CN110869374A

CN110869374A - 2-氧代-1,3-噁唑烷基咪唑并噻二唑衍生物

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Publication number: CN110869374A
Application number: CN201880046128.8A
Authority: CN
Inventors: L·普鲁温斯; H·尚特斯; Y·凯内尔
Original assignee: UCB Biopharma SRL
Current assignee: UCB Biopharma SRL
Priority date: 2017-07-10
Filing date: 2018-07-05
Publication date: 2020-03-06
Anticipated expiration: 2038-07-05
Also published as: ES2896331T3; RU2020104753A; EP3652183A1; EP3652183B1; JP2020526532A; CN110869374B; US11155565B2; WO2019011770A1; JP7126545B2; US20200231599A1; BR112019028078A2; CA3069040A1; MA49559A

Abstract

本发明涉及2‑氧代‑1,3‑

唑烷基咪唑并噻二唑衍生物、其制备方法、包含它们的药物组合物及其作为药物的用途

Description

2-氧代-1,3-噁唑烷基咪唑并噻二唑衍生物

简介

本发明涉及2-氧代-1,3-

唑烷基咪唑并噻二唑(oxazolidinylimidazothiadiazole)衍生物、其制备方法、包含它们的药物组合物及其作为药物的用途。

那些根本不响应于现有治疗方法或对现有治疗响应不充分的患者出现癫痫发作控制的持久性问题。那些患者被视为难以治疗(refractory)且对医学界构成了巨大挑战。估计有约30％癫痫患者被归类为难治性患者。因此，有必要开发专门针对这类患者人群的新药物(medication)。

WO 2008/132139中公开了下式(A)的抗癫痫化合物:

其中

Y是O或S；

R¹是氢或C_1-6烷基；

R²是氢；

R³是-CONR⁵R⁶；-COR⁷、咪唑基、咪唑并吡啶基、咪唑并哒嗪基；

R⁵、R⁶相同或不同，并且独立地选自氢和C_1-6烷基；

R⁷是C_1-6烷基；

Z是单环或双环杂环结构部分(moiety)，其选自：咪唑烷-1-基、1,3-

唑烷-3-基、2,5-二氢-1H-吡咯-1-基、1,3-噻唑-3(2H)-基、1,3-噻唑烷-3-基、哌啶-1-基、氮杂环庚烷-1-基、5,6-二氢-4H-噻吩并[3,2-b]吡咯-4-基、六氢-4H-噻吩并[3,2-b]吡咯-4-基、2,3-二氢-1H-噻吩并[3,4-b]吡咯-1-基、1,3-苯并噻唑-3(2H)-基、1,3-苯并

唑-3(2H)-基、吡唑并[1,5-a]吡啶-1(2H)-基、3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基、3,4-二氢喹啉-1(2H)-基、1,3,4,5-四氢-2H-2-苯并氮杂

-2-基、1,2,4,5-四氢-3H-3-苯并氮杂

-3-基。

在WO 2008/132139的一个具体实施方案中，式(A)中的Z＝Y结构部分可以是：

其中X是O或S。

式(I)的抗癫痫化合物公开于WO 2011/047860：根据式(I)的2-氧代-1-吡咯烷基咪唑并噻二唑衍生物

其中

R¹是含有至少一个卤素取代基的C_1-4烷基；

R²是卤素(氯、溴、碘)或含有至少一个卤素取代基的C_1-4烷基；

R³是含有至少一个羟基(OH)或烷氧基(例如甲氧基或乙氧基或丙氧基)取代基的C_1-4烷基(例如甲基或乙基)。

式(I)的抗癫痫化合物公开于WO 2012/143116：根据式(I)的4-氧代-1-咪唑烷基咪唑并噻二唑衍生物，

其中

R¹是任选被下述取代的C_1-4烷基：一个或多个(1至6个，优选2、3或5个)卤素、取代的或未取代的苯基或取代的或未取代的C_1-4环烷基；

R²是卤素(氯、溴、碘)或含有一个或多个(即1、2或3个)卤素取代基的C_1-4烷基；

本发明提供了具有式(I)的新的2-氧代-1,3-

唑烷基咪唑并噻二唑衍生物、它们的几何异构体、对映异构体、非对映异构体和混合物或其药学上可接受的盐，

通过详细描述，本发明的其他方面将变得显而易见。

发明详述

本发明涉及根据式(I)的2-氧代-1,3-

唑烷基咪唑并噻二唑衍生物，

其中

R¹是任选地被一个或多个卤素取代基取代的C_1-4烷基；

R²是卤素原子或任选地被一个或多个卤素原子取代的C_1-4烷基；

R³是被烷氧基取代基取代的C_1-4烷基。

还包括式(I)化合物互变异构体、几何异构体、对映异构体、非对映异构体、同位素和混合物或药学上可接受的盐以及任何氘代变体。

在特定的实施方案中，R¹是异丁基、正丙基、2,2-二氟丙基、2-氯-2,2-二氟乙基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基或2-氟乙基结构部分。

在一个更特定的实施方案中，R¹是正丙基、2-氯-2,2-二氟乙基、2,2-二氟丙基或2,2,2-三氟乙基结构部分。

优选的是，R¹是2,2-二氟丙基、2,2,2-三氟乙基或正丙基结构部分。

在另一特定实施方案中，R²是氯原子、二氟甲基结构部分或三氟甲基结构部分。

在优选的实施方案中，R²是二氟甲基结构部分或三氟甲基结构部分。

在另一特定实施方案中，R³是甲氧基甲基、[(²H3)甲基氧基]甲基、甲氧基(²H₂)甲基或[(²H₃)甲基氧基](²H₂)甲基结构部分。

在优选的实施方案中，R³是甲氧基甲基结构部分。

在另一特定实施方案中，式(I)化合物为那些，其中：

·R¹是正丙基结构部分、2-氯-2,2-二氟乙基、2,2-二氟丙基或2,2,2-三氟乙基结构部分；

·R²是氯原子、二氟甲基或三氟甲基结构部分；

·R³是甲氧基甲基、[(²H₃)甲基氧基]甲基、甲氧基(²H₂)甲基或[(²H₃)甲基氧基](²H₂)甲基结构部分。

在另一特定实施方案中，式(I)化合物为那些，其中：

·R¹是正丙基结构部分；2,2-二氟丙基或2,2,2-三氟乙基结构部分

·R²是二氟甲基或三氟甲基结构部分；

在优选的实施方案中，式(I)化合物为那些，其中：

·R¹是正丙基结构部分；2,2-二氟丙基或2,2,2-三氟乙基结构部分；

·R²是二氟甲基或三氟甲基结构部分；

·R³是甲氧基甲基结构部分。

本发明的特定化合物是选自以下的那些：

·(+)-3-[[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮；

·(-)-3-[[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮；

·(+)-3-[[6-(二氟甲基)-2-(甲氧基甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮；

·(-)-3-[[6-(二氟甲基)-2-(甲氧基甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮；

·(+)-3-[[2-[二氘(dideuterio)(甲氧基)甲基]-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮；

·(-)-3-[[2-[二氘(甲氧基)甲基]-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮；

·(+)-3-[[2-[二氘(三氘甲氧基)甲基]-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮；

·(-)-3-[[2-[二氘(三氘甲氧基)甲基]-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮；

·(+)-3-[[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-(2,2,2-三氟乙基)

唑烷-2-酮；

·(-)-3-[[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-(2,2,2-三氟乙基)

唑烷-2-酮；

·(+)-3-[[6-(二氟甲基)-2-(甲氧基甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-(2,2,2-三氟乙基)

唑烷-2-酮；

·(-)-3-[[6-(二氟甲基)-2-(甲氧基甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-(2,2,2-三氟乙基)

唑烷-2-酮；

·(-)-5-(2,2-二氟丙基)-3-[[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]

唑烷-2-酮；

·(+)-5-(2,2-二氟丙基)-3-[[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]

唑烷-2-酮；

·3-[[6-(二氟甲基)-2-(甲氧基甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-(2,2-二氟丙基)

