CN110869354A - 脂肪酸衍生物及其用途 - Google Patents

Abstract

本公开涉及脂肪酸衍生物、包含该脂肪酸衍生物的药物组合物和使用该脂肪酸衍生物例如治疗受试者的炎症、慢性瘙痒、慢性疼痛、自体免疫疾病、动脉粥样硬化、皮肤病症、关节炎、神经退行性疾病或精神疾病的方法。在一些实施方式中，脂肪酸衍生物是具有根据下式的结构的化合物或其立体异构体、互变异构体或可药用盐：

其中X的长度为1‑16个碳，Z是长度为1‑16个碳的脂族基团或不存在，Y选自：

R¹、R²和R³独立地是氢或低级烷基、R⁴是低级烷基、羟基、羧基或胺，R⁵是氢、低级烷基或卤化物，R⁶是羟基或取代巯基，并且每个R⁷独立地是氢或氟化物或不存在，并且相邻的碳形成炔。

Description

脂肪酸衍生物及其用途

相关申请

本专利申请要求2017年7月7日提交的美国临时专利申请第62/529,846号的优先权，该申请通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开涉及脂肪酸衍生物及使用其的方法，例如，用于治疗受试者的炎症、瘙痒、疼痛、自体免疫和/或动脉粥样硬化。

背景技术

诸如炎症、瘙痒、疼痛、自体免疫、屏障功能障碍、退化(degeneration)和动脉粥样硬化之类的生物过程呈现了医学领域中持续存在的问题，其部分在于患者治疗和评估方面。尽管有针对这些疾病和病症的治疗，但它们往往达不到已证明的需要。因此，需要能够在治疗患有这些疾病或病症中的一种或多种的受试者的方法中使用的新药剂。

发明概述

本公开涉及脂肪酸衍生物，包含该脂肪酸衍生物的药物组合物，和使用该脂肪酸衍生物治疗例如受试者的炎症、瘙痒、疼痛、自体免疫、动脉粥样硬化和/或皮肤病症的方法。

在一些实施方式中，所公开的脂肪酸衍生物是不稳定的内源生物活性化合物的衍生物，其被设计为保持相应的内源生物活性化合物的作用，同时使稳定性，活性和对受试者的递送容易性最大化。

在一些实施方式中，脂肪酸衍生物是具有根据下式的结构的化合物或其立体异构体、互变异构体或可药用盐：

其中X是长度为1-16个碳的脂族基团，Z是长度为1-16个碳的脂族基团或不存在，Y选自以下中的任一个：

R¹、R²和R³独立地是氢或低级烷基，R⁴是低级烷基、羟基、羧基或胺，R⁵是氢、低级烷基或卤化物，R⁶是羟基或取代巯基，并且每个R⁷独立地是氢或氟化物或者不存在，并且相邻的碳形成炔。在一些实施方式中，X和Z独立地是炔基或者取代或未取代的烯基。在一些实施方式中，X和Z独立地是低级烯基，并且包含一个或多个氟烯烃或二氟烯烃部分。

在一些实施方式中，提供了一种使用所公开的脂肪酸衍生物治疗受试者的疾病或病症的方法。所述方法包括对患有或怀疑患有所述疾病或病症的受试者施用治疗有效量的包含所公开的脂肪酸衍生物的药物组合物。可应用该方法的示例性疾病或病症包括炎症、慢性瘙痒、慢性疼痛、自体免疫疾病、动脉粥样硬化、皮肤病症、关节炎、神经退行性疾病或精神疾病。

在一些实施方式中，提供了一种通过测量所公开的脂肪酸衍生物在来自受试者的生物样品中的水平来诊断受试者的疾病或病症的方法。所述方法包括从受试者获得生物样品，测量本文所提供的化合物1-16中的任一个在该生物样品中的水平；并且如果与正常对照相比，在生物样品中检测到升高水平的该化合物，则将该受试者诊断为患有疾病或病症的受试者。可应用该方法的示例性疾病或病症包括炎症、慢性瘙痒、慢性疼痛、自体免疫疾病和动脉粥样硬化。

还提供了药物组合物的实施方式，其包括如本文公开的脂肪酸衍生物和可药用载体。药物组合物可被配制为，例如，用于局部、肠胃外或口服施用。

通过以下参考附图进行的几个实施方式的详细描述，本公开的前述和其它特征及优点将变得更明显。

附图说明

图1.游离羟基-环氧基-和酮基-环氧基-十八碳烯酸在银屑病皮肤损伤(尤其是瘙痒皮肤)中升高。显示了银屑病病变和对照人类皮肤中游离羟基-环氧基-和酮基-环氧基-十八碳烯酸的浓度。所测定的化合物为：

11-羟基(H)-12,13-反式-环氧基-(E)-十八碳烯酸(11H-12,13E-LA，化合物1)，

11-羟基(H)-9,10-反式-环氧基-(E)-十八碳烯酸(11H-9,10E-LA，化合物3)，

11-酮基(K)-9,10-反式-环氧基-(E)-十八碳烯酸(11K-9,10E-LA，化合物4)，

9-羟基(H)-12,13-反式-环氧基-(E)-十八碳烯酸(9H-12,13E-LA，化合物5)，

9-酮基(K)-12,13-反式-环氧基-(E)-十八碳烯酸(9K-12,13E-LA，化合物6)，和

13-羟基(H)-9,10-反式-环氧基-(E)-十八碳烯酸(13H-9,10E-LA，化合物7)。

统计学分析使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test)进行。对于对照皮肤、银屑病病变(无瘙痒)和银屑病皮肤(瘙痒)，N分别为7、3和5。

图2A-2D.成年大鼠背根神经节(DRG)神经元的降血钙素基因相关肽(CGRP)释放的区域选择性增多(盲法分析)。从成年DRG神经元培养物测量的离体CGRP释放。所测定的化合物包括：11H-12,13E-LA(化合物1)、11H-9,10E-LA(化合物3)、11K-9,10E-LA(化合物4)、9H-12,13E-LA(化合物5)、9K-12,13E-LA(化合物6)、13H-9,10E-LA(化合物7)、11-酮基(K)-12,13-反式-环氧基-(E)-十八碳烯酸(11K-12,13E-LA、化合物2)和13-酮基(K)-9,10-反式-环氧基-(E)-十八碳烯酸(13K-9,10E-LA，化合物8)。在1μm浓度下，前列腺素E2(PGE2)、11H-12,13E-LA(图2A和2C)和11H-9,10E-LA(图2B和2C)显著增加了低-pH-诱发的和辣椒素-诱发的CGRP释放，13H-9,10E-LA(图2A和2C)显著增加低pH-诱发的CGRP释放，但对辣椒素-诱发的释放没有影响(图2D)。对这两种脂质而言是独特的且共有的3-羟基-Z-戊烯基-E-环氧部分是被提议的药效部分，其介导11H-12,13E-LA和11H-9,10E-LA的影响。*表示p<0.05，使用Tukey事后检验(Tukey’s post hoc test)进行ANOVA。CGRP，降血钙素基因相关肽。

