CN110876725A

CN110876725A - 含egcg防龋齿口腔原位凝胶喷雾剂及其制备方法

Info

Publication number: CN110876725A
Application number: CN201911187837.0A
Authority: CN
Inventors: 祝红达; 徐肖迪; 寇先勇; 秦汤; 张子林
Original assignee: Hubei University of Technology
Current assignee: Hubei University of Technology
Priority date: 2020-01-14
Filing date: 2020-01-14
Publication date: 2020-03-13
Anticipated expiration: 2040-01-14
Also published as: CN110876725B

Abstract

本发明公开了一种含EGCG防龋齿口腔原位凝胶喷雾剂及其制备方法；它包含0.1～5wt％的EGCG、0.1～8wt％的磷脂、0.1～5wt％的表面活性剂、10～35wt％的温敏型牙齿粘附剂；余量为水。本发明一方面提高了EGGC的稳定性，另一方面增强其生物利用度。最后通过采用原位凝胶作为温敏型口腔粘附剂，适应口腔的温度环境，延长在牙齿表面粘附和作用时间，促进EGGC的有效释放，以增强该发明的抗龋齿效果。

Description

含EGCG防龋齿口腔原位凝胶喷雾剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及医疗技术领域，具体涉及一种含EGCG防龋齿口腔原位凝胶喷雾剂及其制备方法。

背景技术

龋齿是一种口腔常见的细菌性疾病，是人类广泛流行的一种慢性疾病，尤其在青少年和儿童中发病率高。目前世界卫生组织已将龋齿列为与肿瘤，高血压并列的3个重点防治疾病之一。近年的研究表明龋齿发病原因与致龋菌在口腔中的生长、产酸及在牙面的黏附和聚集以及菌斑中超氧化物阴离子自由基的浓度等有关，其中致龋菌在牙齿表面粘附聚集是龋齿发生的首要条件，阻断这一过程就能有效干预龋齿的发生。目前防龋方法主要集中在氟化物防龋、免疫疫苗防龋和天然产物防龋三个方面。氟化物是应用时间最长、最广泛的防龋方法，通过提高牙釉质对酸的抵抗能力、使脱矿的牙齿再矿化、抑制致龋齿菌生长代谢，达到防治龋齿的目的，然而长期大量的氟会导致中毒、并诱导口腔耐氟菌株的产生；免疫防龋是通过接种疫苗诱导宿主产生唾液特异性抗体影响致龋齿菌在牙齿表面的粘附、定植而达到防龋的目的，而防龋疫苗的药效性和安全性还有待进一步研究；天然产物抗龋齿效果明显、安全性好，是防龋齿研究中重点关注的对象，尤其是植物多酚类化合物(如茶多酚、不同来源的原花青素和黄酮类化合物)，其中茶多酚中含量最多且活性最强的多酚物质表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)特有的酚羟基结构使其具有更高氧化能力，能抑制乳酸脱氢酶和致龋因子(GTF)的活性，降低致龋菌产酸能力、减少致龋菌在牙齿表面的粘附聚集从而抑制致龋菌的生长。由于EGCG结构的特异性，其在人体生理环境中易发生氧化、异构化和降解等化学变化，同时超强的极性使药物分子不易穿透细胞膜导致其在体内的生物利用度降低。

因此，如何提高EGCG的稳定性及其生物利用度成为其发挥预防龋齿作用需要解决的关键问题。现有发明CN109010332A提出的一种基于微晶儿茶素的抑菌制剂，为了保持EGGC的稳定性制备出了微晶儿茶素，但作为抑菌剂分散于水中，无法长时间在口腔中停留，导致其作用时间较短；发明CN108727836A提出的一种具有缓释EGGC性能的可食生物明胶膜的制备方法，该发明具有缓释特性，但EGGC释放度即使在75h后也不超过40％，且明胶膜对于人体不同抑菌环境的适应性较差，无法在有效时间内在人体释放有效的EGGC成分来抑制细菌生长。

