CN116640714A - 一种构建高效分泌表达克拉酸重组大肠杆菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种构建高效分泌表达克拉酸重组大肠杆菌的方法，属于基因工程和发酵工程技术领域。本发明提供了一种大肠杆菌基因工程菌，所述基因工程菌为，敲除了大肠杆菌MG1655基因组上的脂多糖核心多糖合成基因簇waa(L‑Q)，并敲除了基因组上的Lon蛋白编码基因lon，并敲除了基因组上的HNS调节蛋白编码基因hns；同时敲除了基因组上的心磷脂的编码基因clsA，clsB和clsC中的一个或多个。采用本发明的方法制备得到的克拉酸的最大产量为22.45g·L‑1，为出发菌株MG1655的187倍。在1.5L发酵罐中扩大化培养后，最大产量为44.86g·L‑1。
Description
技术领域
本发明涉及一种构建高效分泌表达克拉酸重组大肠杆菌的方法，属于基因工程和发酵工程技术领域。
背景技术
胞外多糖是通过微生物的代谢途径在相关细胞表面产生的一种多糖聚合物。克拉酸(CA)是一种由肠道细菌分泌的带负电荷的胞外多糖。据了解，在大肠杆菌K12中，CA合成的激活是由环境或内部条件的改变触发的，包括膜壁的组成和结构的改变。CA在细菌抵抗外界环境压力(氧化应激、低温、低pH值或渗透性休克)方面发挥了关键作用。此外，纯化的CA聚合物引起哺乳动物线粒体的改变并同时延长寿命，而且这些特征在物种间是保守的。这也使得CA在食品和医药行业受到越来越多的关注。此外，CA具有高分子量和表面多亲水基团，这有助于其良好的保水性和在化妆品中的广泛应用。同时，多糖的抗氧化性能扩大了CA的应用范围和研究潜力。
CA在多个应用领域有着广阔的前景，提高CA产率和揭示CA性质无疑将促进CA更广泛研究和应用。目前关于微生物发酵法生产克拉酸的报导相对较少，已发表的微生物发酵法生产克拉酸的相关研究主要集中于解除Rcs系统对cps基因簇的负调控以及维持低pH条件等。
通常情况下，大肠杆菌细胞膜变化会激活RCS系统的信号传递。大肠杆菌由细胞内膜和细胞外膜两层细胞膜组成。细胞内膜包裹着细胞质，主要由磷脂组成；细胞外膜由外叶的脂多糖(LPS)分子和内叶的磷脂组成，将细胞与周围环境隔离。大肠杆菌K-12的LPS是由一个疏水的脂质A域和一个非重复性的核心寡糖组成，是细胞外膜的组成部分。目前关于细胞膜膜壁结构改造提高克拉酸的相关研究较少。根据我们之前报道，LPS的结构缺陷促进了CA的合成。此外暂无针对关于细胞内膜中磷脂的改造。克拉酸的应用前景广阔，因此通过膜壁结构改造构建高效生产克拉酸的大肠杆菌对于后续克拉酸的大规模工业化生产尤为必要。
发明内容
本发明提供了一种大肠杆菌基因工程菌，所述基因工程菌为，敲除了大肠杆菌Escherichia coli str K-12MG1655基因组上的脂多糖核心多糖合成基因簇waaL，waaU，waaZ，waaY，waaR，waaO，waaB，waaP，waaG，waaQ，并敲除了基因组上的Lon蛋白编码基因lon，并敲除了基因组上的HNS调节蛋白编码基因hns；同时敲除了基因组上的心磷脂的编码基因clsA，clsB和clsC中的一个或多个。
在本发明的一种实施方式中，所述脂多糖核心多糖合成基因簇waaL，waaU，waaZ，waaY，waaR，waaO，waaB，waaP，waaG，waaQ的NCBI登录号依次为948148，948147，948146，948145，948142，948143，948144，948150，948149，948155；所述lon的NCBI登录号为945085；所述hns的NCBI登录号为945829；所述clsA,clsB以及clsC的NCBI登录号依次为945821，945409和66521438。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，敲除了大肠杆菌Escherichiacoli str K-12MG1655基因组上的脂多糖核心多糖合成基因簇waaL，waaU，waaZ，waaY，waaR，waaO，waaB，waaP，waaG，waaQ，并敲除了基因组上的Lon蛋白编码基因lon，并敲除了基因组上的HNS调节蛋白编码基因hns；同时敲除了基因组上的心磷脂的编码基因clsA，命名为WWM11。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，敲除了大肠杆菌Escherichiacoli str K-12MG1655基因组上的脂多糖核心多糖合成基因簇waaL，waaU，waaZ，waaY，waaR，waaO，waaB，waaP，waaG，waaQ，并敲除了基因组上的Lon蛋白编码基因lon，并敲除了基因组上的HNS调节蛋白编码基因hns；同时敲除了基因组上的心磷脂的编码基因clsB，命名为WWM12。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，敲除了大肠杆菌Escherichiacoli str K-12MG1655基因组上的脂多糖核心多糖合成基因簇waaL，waaU，waaZ，waaY，waaR，waaO，waaB，waaP，waaG，waaQ，并敲除了基因组上的Lon蛋白编码基因lon，并敲除了基因组上的HNS调节蛋白编码基因hns；同时敲除了基因组上的心磷脂的编码基因clsC，命名为WWM13。