图3A和3B.在皮内后爪注射所公开的脂肪酸衍生物之后的疼痛-相关的行为反应(盲法实验)。(图3A)与介质(vehicle)对照相比，11-羟基-12,13-环氧基-十八碳烯酸和PGE2减少了C-纤维缩回潜伏期(C-fiber withdrawal latency)反应。(图3B)PGE2增加了Aδ纤维刺激之后的缩回反应的比例。对于介质、11-羟基-12,13-环氧基-十八碳烯酸和PGE2，N分别为12、11、10。

图4A-4C.在皮内注射所公开的脂肪酸衍生物之后的瘙痒-相关抓挠反应(盲法分析)。(图4A)皮内注射所公开的脂肪酸衍生物(100μg)显示对9K-12,13E-LA和对9K-12,13E-LA+13K-9,10E-LA(各自100ug)的混合物的抓挠反应增加，但对单独的13K-9,10E-LA无反应。对于介质、9K-12,13E-LA、13K-9,10E-LA和混合物，N分别为8、7、6、8。(图4B)9K-12,13E-LA诱发的抓挠反应在统计学上大于介质，并且在10-15分钟时达到最大值，随后逐渐降低。(图4C)组胺(50μg)诱发的抓挠反应在5分钟之内显著大于介质，在5-10分钟内达到最大值，随后急剧降低。对于组胺和对照，N＝6。

图5A-5D.饮食引起的血浆11H-12,13E-LA减少与临床疼痛减轻相关。图5A示出了为期12周的饮食性LA减少使得患有慢性每日头痛的患者的11H-12,13E-LA、13H-9,10E-LA和总羟基-环氧基-十八碳烯酸的血浆浓度降低(n＝44)。图5B-5D示出了饮食引起的11H-12,13E-LA减少与以下相关：每天的头痛小时数减少(n＝40)，每月的头痛天数减少(n＝44)，和头痛影响减少(n＝44)。图表包括基于控制每个结果和基线处脂肪酸衍生物浓度的泊松回归模型(Poisson regression model)的头痛效果(y-轴)与12周时的脂肪酸衍生物浓度(x-轴)。图5A中的虚线表示定量极限。图5B-5D中的95％置信区间以灰色阴影示出。

图6.鼠背根神经节感觉神经元中对所公开的内源脂肪酸衍生物及其稳定类似物的Ca²⁺响应(盲法分析)。在15种化合物的盲选(72-273细胞/化合物)中，内源脂质及其稳定类似物(1μm)在小鼠背根神经节感觉神经元中引起Ca²⁺瞬变。所测定的化合物包括：13H-9,10E-LA(化合物7)、2,2DM-13H-9,10E-LA(化合物53)、13-甲基-13H-9,10E-LA(化合物56)、2,2DM-13-甲基-13H-9,10E-LA(化合物55)、13K-9,10E-LA(化合物8)、11H-12,13E-LA(化合物1)、2,2DM-11H-12,13E-LA(化合物17)、11-甲基-11H-12,13E-LA(化合物26)、11K-12,13E-LA(化合物2)、9H-12,13E-LA(化合物5)、9-甲基-9H-12,13E-LA(化合物46)、11H-9,10E-LA(化合物3)和11-甲基-11H-9,10E-LA(化合物36)。PGE2，阳性对照(919细胞)。

图7A和7B.三叉神经感觉神经元对所公开的内源脂肪酸衍生物的Ca²⁺响应(盲法分析)。(图7A)在4种化合物的盲选中，11-羟基环氧化物和11-酮基-环氧化物在小鼠三叉神经感觉神经元中引起浓度依赖性Ca²⁺瞬变。浓度-反应曲线显示了响应于11H-12,13E-LA和11H-9,10E-LA的细胞数量增加(图7B)。

图8.皮内注射所公开的脂肪酸衍生物之后的瘙痒-相关抓挠反应(盲法分析)。皮内注射所公开的脂肪酸衍生物(100μg)在野生型和肥大细胞敲除小鼠中均显示对9K-12,13E-LA的抓挠反应增加。每组N＝5-8。

图9.人THP-1细胞中的盲法ApoA1胆固醇流出物筛选(efflux screen)。9-羟基-十八碳烯酸增多，并且11H-12,13E-LA和11K-12,13E-LA(50μm)抑制了载脂蛋白A1(ApoA1)介导的单核细胞胆固醇流出物。

图10.新鲜分离的人PBMC中的盲法ApoA1胆固醇流出物筛选。11H-12,13E-LA和11K-12,13E-LA(50μm)抑制了ApoA1介导的单核细胞胆固醇流出物。

图11A-11D.11H-12,13E-LA和11K-12,13E-LA(100μm)对人PBMC细胞因子分泌的影响(通过ELISA测量)(盲法分析)。用11H-12,13E-LA和11K-12,13E-LA温育抑制了天然脂多糖(LPS)引起的(图11A)和天然的(图11B)肿瘤坏死因子(TNF)-α分泌，但对白介素(IL)-1没有影响(图11C和11D)。

图12A和12B.在酯化条件下温育之后从13-羟基-9,10-反式-环氧基-(11E)-十八碳烯酸的LC-MS分析获得的保留时间和质谱图。

图13A-13C.在酯化条件下温育之前(图13C)和之后(图13A和13B)从9,10,13-三羟基-(11E)-十八碳烯酸的LC-MS分析获得的保留时间和质谱图。