纳米制剂技术可通过包裹、吸附或偶联等方式改变活性成分的理化特性和生物学特性如生物黏附性、缓控释特性、靶向性等，为天然产物制剂的研制提供了契机。在天然产物开发中引入纳米制剂技术，在解决现有天然产物不稳定、顺应性差、生物利用度低等问题中具有十分重要的意义。纳米囊泡是一种新型的类脂分子层构建的超微囊泡，具有包封率高、稳定性好、药物被其包埋后能显著提高自身稳定性的特点。同时采用原位凝胶技术作为牙齿粘附剂，使纳米囊泡在口腔喷雾后原位凝胶化(35-37℃)，迅速黏附于口腔和牙齿表面，避免因唾液和吞咽动作导致的药液损失，延长活性成分在牙齿表面的作用时间。原位凝胶技术具有以下特点：

①快速的温度响应行为：溶胶-凝胶(凝胶化)转变时间通常在数秒之内，这种快速的温度响应行为，有利于药物的黏附和快速吸收；

②较强黏附作用，可促使活性成分或纳米粒较好地黏附于牙齿和牙龈表面，延长活性物质的作用时间；

③刺激性小，低含量药用辅料即可凝胶化磷脂纳米囊泡，对黏膜的刺激性小，有利于制剂长期使用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种含EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)防龋齿口腔原位凝胶喷雾剂及其制备方法，该口腔喷雾剂利用纳米囊泡优良的载体性能和原位凝胶技术解决EGCG稳定性问题、改善EGCG的极性，延长活性成分在牙齿表面吸附时间，进而增强EGCG的防龋齿疗效。

为实现上述目的，本发明所设计一种含EGCG防龋齿口腔原位凝胶喷雾剂，它包含以下组分：

1)0.1～5wt％的EGCG；

2)0.1～8％wt％的磷脂；

3)0.1～5wt％的表面活性剂；

4)10～35wt％的温敏型牙齿粘附剂；

5)余量为水。

进一步地，含EGCG防龋齿口腔原位凝胶喷雾剂包含以下组分：

1)0.1～3wt％的EGCG；

2)0.2～3wt％的卵磷脂；

3)0.1～3wt％的表面活性剂；

4)15～30wt％的温敏型牙齿粘附剂；

5)余量为水。

再进一步地，所述卵磷脂为大豆卵磷脂或者蛋黄卵磷脂。

再进一步地，所述表面活性剂为聚乙二醇硬脂酸酯，吐温和蔗糖脂肪酸脂中的任意一种。

再进一步地，所述温敏型牙齿粘附剂为泊洛沙姆，木葡聚糖，羟丙甲基纤维素，甲基纤维素中的任意一种或几种。

再进一步地，所述水为纯水。

再进一步地，含EGCG防龋齿口腔原位凝胶喷雾剂包含以下组分：

1)1wt％的EGCG；

2)3wt％的蛋黄卵磷脂；

3)2wt％的吐温-80；

4)28wt％的温敏型牙齿粘附剂；

5)66wt％的纯水。

本发明还提供了一种上述含EGCG防龋齿口腔原位凝胶喷雾剂的制备方法，包括以下步骤：

1)按上述重量百分比称取EGCG、卵磷脂、表面活性剂和温敏型牙齿粘附剂；

2)将卵磷脂与EGGC依次溶于无水乙醇中，并在温度为25～50℃条件下冷凝回流2～5h，即得到EGCG磷脂复合物作为有机相；

3)将称取的表面活性剂溶于水中配制成1～5wt％水溶液作为水相，将步骤2)中有机相缓慢滴注到该水相中形成混合溶液；

4)将步骤3)的混合溶液在功率为800～1600W超声波下，超声30～80次，进行匀质化处理，即得到EGCG纳米囊泡；

5)在室温条件下将温敏型牙齿粘附剂溶于水中，得到温敏型牙齿粘附剂溶液；将步骤4)中所得纳米囊泡加入到温敏型牙齿粘附剂中，冰水浴中搅拌混合0.1～1h，即得到含EGCG的防龋齿口腔原位凝胶喷雾剂。