唑烷-2-酮，对映异构体1；

唑烷-2-酮，对映异构体2。

本发明的化合物用作药物，用于治疗癫痫、癫痫发生、癫痫发作障碍、惊厥，特别是用于难治性癫痫发作(refractory seizures)。

以下段落提供了组成本发明化合物的各种化学结构部分的定义，并且旨在在整个说明书和权利要求书中统一地应用，除非另外明确列出的定义提供了更宽泛的定义。

“C_1-4烷基”是指具有1-4个碳原子的烷基。该术语由诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基的基团示例。“C_1-4烷基”基团可以被一个或多个选自卤素或烷氧基的取代基取代。

式(I)中的任何结构部分“H”可以是同位素氢、氘或氚。

“烷氧基”是指基团-O-R，其中R包括“C_1-4烷基”。

“卤素”是指氟、氯、溴和碘原子，优选氟和氯。

根据本发明的“药学上可接受的盐”包括式(I)的化合物能够形成的具有治疗活性的无毒酸或碱盐形式。

以游离形式作为碱存在的式(I)的化合物的酸加成盐形式可以通过以下而获得：用适当的酸处理游离碱，所述适当的酸例如无机酸，例如氢卤酸例如盐酸或氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或有机酸，例如乙酸、三氟乙酸、羟基乙酸、丙酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己烷氨基磺酸、水杨酸、对氨基水杨酸、扑酸等。

含有酸性质子的式(I)的化合物可通过适当的有机和无机碱处理被转化成它们的治疗活性的无毒碱加成盐形式，例如金属或胺盐。合适的碱盐形式包括例如铵盐、碱金属和碱土金属盐，例如锂、钠、钾、镁、钙盐等，与有机碱形成的盐，例如N-甲基-D-葡糖胺，海巴明(hydrabamine)盐以及与氨基酸形成的盐，例如精氨酸、赖氨酸等。

相反，可以通过用适当的碱或酸处理将所述盐形式转化为游离形式。

式(I)的化合物及其盐可以是溶剂化物的形式，其包括在本发明的范围内。这样的溶剂化物包括例如水合物、醇化物等。

式(I)的化合物和/或其中间体可以在其结构中具有至少一个立体异构中心。该立体异构中心可以R或S构型存在，所述R和S符号与Pure Appl.Chem.,45(1976)11-30中描述的规则相对应地使用。因此，本发明还涉及式(I)的化合物的所有立体异构形式，例如对映异构和非对映异构形式或其混合物(包括所有可能的立体异构体混合物)。关于本发明，对于一个或多个化合物的提及旨在包括其每种可能的异构形式的化合物及其混合物，除非具体提及特定的异构形式。如本文所用的表述“对映体纯的”是指对映体过量(ee)大于95％的化合物。

根据本发明的化合物可以以不同的多晶型形式(polymorphic form)存在。尽管在上式中没有明确指出，但是这些形式意图包括在本发明的范围内。

根据本发明的式(I)的化合物可以类似于合成有机化学领域技术人员所理解的常规方法来制备。

根据一个实施方案，具有通式(I)的化合物可以通过使式(II)的化合物与式(III)的脲根据下式反应来制备：

其中R¹、R²和R³具有与以上对式(I)的化合物所定义的相同的定义。

该反应可以在非质子溶剂例如环丁砜中使用酸例如对甲苯磺酸在高温下进行。

式(II)的化合物可以根据下式通过式(IV)的化合物的羟甲基化来制备：

其中R²和R³具有与以上对式(I)的化合物所定义的相同的定义。

该反应可以在酸性条件下、在极性溶剂，例如二

烷中，使用甲酰化剂，例如多聚甲醛(paraformaldehyde)，在100℃下进行，或者根据本领域技术人员已知的任何其他方法进行。

式(IV)的化合物可以根据下式通过使式(V)的化合物与式(VI)的溴代衍生物反应来合成：

该反应可以使用文献中描述的或本领域技术人员已知的操作进行。

式(V)的化合物和式(VI)的化合物可以商购获得，或者可以根据本领域技术人员已知的任何方法合成。

根据一个实施方案，式(III)化合物可通过根据下式环化式(VII)化合物来制备：

该反应可以用1,1'-羰基二咪唑，在极性溶剂例如四氢呋喃中，在例如氢化钠的碱存在下，在室温进行或使用本领域技术人员已知的操作进行。

式(VII)的化合物可通过根据下式还原式(VIII)的化合物来制备

其中R¹具有与上述定义相同的定义。

该反应可以使用还原剂例如但不限于氢，在催化剂例如炭载钯的存在下，在极性溶剂例如乙醇中进行，或通过本领域技术人员已知的其他操作进行。

式(VIII)的化合物可以根据本领域技术人员已知的任何反应顺序，从可商购的醛或醇(其中R¹具有与上文所定义的相同的定义)开始制备。

本发明的化合物用作药物，用于治疗癫痫、癫痫发生、癫痫发作障碍、惊厥，特别是用于难治性癫痫发作。

当患者无法使用最大耐受剂量的两种或更多种抗癫痫药治疗12个月或更长时间的现有技术治疗实现无癫痫发作(seizure freedom)时，所述癫痫发作可归为难治性的。国际抗癫痫联盟(ILAE)将耐药性癫痫定义为“充分尝试两种耐受且适当选择且使用AED方案(无论是单一疗法还是组合疗法)也未能实现持续的无癫痫发作”。

本发明的方法包括向患有上述病况或障碍的哺乳动物(优选人)施用足以减轻或预防所述障碍或病况的量的本发明的化合物。

该化合物以任何合适的单元剂型方便地施用，包括但不限于每单元剂型含有1-2000mg，优选1-1000mg，更优选1-500mg活性成分的单元剂型。

如本文所用，术语“治疗”包括治愈性治疗和预防性治疗。

“治愈性”是指治疗障碍或病况的当前症状发作的功效。

“预防性”是指预防障碍或病况的发生或复发。

如本文所用，术语“癫痫”是指以无缘无故的、反复发作的癫痫性癫痫发作(epileptic seizure)为特征的慢性神经病学病况。癫痫性癫痫发作是表现出一组大脑神经元异常且过度同步放电。其临床表现是突然的和短暂的。如本文所用，术语“癫痫”还可以指特征为癫痫发作的周期性发生的脑功能障碍。癫痫发作当在正常的大脑中因例如高烧的病况或接触毒素而被诱发时可能是“非癫痫性的”，或在没有明显刺激的情况下被诱发时可能是“癫痫性的”。

如本文所用，术语“癫痫发作”是指由于脑神经元群体的无序、同步和有节奏的放电(rhythmic firing)而引起的行为的短暂改变。

本发明的另一方面涉及药物组合物，其包含有效量的式(I)的化合物与药学上可接受的稀释剂或载体的组合。

当然，可以通过以相关领域技术人员对于特定适应证和/或通常在临床试验设计中已知的方式进行合适的临床试验，来确定在任何上述适应证中的活性。

为了治疗疾病，可以以有效的每日剂量使用式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，并以药物组合物的形式施用。

因此，本发明的另一个实施方案涉及药物组合物，其包含有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的稀释剂或载体。

为了制备根据本发明的药物组合物，根据本领域技术人员已知的常规药物混合技术，将一种或多种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐与药物稀释剂或载体紧密混合。

合适的稀释剂和载体可以采取多种形式，这取决于所需的施用途径，例如口服、直肠、肠胃外或鼻内施用。

包含根据本发明的化合物的药物组合物可以例如经口服、肠胃外、即静脉内、肌内或皮下、鞘内、经皮(贴剂)、通过吸入或鼻内施用。

适用于口服施用的药物组合物可以是固体或液体，并且可以是例如片剂、丸剂、糖锭剂、明胶胶囊、溶液、糖浆、口香糖等形式。

为此，可以将活性成分与惰性稀释剂或无毒的药学上可接受的载体例例如淀粉或乳糖混合。任选地，这些药物组合物还可包含粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶，崩解剂例如藻酸，润滑剂例如硬脂酸镁，助流剂例如胶体二氧化硅，甜味剂例如蔗糖或糖精，或着色剂或调味剂，例如薄荷或水杨酸甲酯。

