CN110878276A

CN110878276A - 一种通过外膜缺陷制备革兰氏阴性细菌感受态细胞的方法

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Publication number: CN110878276A
Application number: CN201811036515.1A
Authority: CN
Inventors: 陈国强; 王子瑜; 秦琴
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2018-09-06
Filing date: 2018-09-06
Publication date: 2020-03-13
Anticipated expiration: 2038-09-06
Also published as: CN110878276B

Abstract

本发明公开了一种通过外膜缺陷制备革兰氏阴性细菌感受态细胞的方法。本发明方法包括：敲除和/或抑制革兰氏阴性细菌的基因组中与外膜脂多糖(LPS)相关的基因，获得外膜缺陷型菌株；利用所述外膜缺陷型菌株制备感受态细胞。本发明方法可提高野生型即可进行电转或化学转化的菌株(如嗜虫假单胞菌)的转化效率。更重要地，对于野生型不能进行电转或化学转化的革兰氏阴性菌株(如嗜盐菌等)而言，由此外膜缺陷型菌株制备的感受态细胞可以进行电转或化学转化DNA分子，可转化各种质粒，并表达其功能性的基因。该方法将在革兰氏阴性细菌基因编辑方面发挥重要应用。

Description

一种通过外膜缺陷制备革兰氏阴性细菌感受态细胞的方法

技术领域

本发明涉及微生物基因工程技术领域，具体涉及一种通过外膜缺陷制备革兰氏阴性细菌感受态细胞的方法。

背景技术

在自然状态下，部分细菌可以通过接合作用将质粒DNA转入到新的宿主中。Cohen在1972年首次成功将质粒DNA分子转化由CaCl₂法制得的革兰氏阴性细菌大肠杆菌E.coli感受态细胞(Cohen,S.N.,et al.(1972)."Nonchromosomal antibiotic resistance inbacteria:genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA."ProcNatl Acad Sci U S A 69(8):2110-2114)，自此，感受态细胞的制备和转化成为现代分子生物学实验中的一项重要技术，在基因编辑、DNA文库构建等方面发挥了重要作用。目前常用的转化方法为氯化钙法、Hanahan法以及电转化法。其中，电转化法的转化效率较高，但仍难于满足构建基因文库、突变库等需求，并且目前仍然存在很多种菌属(如嗜盐菌、气单胞菌、假交替单胞菌、黄杆菌等)不能制备感受态细胞或转化效率很低，只能通过接合转化转运DNA分子，阻碍了我们对其进行基因编辑的可能性。

革兰氏阴性菌拥有外膜作为一种保护性的渗透屏障，能阻止外界环境中的有害物质如抗生素等对细胞的伤害。外膜是一种不对称的脂质双层，内层含有各种甘油磷脂，外层的成分主要是脂多糖(LPS)。LPS的结构可以分为三个共价连接区域：一个高度酰化的2-葡萄糖胺骨架(脂质A)连接到一个包含重复糖(O抗原)的多糖与一个高度保守的核心多糖上(Sperandeo,P.,et al.(2017)."Lipopolysaccharide biogenesis and transport atthe outer membrane of Gram-negative bacteria."Biochim Biophys Acta1862(11):1451-1460.)。在大肠杆菌中，外膜厚度为8-10nm，每个细胞中约有～10⁶个LPS分子，覆盖了近四分之三的细胞外表面积。LPS具有高度有序的准晶体结构，且流动性非常低，为渗透限制奠定了分子基础(Dong,H.,et al.(2014)."Structural basis for outer membranelipopolysaccharide insertion."Nature 511(7507):52-56.)。因此，很有可能是外膜上的LPS阻碍了感受态细胞的DNA分子转运。

综上所述，开发一种可用于制备革兰氏阴性细菌感受态细胞得方法具有急切的应用需要，通过敲除或者抑制革兰氏阴性细菌外膜LPS合成及转运的相关基因以去除或弱化外膜是制备革兰氏阴性细菌感受态细胞的突破口。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过外膜缺陷制备革兰氏阴性细菌感受态细胞的方法。

第一方面，本发明要求保护一种制备革兰氏阴性细菌感受态细胞的方法。

本发明所提供的制备革兰氏阴性细菌感受态细胞的方法，可包括对革兰氏阴性细菌制造外膜缺陷的步骤。

进一步地，所述方法可包括如下步骤：

(1)敲除和/或抑制革兰氏阴性细菌的基因组中与外膜脂多糖(LPS)相关的基因，获得外膜缺陷型菌株；

(2)利用所述外膜缺陷型菌株制备感受态细胞。

在所述方法的步骤(1)中，所述与外膜脂多糖(LPS)相关的基因可为如下中至少一种：

(a1)外膜脂质A合成和修饰相关基因；

(a2)外膜脂多糖(LPS)合成和修饰相关基因；

(a3)外膜脂多糖(LPS)转运相关基因。

进一步地，所述外膜脂质A合成和修饰相关基因可为但不限于如下基因中至少一种：LpxA基因、LpxC基因、LpxD基因、LpxH基因、LpxB基因、LpxK基因、kdtA基因、LpxL基因和LpxM基因。所述外膜脂多糖(LPS)合成和修饰相关基因可为但不限于如下基因中至少一种：MsbA基因、WzX基因、WzY基因、WaaL基因、WaaF基因和WaaC基因。所述外膜脂多糖(LPS)转运相关基因可为但不限于如下基因中至少一种：LptA基因、LptB基因、LptC基因、LptD基因、LptE基因、LptF基因和LptG基因。