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，敲除了大肠杆菌Escherichiacoli str K-12MG1655基因组上的脂多糖核心多糖合成基因簇waaL，waaU，waaZ，waaY，waaR，waaO，waaB，waaP，waaG，waaQ，并敲除了基因组上的Lon蛋白编码基因lon，并敲除了基因组上的HNS调节蛋白编码基因hns；同时敲除了基因组上的心磷脂的编码基因clsA和clsB，命名为WWM14。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，敲除了大肠杆菌Escherichiacoli str K-12MG1655基因组上的脂多糖核心多糖合成基因簇waaL，waaU，waaZ，waaY，waaR，waaO，waaB，waaP，waaG，waaQ，并敲除了基因组上的Lon蛋白编码基因lon，并敲除了基因组上的HNS调节蛋白编码基因hns；同时敲除了基因组上的心磷脂的编码基因clsA和clsC，命名为WWM15。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，敲除了大肠杆菌Escherichiacoli str K-12MG1655基因组上的脂多糖核心多糖合成基因簇waaL，waaU，waaZ，waaY，waaR，waaO，waaB，waaP，waaG，waaQ，并敲除了基因组上的Lon蛋白编码基因lon，并敲除了基因组上的HNS调节蛋白编码基因hns；同时敲除了基因组上的心磷脂的编码基因clsB和clsC，命名为WWM16。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，敲除了大肠杆菌Escherichiacoli str K-12MG1655基因组上的脂多糖核心多糖合成基因簇waaL，waaU，waaZ，waaY，waaR，waaO，waaB，waaP，waaG，waaQ，并敲除了基因组上的Lon蛋白编码基因lon，并敲除了基因组上的HNS调节蛋白编码基因hns；同时敲除了基因组上的心磷脂的编码基因clsA，clsB和clsC，命名为WWM17。
本发明还提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是上述大肠杆菌基因工程菌WWM11、WWM12、WWM13、WWM14、WWM15、WWM16、WWM17为表达宿主，过表达了外膜脂蛋白rcsF基因、转录调控蛋白rcsA基因或磷酸转运蛋白rcsD1-466基因。
在本发明的一种实施方式中，编码所述rcsF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述rcsA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述rcsD1-466基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌采用pTargetF为表达载体，表达了外膜脂蛋白rcsF基因，得到重组载体pTargetF-rcsF。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以pRSFDuet-1为表达载体，表达了转录调控蛋白rcsA基因，得到重组载体pRSFDuet-1-rcsA。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以pBad33为表达载体，表达了磷酸转运蛋白rcsD1-466基因，得到重组载体pBad33-rcsD1-466。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以pBad33为表达载体，表达了磷酸转运蛋白rcsD1-466基因和转录调控蛋白rcsA基因，得到重组载体pBad33-rcsD1-466-rcsA。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌为，以pRSFDuet-1-rcsA为重组载体，以WWM16为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌为，以pTargetF-rcsF为重组载体，以WWM16为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌为，以pBad33-rcsD1-466为重组载体，以WWM16为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌为，以pBad33-rcsD1-466-rcsA为重组载体，以WWM16为表达宿主。
本发明还提供了一种提高大肠杆菌中克拉酸产量的方法，所述方法为，敲除了大肠杆菌Escherichia coli str K-12MG1655基因组上的脂多糖核心多糖合成基因簇waaL，waaU，waaZ，waaY，waaR，waaO，waaB，waaP，waaG，waaQ，并敲除了基因组上的Lon蛋白编码基因lon，并敲除了基因组上的HNS调节蛋白编码基因hns；同时敲除了基因组上的心磷脂的编码基因clsA，clsB和clsC中的一个或多个。
在本发明的一种实施方式中，所述脂多糖核心多糖合成基因簇waaL，waaU，waaZ，waaY，waaR，waaO，waaB，waaP，waaG，waaQ的NCBI登录号依次为948148，948147，948146，948145，948142，948143，948144，948150，948149，948155；所述lon的NCBI登录号为945085；所述hns的NCBI登录号为945829；所述clsA,clsB以及clsC的NCBI登录号依次为945821，945409和66521438。