本发明还考虑了可以以受控方式释放活性物质的组合物。

可以用于肠胃外施用的药物组合物是常规形式，例如通常包含在安瓿、一次性注射器、玻璃或塑料小瓶或输液容器中的水性或油性溶液或悬浮液。

除了活性成分外，这些溶液或悬浮液还可任选地包含无菌稀释剂，例如注射用水、生理盐水溶液、油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂，抗细菌剂(例如苄醇)，抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，螯合剂例如乙二胺-四乙酸，缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调节摩尔渗透压浓度(osmolarity)的试剂例如氯化钠或葡萄糖。

这些药物形式是使用药剂师常规使用的方法制备的。

药物组合物中活性成分的含量可以在很宽的浓度范围内，并且取决于多种因素，例如患者的性别、年龄、体重和医学状况以及施用方法。因此，相对于组合物的总重量，式(I)的化合物在口服施用组合物中的量为至少0.5重量％，并且可以高达80重量％。

根据本发明，还发现式(I)的化合物或其药学上可接受的盐可以单独施用或与其他药学活性成分组合施用。可以引用与本发明化合物组合使用的此类其他化合物的非限制性实例是抗病毒药、抗痉挛药(例如巴氯芬)、止吐药、抗躁狂情绪稳定剂、镇痛药(例如阿司匹林、布洛芬、扑热息痛)、麻醉性镇痛药、局部麻醉药、阿片类镇痛药、锂盐、抗抑郁药(例如米安色林、氟西汀、曲唑酮)、三环类抗抑郁药(例如丙咪嗪、地昔帕明)、抗惊厥药(例如丙戊酸、卡马西平、苯妥英)、抗精神病药物(例如利培酮、氟哌啶醇)、精神安定药(neuroleptics)、苯二氮

类药物(例如地西泮、氯硝西泮)、吩噻嗪类药物(例如氯丙嗪)、钙通道阻滞剂、苯丙胺、可乐定、利多卡因、美西律、辣椒辣素、咖啡因、喹硫平、5-羟色胺拮抗剂、β-受体阻滞剂、抗心律失常药、普坦类、麦角衍生物和金刚烷胺。

对于口服组合物，每日剂量在1mg至2000mg式(I)的化合物的范围内。优选在1mg至1000mg范围内的式(I)的化合物，最优选1mg至500mg。

在肠胃外施用的组合物中，相对于组合物的总重量，存在的式(I)的化合物的量是至少0.5重量％，并且可以高达33重量％。对于优选的肠胃外组合物，剂量单元是1mg至2000mg范围的式(I)的化合物。

日剂量可以落在式(I)的化合物的剂量单元的宽范围内，并且通常在1至2000mg，优选1至1000mg的范围内。但是，应该理解，具体剂量可以根据医生的判断，根据个体需要调整为适应特定情况。

本发明提供的结合SV2蛋白的化合物及其标记的衍生物可以用作确定被测化合物(例如，潜在的药物)结合SV2蛋白的能力的标准和试剂。

本发明提供的标记的SV2蛋白配体的衍生物也可用作放射性示踪剂，用于正电子发射断层摄影术(PET)成像或用于单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)。

因此，本发明进一步提供了标记的配体作为筛选化学文库的工具，以发现潜在的药物试剂，特别是用于在与SV2蛋白的更有效结合的基础上治疗和预防本文所述病况，用于在组织中定位SV2蛋白，用于表征纯化的SV2蛋白。SV2蛋白包括SV2A、SV2B和SV2C，其中SV2A是抗癫痫发作药左乙拉西坦及其类似物的结合位点。SV2同种型SV2A、SV2B或SV2C可源自任何哺乳动物物种，包括人、大鼠或小鼠的组织，尤其是脑。或者，同种型可以是异源表达并用于测定的任何哺乳动物物种(包括人、大鼠和小鼠)的克隆形式。筛选方法包括将脑膜例如哺乳动物或人脑膜、或表达SV2蛋白或其片段特别是SV2A和SV2C、但包括SV2B的细胞系暴露于推定的试剂，并孵育膜或蛋白或片段和具有标记的式(I)的化合物的试剂。该方法还包括确定推定的试剂是否抑制式(I)的化合物与蛋白质的结合，从而鉴定该蛋白质的结合伴侣。因此，筛选测定能够鉴定与SV2蛋白相互作用的新药或化合物。本发明还提供了SV2蛋白的可光活化(photoactivable)配体。

标记的配体还可以用作评估溶解、纯化和色谱分离后SV2蛋白构象状态的工具。标记的配体可以直接或间接标记。合适的标记物的实例包括放射性标记物例如³H、荧光标记物、酶、铕、生物素和用于此类测定的其他常规标记物。

标记的式(I)的化合物可在所述方法中用作筛选与SV2蛋白(SV2A、SV2B和SV2C)结合的新化合物或试剂的测定中的探针。在这样的测定实施方案中，可以不经修饰地使用配体，或者可以以各种方式修饰配体；例如，通过标记，例如共价或非共价连接直接或间接提供可检测信号的结构部分。在任何这些测定中，可以直接或间接标记材料。直接标记的可能性(possibilities)包括标记组，例如：放射性标记，包括但不限于[³H]、[¹⁴C]、[³²P]、[³⁵S]或[¹²⁵I]，酶例如过氧化物酶和碱性磷酸酶，以及能够监测荧光强度、波长偏移或荧光偏振变化的荧光标记，包括但不限于荧光素或罗丹明。间接标记的可能性包括一种成分的生物素化，然后与偶联上述标记组之一的抗生物素蛋白结合或使用抗配体抗体。在化合物要连接固体支持物(solid support)的情况下，化合物还可以包括间隔基或接头。为了鉴定与根据本发明的标记的配体竞争或相互作用以与SV2蛋白(特别是SV2A和SV2C)结合的试剂或化合物，可以使用完整细胞、细胞或膜片段(含有SV2A或SV2C)或整个SV2蛋白或其片段。可以在与标记的左乙拉西坦或其类似物或衍生物一起孵育之前、同时或之后，将试剂或化合物与细胞、膜、SV2蛋白或片段一起孵育。可以以任何可用的形式修改或制备测定，包括监测左乙拉西坦或其衍生物或类似物与SV2蛋白或其片段的结合的高通量筛选(HTS)测定。在测试化合物文库的许多药物筛选程序中，需要高通量测定，以便在给定的时间段内最大化所检测化合物的数量。这样的筛选测定可以使用完整的细胞、细胞或膜片段(含有SV2)以及无细胞或无膜系统，例如可以用纯化或半纯化的蛋白质衍生的系统。用含有SV2的膜片段或纯化的SV2蛋白和肽进行测定的优势在于，通常可以忽略测试化合物的细胞毒性和/或生物利用度的影响，相反，测定主要集中于药物对分子靶标的影响，可表现为抑制例如两个分子之间的结合。可以配制测定以检测测试剂或化合物抑制根据本发明的标记的配体与SV2或SV2的片段或标记的左乙拉西坦或其衍生物或类似物与SV2或SV2蛋白的片段结合的能力。可以通过多种技术来检测复合物形成的抑制，例如过滤测定、Flashplates(Perkin Elmer)、闪烁迫近测定(SPA，GE)。对于高通量筛选(HTS)，使用生物膜包被的微球的闪烁迫近测定或生物膜包被的flashplate是强大的方法，其不需要分离或洗涤步骤。

当开发用于治疗的化合物时，可能会遇到的问题是某些化合物(犯罪药物(perpetrator drug))诱导CYP450酶，特别是CYP3A4/5的能力，所述化合物可以与本发明的化合物(受害药物(victim drug))一起共同施用。当主要由CYP450酶和CYP3A4/5代谢时，由犯罪药物诱导的此类酶可能会影响受害药物的暴露，从而可能改变其效力曲线(efficacyprofile)。因此，需要开发被CYP3A4/5酶代谢的潜力有限的化合物。

CYP3A4/5对根据本发明的化合物的总代谢的贡献已通过计算在不存在和存在选择性CYP3A4/5抑制剂(例如阿扎莫林(azamulin))的情况下人肝细胞清除率之间的比率来评估。

当根据本专利申请中所述的方案在该测定中进行测试时，根据本发明的化合物显示出被CYP3A4/5(F_m，CYP3A4/5)代谢的分数(fraction)通常低于40％，因此将与CYP450诱导剂共同施用时药物-药物相互作用的风险最小化。