在本发明具体实施方式中，所述脂质A合成和修饰相关基因具体为如下基因：LpxA基因、LpxC基因、kdtA基因、LpxL基因和LpxM基因。所述外膜脂多糖(LPS)合成和修饰相关基因具体为如下基因：MsbA基因、WzX基因、WzY基因、WaaL基因、WaaF基因和WaaC基因。所述外膜脂多糖(LPS)转运相关基因为具体如下基因：LptA基因、LptB基因、LptC基因、LptD基因、LptE基因、LptF基因和LptG基因。

更加具体的，在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(1)为：敲除革兰氏阴性细菌的基因组中如下基因：LpxA基因、LpxC基因、kdtA基因、LpxL基因和LpxM基因，从而获得所述外膜缺陷型菌株(对应实施例1和2)。在本发明的另一个具体实施方式中，所述步骤(1)为：抑制革兰氏阴性细菌的基因组中如下基因：MsbA基因、WzX基因、WzY基因、WaaL基因、WaaF基因和WaaC基因，从而获得所述外膜缺陷型菌株(对应实施例3和5)。在本发明的再一个具体实施方式中，所述步骤(1)为：敲除革兰氏阴性细菌的基因组中如下基因：LpxA基因、LpxC基因、KdtA基因、LpxL基因和LpxM基因，并且抑制革兰氏阴性细菌的基因组中如下基因：LptA基因、LptB基因、LptC基因、LptD基因、LptE基因、LptF基因和LptG基因，从而获得所述外膜缺陷型菌株(对应实施例4)。

在所述方法的步骤(2)中，利用所述外膜缺陷型菌株制备所述感受态细胞在低温(如4℃)和室温下均可进行。

优选地，上述方法的步骤(2)中制备所述感受态细胞在室温下进行。更优选地，上述方法的步骤(2)中制备所述感受态细胞在10-30℃(如10-25℃，具体如10℃、15℃、20℃或25℃)下进行。

在所述方法的步骤(2)中，利用所述外膜缺陷型菌株制备所述感受态细胞可按照包括如下步骤的方法进行：将所述外膜缺陷型菌株用缓冲溶液处理(此处的“处理”具体可为重悬，然后离心去上清。可重复此操作两次)后获得所述感受态细胞；所述缓冲溶液的溶剂为水，溶质为如下(b1)或(b2)或(b3)：

(b1)蔗糖和甘油；

(b2)甘油；

(b3)蔗糖。

进一步地，在(b1)所示的所述缓冲溶液中，所述蔗糖的含量可为200-600mM(如200-500mM；具体如200mM、400mM或者500mM)；所述甘油的体积百分含量可为5-20％(如5-10％或10-20％；具体如5％、10％或者20％)。在(b2)所示的所述缓冲溶液中，所述甘油的体积百分含量可为5％-20％(如5-10％或10-20％；具体如5％、10％或者20％)。在(b3)所示的所述缓冲溶液中，所述蔗糖的含量可为200-600mM(如200-500mM；具体如200mM、400mM或者500mM)。

在所述方法的步骤(2)中，在将所述外膜缺陷型菌株用所述缓冲溶液处理前还包括将所述外膜缺陷型菌株置于培养基中培养，然后离心去上清的步骤。

第二方面，本发明要求保护一种制备革兰氏阴性细菌的外膜缺陷型菌株的方法。

本发明所提供的制备革兰氏阴性细菌的外膜缺陷型菌株的方法，可包括前文第一方面中所述方法的步骤(1)。

第三方面，本发明要求保护下述任一生物材料：

(c1)利用前文第一方面中所述的方法制备得到的革兰氏阴性细菌的感受态细胞。

(c2)利用前文第二方面中所述方法制备得到的革兰氏阴性细菌的外膜缺陷型菌株。

利用前文第一方面中所述的方法制备得到的革兰氏阴性细菌的感受态细胞可用于电转或化学转化，但不限于电转或化学转化。

第四方面，本发明要求保护下述任一应用：

(d1)前文第三方面中所述的感受态细胞在以电转或化学转化方式被导入DNA分子(可为线性DNA分子或环形质粒)中的应用；

在所述应用中，向所述感受态细胞中以电转的方式导入DNA分子时，电转温度为低温(4℃)或室温。

优选地，所述电转温度为室温。更优选地，所述电转温度为10-30℃(如10-25℃，具体如10℃、15℃、20℃或25℃)。

在所述应用中，向所述感受态细胞中以电转的方式导入DNA分子时，电转电压为12-18kV/cm(如12kV/cm、15kV/cm或18kV/cm)。

(d2)前文第三方面中所述的外膜缺陷型菌株在制备革兰氏阴性细菌的感受态细胞中的应用。

在前文各方面中，所述革兰氏阴性细菌可包括但不限于嗜盐菌、假单胞菌或大肠杆菌等。

在本发明的具体实施方式中，所述革兰氏阴性细菌为嗜盐单胞菌(Halomonasbluephagenesis或嗜虫假单胞菌(Pseudomonas entomophila)。

所述嗜盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)具体为嗜盐单胞菌(Halomonasbluephagenesis)TD01或嗜盐单胞菌(Halomonas campaniensis)LS21。所述嗜虫假单胞菌(Pseudomonas entomophila)具体为嗜虫假单胞菌(Pseudomonas entomophila)L48。

实验证明，本发明通过敲除或抑制革兰氏阴性细菌的基因组中与外膜脂多糖(LPS)相关的基因，可获得外膜缺陷型菌株，该菌株经过缓冲溶液处理可成为感受态细胞，且本发明制备感受态细胞在低温和室温下均可(现有的革兰氏阴性细菌感受态细胞制备均在低温(如冰上，4℃)进行)，优选室温，操作方便，且可提高野生型即可进行电转或化转的菌株(如嗜虫假单胞菌)的转化效率。更重要地，对于野生型不能进行电转或化转的革兰氏阴性菌株(如嗜盐菌等)而言，由此外膜缺陷型菌株制备的感受态细胞可以进行电转或化转DNA分子，可转化各种质粒，并表达其功能性的基因。该方法将在革兰氏阴性细菌基因编辑方面发挥重要应用。