本发明的有益效果：

本发明采用从天然产物茶叶中提取的活性成分—EGGC作为抗龋齿的主要药效成分，对人体安全性高，副作用小。同时为了避免其因多酚羟基结构而造成的稳定性差、极性大导致的体内药效低等问题，采用与磷脂形成复合物的方法，并进一步制备为磷脂纳米囊泡，一方面提高了EGGC的稳定性，另一方面增强其生物利用度。最后通过采用原位凝胶作为温敏型口腔粘附剂，适应口腔的温度环境，延长在牙齿表面粘附和作用时间，促进EGGC的有效释放，以增强该发明的抗龋齿效果。

附图说明

图1EGCG、卵磷脂、两者所形成的物理混合物以及两者所形成的磷脂复合物DSC图；

图2含EGCG口腔原位凝胶喷雾剂粒径图；

图3含EGCG口腔原位凝胶喷雾剂透射电镜图；

图4含EGCG口腔原位凝胶喷雾剂稳定性评价；

图5含EGCG口腔原位凝胶喷雾剂的溶蚀曲线；

图6含EGCG口腔原位凝胶喷雾剂体外释放曲线；

图7EGGC对变异链球菌的抑菌曲线；

图8不同制剂对变异链球菌的抑菌比较；

图9含EGGC口腔原位凝胶喷雾剂抗菌粘附图；

图中，凡以上图中显示星号，即为通过Graphpad Prism 7计算显著性差异P值所得，其中*表示为P＜0.1，**表示为P＜0.01，***表示为P＜0.001，****表示为P＜0.0001，ns为无显著性差异。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

实施例1

含EGCG防龋齿口腔原位凝胶喷雾剂的制备方法包括以下步骤：

1)取0.3g蛋黄卵磷脂在室温磁力搅拌下溶于5mL无水乙醇中，然后缓慢加入0.1gEGCG，40℃水浴，冷凝回流4h；得到EGCG磷脂复合物；

2)将0.2g吐温-80加入到4mL纯水中，形成5％的吐温-80溶液；即为水相；将步骤1)中所得EGCG磷脂复合物缓慢滴入其中，形成混合溶液；

3)将混合溶液在功率为800～1600W超声波下，超声30～80次，进行匀质化处理，即得到EGCG纳米囊泡；

4)分别称取2.4g泊洛沙姆407和0.4g泊洛沙姆188，在室温搅拌下加入到2.6mL纯水中混合均匀，4℃静置18h得到泊洛沙姆混合溶液；将上述所得EGCG纳米囊泡加入到泊洛沙姆混合溶液中，磁力搅拌20～40min，得到含EGCG口腔原位凝胶喷雾剂1。

a.上述EGCG磷脂复合物表征比较：

将上述步骤1)EGCG磷脂复合物60℃旋转蒸发，去除乙醇后，60℃真空干燥，得到干燥的EGCG磷脂复合物；将干燥的EGCG磷脂复合物、EGCG、卵磷脂、EGCG与卵磷脂的物理混合物通过差式扫描量热法测定。结果如图1所示：EGCG，卵磷脂以及两者的物理混合物有熔点峰，而EGCG磷脂复合物中EGCG的熔点峰完全消失，说明EGCG的晶型和状态发生变化，形成了无定型状态EGCG磷脂复合物。

b.EGCG口腔原位凝胶喷雾剂的表征

将上述步骤4)所得的含EGCG口腔原位凝胶喷雾剂稀释10倍，通过马尔文激光粒度仪测定；将上述步骤4)所得的含EGCG口腔原位凝胶喷雾剂用2％磷钨酸按1:1(V/V)混合染色后，滴加到铜网上，通过透射电镜观察形貌。如图2的纳米特性的表征显示：含EGCG口腔原位凝胶喷雾剂的粒径126.84nm，多分散系数(PDI)为0.128；透射电镜图(图3)显示，含EGCG口腔原位凝胶喷雾剂成均一的球状，粒径与激光粒度仪测定结果一致。