实验部分

缩写/反复出现的试剂(recurrent reagent)

Ac：乙酰基

ACN：乙腈

盐水：饱和氯化钠水溶液

nBu：正丁基

tBu：叔丁基

Bz：苯甲酰基

CV:柱体积

DCM：二氯甲烷

DMF：N,N-二甲基甲酰胺

DMSO：二甲基亚砜

Et：乙基

EtOH：乙醇

Et₂O：乙醚

EtOAc：乙酸乙酯

h：小时

HPLC：高压液相色谱法

LC：液相色谱法

LCMS：液相色谱质谱

MeOH：甲醇

min.：分钟

NMR：核磁共振

iPrOH：异丙醇

PTSA：对甲苯磺酸

RT：室温

SFC：超临界流体色谱法

THF：四氢呋喃

TLC：薄层色谱法

在本申请中，提及了化合物的IUPAC名称(或从Accelerys Draw4.0产生的名称)。

分析方法

所有涉及空气或湿气敏感试剂的反应均在氮气或氩气气氛下使用干燥的溶剂和玻璃器皿进行。需要微波辐射的实验是在Biotage Initiator 60微波炉上进行的，该微波炉已升级为2.0版的操作软件。进行实验以尽快达到所需温度(最大照射功率：400W，无需外部冷却)。商业溶剂和试剂通常无需进一步纯化即可使用，包括适当时的无水溶剂(通常是Aldrich Chemical Company的Sure-Seal^TM产品或ACROS Organics的AcroSeal^TM)。通常，反应后进行薄层色谱法、HPLC或质谱分析。

使用安装有Waters XBridge MS C18、5pm、150X 4.6mm柱的Agilent 1100系列HPLC系统进行HPLC分析。梯度在6min内从100％溶剂A(水/ACN/甲酸铵溶液85/5/10(v/v/v))到100％溶剂B(水/ACN/甲酸铵溶液5/85/10(v/v/v))，保持100％B达5分钟。流速在6分钟内设置为8mL/min，然后在2min内以3mL/min增加，在3分钟内保持3mL/min。在API来源之前使用1/25的分流(split)。在45℃下进行色谱分析。甲酸铵溶液

通过以下制备：将甲酸铵(630mg)溶解在水(1L)中，并加入氢氧化铵30％(500μL)。

对于本领域技术人员显而易见的是，如果使用不同的分析条件，则对于LC数据可以获得不同的保留时间。

LCMS模式下的质谱测量如下进行：

-对于碱性洗脱，使用下述进行分析：

QDA Waters简单四极质谱仪用于LCMS分析。该光谱仪配备有ESI源和带二极管阵列检测器(200至400nm)的UPLC Acquity Hclass。在阳性模式下通过碱性洗脱，以全MS扫描从m/z 70到800获得数据。反相分离是在45℃在Waters Acquity UPLC BEHC18 1.7μm(2.1x50mm)柱上进行的，所述柱用于碱性洗脱。用水/ACN/甲酸铵(95/5/63mg/L)(溶剂A)和ACN/水/甲酸铵(95/5/63mg/L)(溶剂B)进行梯度洗脱。进样量：1μL。MS中的全流动(Full flow)。

碱性程序“4min”

碱性程序“10min”

-对于酸性洗脱，使用下述进行分析：

QDA Waters简单四极质谱仪用于LCMS分析。该光谱仪配备有ESI源和带二极管阵列检测器(200至400nm)的UPLC Acquity Hclass。在阳性模式下通过酸性洗脱，以全MS扫描从m/z 70到800获得数据。反相分离是在45℃在Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μm(2.1x50mm)柱上进行的，所述柱用于酸性洗脱。用水/ACN/TFA(95/5/0.5mL/L)(溶剂A)和ACN(溶剂B)进行梯度洗脱。进样量：1μL。MS中的全流动。

酸性程序“4min”

酸性程序“10min”

可以通过正相色谱法、(酸性或碱性)反相色谱法、手性分离或重结晶纯化粗物质。

使用硅胶柱(Interchim的100：200目硅胶或

-50SIHC-JP柱)进行正反相(normal reverse phase)色谱法分析。

制备型反相色谱法如下进行：

-使用SQD或QM Waters三重四极杆质谱仪进行LCMS纯化(碱性模式(basic mode)，LCMS制备)用于LCMS纯化。该光谱仪配备有ESI源和带有二极管阵列检测器(210至400nm)的Prep LC控制器Waters四元泵。

MS参数：ESI毛细管电压3kV。锥和提取器电压10。源块温度为120℃。去溶剂温度为300℃。锥形气体流(Cone gaz flow)30L/h(氮气)，去溶剂气流650L/h。通过酸性或碱性洗脱，以阳性模式在m/z 100到700的全MS扫描中获得数据。

LC参数：在rt下，在XBridge制备型OBD C18柱(5μm，30x50mm)上进行反相分离(碱性洗脱)。用水(溶剂A)、ACN(溶剂B)、碳酸氢铵水溶液8g/L+500μL/L NH₄OH 30％(溶剂C)

进行梯度洗脱。HPLC流速：35mL/min至60mL/min，进样量：1mL。将分流比设置为+/-1/6000(至MS)。

使用液相色谱法或超临界流体色谱法(SFC)仪器，以低级醇和C₅至C₈直链、支链或环状烷烃的各种混合物，以360mL/min进行制备型手性色谱分离。溶剂混合物以及柱在各操作中进行了描述。

产品通常在真空下干燥，然后再进行最终分析并进行生物学测试。

NMR光谱记录在装有运行Topspin 3.2软件的Windows 7Professional工作站和5毫米双共振宽带探头(PABBI 1H/19F-BB Z-GRD Z82021/0075)或1mm三重共振探头(PATXI1H/D-13C/15N Z-GRD Z868301/004)的BRUKER AVANCEIII 400MHz-Ultrashield NMR光谱仪上。在DMSO-d₆或CDCl₃溶液中以300K的探针温度和10mg/mL的浓度研究了这些化合物。仪器锁定DMSO-d₆或CDCl₃的氘信号。化学位移以相对于作为内标的TMS(四甲基硅烷)低场ppm给出。

旋光度([α]_D)是在PERKIN-ELMER旋光仪341上，在比色杯(l＝1dm)中，在10mg/mL的浓度下，在特定示例中提到的温度下，在589nm(钠灯)下测量的。

下列实施例说明如何合成式(I)覆盖的化合物。提供它们仅出于说明目的，并且无意于也不应解释为以任何方式限制本发明。本领域技术人员将理解，可以在不超出本发明的精神或范围的情况下，对以下实施例进行常规变化和修改。

实施例1.(+)-3-[[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮1和(-)-3-[[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮2的合成

1.1 1-硝基戊-2-醇I的合成

在50℃下，搅拌丁醛(CAS：123-72-8，1eq.，5.0g，69.3mmol)和碳酸钾(1eq.，9.68g，69.3mmol)在硝基甲烷(95mL)中的混合物5h。将混合物冷却至室温，并加入乙酸乙酯(100mL)。有机层用水洗涤(两次)，用MgSO₄干燥，过滤并蒸发至干燥，得到棕色油状物。粗混合物通过快速色谱法Biotage Isolera Four纯化(100g KP-SNAP硅胶柱，采用超过12CV的100％二氯甲烷)，并将纯级分蒸发至干燥，得到1-硝基戊-2-醇I(4.7g,35.0mmol)，为无色油状物。

收率：51％

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ5.26(d,J＝6.2Hz,1H)，4.64(dd,J＝12.2,3.2Hz,1H)，4.31(dd,J＝12.1,9.3Hz,1H)，4.09(ddt,J＝8.9,5.9,3.2Hz,1H)，1.47–1.23(m,4H)，0.95–0.77(m,3H)。

1.2 1-氨基戊-2-醇II的合成

在50℃，在H₂压力(50巴)下，在H-Cube反应器中，在10％Pd/C柱(cartridge)上，将1-硝基戊-2-醇I(1eq.，200mg，1.5mmol)在乙醇(8mL)中的溶液氢化1h(流动:1mL/min,7.5个循环)。将粗混合物蒸发至干燥并在高真空下干燥，得到1-氨基戊-2-醇II(140mg,1.22mmol)，为无色油状物。所得粗化合物无需进一步纯化即直接用于下一步。