附图说明

图1为验证基因敲除设计的引物示意图(以LpxM基因为例)。

图2为敲除效果的PCR验证结果图(以LpxM基因为例)。

图3为嗜盐单胞菌电转感受态细胞经过电转含有壮观霉素抗性基因的质粒，在筛选平板上的生长结果。

图4为嗜盐单胞菌电转感受态细胞在转化含有壮观霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因gfp基因的质粒后在筛选平板上的生长结果。

图5为qPCR检测基因表达抑制水平(以WaaF基因为例)。

图6为通过抑制嗜盐单胞菌(H.campaniensis)LS21基因组中外膜LPS合成和修饰相关基因获得的电转效果图。

图7为敲除嗜盐单胞菌(H.bluephagenesis)TD01外膜脂质A合成和修饰相关基因和抑制外膜LPS转运相关基因获得的电转效果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

嗜盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD01：本实验室筛选得到的一株耐盐、耐碱、天然生产PHB的革兰氏阴性嗜盐细菌，此菌自身即可积累较高含量的聚羟基脂肪酸，具有非常好的工业化生产应用前景。记载于“Tan Dan,Wu Qiong,Chen,Jin-Chun and ChenGQ.Engineering Halomonas TD01 for Low Cost Production ofPolyhydroxyalkanoates.Metabolic Engineering 26(2014)34–47”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

嗜盐单胞菌(Halomonas campaniensis)LS21：是本实验室筛选得到的一株革兰氏阴性嗜盐细菌，具有非常好的工业化生产应用前景。记载于“Haitao Yue et al.Aseawater-based open and continuous process for polyhydroxyalkanoatesproduction by recombinant Halomonas campaniensis LS21 grown in mixedsubstrats.Biotechnology for Biofuels,2014,7(1):1-12”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

嗜虫假单胞菌(Pseudomonas entomophila)L48：为实验室保存菌种。记载于“Vodovar N,Vallenet D,Cruveiller S,et al.Complete genome sequence of theentomopathogenic and metabolically versatile soil bacterium Pseudomonasentomophila.Nat Biotechnol,2006,24(6):673-679”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

培养基配方：

LB培养基含：5g/L酵母提取物(英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L蛋白胨(英国OXID公司，产品目录号LP0042)，10g/L NaCl，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。LB60培养基为LB培养基含有60g/L NaCl，其余成分和制备条件与LB培养基相同。

pSEVA241质粒、pSEVA321质粒和pQ08质粒：记载在如下文献中：Qin Qin,ChenLing,Yiqing Zhao,Tian Yang,Jin Yin,Yingying Guo,2018,CRISPR/Cas9 editinggenome of extremophile Halomonas spp,Metabolic Engineering,47(2018)219-229。公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

实施例1、通过敲除外膜脂质A合成和修饰相关基因制备嗜盐单胞菌的电转感受态细胞

通过敲除嗜盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD01基因组中外膜脂质A合成和修饰相关基因后，获得LPS缺陷型菌株，该菌株经过蔗糖-甘油缓冲液处理可成为电转感受态细胞，可电转含有壮观霉素抗性基因的质粒。

具体操作过程如下：

步骤一、用CRISPR-Cas9技术敲除嗜盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD01基因组中外膜脂质A合成和修饰相关基因LpxA、LpxC、kdtA、LpxL、LpxM，获得嗜盐菌外膜缺陷型菌株。具体如下：

1、敲除基因

用于表达sgRNA以及donor DNA的原始表达载体为pSEVA241质粒(含卡那霉素和壮观霉素抗性基因)，sgRNA插入在启动子J23119(SpeI)之后，上下游同源臂插入在sgRNA之后，得到相应的重组质粒。

sgRNA的DNA序列为：

LpxA：5’-gtaggtcatgactgtgtgatGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTG-3’(SEQ ID No.1)；

LpxC：5’-ctggcactaccgtccatgatGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTG-3’(SEQ ID No.2)；

kdtA：5’-ctgttgcggttgtgaacgggGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTG-3’(SEQ ID No.3)；

LpxL：5’-ctgatcaggggagtaccataGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTG-3’(SEQ ID No.4)；

LpxM：5’-ccccagtttggttcttgatcGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTG-3’(SEQ ID No.5)；

上下同源臂的DNA序列为：LpxA：SEQ ID No.6；LpxC：SEQ ID No.7；kdtA：SEQ IDNo.8；LpxL：SEQ ID No.9；LpxM：SEQ ID No.10。

用于表达cas9的原始表达载体为pSEVA321质粒，所得重组表达载体为pQ08质粒(含氯霉素抗性基因)。

两种质粒通过大肠杆菌S17-1接合转化至嗜盐单胞菌(Halomonasbluephagenesis)TD01。

2、通过菌落PCR设计引物筛选基因敲除的突变株，并且通过基因测序确认。设计验证引物如图1所示，LpxM(图中标记为TD_02821)为目的基因，HR为同源臂。Wild type验证引物Y108+Y160＝630bp。mutant验证引物：Y110+Y108＝1637bp(Wild type)，Y110+Y108＝1133bp(mutant)。菌落PCR为常规操作，使用上述验证引物验证结果如图2所示。其中，图1和图2是以LpxM基因为例。