本发明还提供了一种提高大肠杆菌中克拉酸产量的方法，所述方法为，所述方法为，敲除了大肠杆菌Escherichia coli str K-12MG1655基因组上的脂多糖核心多糖合成基因簇waaL，waaU，waaZ，waaY，waaR，waaO，waaB，waaP，waaG，waaQ，并敲除了基因组上的Lon蛋白编码基因lon，并敲除了基因组上的HNS调节蛋白编码基因hns；同时敲除了基因组上的心磷脂的编码基因clsA，clsB和clsC中的一个或多个；并过表达了外膜脂蛋白rcsF基因、转录调控蛋白rcsA基因或磷酸转运蛋白rcsD1-466基因。
在本发明的一种实施方式中，所述脂多糖核心多糖合成基因簇waaL，waaU，waaZ，waaY，waaR，waaO，waaB，waaP，waaG，waaQ的NCBI登录号依次为948148，948147，948146，948145，948142，948143，948144，948150，948149，948155；所述lon的NCBI登录号为945085；所述hns的NCBI登录号为945829；所述clsA,clsB以及clsC的NCBI登录号依次为945821，945409和66521438。编码所述rcsF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述rcsA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述rcsD1-466基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种制备克拉酸的方法，所述方法为，采用上述大肠杆菌基因工程菌大肠杆菌基因工程菌WWM11、WWM12、WWM13、WWM14、WWM15、WWM16、WWM17，利用葡萄糖发酵生产克拉酸。
本发明还提供了一种制备克拉酸的方法，所述方法为，以上述重组大肠杆菌，利用葡萄糖发酵生产克拉酸。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌为，以pRSFDuet-1-rcsA为重组载体，以WWM16为表达宿主；
或所述重组大肠杆菌为，以pTargetF-rcsF为重组载体，以WWM16为表达宿主；
或所述重组大肠杆菌为，以pBad33-rcsD1-466为重组载体，以WWM16为表达宿主；
或所述重组大肠杆菌为，以pBad33-rcsD1-466-rcsA为重组载体，以WWM16为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌的二级种子接种至发酵培养基中，进行发酵制备得到克拉酸；其中，所述发酵培养基包含：15～30g·L-1葡萄糖，35～45g·L-1Na2HPO4·12H2O，1～8g·L-1NH4Cl，2～4g·L-1KH2PO4，2～4g·L-1NaCl，0.01～0.05g·L- 1CaCl2和0.1～0.5g·L-1MgSO4。
在本发明的一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌的种子液在发酵培养基中的接种量为0.5％-5％。
在本发明的一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌的种子液接种至发酵培养基中，发酵条件为：25～37℃，150～250rpm。
本发明还提供了一种采用上述方法制备得到的克拉酸。
本发明还提供了采用上述大肠杆菌基因工程菌或上述重组大肠杆菌制备含有克拉酸的产品中的应用。
有益效果
(1)本发明为了优化膜壁结构组成，提高克拉酸产量，本发明首先通过单独，组合或全部删除心磷脂合成途径相关基因，构建得到一组高效生产克拉酸的大肠杆菌重组菌株。另外在此基础上精简LPS结构，删除RCS系统相关负调控基因，进一步得到一组高效生产克拉酸的大肠杆菌重组菌株。最后通过过表达RCS系统相关基因进一步激活RCS系统，进一步提高克拉酸产量。
(2)采用本发明的方法制备得到的克拉酸的最大产量为22.45g·L-1，为出发菌株MG1655的187倍。在1.5L发酵罐中扩大化培养后，最大产量为44.86g·L-1。
附图说明
图1为大肠杆菌中构建的高产克拉酸生产菌株基因基因突变图谱。
图2大肠杆菌菌株MG1655、WWM01、WWM02、WWM03、WWM04、WWM05、WWM06和WWM07细胞生长、葡萄糖消耗和克拉酸产量的比较；其中A细胞生长；B葡萄糖消耗量；C克拉酸的产量。
图3为发酵条件下联合突变心磷脂合成相关基因，LP个S合成相关基因，RCS系统抑制基因相关基因的克拉酸生产菌株WQM003、WWM11、WWM12、WWM13、WWM14、WWM15、WWM16和WWM17细胞生长、葡萄糖消耗和CA生成的比较；其中A细胞生长；B葡萄糖消耗量；C克拉酸的产量。
图4为质粒图谱以及大肠杆菌WWM16、WWM16D、WWM16/pWA、WWM16/pWBy、WWM16/pWFy、WWM16/pWDT、WWM16/pWADT和WWM16/pWA+pWBy的细胞生长、葡萄糖消耗和CA产生的比较；其中A本专利中使用的表达质粒图谱；B细胞生长；C葡萄糖消耗量；D克拉酸的产量；
图5为大肠杆菌WWM16/pWADT和WWM16/pWDT补料分批发酵生产克拉酸；其中A细胞生长；B葡萄糖消耗量；C pH值；D克拉酸的产量。
图6为大肠杆菌WWM16/pWADT补料分批发酵过程中有机酸产生量变化。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的WQM003记载于公开号为CN113755515A的中国发明专利申请文本中。