实施例2

口腔原位凝胶喷雾剂2包含以下组分：

1)0.2g的EGCG；

2)0.5g的大豆卵磷脂；

3)0.5g的聚乙二醇硬脂酸酯15；

4)5g的泊洛沙姆407；

5)13.8g的水。

具体制备步骤如下：

1)取0.5g大豆卵磷脂在室温磁力搅拌下溶于5mL无水乙醇中，然后缓慢加入0.2gEGCG，50℃水浴，冷凝回流5h；得到EGCG磷脂复合物；

2)将0.5g聚乙二醇硬脂酸酯15加入到5mL纯水中，形成10％的聚乙二醇硬脂酸酯溶液；即为水相；将步骤1)中所得EGCG磷脂复合物缓慢滴入其中，形成混合溶液；

3)将混合溶液在功率为1200W超声波下，超声60次，进行匀质化处理，即得到EGCG纳米囊泡；

4)分别称取5g泊洛沙姆407，在室温搅拌下加入到8.8mL纯水中混合均匀，4℃静置24h得到泊洛沙姆溶液；将上述所得EGCG纳米囊泡取加入到泊洛沙姆溶液中，磁力搅拌30min，得到含EGCG口腔原位凝胶喷雾剂2。

实施例3

口腔原位凝胶喷雾剂3包含以下组分：

1)0.05g的EGCG；

2)0.1g的蛋黄卵磷脂；

3)0.1g的吐温-80；

4)4g的羟丙甲基纤维素；

5)15.75g的水。

具体制备步骤如下：

1)取0.1g蛋黄卵磷脂在室温磁力搅拌下溶于5mL无水乙醇中，然后缓慢加入0.05gEGCG，40℃水浴，冷凝回流3h；得到EGCG磷脂复合物；

2)将0.1g吐温-80加入到5mL纯水中，形成2％的吐温-80溶液；即为水相；将步骤1)中所得EGCG磷脂复合物缓慢滴入其中，形成混合溶液；

3)将混合溶液在功率为800W超声波下，超声40次，进行匀质化处理，即得到EGCG纳米囊泡；

4)称取4g羟丙甲基纤维素，在室温搅拌下加入到10.75mL纯水中混合均匀，室温静置24h得到羟丙甲基纤维素溶液；将上述所得EGCG纳米囊泡加入到羟丙甲基纤维素溶液中，磁力搅拌30min，得到含EGCG口腔原位凝胶喷雾剂3。

实施例4性能考察和比较

将实施实例1、2和3中所得到含EGCG口腔原位凝胶喷雾剂1～3号样品，进行粒径，分散指数以及胶凝温度的测量。根据表1，其中1号样品与3号样品的粒径与分散指数较好，但3号样品所需胶凝温度高于人体正常体温，与发明目的不符。2号样品胶凝温度尚可，但粒径及分散系数远大于1号和3号样品。于是优选1号样品的处方，并进一步观察该样品随时间的稳定性。将1号样品于4℃放置2周，测量每天的粒径变化。根据图4，含EGCG口腔原位凝胶喷雾剂随放置时间的增长，粒径没有产生较大变化，稳定性良好。

表1含EGCG口腔原位凝胶喷雾剂1～3号性能比较

实施例5含EGCG口腔原位凝胶喷雾剂的体外释放

取5ml实施实例1中所得EGCG口腔原位凝胶喷雾剂于样品瓶中并称重，然后在36℃水浴中至样品由液体变为半固体状，再将预热至36℃的2mL人工唾液加入到凝胶表面，置于36℃摇床，振荡速度为100rpm/min。在不同时间点取2mL释放液测量，并称量其重量，继续释放至凝胶含量不足10％。根据图5，所制备EGCG口腔原位凝胶喷雾剂均能在一定时间内溶蚀。根据图6，所制备EGCG口腔原位凝胶喷雾剂在80min时的释放量达到了80％以上，说明该凝胶具有良好的释放行为。

实施例6 EGCG对变异链球菌的最小抑菌浓度(MIC)以及最小杀菌浓度(MBC)的测定

采用美国临床和实验室标准化委员会(CLSI)推荐的微量肉汤稀释法，以变异链球菌CCTCC AB99010(即ATCC 25175)为质控菌株，检测EGCG对变异链球菌的MIC以及MBC。