最终，经过菌落PCR和基因测序确认，证实嗜盐单胞菌(Halomonasbluephagenesis)TD01基因组中外膜脂质A合成和修饰相关基因LpxA、LpxC、KdtA、LpxL、LpxM已经被敲除。

步骤二、将步骤一获得的外膜缺陷型菌株接种至LB60培养基(LB培养基含有60g/LNaCl)，培养18h后按1％比例(体积比)转接于LB60培养基中，继续培养。

步骤三、步骤二菌液培养至OD600＝2，将菌液离心(20℃，4000rpm，15min)，弃去上清。

步骤四、用步骤三菌液离心前等体积的蔗糖-甘油缓冲液(蔗糖浓度为500mM，甘油浓度为10％；溶剂为水，溶质为蔗糖和甘油，％表示体积百分含量)重悬细胞，离心(20℃，4000rpm，15min)，弃去上清。重复两次。

步骤五、用步骤三菌液离心前10％体积的缓冲液(即步骤四中的蔗糖-甘油缓冲液)重悬细胞，得到嗜盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD01的感受态细胞。

然后取100μL感受态细胞至新的无菌管中，加入含壮观霉素抗性基因的质粒pSEVA241 100ng，转移至电击杯进行电击，电击条件为20℃，18kV/cm。

电击结束后加入500μL SOC60培养基(SOC培养基含有60g/L NaCl)，37℃，200rpm复苏4h后涂于含有壮观霉素的LB60平板。经过37℃，24h静置培养后，结果如图3，可以看到单克隆生长。结果说明，经过敲除外膜脂质A合成和修饰相关基因LpxA、LpxC、kdtA、LpxL、LpxM，嗜盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD01在用蔗糖-甘油缓冲液处理后可以制备为电转感受态细胞，可以转化含有壮观霉素抗性基因的质粒。

实施例2、通过敲除外膜脂质A合成和修饰相关基因制备嗜盐单胞菌的电转感受态细胞，转化含有gfp基因的质粒

使用嗜盐单胞菌(H.bluephagenesis)TD01作为出发菌株，通过敲除脂质A合成和修饰相关基因后，获得该菌株的LPS缺陷型菌株，该菌株经过蔗糖缓冲液处理可成为电转感受态细胞，可电转含有壮观霉素抗性基因和gfp基因的质粒。

具体操作过程如下：

步骤一、用CRISPR-Cas9技术敲除嗜盐单胞菌(H.bluephagenesis)TD01基因组中外膜脂质A合成和修饰相关基因LpxA、LpxC、KdtA、LpxL、LpxM，获得嗜盐单胞菌外膜缺陷型菌株。具体操作同实施例1步骤一。

步骤二、将步骤一获得的外膜缺陷型菌株接种至LB60培养基(LB培养基含有60g/LNaCl)，培养22h后按2％比例(体积比)转接于LB60培养基中，继续培养。

步骤三、步骤二菌液培养至OD600＝1.5，将菌液离心(15℃，5000rpm，15min)，弃去上清。

步骤四、用步骤三菌液离心前等体积的蔗糖缓冲液(蔗糖浓度为400mM；溶剂为水，溶质为蔗糖)重悬细胞，离心(15℃，5000rpm，15min)，弃去上清。重复两次。

步骤五、用步骤三菌液离心前10％体积的缓冲液(即步骤四中的蔗糖缓冲液)重悬细胞，得到嗜盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD01的感受态细胞。

然后取100μL感受态细胞至新的无菌管中，加入含有壮观霉素抗性基因和gfp基因的质粒pSEVA241 300ng，转移至电击杯进行电击，电击条件为15℃，15kV/cm。

电击结束后加入400μL SOC60培养基(SOC培养基含有60g/L NaCl)，37℃，200rpm复苏3h后涂于含有壮观霉素的LB60平板。经过37℃，24h静置培养后，结果如图4，可以看到单克隆生长，并且单克隆都有绿色荧光。结果说明，经过敲除外膜脂质A合成和修饰相关基因LpxA、LpxC、kdtA、LpxL、LpxM，嗜盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD01在用蔗糖缓冲液处理后可以制备为电转感受态细胞，可以转化含有壮观霉素抗性基因的质粒，并且成功表达功能性的基因。

实施例3、通过抑制外膜LPS合成和修饰相关基因制备嗜盐单胞菌的电转感受态细胞

嗜盐单胞菌(Halomonas campaniensis)LS21是本实验室筛选得到的一株革兰氏阴性嗜盐细菌，具有非常好的工业化生产应用前景。通过抑制外膜LPS合成和修饰相关基因后，获得该菌株的LPS缺陷型菌株，该菌株经过蔗糖-甘油缓冲液处理可成为电转感受态细胞，可电转含有氯霉素抗性基因的质粒。

具体操作过程如下：

步骤一、用sRNAi技术抑制嗜盐单胞菌(H.campaniensis)LS21基因组中外膜LPS合成和修饰相关基因包括MsbA、WzX、WzY、WaaL、WaaF、WaaC，获得嗜盐单胞菌外膜缺陷型菌株。具体如下：