图14A和14B.在酯化条件下温育之后从2,2-二甲基-13-羟基-9,10-反式-环氧基-(11E)-十八碳烯酸的LC-MS分析获得的保留时间和质谱图。

图15.在酯化条件下温育之后从4-羟基-DHA和4-羟基-DHA内酯的LS-MS分析获得的保留时间和质谱图。

图16.在酯化条件下温育之后从2-甲基-4-羟基-DHA和2-甲基-4-羟基-DHA内酯的LS-MS分析获得的保留时间和质谱图。

图17.在酯化条件下温育之后从2,2-二甲基-4-羟基-DHA的LS-MS分析获得的保留时间和质谱图。

图18.内源脂质和新化合物激活原代鼠感觉神经元。Y-轴示出了响应于内源介体(mediator)，稳定类似物和包含其拟议的药效团的小分子的鼠背根神经节感觉神经元的百分比。所有化合物均以1μm进行测试，并将反应标准化为氯化钾(KCL)。误差线表示平均值的标准偏差。对于每种化合物，测试了来自≥5只小鼠的≥300KCl-阳性细胞。

图19A-19D.通过局部施用亚油酸氧化衍生物的2,2-二甲基稳定类似物以及标记的游离酸可选择性操纵皮肤游离酸和酯化脂质池(pool)。向小鼠皮肤局部施用氧化亚麻酸的2,2-二甲基衍生物[2,2-二甲基-13-羟基-9,10-环氧基-十八碳烯酸]选择性增加了仅在游离酸池(acid pool)中的2,2-二甲基-13,9,10-三羟基-十八碳烯酸衍生物，而基本不掺入酯化脂质中。这可通过游离酸池(图19A)和总(游离+酯化)脂质池(图19B)中2,2-二甲基-13,9,10-三羟基-亚麻酸酯的峰面积相当来证实。相反，与游离池(图19C)相比，在总池(图19D)中局部施用d5标记的13-羟基-9,10-环氧基-十八碳烯酸的游离酸使得其d5-13,9,10-三羟基-十八碳烯酸衍生物显著增加。

发明详述

本公开涉及一个脂肪酸衍生物家族，其显示在炎症，疼痛感受/瘙痒感受敏化，表皮屏障完整性，脂蛋白功能和动脉粥样硬化模型中具有体内和体外活性。因此，所公开的化合物调节多个高度杠杆化(highly leveraged)的细胞过程。所鉴定的脂肪酸衍生物中的几种是内源存在的。还提供了其它衍生物，它们具有已鉴定的内源化合物的共同功能部分，并被修饰以保持或拮抗相应内源生物活性化合物的作用，同时使稳定性、活性和对受试者的递送容易性最大化。

I.术语

提供以下术语和缩写的解释以更好地描述本公开和指导本领域技术人员实践本公开。如本文所用，除非在上下文中另有明确说明，“包括/包含”表示“含有”，并且“一种”或“一个”或“所述/该”的类似形式包括复数指代物。除非在上下文中另有明确说明，否则术语“或”是指所述可选要素中的单个要素或者2种或更多种要素的组合。

除非另有解释，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有本公开所属领域技术人员普遍理解的含义。尽管在本公开的实践或测试中可使用类似或等同于本文中所述的方法和材料，但在下文中描述了合适的方法和材料。所述材料、方法和实例仅为说明性的，并非旨在限制。从以下详细的说明书和权利要求可明显得知本公开的其他特征。

尽管为方便呈现以特定的相继次序描述了一些所公开的方法的步骤，但是应理解，除非在下文中以特定语言要求了特定的顺序，否则这种描述方式包含重新排列。例如，在某些情况下，顺序描述的步骤可能会重新排列或同时执行。此外，说明书有时使用诸如“产生”和“提供”之类的术语来描述所公开的方法。这些术语是对实际执行的步骤的高度抽象。对应于这些术语的实际步骤将根据特定实践而变化，并且本领域的普通技术人员很容易辨别。

除非另有说明，否则在说明书或权利要求书中使用的所有表示组分、分子量、百分比、温度、时间等的数量的数字应理解为由术语“约”修饰。因此，除非另有隐含或明确的说明，所列出的数字参数是近似值，其可以取决于寻求的所需特性和/或在标准测试条件/方法下的检测极限。当直接和明确地区分实施方式与所讨论的现有技术时，除非阐述了术语“约“，否则实施方式的编号不是近似值。并非本文列举的所有替代方案都是等同的。

本文公开的化合物实施方式可以包含一个或多个不对称要素，例如立体中心，立体轴等，例如不对称碳原子，因此化学缀合物可以不同的立体异构体形式存在。对于具有2种或更多种不对称要素的化合物实施方式，这些化合物实施方式还可为非对映异构体的混合物。对于具有不对称中心的化合物实施方式，除非上下文另有明确说明或者提供了排除异构体的表达陈述，否则所有纯形式的光学异构体及其混合物均被相应的通式涵盖。在这种情况下，可通过本领域技术人员已知的方法获得单个对映异构体，即光学活性形式，诸如不对称合成，从光学纯的前体合成或通过外消旋体的拆分。外消旋体的拆分也可以通过例如常规方法进行，诸如在拆分剂的存在下结晶或者使用例如手性HPLC柱的色谱。本文中考虑了所有异构体形式，无论用于获得它们的方法如何。

施用：通过任何有效途径对受试者提供或给予药剂，例如，所公开的脂肪酸衍生物。示例性施用途径包括但不限于口服，注射(诸如皮下、肌内、皮内、腹膜内和静脉内)、舌下、直肠、透皮(例如、局部)、鼻内、阴道和吸入途径。

化合物的“施用”和“施用”化合物应理解为提供如本文所述的化合物，化合物的前药或药物组合物。化合物或组合物可由另一个人施用给受试者(例如，静脉内)或者其可由受试者自己施用(例如，片剂)。

烷基：具有饱和碳链的烃基团。链可为环状、支链或非支链的。烷基基团的例子包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基和癸基。术语低级烷基表示包含1-10个碳原子的链。术语烯基和炔基分别指具有包含一个或多个双键或三键的碳链的烃基团。

脂族基团(Aliphatic)：基本上基于烃的化合物或其基团(例如，C₆H₁₃，例如己烷基)，包括烷烃、烯烃、炔烃，包括其环状形式，并且进一步包括直链和支链排列以及所有立体异构体和位置异构体。除非另有明确说明，脂族基团包含1-25个碳原子；例如，1-15、1-10、1-6或1-4个碳原子。术语"低级脂族基团"是指包含1-10个碳原子的脂族基团。脂族基团链可为取代或未取代的。除非明确指出是“未取代脂族基团”，脂族基团可为未取代的或取代。脂族基团可用一个或多个取代基取代(对于脂族基团链来说，每个亚甲基碳上至多有2种取代基，或对于脂族基团链中的-C＝C-双键中的每个碳来说，至多一个取代基，或者对于末端次甲基的碳来说，至多一个取代基)。示例性的取代基包括但不限于烷基、烯基、炔基、卤代烯基、烷氧基、烷基氨基、烷硫基、酰基、醛、酰胺、氨基、氨基烷基、芳基、芳基烷基、羧基、氰基、环烷基、二烷基氨基、卤代、卤代脂族基团、杂脂族基团、杂芳基、杂环脂族基团、羟基、氧代、磺酰胺、巯基、硫代烷氧基或其它官能团。