下述实施例中所涉及的菌株、培养和发酵条件如下：
用于构建载体和突变体的大肠杆菌细胞在LB培养基中培养。加入18g/L琼脂糖的LB和M9培养基用于鉴定CA的合成。
CA发酵培养基组成为：葡萄糖21.47g/L、NH4Cl 1g/L、Na2HPO4·12H2O 40.2g/L、KH2PO43g/L、NaCl 3g/L、CaCl2 0.014g/L、MgSO4 0.24g/L。卡那霉素、壮观霉素、氨苄青霉素、阿拉伯糖和异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的浓度分别为50mg/L、50mg/L、100mg/L、10mM和0.5mM。
菌株活化：菌株于从保种的甘油管中取出适量菌液，划线至相应的抗性平板或无抗平板以活化菌株，待平板上长出单菌落，挑菌进行菌落PCR以验证其基因型以及质粒。
一级种子制备：从平板挑菌接种至5mL LB培养基，37℃，200rpm过夜培养。
二级种子制备：将二级种子以初始OD600＝0.02接种至25mL LB培养基中，培养10h。
摇瓶发酵：将二级种子以2％的接种量接种至含有50mL发酵培养基的250mL摇瓶中，30℃培养72h。
下述实施例中所涉及的菌株如表1所示。
表1：本发明所涉及的菌株
下述实施例中所涉及的引物序列如表2所示。
表2：本发明所涉及的引物
下述实施例中所涉及的菌株和载体如表3所示。
表3：本发明中使用的细菌菌株和载体
下述实施例中所涉及的克拉酸的制备及检测方法如下：
制备克拉酸粗样：
1.取500μL发酵液。
2.将发酵液置于沸水浴中加热，持续20分钟。
3.待液体冷却至室温后，以13500×rpm的速度离心1小时，获得发酵上清液。
4.将上清液与预先冷却的无水乙醇按1:10的体积比例混合。
5.在4℃条件下，将混合液放置过夜进行醇沉。
6.使用12000×rpm的速度离心5分钟，弃去上清液(乙醇)。
7.将样品放置于烘箱中干燥4小时，或者在通风橱中过夜以蒸发乙醇，得到干燥的克拉酸粗样。
8.将克拉酸粗样溶解于适量的蒸馏水中，得到克拉酸的水溶液。
克拉酸的检测(Dische比色法)：
该方法用于定量测定克拉酸产量，通过检测克拉酸(CA)重复单元中关键成分L-岩藻糖的含量来进行。
1.取100μL克拉酸水溶液，并加入450μL 87％ H2SO4混匀。
2.将混合物放入沸水浴中加热，持续15分钟。
3.待混合物冷却至室温后，取150μL反应混合物加入96孔板中。
4.在396nm和430nm处测量克拉酸水解样品的吸光度，并计算A396-A430的值作为A1。
5.向150μL水解样品中加入5.45μL 6％半胱氨酸盐酸盐溶液，并混匀吹吸。
6.将混合液于37℃、200rpm下孵育40分钟后，再次测量样品在396nm和430nm处的吸光度，计算A2。
7.根据岩藻糖标准曲线，利用A2-A1确定克拉酸水解样品中岩藻糖的浓度，并进一步推算克拉酸的浓度。
实施例1：高产克拉酸的基因工程菌的构建
本研究使用的菌株列于表1，所用引物列于表2，菌株的构建如图1所示。
具体实施方式如下：
1、WWM01(MG1655基因组中缺失clsA)的构建：
使用CRISPR-Cas9系统修饰大肠杆菌菌株的基因组。
(1)对于MG1655中clsA的缺失，使用TF-clsA-F/TF-clsA-R引物对扩增原pTargetF，得到线性pTargetF-clsA，用于MG1655中clsA的缺失。环状pTargetF-clsA是通过在大肠杆菌JM109中环化线性pTargetF-clsA而得到的。
(2)从大肠杆菌MG1655基因组DNA中分别用U-clsA-F/U-clsA-R和D-clsA-F/D-clsA-R引物扩增出clsA基因的上游和下游片段。通过使用重叠PCR和U-clsA-F和D-clsA-R引物将这些片段融合在一起，开发出用于clsA缺失的供体DNA片段。
(3)最后，将融合的DNA片段和pTargetF-clsA质粒通过电穿孔(2000V,200Ω，25μF,5ms脉冲持续时间)共转移到大肠杆菌MG1655/pCas9感受态细胞中。利用DNA测序和菌落PCR对重组菌株进行鉴定。将温度敏感质粒pTargetF-clsA和pCas加入0.5mM异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)，在42℃下振荡培养。
最终制备得到E.coli/MG1655ΔclsA，命名为WWM01。
2、WWM02(MG1655基因组中缺失clsB)的构建：
具体构建方法同WWM01，区别在于敲除clsB基因，其中，所涉及的引物序列表述如下：pTargetF-clsB片段使用引物TF-clsB-F/TF-clsB-R扩增。上游片段用U-clsB-F/U-clsB-R引物扩增，下游片段用D-clsB-F/D-clsB-R引物扩增。用U-clsB-F/D-clsB-R引物获得clsB缺失的片段DNA。分别用引物clsB test-F/clsB test-R测序鉴定菌株，最终制备得到E.coli/MG1655ΔclsB，命名为WWM02。
3、WWM03(MG1655基因组中缺失clsC)的构建：
具体构建方法同WWM01，区别在于敲除clsC基因，其中，所涉及的引物序列表述如下：
使用引物TF-clsC-F/TF-clsC-R扩增pTargetF-clsC片段。上游片段用U-clsC-F/U-clsC-R引物扩增，下游片段用D-clsC-F/D-clsC-R引物扩增。用U-clsC-F/D-clsC-R引物获得clsC缺失的片段DNA。用引物clsC test-F/clsC test-R测序鉴定菌株，最终制备得到E.coli/MG1655ΔclsC，命名为WWM03。