1、以基因起始密码子AUG+21bp作为target-binding sequence，通过酶切连接方法插入至至pSEVA321质粒中氯霉素抗性基因启动子之前。通过化学转化的方法转入大肠杆菌S17-1。将该质粒通过接合转化从大肠杆菌S17-1转入到嗜盐单胞菌(H.campaniensis)LS21中，pSEVA321质粒含有氯霉素抗性基因，可作为筛选条件，防止质粒丢失。同时以不含target-binding sequence的pSEVA321质粒作为对照组。

target-binding sequence序列如下：

MsbA：5’-atgaacccaacctgaatcagtcac-3’(SEQ ID No.11)。

WzX：5’-atgagcctggagcaacgctggctt-3’(SEQ ID No.12)。

WzY：5’-atgaaagttgatttaaccgccctg-3’(SEQ ID No.13)。

WaaL：5’-atgctgtcagggtggaaaatgccg-3’(SEQ ID No.14)。

WaaF：5’-atggctaattctgccaagcgcata-3’(SEQ ID No.15)。

WaaC：5’-atgcccacggtgcgcgcgttacag-3’(SEQ ID No.16)。

2、抑制效果用RT-qPCR进行检测。将上述步骤中的实验组和对照组细菌培养至平台期，提取细菌的RNA并进行逆转录，以此cDNA为模板通过qPCR进行检测基因的表达水平。图5为qPCR检测基因表达抑制水平(以WaaF基因为例)。

其中，qPCR引物序列：

用于检测MsbA基因：

MsbA-F：5’-ttaggctgatcatcagcgtaac-3’；

MsbA-R：5’-tgatcattagcgctgctgcg-3’。

用于检测WzX基因：

WzX-F：5’-catgtttgccataagcgcagg-3’；

WzX-R：5’-gcatcaaaatcactggtgagc-3’。

用于检测WzY基因：

WzY-F：5’-tgagttcaaaaccgttgccc-3’；

WzY-R：5’-cgcaaagcctatttatcaccc-3’。

用于检测WaaL基因：

WaaL-F：5’-aggccgacgacgtgattgc-3’；

WaaL-R：5’-tgatgctcgaccgctattggc-3’。

用于检测WaaF基因：

WaaF-F：5’-gcctctctcggtggccatgc-3’；

WaaF-R：5’-tgcgagtgatgagtcgtaac-3’。

用于检测WaaC基因：

WaaC-F：5’-gtgatgattctttccgactac-3’；

WaaC-R：5’-gtggtaggggatgtgatgctc-3’。

最终，经过qPCR确认，证实嗜盐单胞菌(H.campaniensis)LS21基因组中外膜LPS合成和修饰相关基因包括MsbA、WzX、WzY、WaaL、WaaF、WaaC已经被抑制。

步骤二、将步骤一获得的外膜缺陷型菌株接种至LB60培养基(LB培养基含有60g/LNaCl)，培养16h后按1.5％比例(体积比)转接于LB60培养基中，继续培养。

步骤三、步骤二菌液培养至OD600＝2.5，将菌液离心(10℃，6000rpm，10min)，弃去上清。

步骤四、用步骤三菌液离心前等体积的蔗糖-甘油缓冲液(蔗糖浓度为400mM，甘油浓度为5％；溶剂为水，溶质为蔗糖和甘油，％表示体积百分含量)重悬细胞，离心(10℃，6000rpm，10min)，弃去上清。重复两次。

步骤五、用步骤三菌液离心前20％体积的缓冲液(即步骤四中的蔗糖-甘油缓冲液)重悬细胞，得到嗜盐单胞菌(H.campaniensis)LS21的感受态细胞。

然后取80μL感受态细胞至新的无菌管中，加入含氯霉素抗性基因的质粒pSEVA321200ng，转移至电击杯进行电击，电击条件为10℃，12kV/cm。

电击结束后加入600μL SOC60培养基(SOC培养基含有60g/L NaCl)，37℃，200rpm复苏3h后涂于含有氯霉素的LB60平板。经过37℃，24h静置培养后，可以得到生长的单克隆(图6)。

结果说明，经过抑制基因组中外膜LPS合成和修饰相关基因包括MsbA、WzX、WzY、WaaL、WaaF、WaaC，嗜盐单胞菌(H.campaniensis)LS21在用蔗糖-甘油缓冲液处理后可以制备为电转感受态细胞，可以转化含有氯霉素抗性基因的质粒。

实施例4、通过在敲除外膜脂质A合成和修饰相关基因的外膜缺陷型菌株中抑制外膜LPS转运相关基因制备嗜盐单胞菌的电转感受态细胞

使用嗜盐单胞菌(H.bluephagenesis)TD01作为出发菌株，敲除外膜脂质A合成和修饰相关基因后，进一步抑制外膜LPS转运相关基因的表达，获得该菌株的LPS缺陷型菌株，该菌株经过蔗糖-甘油缓冲液处理可成为电转感受态细胞，可电转含有氯霉素抗性基因的质粒。

具体操作过程如下：

步骤一、先用CRISPR-Cas9技术敲除嗜盐单胞菌(H.bluephagenesis)TD01基因组中外膜脂质A合成和修饰相关基因LpxA、LpxC、KdtA、LpxL、LpxM(具体操作同实施例1步骤一)，再用sRNAi技术进一步抑制外膜LPS转运相关基因包括LptA、LptB、LptC、LptD、LptE、LptF、LptG，获得嗜盐菌外膜缺陷型菌株(具体操作同实施例3步骤一)。

步骤二、将步骤一获得的外膜缺陷型菌株接种至LB60培养基(LB培养基含有60g/LNaCl)，培养20h后按3％比例(体积比)转接于LB60培养基中，继续培养。

步骤三、步骤二菌液培养至OD600＝3.5，将菌液离心(25℃，8000rpm，5min)，弃去上清。

步骤四、用步骤三菌液离心前等体积的蔗糖-甘油缓冲液(蔗糖浓度为200mM，甘油浓度为20％；溶剂为水，溶质为蔗糖和甘油，％表示体积百分含量)重悬细胞，离心(25℃，8000rpm，5min)，弃去上清。重复两次。