收率：81％

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ3.37–3.25(m,1H)，2.52(d,J＝4.1Hz,1H)，2.37(dd,J＝12.6,7.3Hz,1H)，1.45–1.20(m,4H)，0.93–0.79(m,3H)。

1.3 5-丙基

唑烷-2-酮III的合成

向1-氨基戊-2-醇II(1eq.,1.0g,9.2mmol)和1,1'-羰基二咪唑(1eq.,1.6g,9.7mmol)在THF(20mL)中的溶液，加入氢化钠(0.1eq.,23mg,0.92mmol)，并将混合物在25℃下搅拌24h。将乙酸乙酯和水加入到反应混合物中并将水层用乙酸乙酯萃取(两次)，用水和盐水洗涤，用MgSO₄干燥，过滤并蒸发至干燥，得到黄色油状物。粗产物通过快速色谱法Biotage Isolera Four纯化(50g KP-SNAP硅胶柱，梯度为超过10CV的二氯甲烷中的0％至10％甲醇)，并将纯级分蒸发至干燥，得到5-丙基

唑烷-2-酮III(990mg,7.59mmol)，为白色固体。

收率：82％

LC/MS:[M+H]⁺＝130.1

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ5.98(s,1H)，4.73–4.55(m,1H)，3.65(td,J＝8.4,0.8Hz,1H)，3.22(ddd,J＝8.2,7.2,0.9Hz,1H)，1.87–1.70(m,1H)，1.69–1.32(m,3H)，0.96(t,J＝7.3Hz,3H)。

1.4[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲醇V的合成

在密封管中，将2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑IV(CAS:1294001-16-3,专利申请WO 2012/143117,1eq.,2.0g,8.4mmol)，多聚甲醛(6.0eq.,1.52g,50.6mmol)和盐酸水溶液(2N)(1.0当量,4.2mL,8.4mmol)混合在1,4-二

烷(4mL)中。将混合物在100℃搅拌18h并通过LC/MS检查反应。将粗混合物冷却至室温并且加入NaHCO₃饱和水溶液直至pH＝6-7。用乙酸乙酯萃取水层(三次)并且合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO₄干燥，过滤并蒸发至干燥。粗产物通过快速色谱法Biotage Isolera Four纯化(100g KP-SNAP硅胶柱，梯度为超过15CV的二氯甲烷中的0％至10％甲醇)，得到[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲醇(1.06g,3.5mmol)V，为米色固体。该化合物无需进一步纯化即直接用于下一步。

收率：41％

LC/MS:[M+H]⁺＝268.2

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ5.04(d,J＝5.2Hz,2H)，4.77(s,2H)，3.53(s,3H)，2.32(t,J＝6.3Hz,1H)。

1.5(+)-3-[[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮2的合成

向[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲醇V(1eq.,200mg,0.74mmol)和5-丙基

唑烷-2-酮III(2eq.,190mg,1.48mmol)在环丁砜(3mL)中的混合物，加入对甲苯磺酸一水合物(1eq.,152mg,0.74mmol)并将混合物在110℃搅拌16h。粗混合物直接通过反相制备型HPLC纯化(碱性条件)，得到米色固体(155mg的外消旋物)，其通过手性SFC纯化(Phase WhelkO1(R,R)，50x 227mm/CO₂/EtOH共溶剂20％/30℃/360mL/min)。将最纯的级分蒸发至干燥，得到(+)-3-[[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮1(第一洗脱的，56mg,0.15mmol)和(-)-3-[[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮2(第二洗脱的，56mg,0.15mmol)，为无色油状物。

收率：20％

LC/MS:[M+H]+＝379.4

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ4.84(s,2H)，4.74(qd,J＝15.8,1.2Hz,2H)，4.44(dtd,J＝8.3,7.0,5.4Hz,1H)，3.54(t,J＝8.3Hz,1H)，3.43(s,3H)，3.08(dd,J＝8.4,6.9Hz,1H)，1.62–1.45(m,2H)，1.28(dddd,J＝16.1,13.6,8.4,4.0Hz,1H)，0.85(t,J＝7.4Hz,3H)。

α-D(1,MeOH,10mg/mL,26.5℃)＝+27.0

α-D(2,MeOH,10mg/mL,26.5℃)＝-26.2

实施例2.(+)-3-[[6-(二氟甲基)-2-(甲氧基甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮3和(-)-3-[[6-(二氟甲基)-2-(甲氧基甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮4的合成

1.5 6-(二氟甲基)-2-(甲氧基甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑VII的合成

在100℃，向5-(甲氧基甲基)-1,3,4-噻二唑-2-胺VI(CAS:15884-86-3，1.0eq.，6.5g，45mmol)在DMF(100mL)的溶液中滴加3-溴-1,1-二氟丙烷-2-酮(CAS：883233-85-0，1.05eq.，8.1g，47mmol)在DMF(5mL)中的溶液。将反应混合物在100℃下加热3小时，并通过LC/MS检查完成情况。加入饱和的NaHCO₃水溶液，且有机层用乙酸乙酯萃取(三次)。合并的有机层用水洗涤(五次)，用MgSO₄干燥，过滤并蒸发至干燥，得到棕色固体(7.6g)。粗产物通过快速色谱法Biotage Isolera Four(100g KP-SNAP硅胶柱，梯度为超过12CV的二氯甲烷中0％至5％甲醇)纯化，将纯级分在高真空下蒸发，得到6-(二氟甲基)-2-(甲氧基甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑VII(3.95g，17.8mmol)，为橙色固体。

收率：40％

LC/MS:[M+H]⁺＝220.2

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆):δ8.53(t，J＝2.2Hz，1H)，7.01(t，J＝54.6Hz，1H)，4.83(s，2H)，3.43(s，3H)。

1.6[6-(二氟甲基)-2-(甲氧基甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲醇VIII的合成

在密封管中，6-(二氟甲基)-2-(甲氧基甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑VII(1.0eq.，3.95g，18.0mmol)，多聚甲醛(6.0eq.，3.24g，108mmol)和盐酸水溶液(2N)(0.9当量，8.1mL，16.2mmol)混合在1,4-二

烷(8mL)中。将混合物在100℃下搅拌3.5小时，并通过LC/MS检查反应。将粗混合物冷却至RT，并加入NaHCO₃饱和水溶液直至pH＝6-7。用乙酸乙酯萃取水层(三次)且合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO₄干燥，过滤并蒸发至干燥。粗产物通过快速色谱法Biotage Isolera Four纯化(100g KP-SNAP硅胶柱，梯度为超过15CV的二氯甲烷中的0％至10％甲醇)，得到黄色油状物(3g)，将其第二次通过反相HPLC纯化(KROMASIL-Eternity XT C₁₈ 10μm/ACN/H₂O/NH₄OH，梯度从20/80/0.1至50/50/0.1)。将最纯的级分蒸发至干燥，得到[6-(二氟甲基)-2-(甲氧基甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲醇VIII(2g，8.02mmol)，为白色固体。

收率：45％

LC/MS:[M+H]⁺＝250.2

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆):δ7.11(t，J＝53.6Hz，1H)，5.47(t，J＝5.4Hz，1H)，4.84(s，2H)，4.79(d，J＝5.5，Hz，2H)，3.44(d，J＝0.9Hz，3H)。

1.7.(+)-3-[[6-(二氟甲基)-2-(甲氧基甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮4的合成

向[6-(二氟甲基)-2-(甲氧基甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲醇VIII(1eq.,200mg,0.8mmol)和5-丙基

唑烷-2-酮III(2eq.,206mg,1.6mmol)在环丁砜(3mL)中的混合物，加入对甲苯磺酸一水合物(1eq.,152mg,0.8mmol)并将混合物在110℃搅拌3.5h。粗混合物直接通过反相制备型HPLC纯化(碱性条件)，得到米色固体(216mg的外消旋物)，其通过手性SFC纯化(Phase WhelkO1(R,R)，50x 227mm/CO₂/EtOH共溶剂20％/30℃/360mL/min)。将最纯的级分蒸发至干燥，得到(+)-3-[[6-(二氟甲基)-2-(甲氧基甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮3(第一洗脱的，54mg,0.15mmol,19％收率)和(-)-3-[[6-(二氟甲基)-2-(甲氧基甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮4(第二洗脱的，52mg,0.14mmol,18％收率)，为无色油状物。