胺或氨基：式-NRR'的基团，其中R和R'可独立地是氢或烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、环烷基、卤代烷基、卤代烯基或杂环烷基。例如，“烷基氨基”或“烷基化氨基”是指-NRR'，其中R或R’中的至少一个是烷基。

氨基烷基：其中至少一个氢原子被氨基替换的如上定义的烷基(例如，-CH₂-NH₂)。

芳基：具有单个环(例如苯基)或多个缩合环(例如萘基或蒽基)的一价不饱和芳族碳环基团，其可任选地为未取代或取代的。杂芳基是在芳族基团的环内结合了至少一个杂原子的芳族基团。杂原子的实例包括但不限于氮、氧、硫和磷。杂芳基包括但不限于吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、噻吩基、呋喃基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、喹喔啉基等。芳基或杂芳基可由一个或多个包括但不限于以下的基团取代：烷基、炔基、烯基、芳基、卤化物、硝基、氨基、酯、酮、醛、羟基、羧酸或烷氧基，或所述芳基或杂芳基可以是未取代的。

动脉粥样硬化(Atherosclerosis)：血管随时间的进行性变窄和硬化。动脉粥样硬化是动脉硬化的常见形式，其中在大中型动脉的内膜和内层介质中形成了含有胆固醇、类脂物质和噬脂细胞的淡黄色斑块沉积物(动脉粥样化)。动脉粥样硬化的治疗包括逆转或减慢动脉粥样硬化的发展，例如通过动脉粥样硬化病变的存在和/或该疾病的功能体征来衡量，例如通过体征(例如外周毛细血管再充盈)，症状(例如胸痛和间歇性跛行)或实验室证据(例如通过EKG，血管造影或其他成像技术获得的证据)测量的心血管功能改善。“诊断动脉粥样硬化”表示确定受试者是否患有动脉粥样硬化，确定受试者中动脉粥样硬化的预后和/或确定施用于受试者的治疗方案是否有效治疗或预防受试者中的动脉粥样硬化。

在一些实施方案中，本文公开的脂肪酸衍生物可用于治疗或预防受试者的动脉粥样硬化。

自体免疫疾病：免疫系统对内源抗原产生免疫反应(例如B细胞或T细胞反应)结果损伤组织的疾病。例如，类风湿关节炎是一种自体免疫疾病，以下疾病也是：桥本甲状腺炎、恶性贫血、艾迪生氏病、I型糖尿病、系统性红斑狼疮、皮肌炎、干燥综合征、皮肌炎、红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、雷特氏综合征和格雷夫氏病等。

在一些实施方案中，本文公开的脂肪酸衍生物可用于治疗或预防受试者的自体免疫疾病。

羧基：基团-COO^-或-COOH。羧基可形成羧酸。

对照：用于与实验样品比较的样品或标准物。在一些实施方式中，对照是从健康患者获得的样品。在其它实施方式中，对照是从被诊断患有诸如以下的疾病或病症的患者获得的样品：诸如炎症、瘙痒、疼痛、自体免疫和/或动脉硬化。在一些实施方式中，对照是从被诊断患有疾病或病症(诸如炎症、瘙痒、疼痛、自体免疫和/或动脉硬化)的患者获得的样品，其中所述患者尚未接受用本文公开的脂肪酸衍生物进行的治疗。在其他实施方式中，对照是历史对照或标准参考值或值的范围(诸如先前测试的对照样品，诸如具有已知预后或结果的患者组或者代表基线或正常值的样品组)。

减少(decrease)或降低(reduce)：减少某些事物的数量、量或强度；例如减少疾病或病症的体征或症状。在一个实例中，与不存在治疗的情况下的反应相比，治疗减少了疾病或病症的体征或症状。在特定实例中，与不存在治疗的情况相比，治疗减少了疾病或病症的体征或症状，诸如减少了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

衍生物：衍生物是在化学结构上区别于母体化合物的分子，例如同系物(区别在于化学结构上的增加，诸如烷基链长度的区别)，分子片段，区别在于一个或多个官能团的结构，离子化改变。在一些实例中，衍生物在结构上类似或相关于内源化合物(例如，具有相同的官能团)，其包含旨在赋予理想特性(诸如稳定性，溶解度和/或适合于在生物系统中递送)的非天然(或者非生物衍生的)修饰。衍生物不是必须从母体化合物合成。通常使用定量结构活性关系(QSAR)来发现结构衍生物，使用诸如Remington(The Scienceand Practiceof Pharmacology,19th Edition(1995),chapter 28)中所公开的那些技术。

诊断：通过体征、症状和多种检测的结果来鉴定疾病的过程。通过该过程达到的结论也被称为“诊断”。通常进行的检测形式包括血液检测、医学影像、尿分析和活组织检测。

羟基：由式-OH表示的基团。

炎症：发生组织损伤时，机体对损伤的反应通常是炎症。例如，损坏可能是由于外伤、血液供应不足、出血、自体免疫攻击、移植的外源组织或感染引起的。机体的这种普遍反应包括释放免疫系统的许多成分(例如IL-1和TNF)，将细胞吸引到损伤部位，由于液体的释放而引起的组织肿胀和其他过程。可通过本领域众所周知的许多方法来测量炎症，例如白细胞的数量，多形核中性粒细胞(PMN)的数量，测量PMN激活程度(例如腔内增强的化学发光)或测量存在的细胞因子数量。

炎症可分为急性或慢性。急性炎症是机体对有害刺激的最初反应，是通过血浆和白细胞从血液进入受伤组织的运动增加而实现的。生化事件的级联扩增了炎症反应并使其成熟，涉及局部血管系统、免疫系统以及受伤组织内的各种细胞。持久的炎症被称为慢性炎症，其导致存在于炎症部位的细胞类型的逐渐转变，其特征在于炎症过程中组织的同时破坏和愈合。慢性炎症的一个例子是炎性关节炎。