4、WWM04(MG1655基因组中缺失clsA和clsB)的构建：
具体构建方法同WWM01和WWM02，敲除MG1655基因组的clsA和clsB基因，所涉及的引物与WWM01和WWM02所用相同，最终制备得到E.coli/MG1655ΔclsAΔclsB，命名为WWM04。
5、WWM05(MG1655基因组中缺失clsA和clsC)的构建：
具体构建方法同WWM01和WWM03，敲除MG1655基因组的clsA和clsC基因，所涉及的与WWM01和WWM03所用相同，最终制备得到E.coli/MG1655ΔclsAΔclsC，命名为WWM05。
6、WWM06(MG1655基因组中缺失clsB和clsC)的构建：
具体构建方法同WWM02和WWM03，敲除MG1655基因组的clsB和clsC基因，所涉及的引物与WWM02和WWM03所用相同，最终制备得到E.coli/MG1655ΔclsBΔclsC，命名为WWM06。
7、WWM07(MG1655基因组中缺失clsA，clsB和clsC)的构建：
具体构建方法同WWM01，WWM02和WWM03，敲除MG1655基因组的clsA,clsB和clsC基因，所涉及的引物与WWM01，WWM02和WWM03所用相同，最终制备得到E.coli.MG1655ΔclsAΔclsBΔclsC，命名为WWM07。
实施例2：高产克拉酸的基因工程菌的构建
本研究使用的菌株列于表1。
具体实施方式如下：
WQM003菌株记载于公开号为CN113755515A的中国发明专利申请文本中，菌株的基因型如下：MG1655Δwaa(L-Q)ΔlonΔhns。
1、WWM11(WQM003基因组中缺失clsA)的构建
(1)使用CRISPR-Cas9系统修饰大肠杆菌菌株的基因组对于WQM003中clsA的缺失，使用TF-clsA-F/TF-clsA-R引物对扩增原pTargetF，得到线性pTargetF-clsA，用于WQM003中clsA的缺失。环状pTargetF-clsA是通过在大肠杆菌JM109中环化线性pTargetF-clsA而得到的。
(2)从大肠杆菌WQM03基因组DNA中分别用U-clsA-F/U-clsA-R和D-clsA-F/D-clsA-R引物扩增出clsA基因的上游和下游片段。通过使用重叠PCR和U-clsA-F和D-clsA-R引物将这些片段融合在一起，开发出用于clsA缺失的供体DNA片段。
(3)最后，将融合的DNA片段和pTargetF-clsA质粒通过电穿孔(2000V,200Ω，25μF,5ms脉冲持续时间)共转移到大肠杆菌WQM03/pCas9感受态细胞中。利用DNA测序和菌落PCR对重组菌株进行鉴定。将温度敏感质粒pTargetF-clsA和pCas加入0.5mM异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)，在42℃下振荡培养。
制备得到MG1655Δwaa(L-Q)ΔlonΔhnsΔclsA，命名为WWM11；
2、WWM12(WQM003基因组中缺失clsB)的构建：
具体方法同WWM02，区别在于，调整出发菌株为WQM003，制备得到MG1655Δwaa(L-Q)ΔlonΔhnsΔclsB，命名为WWM12。
4、WWM13(WQM003基因组中缺失clsC)的构建：
具体方法同WWM03，区别在于，调整出发菌株为WQM003，制备得到MG1655Δwaa(L-Q)ΔlonΔhnsΔclsC，命名为WWM13。
5、WWM14(WQM003基因组中缺失clsA和clsB)的构建：
具体方法同WWM04，区别在于，调整出发菌株为WQM003，制备得到MG1655Δwaa(L-Q)ΔlonΔhnsΔclsAΔclsB，命名为WWM14。
6、WWM15(WQM003基因组中缺失clsA和clsC)的构建：
具体方法同WWM05，区别在于，调整出发菌株为WQM003，制备得到MG1655Δwaa(L-Q)ΔlonΔhnsΔclsAΔclsC，命名为WWM15。
7、WWM16(WQM003基因组中缺失clsB和clsC)的构建：
具体方法同WWM06，区别在于，调整出发菌株为WQM003，制备得到MG1655Δwaa(L-Q)ΔlonΔhnsΔclsBΔclsC，命名为WWM16。
8、WWM16D(WWM16ΔrcsD(48-304))的构建：
(1)以WWM16为出发菌株，使用引物TF-rcsD(48-304)-R/TF-rcsD(48-304)-F扩增环化线性pTargetF-rcsD(48-304)片段。
(2)从大肠杆菌MG1655基因组DNA中分别用U-rcsD(48-304)-F/U-rcsD(48-304)-R引物扩增上游片段，用D-rcsD(48-304)-R/D-rcsD(48-304)-F引物扩增下游片段。通过使用重叠PCR和U-rcsD(48-304)-F/D-rcsD(48-304)-R引物将这些片段融合在一起，获得rcsD(48-304)缺失的片段DNA。
(3)最后，将融合的DNA片段和pTargetF-clsA质粒通过电穿孔(2000V,200Ω，25μF,5ms脉冲持续时间)共转移到大肠杆菌MG1655/pCas9感受态细胞中。利用DNA测序和菌落PCR对重组菌株进行鉴定。将温度敏感质粒pTargetF-rcsD(48-304)和pCas加入0.5mM异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)，在42℃下振荡培养。