首先使用BHI肉汤培养基将菌种冻干粉进行活化，过夜培养48h后，在选取对数生长期(即OD₆₃₀＝0.7)的菌株接种于BHI琼脂平板培养18～24h，挑取单菌落接种于BHI肉汤培养基，培养18～24h，培养至0.5麦氏比浊单位，平板计数得到此时菌液浓度为5×10⁷CFU/mL，使用BHI肉汤培养基稀释为5×10⁵CFU/mL备用。定量称取EGCG原料，使用BHI肉汤培养基溶解，在96孔板中连续倍比稀释，得到一系列100μL EGCG梯度稀释液(浓度范围为0.015625～0.5mg/mL)，再加入100μL菌液空白对照为200μL BHI肉汤培养基，阴性对照为100μL培养基以及100μL菌液，每组5个复孔，置于37℃培养箱静置培养24h后，采用酶标仪测量其吸光值。肉眼观察96空板中没有细菌生长的组即为EGCG的MIC，取该组浓度以及该组以上浓度复孔中的溶液各100μL涂平板，每组3个平行，培养48h,没有细菌生长的平板即为MBC。根据图7，EGCG浓度为0.125mg/mL时抑菌率达到了55％，同时96孔板中该浓度组肉眼观察无细菌生长，即该浓度为MIC。根据涂平板所得实验结果，当EGGC浓度为0.5mg/mL时，平板无细菌生长，即高浓度为MBC。

实施例7含EGCG防龋齿口腔原位凝胶喷雾剂的抑菌效果

采用牛津杯法测定EGGC原位凝胶口腔喷雾剂的抑菌效果，由实施实例5确定EGGC的MBC为0.5mg/mL，采用实施实例1制备含量为1mg/mL的EGGC磷脂复合物以及EGGC口腔原位凝胶喷雾剂。使用BHI琼脂培养基各20mL制作平板，每个平板取200μL浓度为5×10⁵CFU/mL的菌液进行涂布，然后等距摆放4个牛津杯(直径为8mm)，标为A,B,C,D四组，A中加入200μL纯水，B中加入200μL EGGC纳米囊泡，C组加入200μL空白口腔原位凝胶喷雾剂，D组加入200μL含EGGC口腔原位凝胶喷雾剂，每组3个平行，置于4℃冰箱中扩散8h后，37℃培养24h，十字法测量各组分抑菌圈大小。根据图八，其中A组以及C组抑菌圈直径为0mm，B组抑菌圈直径为17.3±0.71mm，D组抑菌圈直径为19.2±0.4，说明了EGGC纳米囊泡以及EGCG口腔原位凝胶喷雾剂均具有良好的抑菌效果，其中EGGC口腔原位凝胶喷雾剂抗菌效果显著性高于EGGC纳米囊泡的抗菌活性。

实施例8含EGCG防龋齿口腔原位凝胶喷雾剂的抗菌粘附取实施实例5中浓度为5×10⁷的菌液，3000rpm/min离心10分钟，PBS重悬，调节细菌浓度至OD₆₃₀至0.8备用，将浓度为5mM的2,7-二-(2-羧乙基)-5(6)-羧基荧光素乙酰甲酯(BCECF AM)与菌液混合稀释至10μM，37℃孵育2h进行荧光标记，完成后3000rpm/min离心5分钟，用PBS洗涤2次，直至上清液没有荧光素为止后，将标记好的细菌重新悬浮于37℃的PBS中备用。