收率：19％(3)和18％(4)

LC/MS:[M+H]⁺＝361.4

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ7.12(t,J＝53.5Hz,1H)，4.83(d,J＝0.9Hz,2H)，4.81–4.66(m,2H)，4.46(dtd,J＝8.4,7.0,5.5Hz,1H)，3.56(t,J＝8.4Hz,1H)，3.44(s,3H)，3.09(dd,J＝8.4,7.0Hz,1H)，1.65–1.42(m,2H)，1.39–1.17(m,2H)，0.86(t,J＝7.3Hz,3H)。

α-D(3,MeOH,10mg/mL,27.7℃)＝+17.2

实施例3.(+)-3-[[2-[二氘(甲氧基)甲基]-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮5和(-)-3-[[2-[二氘(甲氧基)甲基]-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮6的合成

3.1[2-[二氘(甲氧基)甲基]-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲醇X的合成

在100℃下，将2-[二氘(甲氧基)甲基]-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑IX(WO2011047860,1.0eq.,1.25g,5.24mmol)，多聚甲醛(6.0当量,943mg,31.45mmol)和盐酸(1.0eq.,2.6mL,5.24mmol)在1,4-二

烷(2.6mL)中的溶液搅拌18h。加入NaHCO₃饱和水溶液并将水层用乙酸乙酯萃取(3次)。合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO₄干燥，过滤并蒸发至干燥，得到黄色油状物。获得的粗产物通过快速色谱法Biotage Isolera Four纯化(50g KP-SNAP硅胶柱，从超过15CV的100％二氯甲烷至二氯甲烷中的10％甲醇)，得到棕色固体，其通过反相色谱法在碱性模式下纯化。将最纯的级分蒸发至干燥，得到[2-[二氘(甲氧基)甲基]-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲醇X(475mg,1.73mmol)，为白色固体。

收率：33％

LC/MS:[M+H]⁺＝270.01

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ5.56(s,1H)，4.77(s,2H)，3.44(s,3H)。

3.2(+)-3-[[2-[二氘(甲氧基)甲基]-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮6的合成

向[2-[二氘(甲氧基)甲基]-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲醇X(1.0eq.,200mg,0.74mmol)和5-丙基

唑烷-2-酮III(2.0eq.,190mg,1.47mmol)在环丁砜(0.2M,3.5mL)中的混合物，加入对甲苯磺酸一水合物(1.0eq.,140mg,0.73mmol)并将混合物在110℃搅拌16h。粗产物在碱性条件下通过反相色谱法直接纯化，得到黄色油状物(172mg)。对映异构体混合物通过手性SFC纯化(W(3μm)*EtOH 50％-庚烷50％-DEA0.1％)，得到(+)-3-[[2-[二氘(甲氧基)甲基]-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮5(75mg,0.20mmol)和(-)-3-[[2-[二氘(甲氧基)甲基]-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮6(72mg,0.19mmol)，为无色油状物。

总体的收率：52％(26.5％+25.5％)

LC/MS:[M+H]⁺＝381.11

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ5.00–4.75(m,2H)，4.51–4.40(m,1H)，3.51(s,4H)，3.04(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H)，1.76–1.66(m,1H)，1.60–1.50(m,1H)，1.48–1.29(m,2H)，0.92(t,J＝7.3Hz,3H)。

α-D(5,MeOH,10mg/mL,25℃)＝+17.6

实施例4.(+)-3-[[2-[二氘(三氘甲氧基)甲基]-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮7和(-)-3-[[2-[二氘(三氘甲氧基)甲基]-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮8的合成

4.1 2-[二氘(三氘甲氧基)甲基]-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑XII的合成

在室温下，向二氘-[6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-2-基]甲醇XI(WO2011047860,1.0eq.,3.25g,13.0mmol)在甲醇(100mL)中的溶液，加入氧化银(1.3eq.,3.9g,16.9mmol)和碘甲烷-d3(4.0eq.,3.23mL,52.0mmol)。将反应混合物在40℃下搅拌20h。然后将混合物通过硅藻土垫过滤并蒸发至干燥。加入NaHCO₃饱和水溶液并将水层用乙酸乙酯萃取(3次)。合并的有机层用MgSO₄干燥，过滤并蒸发至干燥，得到黄色油状物，其经快速色谱法Biotage Isolera Four纯化(100g KP-SNAP硅胶柱，从超过15CV的100％二氯甲烷至二氯甲烷中的5％甲醇)，得到2-[二氘(三氘甲氧基)甲基]-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑XII(2.11g,7.4mmol)，为白色固体。

收率：57％

LC/MS:[M+H]⁺＝243.08

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.90(s,1H)。

4.2[2-[二氘(三氘甲氧基)甲基]-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲醇XIII的合成

在100℃下，将2-[二氘(三氘甲氧基)甲基]-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑XII(1.0eq.,1.0g,4.1mmol)，多聚甲醛(6.0eq.,743mg,24.7mmol)和盐酸(1.0eq.,4.1mmol,2.0mL)在1,4-二

烷(2mL)中的溶液搅拌18h。加入NaHCO₃饱和水溶液并将水层用乙酸乙酯萃取(3次)。合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO₄干燥，过滤并蒸发至干燥，得到黄色油状物，其通过反相色谱法在碱性模式下纯化。将最纯的级分蒸发至干燥，得到[2-[二氘(三氘甲氧基)甲基]-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲醇XIII(560mg,1.97mmol)，为白色固体。

收率：48％

LC/MS:[M+H]⁺＝270.01

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ5.30-6.30(br s,1H)4.77(d,J＝1.3Hz,2H)。

4.3(+)-3-[[2-[二氘(三氘甲氧基)甲基]-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮8的合成

向[2-[二氘(三氘甲氧基)甲基]-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲醇XIII(1.0eq.,200mg,0.73mmol)和5-丙基

唑烷-2-酮III(2.0eq.,190mg,1.47mmol)在环丁砜(0.2M,3.5mL)中的混合物，加入对甲苯磺酸一水合物(1.0eq.,101mg,0.53mmol)并将混合物在110℃搅拌16h。粗产物在碱性条件下通过反相色谱法纯化，得到黄色油状物(175mg)。对映异构体混合物通过手性SFC纯化(W(3μm)*EtOH 50％-庚烷50％-DEA0.1％)，得到(+)-3-[[2-[二氘(三氘甲氧基)甲基]-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮7(47mg,0.12mmol)和(-)-3-[[2-[二氘(三氘甲氧基)甲基]-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-丙基-

唑烷-2-酮8(51mg,0.13mmol)，为澄清的油状物。

总体的收率：35％(17％+18％)

LC/MS:[M+H]⁺＝384.14

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ4.95(dd,J＝15.7,1.2Hz,1H)，4.79(dd,J＝15.6,1.2Hz,1H)，4.47(qd,J＝7.7,5.2Hz,1H)，3.49(t,J＝8.4Hz,1H)，3.13–2.95(m,1H)，1.70(dddd,J＝12.8,9.6,7.5,5.2Hz,1H)，1.57–1.49(m,1H)，1.48–1.28(m,2H)，0.93(t,J＝7.3Hz,3H)。

α-D(7,MeOH,10mg/mL,25℃)＝+26.9

实施例5.获得(+)-3-[[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-(2,2,2-三氟乙基)

唑烷-2-酮9和(-)-3-[[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-(2,2,2-三氟乙基)

唑烷-2-酮10的合成

5.1 4,4,4-三氟-1-硝基-丁-2-醇XIV的合成

将3,3,3-三氟丙醛(1.0eq.,5.0g,44.62mmol)，碳酸钾(1.0eq.,6.2g,44mmol)和硝基甲烷(30eq.,60.2mL,1340mmol)的混合物在50℃搅拌5h。将混合物冷却至室温，并用水和乙酸乙酯稀释。用乙酸乙酯萃取水层(3次)和将合并的有机层用水洗涤(2次)，用MgSO₄干燥，过滤并蒸发至干燥。粗产物通过快速色谱法Biotage Isolera Four纯化(100g KP-SNAP硅胶柱，梯度:超过10CV的100％二氯甲烷)。将最纯的级分蒸发至干燥，得到4,4,4-三氟-1-硝基-丁-2-醇XIV(3.8g,22mmol)，为无色油状物。