用引物U-rcsD(48-304)-F/D-rcsD(48-304)-R测序鉴定菌株，制备得到MG1655Δwaa(L-Q)ΔlonΔhnsΔclsBΔclsCΔrcsD(48-304)，命名为WWM16D。
9、WWM17(WQM003基因组中缺失clsA，clsB和clsC)的构建：
具体方法同WWM07，区别在于，调整出发菌株为WQM003，制备得到MG1655Δwaa(L-Q)ΔlonΔhnsΔclsAΔclsBΔclsC，命名为WWM17。
实施例3：克拉酸的制备
分别将实施例1和实施例2制备得到的菌株于从保种的甘油管中取出适量菌液，划线至相应的抗性平板(含有表达质粒的生产菌株)或无抗平板(不含有表达质粒的生产菌株)以活化菌株，待平板上长出单菌落，挑菌进行菌落PCR以验证其基因型以及质粒。
具体步骤如下：
(1)分别将实施例1和实施例2制备得到的菌株从平板挑菌，接种至5mL LB培养基，37℃，200rpm培养10h，制备得到种子液；
(2)将步骤(1)制备得到的种子液以初始OD600＝0.02接种至25mL LB培养基中，37℃，200rpm培养10h；分别制备得到二级种子液；
(3)分别将上述二级种子液以2％的接种量接种至含有50mLCA发酵培养基的250mL摇瓶中，30℃培养72h；分别制备得到发酵液。
(4)反应结果(图2～3所示)：
1)发酵72h后，WWM01、WWM02和WWM03的克拉酸CA产量分别为0.18g/L、0.19g/L和0.18g/L；
WWM04、WWM05、WWM06和WWM07分别产生0.39g/L、0.41g/L、0.46g/L和0.47g/L CA。与MG1655(克拉酸CA产量为：0.18g/L)相比，WWM06和WWM07的克拉酸产量增加了2.48倍。
2)与对照WQM003(克拉酸产量为13.72g/L)相比，7个cls突变体的克拉酸产量均有所增加。WQM003的克拉酸产量为13.72g/L，而WWM11、WWM12、WWM13、WWM14、WWM15、WWM16和WWM17的克拉酸产量分别达到17.06g/L、16.70g/L、16.42g/L、17.37g/L、17.44g/L、19.61g/L和18.13g/L。WWM16D的克拉酸产量为：8.96g/L。
其中WWM16和WWM17的克拉酸产量增加了1.42和1.32倍，是野生型MG1655的126.12和117.24倍。
可见，WWM16的克拉酸产量最高，后续以WWM16为基础进行研究。
实施例4：高产克拉酸的基因工程菌的构建
1、表达载体的构建
利用大肠杆菌JM109(DE3)菌株和标准分子生物学方法构建质粒(表3)。
(1)利用pFT-vector-F/pFT-vector-R引物从pFT24中扩增基因片段作为载体；从pTargetF中扩增出复制子pMB1，记为基因片段1；利用引物对rcsB-os-F/rcsB-os-R和rcsF-os-F/rcsF-os-R分别从大肠杆菌基因组DNA中扩增出rcsB和rcsF基因片段(NCBI上的编号分别为：947441和949113)，记为基因片段2.1和2.2；将载体、片段1，分别和片段2.1与2.2连接；分别构建得到重组质粒pWBy(pTargetF-rcsB)和pWFy(pTargetF-rcsF)。
(2)利用引物对pRSF-vector-F/pRSF-vector-R对pRSFDuet-1质粒进行线性化，利用rcsA-os-F/rcsA-os-R引物扩增rcsA基因(NCBI上的编号为：946467)，并将这两个DNA片段连接，构建得到重组质粒，命名为pWA质粒(pRSFDuet-1-rcsA)。
(3)利用引物kan-os-F/kan-os-R以pRSFDuet-1质粒为模板扩增基因片段，利用引物pBad-vector-F/pBad-vector-R对pBad33质粒进行线性化得到基因片段。将两片段连接，构建得到重组质粒质粒pW(pBad33-kan)。
(4)利用引物pBAD-DA vector-F/pBAD-DA vector-R对pW质粒进行线性化，得到基因片段。利用rcsD-osB-F,rcsD-osB-R引物扩增rcsD基因(NCBI上的编号为：946717)的前466个碱基片段，并将这两个DNA片段连接，构建得到重组质粒，命名为pWDT质粒(pBad33-kan-rcsD1-466)。
(5)构建质粒pWADT的方法是：
利用引物rcsA-os-F/rcsA-os-R从大肠杆菌MG1655基因组中扩增rcsA基因片段，并将片段插入质粒pWDT中，得到pWADT(pBad33-kan-rcsD1-466-rcsA)。
使用ClonExpress II一步克隆试剂盒(Vazyme，南京，中国)构建所有质粒。本研究使用的所有引物列于表2。
2、基因工程菌的构建
分别将上述构建得到的pWA、pWADT、pWDT、pWBy和pWFy质粒转入到菌株WWM16中，分别制备得到基因工程菌WWM16/pWADT、WWM16/pWDT、WWM16/pWA、WWM16/pWBy、WWM16/pWFy。
将pWA、pWBy同时转入到菌株WWM16中，制备得到基因工程菌WWM16/pWA+pWBy。
3、发酵制备克拉酸
(1)分别将步骤2制备得到的菌株从平板挑菌，接种至5mL LB培养基，37℃，200rpm培养10h，制备得到种子液；
(2)将步骤(1)制备得到的种子液以初始OD600＝0.02接种至25mL LB培养基中，在37℃，200rpm条件下培养10h；分别制备得到二级种子液；
(3)分别将上述二级种子液以2％(v/v)的接种量接种至含有50mL CA发酵培养基的250mL摇瓶中，30℃培养72h；每12h取样一次，分别制备得到不同时间点的发酵液。