步骤五、用步骤三菌液离心前20％体积的缓冲液(即步骤四中的蔗糖-甘油缓冲液)重悬细胞，得到嗜盐单胞菌(H.bluephagenesis)TD01的感受态细胞。

然后取50μL感受态细胞至新的无菌管中，加入含氯霉素抗性基因的质粒pSEVA321500ng，转移至电击杯进行电击，电击条件为25℃，15kV/cm。

电击结束后加入400μL SOC60培养基(SOC培养基含有60g/L NaCl)，37℃，200rpm复苏4h后涂于含有氯霉素的LB60平板。经过37℃，24h静置培养后，可以得到生长的单克隆(图7)。

结果说明，经过敲除外膜脂质A合成和修饰相关基因LpxA、LpxC、KdtA、LpxL、LpxM和抑制外膜LPS转运相关基因包括LptA、LptB、LptC、LptD、LptE、LptF、LptG，嗜盐单胞菌(H.bluephagenesis)TD01在用蔗糖-甘油缓冲液处理后可以制备为电转感受态细胞，可以转化含有氯霉素抗性基因的质粒。

实施例5、通过抑制外膜LPS合成和修饰相关基因提高嗜虫假单胞菌的电转感受态细胞的转化率

使用嗜虫假单胞菌(Pseudomonas entomophila)L48作为出发菌株，通过抑制外膜LPS合成和修饰相关基因，获得该菌株的LPS缺陷型菌株，该菌株经过甘油缓冲液处理可成为电转感受态细胞，与野生型菌株相比，可提高质粒DNA分子的电转效率。

具体操作过程如下：

步骤一、用sRNAi技术抑制嗜虫假单胞菌(P.entomophila)L48基因组中外膜LPS合成和修饰相关基因包括MsbA、WzX、WzY、WaaL、WaaF、WaaC，获得嗜虫假单胞菌外膜缺陷型菌株。具体操作同实施例3步骤一。

步骤二、将步骤一获得的外膜缺陷型菌株和野生型菌株分别接种至LB培养基，培养18h后按5％比例(体积比)转接于LB培养基中，继续培养。

步骤三、步骤二菌液培养至OD600＝0.8，将菌液离心(4℃，6000rpm，10min)，弃去上清。

步骤四、用步骤三菌液离心前等体积的甘油缓冲液(甘油浓度为15％；溶剂为水，溶质为甘油，％表示体积百分含量)重悬细胞，离心(4℃，6000rpm，10min)，弃去上清。重复两次。

步骤五、用步骤三菌液离心前20％体积的缓冲液(即步骤四中的甘油缓冲液)重悬细胞，得到嗜虫假单胞菌(P.entomophila)L48的感受态细胞。

然后取100μL感受态细胞至新的无菌管中，加入含氯霉素抗性基因的质粒pSEVA321200ng，转移至电击杯进行电击，电击条件为4℃，18kV/cm。

电击结束后加入500μL LB培养基，37℃，200rpm复苏1h后涂于含有氯霉素的LB平板。经过37℃，24h静置培养后，发现经过抑制外膜LPS合成和修饰相关基因的外膜缺陷型嗜虫假单胞菌(P.entomophila)L48菌株得到转化克隆数目是野生型菌株的近十倍。结果说明，经过抑制基因组中外膜LPS合成和修饰相关基因包括MsbA、WzX、WzY、WaaL、WaaF、WaaC，嗜虫假单胞菌(P.entomophila)L48在甘油缓冲液处理后可以制备为电转感受态细胞，可以明显地提高转化效率。

以上实施例对本发明进行了详细的描述，但本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，不能以此来限制本发明的保护范围。且本发明不限于上述实施例，凡根据本发明的技术构思所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

<110> 清华大学

<120> 一种通过外膜缺陷制备革兰氏阴性细菌感受态细胞的方法

<130> CGGNQALN186083

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

gtaggtcatg actgtgtgat gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt g 81

<210> 2

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

ctggcactac cgtccatgat gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt g 81

<210> 3

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

ctgttgcggt tgtgaacggg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt g 81

<210> 4

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

ctgatcaggg gagtaccata gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt g 81