在几个实施方式中，本文公开的脂肪酸衍生物可用于治疗或预防受试者的炎症。

瘙痒：也称为瘙痒症，瘙痒是诱使受试者去抓挠受影响区域的皮肤麻刺感或刺激。瘙痒可能在全身发生或者进在一个位置发生。瘙痒可与组胺相关或无关。

瘙痒可分为以下几种：影响患有原发性疾病的发炎皮肤的瘙痒(例如受炎症、感染、自体免疫疾病、淋巴瘤或药物反应影响的皮肤)，影响非原发性疾病的未发炎皮肤的瘙痒(例如与神经疾病或精神病学来源相关的瘙痒)或与继发性抓挠损伤相关的瘙痒，所述继发性抓挠损伤是由患者对最初的瘙痒作出反应而引起的抓挠损伤，且包括脱皮、结痂、丘疹、结节和慢性继发性抓挠损伤如结节性痒疹。

瘙痒是大多数炎性皮肤病症(例如特异性皮炎、接触性皮炎、荨麻疹、药物反应、类天疱疮、疱疹样皮炎)、寄生虫或感染性疾病(例如疥疮、真菌病、水痘)、虫咬以及皮肤T-细胞淋巴瘤的最常见症状。

慢性瘙痒是存在至少6周的瘙痒感觉，并且在诸如特应性皮炎、银屑病以及肾病或肝病的病症下特别流行。

在几个实施方式中，本文公开的脂肪酸衍生物可用于治疗或预防受试者的瘙痒(诸如慢性瘙痒)。

部分：部分是分子片段或缀合物的一部分。

疼痛：与实际或潜在的组织损伤相关的或者在此类损伤中描述的不愉悦的感官和情绪经历。哺乳动物所经历的疼痛可分为2种主要类别：急性疼痛(或伤害感受性的)和慢性疼痛，后者可分为慢性炎性疼痛和慢性神经性疼痛。急性疼痛是对引起组织损伤的刺激的反应，并且是远离刺激以最小化组织损伤的信号。另一方面，慢性疼痛没有任何生物学功能，并且因组织损伤(炎性疼痛)或神经系统的损伤(诸如脱髓鞘)(神经性疼痛)引起的炎症而发展。慢性疼痛通常特征在于与刺激无关的持久疼痛或者在于无害刺激触发的异常疼痛感受。疼痛的非限制性实例包括术后疼痛、与组织损伤相关的疼痛、来自炎症的疼痛、来自感染的疼痛(带状疱疹)、来自神经病症的疼痛和来自骨骼肌病症的疼痛。

在几个实施方式中，本文公开的脂肪酸衍生物可用于治疗或预防受试者的疼痛(诸如慢性疼痛)。

可药用：可被受试者摄入而不会对受试者产生显著的不良毒理学作用的物质。术语"可药用形式"表示任何可药用衍生物或变体，诸如立体异构体、立体异构体混合物、对映体、溶剂合物、水合物、同晶型、多晶型、伪晶型、中性形式、盐形式和前药试剂。

可药用载体：可用于本公开的可药用载体(介质)是常规的。Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,The University of the Sciences inPhiladelphia,Editor,Lippincott,Williams,&Wilkins,Philadelphia,PA,21^st Edition(2005)描述了适合用于一种或多种治疗组合物和额外的药物剂的药物递送的组合物和制剂。通常，载体的特质将取决于所采用的具体施用模式。例如，肠胃外制剂通常包括作为介质的可注射流体，其包括药学和生理学可接受的流体，诸如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。在一些实例中，可药用载体可为无菌的以适合用于施用给受试者(例如，通过肠胃外，肌内或皮下注射)。除了生理中性载体之外，要被施用的药物组合物可包含少量无毒辅助物质，诸如湿润或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或单月桂酸山梨醇酯。在一些实例中，可药用载体是非天然或合成的载体。载体也可配制为携带预先选择的治疗剂量的活性药剂的单位剂型，例如在药丸、小瓶、瓶子或针筒中。

可药用盐：可用作药物的化合物的生物可相容盐，所述盐来源于本领域中公知的多种有机和无机抗衡离子，并且仅作为实例，包括钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等；并且当分子包含碱性官能团时，包括诸如有机酸或无机酸的盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。可药用的酸加成盐是那些保留了游离碱的生物功效并且由不是生物学或其他方面不理想的酸伴侣(acid partners)形成的盐，所述酸伴侣为，例如，无机酸，诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；以及有机酸，诸如乙酸、三氟乙酸、丙酸、羟基乙酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、苯磺酸(苯磺酸盐)、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。可药用的碱加成盐包括来源于无机碱的那些，诸如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等。示例性的盐是铵、钾、钠、钙和镁盐。来源于可药用的有机无毒碱的盐包括但不限于以下的盐：伯、仲和叔胺，取代胺(包括天然取代胺)，环胺和碱性离子交换树脂，诸如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、甲葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。示例性的有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。(参见，例如，S.M.Berge,et al.,“PharmaceuticalSalts,”J.Pharm.Sci.,1977；66:1-19，其通过引用并入本文)。

皮肤病症：皮肤的疾病或病症，诸如炎性、增生性、敏化、皮肤屏障功能障碍疾病或病症。皮肤病症的非限制性实例包括特应性皮炎、脂溢性皮炎、痤疮、酒糟鼻、鱼鳞病、红皮病、脱发、皱纹、皮肤干燥症/水屏障功能、必需脂肪酸缺乏症、白癜风、皮脂囊肿、藏毛囊肿、增生性瘢痕/瘢痕疙瘩、脂溢性角化病和光化性角化病。立体异构体：具有相同分子式和键合原子顺序但区别仅在于原子在空间中的三维取向的异构体。彼此不为镜像的立体异构体被称为“非对映体”，并且那些彼此为不重叠镜像的立体异构体被称为“对映体”。当化合物具有不对称中心时，例如，如果碳原子键合到四个不同基团时，则可有一对对映体。对映体可通过其不对称中心的绝对构型来表征，并且通过Cahn和Prelog的R-和S-顺序规则来描述或者通过分子使偏振光平面旋转的方式来表征为右旋或左旋的(即，分别为(+)或(-)异构体)。手性化合物可作为单个对映体或作为其混合物存在。包含等比例对映体的混合物被称为“外消旋混合物”。E/Z异构体是区别在于双键的立体化学的异构体。E异构体(来自entgegen，表示“opposite”的德文词语)在双键处具有反式构型，其中优先度最高的2种基团位于双键的不同侧。Z异构体(来自zusa mmen，表示“together”的德文词语)在双键处具有顺式构型，其中优先度最高的2种基团位于双键的同侧。