分别检测步骤(3)的OD600值，同时检测得到的基因工程菌的CA的产量，结果如下图4、表4所示。
表4：不同基因工程菌的CA的产量和OD600值
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结果显示，WWM16/pWADT和WWM16/pWDT菌株发酵制备得到的CA的产量最高，在摇瓶阶段，产量分别为：22.4g/L、22.2g/L。
实施例5：发酵罐水平制备克拉酸
为了研究最终的重组菌株在发酵生产克拉酸方面的性能，我们进行了发酵罐规模的放大实验。
具体步骤如下：
(1)分别将WWM16/pWADT和WWM16/pWDT菌株从平板挑菌，接种至5mL LB培养基，37℃，200rpm培养10h，制备得到种子液；
(2)将步骤(1)制备得到的种子液以初始OD600＝0.02接种至25mL LB培养基中，在37℃，200rpm条件下培养10h；分别制备得到二级种子液；
(3)在一个容量为2.0L的发酵罐中，装入1.2L的克拉酸CA发酵培养基，分别将上述二级种子液以2％(v/v)的接种量接种至发酵罐中，30℃培养72h；每6h取样一次，分别制备得到不同时间点的发酵液。
通过联合控制溶氧和搅拌，确保发酵液中的溶氧不低于30％。同时，在发酵过程中使用1mol·L-1氢氧化钠溶液流加，以控制发酵液的pH值不低于6.0。
我们还定期取样，测定葡萄糖浓度，并适度地进行补料，通过流加800g/L葡萄糖来进行克拉酸的发酵生产。结果如图5所示。
结果显示：
1)根据图5的结果，WWM16/pWADT和WWM16/pWDT菌株在约12小时进入对数生长期后，约18小时进入平稳生长期(图5中的A)。WWM16/pWADT和WWM16/pWDT的生长曲线相似，其最大光密度(OD600)分别为4.29和4.08。
2)当菌株进入对数生长期时，它们迅速消耗葡萄糖。发酵结束时，WWM16/pWADT和WWM16/pWDT的葡萄糖残留量分别为2.0g/L和3.0g/L(图5中的B)。
在WWM16/pWADT和WWM16/pWDT发酵过程中，葡萄糖的消耗量分别为35.47g和32.47g。低pH值抑制了在克拉酸和葡萄糖代谢中积累有机酸的形成，从而限制了菌株的生长和其他代谢活动。因此，在发酵过程中对pH进行控制至关重要。发酵过程中，有机酸含量变化如图6所示。WWM16/pWADT发酵液和WWM16/pWDT发酵液的pH值持续下降，在42小时和32小时左右降至约6.0。发酵过程中，pH值一直保持在6.0以上(图5中的C)。
3)WWM16/pWADT菌株在12小时后迅速积累CA，其最高产量在96小时达到44.89g/L(图5中D)，比目前报道的最高滴度增加了2.27倍。
而WWM16/pWDT菌株的CA产量为32.76g/L，低于WWM16/pWADT。
4)WWM16/pWADT和WWM16/pWDT的克拉酸与葡萄糖转化率(克拉酸产量/葡萄糖消耗量)分别为1.267g/g和1.008g/g。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为，敲除了大肠杆菌Escherichia coli str K-12MG1655基因组上的脂多糖核心多糖合成基因簇waaL，waaU，waaZ，waaY，waaR，waaO，waaB，waaP，waaG，waaQ，并敲除了基因组上的Lon蛋白编码基因lon，并敲除了基因组上的HNS调节蛋白编码基因hns；同时敲除了基因组上的心磷脂的编码基因clsA，clsB和clsC中的一个或多个。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述脂多糖核心多糖合成基因簇waaL，waaU，waaZ，waaY，waaR，waaO，waaB，waaP，waaG，waaQ的NCBI登录号依次为948148，948147，948146，948145，948142，948143，948144，948150，948149，948155；所述lon的NCBI登录号为945085；所述hns的NCBI登录号为945829；所述clsA,clsB以及clsC的NCBI登录号依次为945821，945409和66521438。
3.根据权利要求1或2所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为，敲除了大肠杆菌Escherichia coli str K-12MG1655基因组上的脂多糖核心多糖合成基因簇waaL，waaU，waaZ，waaY，waaR，waaO，waaB，waaP，waaG，waaQ，并敲除了基因组上的Lon蛋白编码基因lon，并敲除了基因组上的HNS调节蛋白编码基因hns；同时敲除了基因组上的心磷脂的编码基因clsA，命名为WWM11；
或所述基因工程菌为，敲除了大肠杆菌Escherichia coli str K-12MG1655基因组上的脂多糖核心多糖合成基因簇waaL，waaU，waaZ，waaY，waaR，waaO，waaB，waaP，waaG，waaQ，并敲除了基因组上的Lon蛋白编码基因lon，并敲除了基因组上的HNS调节蛋白编码基因hns；同时敲除了基因组上的心磷脂的编码基因clsB，命名为WWM12；
或所述基因工程菌为，敲除了大肠杆菌Escherichia coli str K-12MG1655基因组上的脂多糖核心多糖合成基因簇waaL，waaU，waaZ，waaY，waaR，waaO，waaB，waaP，waaG，waaQ，并敲除了基因组上的Lon蛋白编码基因lon，并敲除了基因组上的HNS调节蛋白编码基因hns；同时敲除了基因组上的心磷脂的编码基因clsC，命名为WWM13；
