病的诊断。选取3个肠道组织，制作成石蜡蜡块并制备4μm切片。对照组为正常人的肠组织样本，具体组织处理方法跟上述一致。
(2)IHC具体检测方法如下：
将切片正面迎风置于65℃烘烤箱中烘烤40min，使样本贴附更好，浸入二甲苯洗缸I、II、III中，分别置于25℃恒温水浴箱中10min，转入100％、85％、75％乙醇中各3min梯度水化，然后转入PBS缓冲液I、II、III中，每次5min，置于3％过氧化氢洗缸中15min，封闭内源性过氧化酶。浸入加热后的枸橼酸钠缓冲液中，微波炉中低火20min。浸入PBS缓冲液I、II、III中，每次3min。用PAP Pen免疫组化石蜡笔沿切片组织边缘画出其范围，将稀释后的一抗溶液或抗体工作液用200μL微量加样器铺满所画范围内的组织表面并置于湿盒之中，37℃恒温培养箱中孵育2h或4℃冰箱中过夜。在纸巾上去除多余一抗，将组织芯片依次浸入PBS缓冲液I、II、III中，每次3min。加二步法免疫组化检测试剂盒中的试剂Ⅱ，确保铺满所画范围内的组织表面并置于湿盒之中，37℃恒温培养箱中孵育15min。在纸巾上去除多余试剂，将组织芯片依次浸入PBS缓冲液I、II、III中，每次3min。加二步法免疫组化检测试剂盒中的试剂Ⅲ(Polyperoxidase-anti-mouse/rabbit IgG)，确保铺满所画范围内的组织表面并置于湿盒之中，37℃恒温培养箱中孵育30min。在纸巾上去除多余试剂，将组织芯片依次浸入PBS缓冲液I、II、III中，每次3min。取DAB试剂盒取适量试剂，按1mLDAB稀释液加50μLDAB浓缩液的比例混匀；用200μL微量加样器将稀释后的DAB溶液铺满所画范围内的组织表面进行显色，各张切片保持显色时间一致；在镜下观察显色效果直至同一切片内部及不同切片之间形成较显著的对比后在纸巾上去除多余DAB溶液并置于蒸馏水中；显色时间为60s，不同抗体间显色时间有所差异。将苏木素染液用1000μL微量加样器迅速铺满所画范围内的组织阵列表面，10s后用缓慢的流水立刻冲去；将染色后的芯片置于1％氨水中。将切片依次浸入75％、85％、100％乙醇中各3min梯度脱水。浸入二甲苯洗缸中，10min，脱去PAP Pen免疫组化石蜡笔画出的笔迹，将切片置于通风处晾干，用快干封片剂封片。
(3)阳性判断标准：
计数20个高倍视野的免疫组化反应着色的细胞，染色强度积分为：无染色0分，弱染色1分，中等染色2分，强染色3分；染色面积积分为：着色范围≤10％为0分，>10％-25％为1分，>25％-50％为2分，>50％-75％为3分，>75％为4分。若两者积分之和≥3分则为阳性，低于3分则为阴性。
由图1可见，IBS大鼠样本(A)与IBS患者样本(B)的组织结果一致，均为IBS样本的细胞中Thymosinβ4蛋白表达相对于对照组样本的细胞中Thymosinβ4蛋白表达表现出显著的增强。
实施例2
针对肠易激综合征患者的血清、肠液和粪便样本，使用ELISA方法检测Thymosinβ4蛋白的水平。
(1)血浆(血清)样本的处理过程：
收集肠易激综合征患者的血浆(血清)样本，通过1000g离心15分钟，吸取上清进行后续检测。对照组为正常人的血浆(血清)样本。
(2)肠液样本的处理过程：
肠镜下收集肠易激综合征患者的肠液样本，通过1000g离心15分钟，吸取上清进行后续检测。对照组为正常人的肠液样本。
(3)粪便样本的处理过程：
肠易激综合征患者自行采集粪便样本，1个小时内送至实验室，用接种环将50mg的粪便样本加入到PE管中，向管中加入提取缓冲液(样本净重的49倍)，并盖紧管子；将样本管放入多孔涡旋混匀器，用最高速充分震荡30分钟，使样本变成匀浆；将匀浆转移到2ml的微量离心管中，3000g离心5分钟；将上清转移到干净的管内，可以直接用于后续的ELISA实验的检测。对照组为正常人的粪便样本。
(4)ELISA实验的具体检测流程如下：
将100μL的标准品或者血浆(血清)、肠液和粪便处理后的样本加入到孔中，37℃孵育2小时，随后弃孔中的液体，不要清洗。加入100μL生物素标记的抗体，37℃孵育1小时。洗液洗板三次，每次2分钟。加入100μL HRP-生物素，37℃孵育1小时。洗液洗板五次，每次2分钟。加入90μL TMB底物，37℃孵育15-30分钟，随后加入50μL的终止液。在450nm的酶标仪进行读数。
通过对IBS患者血清、肠液和粪便样本中的Thymosinβ4蛋白进行定量分析，发现相对于正常样本，Thymosinβ4蛋白在IBS患者血清和粪便中显著降低，但在肠液中升高。具体地，IBS患者血清样本中的Thymosinβ4蛋白仅为0.039±0.066μg/μl，不足正常对照血清Thymosinβ4蛋白表达量(0.134±0.145μg/μl)的1/3(如图2A)，同样在粪便中的情况也极为相似(如图2C)。但是，在IBS患者肠液样本中Thymosinβ4蛋白为0.015±0.145μg/μg，为正常对照肠液Thymosinβ4蛋白表达量(0.066±0.064μg/μg)的2倍以上(如图2B)。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
Claims (6)
1.一种检测蛋白标志物的配体在制备用于诊断肠易激综合征的产品中的用途，其中，所述蛋白标志物为Thymosinβ4蛋白。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述配体为核酸和/或多肽，所述多肽包括抗体，所述抗体为人抗体、嵌合抗体、重组抗体、人源化抗体、单克隆抗体、单克隆抗体的抗原结合片段或多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的用途，其中，检测蛋白标志物是通过以下步骤进行的：
1)获得肠易激综合征患者的生物样本，所述生物样本为肠组织样本、血浆样本、肠液样本和粪便样本中的一种或多种；
2)确定生物样本中蛋白标志物的表达水平。
4.根据权利要求3所述的用途，其中，步骤2)的方法为免疫组织化学方法和/或酶联免疫吸附测定方法。
5.一种用于诊断肠易激综合征的试剂盒，其中，所述试剂盒包括检测蛋白标志物的配体，所述蛋白标志物为Thymosinβ4蛋白。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述配体为核酸和/或多肽，所述多肽包括抗体，所述抗体为人抗体、嵌合抗体、重组抗体、人源化抗体、单克隆抗体、单克隆抗体的抗原结合片段或多克隆抗体。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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