收率：49％

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ4.73(dddd,J＝12.7,7.6,5.0,3.8Hz,1H)，4.58–4.43(m,2H)，3.01(d,J＝5.1Hz,1H)，2.60–2.28(m,2H)。

5.2 1-氨基-4,4,4-三氟-丁-2-醇XV的合成

将4,4,4-三氟-1-硝基-丁-2-醇XIV(1.0eq.,4.8g,28mmol)在乙醇(140mL)中的混合物使用装有阮内镍柱的H-cube反应器进行氢化(流动1mL/min,50℃,50巴)。将混合物蒸发至干燥，得到1-氨基-4,4,4-三氟-丁-2-醇XV(2.5g,17mmol)，为无色油状物。

收率：63％

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ3.89(tt,J＝8.0,3.9Hz,1H)，2.86(dd,J＝12.8,3.5Hz,1H)，2.62(dd,J＝12.8,8.3Hz,1H)，2.35–2.07(m,2H)。

5.3 5-(2,2,2-三氟乙基)

唑烷-2-酮XVI的合成

向1-氨基-4,4,4-三氟-丁-2-醇XV(1.0eq.,2.5g,17mmol)和1,1'-羰基二咪唑(1.0eq.,2.9g,18mmol)在THF(35mL)中的混合物加入氢化钠(0.1eq.,42mg,1.75mmol)并将混合物在25℃搅拌16h。加入几滴水(NaH中和)和将混合物直接蒸发至干燥并在碱性模式下通过反相色谱法纯化，得到5-(2,2,2-三氟乙基)

唑烷-2-酮XVI(2.25g,13.2mmol)，为白色固体。

收率：75％

LC/MS:[M+H]⁺＝170.11

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ7.61(s,1H)，4.81(qd,J＝7.6,4.9Hz,1H)，3.62(t,J＝8.7Hz,1H)，3.20(dd,J＝8.9,7.2Hz,1H)，2.89–2.68(m,2H)。

5.4(+)-3-[[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-(2,2,2-三氟乙基)

唑烷-2-酮10的合成

向[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲醇V(1.0eq.,200mg,0.75mmol)和5-(2,2,2-三氟乙基)

唑烷-2-酮XVI(1.8eq.,227mg,1.34mmol)在环丁砜(0.5M,3.7mL)中的混合物，加入对甲苯磺酸一水合物(1.0eq.,142mg,0.75mmol)并将混合物在110℃搅拌3h 30。将混合物在碱性条件下通过反相色谱法直接纯化，得到黄色油状物(250mg)。获得的对映异构体混合物通过手性制备型HPLC纯化(AS*EtOH50％-庚烷50％-DEA 0.1％)，得到(+)-3-[[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-(2,2,2-三氟乙基)

唑烷-2-酮9(29mg,0.07mmol)和(-)-3-[[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-(2,2,2-三氟乙基)

唑烷-2-酮10(30mg,0.07mmol)。

总体的收率：19％(9.3％+9.6％)

LC/MS:[M+H]⁺＝419.05

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ5.02–4.66(m,5H)，3.66(t,J＝8.7Hz,1H)，3.52(s,3H)，3.33–3.17(m,1H)，2.76–2.58(m,1H)，2.51–2.35(m,1H)。

α-D(9,MeOH,10mg/mL,25℃)＝+13.0

(+)-3-[[6-(二氟甲基)-2-(甲氧基甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-(2,2,2-三氟乙基)

唑烷-2-酮11和(-)-3-[[6-(二氟甲基)-2-(甲氧基甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-(2,2,2-三氟乙基)

唑烷-2-酮12根据从5-(2,2,2-三氟乙基)

唑烷-2-酮XVI和[6-(二氟甲基)-2-(甲氧基甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲醇VIII开始的相同的操作合成。

总体的收率：14％(7.8％+6.2％)

LC/MS:[M+H]⁺＝401.06

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.14(t,J＝53.5Hz,1H)，4.90–4.60(m,5H)，3.67(t,J＝8.6Hz,1H)，3.43(s,3H)，3.25(dd,J＝8.6,7.0Hz,1H)，2.91–2.63(m,2H)。

α-D(11,MeOH,10mg/mL,25℃)＝+3.6

实施例6.得到(-)-3-[[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-(2,2,2-三氟乙基)

唑烷-2-酮13和(+)-3-[[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-(2,2,2-三氟乙基)

唑烷-2-酮14的合成

6.1 4,4-二氟-1-硝基-戊-2-醇XVII的合成

在0℃下，向3,3-二氟丁-1-醇(1.0eq.,1.5g,9.8mmol)在二氯甲烷(50mL)中的溶液加入Dess-Martin高碘烷(1.2eq.,5.1g,12mmol)并将反应混合物在0℃搅拌2h。然后将粗混合物冷却至-78℃，过滤并且所得固体用冷二氯甲烷洗涤(-78℃)。向在室温下加热的获得的滤液中加入碳酸钾(15.0eq.,21g,150mmol)和硝基甲烷(30.0eq.,18g,290mmol)并将混合物在45℃下搅拌2h。将粗混合物在硅藻土上过滤并将获得的滤液在30℃下真空浓缩，得到黄色胶状物(gum)。得到的胶状物通过快速色谱法Biotage Isolera Four纯化(100gKP-SNAP硅胶柱，梯度为超过6CV的100％二氯甲烷然后超过10CV的0％到10％的二氯甲烷中的甲醇)，得到4,4-二氟-1-硝基-戊-2-醇XVII(678mg,4.0mmol)，为黄色油状物。

收率：41％

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ4.71(tt,J＝7.9,4.0Hz,1H)，4.61–4.36(m,2H)，2.79(dd,J＝4.6,1.7Hz,1H)，2.32–2.03(m,2H)，1.71(t,J＝18.9Hz,3H)。

6.2 1-氨基-4,4-二氟-戊-2-醇XVIII的合成

将4,4-二氟-1-硝基-戊-2-醇XVII(1.0eq.,1g,5.91mmol)在乙醇(40mL)中的溶液在装有10％/Pd柱(cartridge)的H-Cube中氢化(流动1mL/min,50℃,50巴)。将粗混合物蒸发至干燥，得到1-氨基-4,4-二氟-戊-2-醇XVIII(760mg,4.9mmol)，为无色油状物。

收率：83％

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ3.95–3.76(m,1H)，2.88(dd,J＝12.7,3.6Hz,1H)，2.58(dd,J＝12.7,8.2Hz,1H)，2.16–1.88(m,2H)，1.69(t,J＝18.9Hz,3H)。

6.3 5-(2,2-二氟丙基)

唑烷-2-酮XIX的合成

在室温下，向1-氨基-4,4-二氟-戊-2-醇XVIII(1.0eq.,760mg,5.46mmol)在THF(18mL)中的溶液，加入1,1'-羰基二咪唑(1.0eq.,876mg,5.30mmol)和氢化钠(0.1eq.,21mg,0.53mmol)。反应在室温下搅拌16h。加入几滴水至溶液(NaH中和)并且将混合物蒸发至干燥。粗产物直接地通过快速色谱法Biotage Isolera Four纯化(100g KP-SNAP硅胶柱，梯度为超过10CV的二氯甲烷中0％至10％的甲醇，然后超过4CV的10％甲醇)，得到5-(2,2-二氟丙基)

唑烷-2-酮XIX(675mg,4.08mmol)，为米色固体。

收率：75％

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ5.34(d,J＝37.0Hz,1H)，4.96–4.85(m,1H)，3.78(td,J＝8.5,8.0,0.9Hz,1H)，3.37(t,J＝8.2Hz,1H)，2.56–2.18(m,2H)，1.71(t,J＝18.9Hz,3H)。

6.4(-)-5-(2,2-二氟丙基)-3-[[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]

唑烷-2-酮13和(+)-5-(2,2-二氟丙基)-3-[[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]

唑烷-2-酮14的合成

向[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲醇V(1.0eq.,150mg,0.56mmol)和5-(2,2-二氟丙基)