或所述基因工程菌为，敲除了大肠杆菌Escherichia coli str K-12MG1655基因组上的脂多糖核心多糖合成基因簇waaL，waaU，waaZ，waaY，waaR，waaO，waaB，waaP，waaG，waaQ，并敲除了基因组上的Lon蛋白编码基因lon，并敲除了基因组上的HNS调节蛋白编码基因hns；同时敲除了基因组上的心磷脂的编码基因clsA和clsB，命名为WWM14；
或所述基因工程菌为，敲除了大肠杆菌Escherichia coli str K-12MG1655基因组上的脂多糖核心多糖合成基因簇waaL，waaU，waaZ，waaY，waaR，waaO，waaB，waaP，waaG，waaQ，并敲除了基因组上的Lon蛋白编码基因lon，并敲除了基因组上的HNS调节蛋白编码基因hns；同时敲除了基因组上的心磷脂的编码基因clsA和clsC，命名为WWM15；
或所述基因工程菌为，敲除了大肠杆菌Escherichia coli str K-12MG1655基因组上的脂多糖核心多糖合成基因簇waaL，waaU，waaZ，waaY，waaR，waaO，waaB，waaP，waaG，waaQ，并敲除了基因组上的Lon蛋白编码基因lon，并敲除了基因组上的HNS调节蛋白编码基因hns；同时敲除了基因组上的心磷脂的编码基因clsB和clsC，命名为WWM16；
或所述基因工程菌为，敲除了大肠杆菌Escherichia coli str K-12MG1655基因组上的脂多糖核心多糖合成基因簇waaL，waaU，waaZ，waaY，waaR，waaO，waaB，waaP，waaG，waaQ，并敲除了基因组上的Lon蛋白编码基因lon，并敲除了基因组上的HNS调节蛋白编码基因hns；同时敲除了基因组上的心磷脂的编码基因clsA，clsB和clsC，命名为WWM17。
4.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌是以权利要求1或2所述的大肠杆菌基因工程菌为表达宿主，过表达了外膜脂蛋白rcsF基因、转录调控蛋白rcsA基因或磷酸转运蛋白rcsD1-466基因。
5.根据权利要求4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，编码所述rcsF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述rcsA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述rcsD1-466基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
6.根据权利要求4或5所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌采用pTargetF为表达载体，表达了外膜脂蛋白rcsF基因，得到重组载体pTargetF-rcsF；或以pRSFDuet-1为表达载体，表达了转录调控蛋白rcsA基因，得到重组载体pRSFDuet-1-rcsA；或以pBad33为表达载体，表达了磷酸转运蛋白rcsD1-466基因，得到重组载体pBad33-rcsD1-466；或以pBad33为表达载体，表达了磷酸转运蛋白rcsD1-466基因和转录调控蛋白rcsA基因，得到重组载体pBad33-rcsD1-466-rcsA。
7.根据权利要求6所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌为，以pRSFDuet-1-rcsA为重组载体，以WWM16为表达宿主；
或所述重组大肠杆菌为，以pTargetF-rcsF为重组载体，以WWM16为表达宿主；
或所述重组大肠杆菌为，以pBad33-rcsD1-466为重组载体，以WWM16为表达宿主；
或所述重组大肠杆菌为，以pBad33-rcsD1-466-rcsA为重组载体，以WWM16为表达宿主。
8.一种提高大肠杆菌中克拉酸产量的方法，其特征在于，所述方法为，敲除了大肠杆菌Escherichia coli str K-12MG1655基因组上的脂多糖核心多糖合成基因簇waaL，waaU，waaZ，waaY，waaR，waaO，waaB，waaP，waaG，waaQ，并敲除了基因组上的Lon蛋白编码基因lon，并敲除了基因组上的HNS调节蛋白编码基因hns；同时敲除了基因组上的心磷脂的编码基因clsA，clsB和clsC中的一个或多个；
或所述方法为，敲除了大肠杆菌Escherichia coli str K-12MG1655基因组上的脂多糖核心多糖合成基因簇waaL，waaU，waaZ，waaY，waaR，waaO，waaB，waaP，waaG，waaQ，并敲除了基因组上的Lon蛋白编码基因lon，并敲除了基因组上的HNS调节蛋白编码基因hns；同时敲除了基因组上的心磷脂的编码基因clsA，clsB和clsC中的一个或多个；并过表达了外膜脂蛋白rcsF基因、转录调控蛋白rcsA基因或磷酸转运蛋白rcsD1-466基因。
9.一种制备克拉酸的方法，其特征在于，采用权利要求1～3任一所述的大肠杆菌基因工程菌或权利要求4～7任一所述的重组大肠杆菌，利用葡萄糖发酵生产克拉酸。
10.采用权利要求1～3任一所述的大肠杆菌基因工程菌或权利要求4～7任一所述的重组大肠杆菌制备含有克拉酸的产品中的应用。
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