<210> 5

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

ccccagtttg gttcttgatc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt g 81

<210> 6

<211> 1000

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

aggggtgcgg tattttaggc tttaaaacgg tcaataaact gcctgctgac ggctatgttt 60

actatttggt aggaagcgac aatgtgcgct tcaagcgccc tgtgatgccg ggtgaccaat 120

tagtgttgga agccaatgtt atccgtggaa aacgtggcat ttggaagttc gcctgccgtg 180

ccaccgttaa cgatgaatta gcctgtgagg cggaaattat ttgtgctgag aggaaggtag 240

cttgatacat cctactgcac tggttgatcc caaagcgcag cttgctgaca gcgttgaggt 300

tggcccgttt agtgttattg ggccagatgt cacgattggc gctggttctg tgataggccc 360

gcacgtggtt attaaagggc ctactgtgct aggtgagcgt acgcgaattt ttcagtttgc 420

ttcggtagga gaagactgcc aagacaaaaa atacgcgggc gagccaacgc ggttggtaat 480

gggggatgat aacgttgttc gcttgaaacg ccgtggtttt agccgtgacg cgatcaatgc 540

gttaagcagc gcctacaagc tggtataccg ccaaggttta actgtcgagc aagcggttag 600

cgaaatgcgc agccggttcg atctgccaga agtcaccacg tttgccgact ctattgagcg 660

gtcaacgcgg ggtatcgtcc gctaatgaca ttgatgtcta gccgacatca acgatggatt 720

caaatgccac tacttccccg ctcatcatga cacttcagcg cgtctatatt gttgcaggcg 780

aactctccgg cgatatcctc ggagcaggat tgatgcacga gctgaaactg cgccatccag 840

atattgagtt tcgtgggctg ggcggccctc gtatggaagc tcatgggttg acgagccgtt 900

ttccccttga aacgttatcg gtgatgggcc tagttgaggt cataaaacat ctgcctgagc 960

tcattcgcgt gcgccgcact ctgcgcgaag aagcgctcgc 1000

<210> 7

<211> 1000

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

agaatgcagg caaaacgcta gccgagtgcg caaaagatac cgacaacccc tcccttaaaa 60

acgccttgga gcgcttagcg gctcatgcac ctaagcattc agatgaataa acattaatcg 120

ccatgttaat cccagcgtta aaatgcaaaa gcaccgccag agcggtgctt tttactgttg 180

cgatcgtact acccaaaaat ctgacaggtg tttaacctat gccattgcag gtgccgagta 240

agagataggc gcaaccgctt tatcttcttc aaatgtgacg atttcatagg cgtcgggctg 300

cgccaatagc tcgcggcaca actggttgtt gagcgcgtgt cccgatttaa caccctggaa 360

ctcgccaatc aaactgtggc ccagctggta caaatcacca atagcatcaa gcaccttatg 420

cttgacgaac tcatcgtcgt aacgcagacc accttcgttc acgatgcggt agtcatccac 480

aacaatagca ttatctaagc ttgtaagaaa gcgcagtgca taatgtggtg tcttccacca 540

attcggcacg agcaggtacg tgagccacag gctccaaatc ggtccggata aacacaattc 600

cggtattagc cggcgccggg cgcaaagcca agtggacttt tttgccagag tgcagaccca 660

ctccggtggc gcgaatgacg ttttgtaatg tgcgttgtct gatcatgggc agtggtcgaa 720

ctctaatgac ggcggtcacc ggcagaagcg ccgacaagta ccgctagggg aaagaaagta 780

aagaaacagt gttcacttta acagcaaacg agcgttttaa ccaataaaac tctcgtttgc 840

tgctttagtg aacgctgatg gcgccgatta atctgcctga cgacgtaaaa atgcgggaat 900

gtccaaatag tcatcggcgt ctggggctcg acgcttatca ggacgaggtt tcgcagctgg 960

ctcaggggct tctgcacgtg ccgttgcttg ctgacgcata 1000

<210> 8

<211> 1000

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

gcgctgattg aagccgtttt gccggatatc ttggtgaaag gtggtgatta ccgccctgaa 60

gatattgccg gtggtgaagc cgttatcgcc aacggtggtg acgttaaagt attgggcttt 120

gaagatggtg tatcgactac cgcaatgatc agctcgattt tggatcgtga gggttaatgg 180

cgtcgccagt ttggccgcgt ctggtctatt cagcggcgct ctatgtcttg tctccgctta 240

ttttatggcg tatttggcgg gagcaagtac ttacttactc ccgcttgcag cgttttggta 300

tgcgcctggg tgcgcttcct caagcgccac gaatttggtt gcactgcgcc tcggtggggg 360

aagtgcgcgc tgcgcgtccg ctgatagaag gtttgctggc gcgctaccct catcacagcc 420

tgctgcttac caccatgacc gcgactggag ctcagcaagc tcaggcgcta attgatgaac 480

aagctgcacc tgaccaagta gccatgtggc ttatgtcggt ggtagtttgg tgccgttggg 540

cggccacaac gtgctggagc ctgcggcgtt gggtaagccg gtgctctgcg gcccttcgct 600

tgagaacttt agcgatgtgg ctgagccgct attgtcgtca ggcgcattaa gcgtggtgga 660

tccccccgac gccttggccg acgcactggc cgagctactg gtaagtccac ctttcgccca 720

gcacattggg catgctgggc gaaaggtggt tgaagacaac cgaggagcgc tagcgcgcac 780

tctcgatggg cttagccagt ggctaacgta acgcgggtcg ttccacgccg ttctctgtac 840

ccagcagcag cacatcagca ccgcgttgag cgaataaccc gtttgttacc acgcccacaa 900

tggcattaat ccgtgcctcc atggacgctg ggtcgtcgat cataaaatca aagcagtcga 960

taatctggtt gccattatcg gtgacgacac cttgtcgata 1000

<210> 9

<211> 1004

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

tggcagaaga taccaagcac gcctaccaaa tgatcgacgt gaacgtctat caagaaaaca 60

tgttccacac caaaatgctg ctgaaagact tcgaacttga taactatctg ttcggcacat 120

cgcgtcgcga cattacattc gaagaagcac gggacattga aagccggctg cgcaaagaga 180