受试者：活的多细胞脊椎动物生物体，包含人和非人哺乳动物的类别。

取代的或取代：分子或R-基团的氢原子用由一个或多个额外的R基团替换。除非另有定义，如本文所用，术语“任选-取代的”或“任选取代基”是指可以被或不被1、2、3、4或更多个基团(优选1、2或3个基团，更优选1或2个基团)进一步取代的基团。取代基可选自，例如，C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6氟代烯基、C_2-6二氟烯基、C_2-6炔基、C_3-8环烷基、羟基、氧代(oxo)、C_1-6烷氧基、芳氧基、C_1-6烷氧基芳基、卤代、C_1-6卤代烷基(诸如CF₃和CHF₂)、C_1-6卤代烷氧基(诸如OCF₃和OCHF₂)、羧基、酯、氰基、硝基、氨基、取代氨基、二取代氨基、酰基、酮、酰胺、氨基酰基、取代酰胺、二取代酰胺、巯基、烷硫基、硫代(thioxo)、硫酸盐、磺酸盐、亚磺酰基、取代亚磺酰基、磺酰基、取代磺酰基、磺酰基酰胺、取代磺酰胺、二取代磺酰胺、芳基、芳基C_1-6烷基、杂环基和杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基和杂环基和包含它们的基团可进一步被任选取代。在N-杂环的情况中，任选取代基还可包括但不限于C_1-6烷基，即N-C_1-3烷基，更优选甲基，特别是N-甲基。

互变异构体：区别仅在于质子和电子的位置并且可通过氢原子迁移而互相转换的有机化合物的组成型异构体。互变异构体通常平衡地共同存在。

治疗有效量：足以为受试者或指定百分比的受试者提供有益或治疗作用的量。治疗剂的治疗有效量可以多种不同方式测定，诸如测定疾病或病症(诸如动脉粥样硬化)的减轻。治疗有效量也可通过多种体外、体内或原位测定法来测定。治疗剂可以单一剂量或若干剂量施用，例如在疗程期间每天施用。然而，有效量可取决于应用的来源、接受治疗的受试者、所治疗的病症的严重程度和类型以及施用的方式。

巯基：基团-SH。取代的巯基是氢原子被例如C_1-6烷基(“-S(C_1-6烷基)”)、芳基(“-S(芳基)”)或芳基烷基(“-S(烷基)(芳基)”)等取代的巯基。

治疗(treating或treatment)：关于疾病或病症，任一术语均包括(1)预防疾病或病症，例如，使疾病或病症的临床症状不在可能暴露于该疾病或病症或倾向于该疾病或病症但尚未经历或显示该疾病或病症的症状的受试者中发展，(2)抑制疾病或病症，例如，阻止疾病或病症或其临床症状的发展，或(3)缓解疾病或疾病，例如，导致疾病或状况或其临床症状消退。

II.脂肪酸衍生物

公开了脂肪酸衍生物的实施方式。如本文所讨论的，所公开的脂肪酸衍生物具有治疗多种疾病和病症的用途，包括炎症、瘙痒、疼痛、自体免疫病症和动脉粥样硬化。在几个实施方式中，所公开的脂肪酸衍生物与用于治疗炎症、瘙痒、疼痛、自体免疫病症和/或动脉粥样硬化的现有药剂相比在人类患者中活性增加，毒性较低，副作用少，稳定性更高，半衰期更长或者具有以上的组合。有利地，所公开的脂肪酸衍生物的某些实施方式能够越过血脑屏障。

在某些实施方式中，脂肪酸衍生物是具有根据式I的结构的化合物或其立体异构体、互变异构体或可药用盐：

在式I中，X是长度为1-16个碳的脂族基团(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16中的任一个)，Z是长度为1-16个碳的脂族基团(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16中的任一个)或不存在，Y选自以下中任一个：

R¹是氢或低级烷基(诸如甲基、乙基、丙基或丁基)；R²是氢或低级烷基(诸如甲基、乙基、丙基或丁基)；R³是氢或低级烷基(诸如甲基、乙基、丙基或丁基)；R⁴是低级烷基(诸如甲基、乙基、丙基或丁基)、羟基、羧基或胺；R⁵是氢、低级烷基或卤化物，R⁶是羟基或取代巯基，并且每个R⁷独立地是氢或氟或不存在，并且相邻的碳形成炔。Y可以如上所示的取向或以相反取向插入到式I中以产生式I的化合物。

在式I的一些实施方式中，Y选自以下中任一个：

R¹是氢或低级烷基(诸如甲基、乙基、丙基或丁基)；R²是氢或低级烷基(诸如甲基、乙基、丙基或丁基)；R³是氢或低级烷基(诸如甲基、乙基、丙基或丁基)；R⁴是低级烷基(诸如甲基、乙基、丙基或丁基)、羟基、羧基或胺；R⁵是氢、低级烷基或卤化物，R⁶是羟基或取代巯基，并且每个R⁷独立地是氢或氟。Y可以如上所示的取向或以相反取向插入到式I中以产生式I的化合物。

在式I的一些实施方式中，X和Z独立地选自以下之一：长度为1-10、4-8、2-6、5-10、4-12或10-16个碳。在一些实施方式中，Z的长度为1-10个碳，并且X的长度为1-10个碳。在一些实施方式中，Z不存在。在式I的一些实施方式中，X的长度选自4-8种碳，并且Z的长度选自1-6个碳。在式I的一些实施方式中，X的长度是6个碳，和/或Z的长度是4个碳。在式I的一些实施方式中，X和Z的长度总共为8-14个碳。在式I的一些实施方式中，X和Z的长度总共为7-12个碳。在式I的一些实施方式中，X和Z的长度总共为10个碳。在几个实施方式中，X和Z独立地是烷基或烯基，或卤代烯基，特别是氟代烯基或二氟烯基。在一些实施方式中，X和Z独立地包括一个或多个氟代烯烃或二氟烯烃部分。

在式I的一些实施方式中，R¹、R²、R³和/或R⁴是甲基。在式I的一些实施方式中，R¹、R²、R³和R⁴是甲基。在式I的一些实施方式中，R⁵是氢。在式I的一些实施方式中，R⁶是羟基。在式I的一些实施方式中，R⁶是半胱氨酸或谷胱甘肽。在式(I)的一些实施方式中，R¹是氢，R²、R³和R⁴是甲基，R⁵是氢和R⁶是羟基。在式(I)的一些实施方式中，R¹、R²、R³和R⁴是甲基，R⁵是氢和R⁶是羟基。