唑烷-2-酮XIX(1.5eq.,139mg,0.84mmol)在环丁砜(3mL)中的混合物，加入对甲苯磺酸一水合物(1.0eq.,106mg,0.56mmol)。将混合物在100℃下搅拌16h。混合物通过碱性模式的反相色谱法直接纯化，得到黄色油状物。对映异构体混合物通过手性SFC纯化(AS*EtOH 50％-庚烷50％-DEA0.1％)，得到(-)-5-(2,2-二氟丙基)-3-[[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]

唑烷-2-酮13(19.1mg,0.05mmol)和(+)-5-(2,2-二氟丙基)-3-[[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]

唑烷-2-酮14(19.9mg,0.05mmol)，为白色固体。

总体的收率：16.7％(8.2％+8.5％)

LC/MS:[M+H]⁺＝415.02

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ4.90–4.55(m,5H)，3.63(t,J＝8.4Hz,1H)，3.45(s,3H)，3.22(t,J＝8.0Hz,1H)，2.42–2.26(m,2H)，1.63(t,J＝19.3Hz,3H)。

α-D(13,MeOH,10mg/mL,28.6℃)＝-13.3

3-[[6-(二氟甲基)-2-(甲氧基甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-(2,2-二氟丙基)

唑烷-2-酮15和3-[[6-(二氟甲基)-2-(甲氧基甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基]-5-(2,2-二氟丙基)

唑烷-2-酮16根据从5-(2,2-二氟丙基)

唑烷-2-酮XIX和[6-(二氟甲基)-2-(甲氧基甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲醇VIII开始的相同的操作合成。

总体的收率：8％(4％+4％)

LC/MS:[M+H]⁺＝397.04

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.13(t,J＝53.5Hz,1H)，4.89–4.60(m,5H)，3.64(t,J＝8.5Hz,1H)，3.43(s,3H)，3.21(t,J＝8.0Hz,1H)，2.41–2.17(m,2H)，1.62(t,J＝19.3Hz,3H)。

手性色谱(SFC,phase W,CO₂-MeOH 15％,3ml/min):峰1(15):6.64min和峰2(16):7.72min。

表(I)表示该化合物的IUPAC名称(或从Accelerys Draw 4.0生成的名称)，在质谱中观察到的离子峰和¹H NMR描述。

表I：实施例化合物的物理表征。

实施例7.与SV2A和SV2C的结合测定。

人SV2A和SV2C蛋白在人胚胎肾脏(HEK)细胞中表达。如Gillard等人(Eur.J.Pharmacol.2006，536，102-108)中所述制备HEK SV2A和HEK SV2C膜制备物。为了测量未标记化合物的亲和力，进行竞争实验如下：将表达SV2蛋白的膜(每次测定5至15μg蛋白)在37℃下与0.2ml的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中的[3H]-2-[4-(3-叠氮基苯基)-2-氧代-1-吡咯烷基]丁酰胺(5nM)和/或[3H]-4R-(2-氯-2,2-二氟乙基)-1-{[2-(甲氧基甲基)-6-(三氟甲基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-5-基]甲基}吡咯烷-2-酮(25nM)孵育60分钟，所述缓冲液含有2mM MgCl₂、0.1％二甲基亚砜和十种浓度递增的未标记测试化合物(0.1nM至10μM)。孵育结束时，通过预先浸泡在0.1％聚乙烯亚胺中的GF/C玻璃纤维过滤器(filter)进行快速过滤，回收结合膜的放射性配体。用冰冷的50mM Tris HCl缓冲液(pH7.4)的测定体积的至少4倍洗涤膜。干燥过滤器，并通过液体闪烁测定放射性。整个过滤步骤不超过10秒。根据Cheng和Prusoff(Biochem.Pharmacol.1973，22(23)，3099-3108)将测得的亲和力pIC₅₀值针对pKi进行校正。

根据本发明的式(I)的化合物典型地显示至少6.5的pKi SV2A值和至少6.0的pKiSV2C值。

实施例8.癫痫发作模型。

在所有实验中均使用重22-32g的雄性NMRI小鼠(德国查尔斯河)。将动物保持在12/12-h光/暗周期，在上午6:00开灯，并圈养在保持在20-21℃的温度和约40％的湿度下。每笼每组圈养10只小鼠(III型)。在随机分配给由10只小鼠组成的每组的实验组之前，所有动物都可以自由获得标准的颗粒食物和水。所有动物实验均按照国家动物实验规则进行，并按照欧盟理事会指令2010/63/EU的指南进行。当地的伦理委员会批准了实验方案。

8.1 6Hz癫痫发作模型

根据先前描述的方案(Kaminski等人，Epilepsia(2004)，45，864-867)进行6Hz模型。简而言之，通过恒流装置(ECT单元57800；Ugo Basile，Comerio，意大利)递送角膜刺激(44mA，0.2ms-持续时间，6Hz的单极性矩形脉冲达3s)。在电刺激之前，在眼睛上放置一滴0.4％的盐酸奥布卡因(Unicaine，Thea，法国)。在刺激过程中，对小鼠手动施加约束，电流施加后立即将小鼠释放到观察笼中(38x 26x 14cm)。癫痫发作之前通常是短期(约2-3s)强烈运动不安(狂奔和跳跃)。然后，动物表现出与以后肢站立、前肢自动运动和阵挛、触须抽搐(twitching of the vibrissae)和Strub尾有关的“惊呆”姿势。癫痫发作结束时，动物恢复其正常的探索行为。实验终点是针对癫痫发作的保护。如果动物在刺激后7秒钟内恢复其正常的探索行为，则认为该动物受到了保护。

在单次IP给药后，确定测试化合物的体内活性典型地为0.05mg/kg至20mg/kg。

8.2戊四唑(PTZ)癫痫发作模型

以先前确定的89mg/kg CD₉₇剂量使用戊四唑；在97％的小鼠中导致所有四肢阵挛性惊厥(clonic convulsions)的惊厥性剂量(Klitgaard等，Eur.J.Pharmacol.(1998)，353，191-206)。戊四唑注射后，立即将小鼠单独置于Perspex笼中，观察60分钟内所有四肢是否存在阵挛性惊厥和强直性后肢伸展。

在单次IP给药后，确定测试化合物的体内活性典型地为0.5mg/kg至30mg/kg。

实施例9.阿扎莫林测定

冷冻保存的人类肝细胞(20个供体混合(pool)，来自Celsis/IVT/Bioreclamation的BSU批次)根据提供者信息被解冻。生存力(锥虫蓝排斥)高于75％。预孵育(在2x10⁶肝细胞/mL的250μL肝细胞悬浮液)如下进行：采用含有2mM谷氨酰胺和15mM Hepes的William培养基，在+37℃的48孔板中，在培养箱(5％CO₂)中，在缓慢搅拌(振动搅拌器，Titramax 100，约300rpm)下，在30min期间内进行。预孵育后，通过向肝细胞中加入250μL含UCB化合物(1μM)或咪达唑仑(阳性对照)、有或没有阿扎莫林(6μM–特定CYP3A4/5抑制剂)的培养基(参见上述组成)开始孵育。孵育物中的UCB化合物和阿扎莫林的终浓度分别为0.5μM和3μM。通过2次进出抽吸(in-out pipetting)将细胞悬浮液快速均质化。孵育0、30、60、120、180和240分钟后，通过将50μl孵育物转移到含有50μL冰冷乙腈(以酮康唑1μM为内标)的96孔板中的适当孔中来终止反应。在每次采样之前，将细胞孵育物通过2次进出抽吸重新均质化。

一旦孵育结束后，将96孔板在+4℃下以约3700rpm离心15分钟。将50μL上清液转移至其他深孔板的孔中，并向其中加入150μL H₂O Millipore。通过微型UPLC/HR-MS分析这些样品的母体消失(parent disappearance)和代谢物形成监测。

通过使用下式，在阿扎莫林存在和不存在的情况下，对每个化合物从CLint(基于母体药物消失)之间的比率来计算CYP3A4/5的贡献(其被认为是被CYP3A4/5代谢的分数(f_m，CYP3A4/5))。

测试化合物被CYP3A4/5代谢的分数(f_m，CYP3A4/5)典型地为0％至40％。