tgctagaaat tttctactct cgaaatctgg actaacgcct gctttcaacg ttaacgaaaa 240

gccgttctgc caccctagca gaacggcttt ttttgtttat cacttcgcta acgaatgcta 300

ctagtaaacg cctgcctccc cttccgggcg agttttaaag cgccgatgaa gccataggta 360

ctgctcagga tgcttgcgaa tagcctgctc gataaattcg ttgacccttg ttgcatcggc 420

cacttcatca ccgcttggaa agttatcaag cgcgggcaag caagtgatgg tataggtctg 480

gttatctggg tttcggtgat aagggcccca tcccattggc aataaaaatc tcttttccca 540

gccggtgctg ctcatcggca cttttttcag ggaaacagag tgcaatattt gtctcagtga 600

tatgccgccg acgctttatg aaacgccatg ctaacaaacc aattactttc ccaacccata 660

gtttaagccg ccagggaagc caggcaacaa catgcattgc gcctatcgca agccaggttg 720

gccagtagcg agggtgtgca aatgaccgcg gataagaggt tttagacata ctgataaccg 780

tttaagcgaa ggccccatga tagcgacgcg gcgctcttgg cagcactccc gttaataagg 840

tatagctgat ggtatcgcag tagcgtgcta cctcatcaat tggcaacaca gcaccgtcgc 900

tggcggctcc ccacagcacg acttcgctac cgatggcagc tcccagcacg tcggtgacat 960

cgacggttag catatccatt gaaaccttgc cagcaatcgc acag 1004

<210> 10

<211> 1004

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

gcgcacacaa agccacacca ctaatagtgg ccatagcaat gtgcccacta acattaagct 60

aagggtaaag gtaactataa agtagagaca gcctatccaa aaagtacgga tcaaataacg 120

gtagtgagct tgcagccacg gcgccgcttc attgcgatac acataagcga taataacgcc 180

aatcaacagc gtaatatttg ctgttactag gcccgctaag taaagtgcgt aaatgatttg 240

tggcgggcgc atttcctctt tgggaatata acgctgggtc ataaattttc tcattaccct 300

tcagtaaagc ctaaattgtt tggcgtttgc tagcccttgc tgttgctcta ttactttgcg 360

atagcgcttg tattcccact gatactgcgt cggatcaaga gcgattgatg cttctacgct 420

ggcattaacg ccagtcgccg ataccacatc atcttcgctg taaacctgct cgtcggcgtc 480

aaggaaatga atttcaaatc aaggtttgta tggcaagtgc tttgcgctgg ctggtagtgg 540

cctcagggtt aaccacttgc agattgattt ccgttacctg gcgttctcgt ttactaaagc 600

gatagaccag cgggcctaat agcacggcga tacgccaaag aacggcaagt ggccaacgcg 660

ccagtagttt ccaaaggcct gtgatggcac gtgcctggaa aagcgatttt ttagaagttg 720

cctgctctgt cataagttac aggaaccagc tatcaacgtt ggttggtgca cgcttctcct 780

gcagaccctt aaagcctttc acacagcgaa caataaacca tacggccaac gccaatagca 840

tgggaatgcc aatcagaata aacgttagca aagtggcgat gctgccgtag agcagcccaa 900

tccaaaacgt gcggatctga tagcggtagt gttcatccag ccattcaggg cctttaccac 960

gatagacata ggcgataacg atgcccacaa gcgaggtgaa ccct 1004

<210> 11

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atgaacccaa cctgaatcag tcac 24

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atgagcctgg agcaacgctg gctt 24

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atgaaagttg atttaaccgc cctg 24

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atgctgtcag ggtggaaaat gccg 24

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<213> Artificial sequence

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<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 16

atgcccacgg tgcgcgcgtt acag 24

Claims

1.一种制备革兰氏阴性细菌感受态细胞的方法，包括对革兰氏阴性细菌制造外膜缺陷的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

(1)敲除和/或抑制革兰氏阴性细菌的基因组中与外膜脂多糖相关的基因，获得外膜缺陷型菌株；

(2)利用所述外膜缺陷型菌株制备感受态细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述与外膜脂多糖相关的基因为如下中至少一种：

(a1)外膜脂质A合成和修饰相关基因；

(a2)外膜脂多糖合成和修饰相关基因；

(a3)外膜脂多糖转运相关基因。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述外膜脂质A合成和修饰相关基因为如下基因中至少一种：LpxA基因、LpxC基因、LpxD基因、LpxH基因、LpxB基因、LpxK基因、kdtA基因、LpxL基因和LpxM基因；

和/或

所述外膜脂多糖合成和修饰相关基因为如下基因中至少一种：MsbA基因、WzX基因、WzY基因、WaaL基因、WaaF基因和WaaC基因；

和/或

所述外膜脂多糖转运相关基因为如下基因中至少一种：LptA基因、LptB基因、LptC基因、LptD基因、LptE基因、LptF基因和LptG基因。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，利用所述外膜缺陷型菌株制备所述感受态细胞是在室温或低温下进行的；

和/或

步骤(2)中，利用所述外膜缺陷型菌株制备所述感受态细胞是按照包括如下步骤的方法进行的：将所述外膜缺陷型菌株用缓冲溶液处理后获得所述感受态细胞；

所述缓冲溶液的溶剂为水，溶质为如下(b1)或(b2)或(b3)：

(b1)蔗糖和甘油；

(b2)甘油；

(b3)蔗糖。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：在(b1)所示的所述缓冲溶液中，所述蔗糖的含量为200-600mM；所述甘油的体积百分含量为5-20％；

在(b2)所示的所述缓冲溶液中，所述甘油的体积百分含量为5％-20％；

在(b3)所示的所述缓冲溶液中，所述蔗糖的含量为200-600mM。

7.一种制备革兰氏阴性细菌的外膜缺陷型菌株的方法，包括权利要求2-4任一中所述的步骤(1)。

8.下述任一生物材料：

(c1)利用权利要求1-6中任一所述的方法制备得到的革兰氏阴性细菌的感受态细胞；

(c2)利用权利要求7所述方法制备得到的革兰氏阴性细菌的外膜缺陷型菌株。

9.下述任一应用：

(d1)权利要求8的(c1)中所述的感受态细胞在以电转或化学转化方式被导入DNA分子中的应用；

(d2)权利要求8的(c2)中所述的外膜缺陷型菌株在制备革兰氏阴性细菌的感受态细胞中的应用。

10.根据权利要求1-9中任一所述的方法或生物材料或应用，其特征在于：所述革兰氏阴性细菌为嗜盐菌、假单胞菌或大肠杆菌；

进一步地，所述革兰氏阴性细菌为嗜盐单胞菌或嗜虫假单胞菌。