在某些实施方式中，脂肪酸衍生物是具有根据式II-XVII中任一个的结构的化合物或其立体异构体、互变异构体或可药用盐：

在式(II)–(CII)中，如果存在的话，R¹是氢或低级烷基(诸如甲基、乙基、丙基或丁基)，R²是氢或低级烷基(诸如甲基、乙基、丙基或丁基)，R³是氢或低级烷基(诸如甲基、乙基、丙基或丁基)，R⁴是低级烷基(诸如甲基、乙基、丙基或丁基)、羟基、羧基或胺，R⁵是氢、低级烷基或卤化物，R⁶是羟基或取代巯基，每个R⁷独立地是氢或氟或不存在，并且相邻的碳形成炔，每个R⁸独立地是氢或氟，并且每个R⁹独立地是氢或氘。在1,4-顺,顺-戊二烯的一部分中用氟或氘取代氢使得这些不良底物被进一步酶促氧化，从而增强了稳定性。

在式(II)–(CII)中任一个的一些实施方式中，如果存在的话，R¹是氢或低级烷基(诸如甲基、乙基、丙基或丁基)，R²是氢或低级烷基(诸如甲基、乙基、丙基或丁基)，R³是氢或低级烷基(诸如甲基、乙基、丙基或丁基)，R⁴是低级烷基(诸如甲基、乙基、丙基或丁基)、羟基、羧基或胺，R⁵是氢、低级烷基或卤化物，R⁶是羟基或取代巯基，每个R⁷独立地是氢或氟，并且相邻的碳形成炔，每个R⁸独立地是氢或氟，并且每个R⁹独立地是氢或氘。在1,4-顺,顺-戊二烯的一部分中用氟或氘取代氢使得这些不良底物被进一步酶促氧化，从而增强了稳定性。

在式(II)–(CII)中任一个的一些实施方式中，R¹、R²、R³和/或R⁴是甲基。在式(II)–(CII)中任一个的一些实施方式中，R¹、R²、R³和R⁴是甲基。在式(II)–(CII)中任一个的一些实施方式中，R⁵是氢。在式(II)–(XVII)的一些实施方式中，R⁶是羟基。在式(II)–(XVII)中任一个的一些实施方式中，R⁶是半胱氨酸或谷胱甘肽。在式(II)–(CII)中任一个的一些实施方式中，R¹是氢，R²、R³和R⁴是甲基，R⁵是氢和R⁶是羟基。在式(II)–(CII)中任一个的一些实施方式中，R¹、R²、R³和R⁴是甲基，R⁵是氢和R⁶是羟基。

落入式(I)范围内的本公开的示例性化合物结构包括但不限于以下：

亚油酸衍生物

十八碳烯酸衍生物

Mead[(5Z,8Z,11Z)-二十碳-5,8,11-三烯]酸衍生物

花生四烯酸衍生物

二十二碳四烯(肾上腺)酸衍生物

二十二碳六烯酸衍生物

本文所公开的任何包含羧基的化合物(例如，化合物1-330)均可用甲酯基团替换羧基基团来制备。此外，本文所公开的任何包含烯基的化合物均可用氟取代替换任何碳碳双键的碳上的氢来制备。

在某些实施方式中，脂肪酸衍生物是具有根据式(CIII)-(CX)中任一个的结构的化合物或其立体异构体、互变异构体或可药用盐：

式(CIII)-(CX)涵盖了化合物1-16的推测活性位点，因此认为其可调节化合物1-16的内源靶的活性。在式(CIII)-(CX)中，R⁵是氢、低级烷基或卤化物，每个R⁷独立地是氢或氟或不存在，相邻的碳形成炔，并且R¹⁰和R¹¹独立地是脂族基团。

在式(CIII)-(CX)的一些实施方式中，R¹⁰和R¹¹独立地是取代或未取代的低级烷基，取代或未取代的低级杂烷基，取代或未取代的低级烯基(诸如卤代烯基，例如氟代烯基或二氟烯基)，取代或未取代的低级杂烯基，取代或未取代的低级炔基，取代或未取代的低级杂炔基，取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。

在式(CIII)-(CX)中任一个的一些实施方式中，R⁵是氢。在式(CIII)-(CX)中任一个的一些实施方式中，R¹⁰是甲基。在式(CIII)-(CX)中任一个的一些实施方式中，R¹¹是甲基。在式(CIII)-(CX)中任一个的一些实施方式中，R⁵是氢，R¹⁰是甲基和R¹¹是甲基。

落入式(CIII)-(CX)范围内的本公开的示例性化合物结构包括但不限于以下：

根据式(I)–(CX)的化合物(诸如化合物1-330)可通过任选地以本文所提供合成方法(参见实施例)补充的常规方法来合成。本领域普通技术人员将会意识到化合物可能会显示互变异构、构象异构、几何异构和/或光学异构现象。例如，某些公开的化合物可包含一个或多个手性中心和/或双键，并且因此可作为立体异构体存在，诸如双键异构体(即，几何异构体)、对映体、非对映体及其混合物，诸如外消旋混合物。作为另一个实例，某些公开的化合物可以数种互变异构形式存在，包括烯醇形式、酮形式及其混合物。由于本说明书和权利要求书中各种化合物的命名、结构式和化合物图仅能代表可能的互变异构、构象异构、光学异构或几何异构形式中的一种，应理解所公开的化合物涵盖了本文所述化合物的任何互变异构、构象异构、光学异构和/或几何异构形式以及这些各种不同异构形式的混合物。

其他化合物实施方式

在某些实施方式中，脂肪酸衍生物是具有2,2-二甲基的氧化脂肪酸，如本文所述，其减少了氧化脂肪酸的酯化。在几个实施方式中，2,2-二甲基修饰的氧化脂肪酸实施方式与相应的未修饰氧化脂肪酸化合物相比在生理条件下(诸如在血液中或在磷酸盐缓冲盐水中)具有增加的半衰期。在一些实施方式中，2,2-二甲基修饰的氧化脂肪酸化合物具有根据式CXI的结构或是其立体异构体、互变异构体或可药用盐：