取100mg羟基磷灰石(SHA)悬浮于10mL 0.2mol/L NaOH溶液中10min，重复3次以除去表面的活性微粒，并反复洗涤直至上清液的pH值为7.0，离心去上清，将沉淀置于100℃真空干燥箱中烘干过夜。按照ISO/TR10271标准制备人工唾液，以5mg羟基磷灰石：200μL唾液的比例混合，加入到96孔板中，每孔200μL。37℃孵育60min后，2000rpm/min离心5min，吸出每孔中的上清液，沉淀即为唾液包被的羟基磷灰石。将上一步所得唾液包被的羟基磷灰石分为A,B,C,D,E组，每组4个复孔，A组为直接将200μL标记的菌液加入到唾液包被的SHA中；B组为先将200μL EGGC口腔原位凝胶喷雾剂(EGGC浓度为1mg/mL)加入到唾液包被的羟基磷灰中，充分混匀后37℃孵育90min，再小心吸取上清液，并用PBS洗涤2次，再用PBS重新悬浮，即为药物处理后的SHA.然后加入200μL标记好的菌液，37℃下轻微振摇1.5h，完成体外粘附后使用PBS轻轻洗涤2次去掉未结合以及结合不紧密的菌体并重新悬浮；C组为先将标记好的菌悬液与EGCG口腔原位凝胶喷雾剂按照1:1混合，37℃作用1.5h后3000rpm/min离心5min，使用PBS洗涤1次后重悬至相同体积，即为处理后的菌液，再取该菌液200μL至唾液包被的SHA中，后续步骤与以上相同，完成体外粘附；D组为200μL PBS标记好的菌液，步骤上同，同为阳性对照；E组为唾液包被的SHA，使用200μL PBS悬浮，为阴性对照；以上五组均使用荧光酶标仪测量其发光值，激发波长为485nm，发射波长为535nm。并计算其粘附率；

根据图9显示，菌液在唾液包被的SHA中的粘附率(图9中组名为：空白对照组)为73.63％；经过含EGCG口腔原位凝胶喷雾剂处理后的SHA中的菌液粘附率(图9中组名为：含EGCG凝胶预处理SHA)为24.79％；经过含EGCG口腔原位凝胶喷雾剂处理后菌液在SHA中粘附率(图9中组名为：含EGCG凝胶预处理细菌)为11.25％。说明EGCG口腔原位凝胶喷雾剂可以通过作用于唾液获得性膜以及变异链球菌来抑制变异链球菌在SHA上的粘附。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.一种含EGCG防龋齿口腔原位凝胶喷雾剂，其特征在于：它包含以下组分：

1)0.1～5wt％的EGCG；

2)0.1～8％wt％的磷脂；

3)0.1～5wt％的表面活性剂；

4)10～35wt％的温敏型牙齿粘附剂；

5)余量为水。

2.根据权利要求1所述含EGCG防龋齿口腔原位凝胶喷雾剂，其特征在于：它包含以下组分：

1)0.1～3wt％的EGCG；

2)0.2～3wt％的卵磷脂；

3)0.1～3wt％的表面活性剂；

4)15～30wt％的温敏型牙齿粘附剂；

5)余量为水。

3.根据权利要求1或2所述含EGCG防龋齿口腔原位凝胶喷雾剂，其特征在于：所述卵磷脂为大豆卵磷脂或者蛋黄卵磷脂。

4.根据权利要求1或2所述含EGCG防龋齿口腔原位凝胶喷雾剂，其特征在于：所述表面活性剂为聚乙二醇硬脂酸酯，吐温和蔗糖脂肪酸脂中的任意一种。

5.根据权利要求1或2所述含EGCG防龋齿口腔原位凝胶喷雾剂，其特征在于：所述温敏型牙齿粘附剂为泊洛沙姆，木葡聚糖，羟丙甲基纤维素，甲基纤维素中的任意一种或几种。

6.根据权利要求1或2所述含EGCG防龋齿口腔原位凝胶喷雾剂，其特征在于：所述水为纯水。

7.根据权利要求1或2所述含EGCG防龋齿口腔原位凝胶喷雾剂，其特征在于：它包含以下组分：

1)1wt％的EGCG；

2)3wt％的蛋黄卵磷脂；

3)2wt％的吐温-80；

4)28wt％的温敏型牙齿粘附剂；

5)66wt％的纯水。

8.一种权利要求1所述含EGCG防龋齿口腔原位凝胶喷雾剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

5)在室温条件下将温敏型牙齿粘附剂溶于水中，得到温敏型牙齿粘附剂溶液；将步骤4)中所得磷脂纳米囊泡加入到温敏型牙齿粘附剂中，冰水浴中搅拌混合0.1～1h，即得到含EGCG的防龋齿口腔原位凝胶喷雾剂。