在式CXI中，X是长度为10-25个碳的脂族基团(诸如长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个碳中的任一个)，并且包括一个或多个环氧基、羟基或羰基取代或其组合，R¹是氢或低级烷基(诸如甲基、乙基、丙基或丁基)，并且每个R²独立地是甲基或氢。在式CXI的一些实施方式中，X是取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的杂烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的杂炔基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。在几个实施方式中，X是烷基或烯基或卤代烯基，特别是氟代烯基或二氟烯基。在一些实施方式中，X包含一个或多个氟代烯烃或二氟烯烃部分。在一些实施方式中，X是烷基或烯基。在一些实施方式中，X包含一个或多个二烯丙基氘取代，例如，X是氘代二烯丙基烯基或二氘代二烯丙基烯基。在一些实施方式中，每个R²是甲基。在一些实施方式中，每个R²是氢。在一些实施方式中，每个R²是甲基，并且化合物是亚油酸的氧化衍生物。在一些实施方式中，式CXI的化合物包含在脂肪酸的氧化敏感位点上或者在进一步转化后变为氧敏感的位点上(例如，在二烯丙基位置处)的氢的一个或多个氘取代。

III.药物组合物

本公开还包括包含本文所公开的至少一种脂肪酸衍生物或其立体异构体、互变异构体或可药用盐的药物组合物。在一些实施方式中，脂肪酸衍生物是根据结构1-330中任一个的化合物。药物组合物的一些实施方式包括至少一种脂肪酸衍生物和除了所选分子之外的至少一种其他可药用添加剂，诸如可药用载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。有用的可药用载体和赋形剂是本领域已知的。

包含一种或多种脂肪酸衍生物的药物组合物可以多种方式配制，这取决于，例如，施用模式和/或成像位置。肠胃外制剂可包括可注射流体，其是药学和生理学可接受的流体介质，诸如水、生理盐水、其他平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。赋形剂可包括，例如，非离子增溶剂，诸如

聚乙氧基化洗涤剂；或蛋白质，诸如人血清白蛋白或血浆制剂。如果需要，待被施用的药物组合物还可包含无毒辅助物质，诸如湿润或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如，乙酸钠或单月桂酸山梨醇酯。

药物组合物的形式将通过所选择的施用模式确定。所公开的药物组合物的实施方式可采用实际上适合用于任何施用形式的形式，包括，例如，口服、口腔、全身、鼻腔、注射、透皮、直肠、阴道等，或者适合于通过吸入或吹入施用的形式。通常，所公开的药物组合物的实施方式将为肠胃外(例如，通过静脉内、动脉内、皮下、肌内或腹膜内注射)、鞘内或口服施用。

有用的可注射制剂包括活性化合物在水性或油性介质中的无菌悬浮液、溶液或乳液。组合物还可包含配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。用于注射的制剂可以单位剂型存在，例如，在安瓿中或在多剂量容器中，并且可包含添加的防腐剂。组合物可采用诸如在油性或水性介质中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可包含配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。例如，肠胃外施用可通过团注法(bolus injection)或连续输注法进行。可替代地，脂肪酸衍生物可为用于在使用前以合适介质(例如无菌水)复液化的粉末形式。

全身制剂包括设计用于通过注射施用的那些，例如，皮下、静脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射，以及设计用于透皮、经粘膜、口服或肺部施用的那些。

口服制剂可为液体(例如，糖浆、溶液或悬浮液)或固体(例如，粉末、片剂或胶囊)。口服制剂可与靶向配体偶联以越过内皮屏障。一些脂肪酸衍生物制剂可通过例如与二糖一起喷雾干燥以形成脂肪酸衍生物粉末。固体组合物可使用可药用赋形剂以常规方法制备，诸如粘合剂(例如，预凝胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如，乳糖、甘露醇、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羧基乙酸淀粉钠)；或湿润剂(例如，月桂基硫酸钠)。片剂可通过本领域公知的方法用例如糖、薄膜或肠溶衣来包被。制备此类剂型的方法是本领域技术人员已知或明显的。

口服施用的液体制剂可采用例如酏剂、溶液、糖浆或悬浮液的形式。此类液体制剂可通过常规方法使用可药用添加剂制成，诸如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水介质(例如，扁桃仁油、油性酯、乙醇、

洗涤剂或分馏的植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。根据需要，制剂还可包含缓冲盐、防腐剂、调味剂、着色剂和增甜剂。用于口服施用的制剂可被适当地配制为提供荧光团的控制释放，如众所周知的那样。

如本文所述的包含脂肪酸衍生物的药物组合物的某些实施方式可配制为适合个别施用精确剂量的单位剂型。如果需要，药物组合物可存在于可包含一个或多个包含脂肪酸衍生物的单位剂型的包装或分配装置中。包装例如可包括金属或塑料箔，诸如泡囊包装。包装或分配装置可附有施用说明书。所施用的脂肪酸衍生物的量将至少部分取决于所治疗的受试者、靶标(例如，肿瘤尺寸、位置和特征)和施用方式，并且是本领域技术人员已知的。在此范围内，待被施用的制剂将包含一定量的本文所述脂肪酸衍生物，其量足以为所治疗的受试者提供治疗有效剂量的药物。

IV.方法

在其他实施方式中，提供了一种使用所公开的脂肪酸衍生物治疗受试者的疾病或病症的方法。所述方法包括向患有或怀疑患有疾病或病症的受试者施用治疗有效量的包含所公开的脂肪酸衍生物的药物组合物。可应用所述方法的示例性疾病或病症包括炎症、慢性瘙痒、慢性疼痛、自体免疫病症、动脉粥样硬化、皮肤病症、神经退行性病症、精神病症和关节炎。在其他实施方式中，公开的脂肪酸衍生物可用于施加到皮肤上的任何组合物中，诸如用于化妆品或个人护理目的的组合物或驱虫剂。

药物组合物可通过任何合适的途径使用，诸如局部、肠胃外或口服。受试者可为哺乳动物，诸如人或非人哺乳动物。在某些实例中，受试者是人。

脂肪酸衍生物以如下方式施用给受试者：单次团注递送，经由延长的时间段内的连续递送(例如，连续静脉内递送)，或使用重复施用方案(例如，每小时、每日、每周或每两周(biweekly)重复施用方案)。治疗有效量的脂肪酸衍生物可被提供作为长期治疗方案中的重复剂量，这将得到减轻与所述疾病或病症相关的一个或多个症状或者可检测状况的临床上显著的结果。在此上下文中测定有效剂量通常是基于动物模型研究随后通过人临床试验的，并且由显著降低受试者的靶向疾病症状或状况的发作或严重程度的施用原则指导。在此方面合适的模型包括，例如，啮齿类、大鼠、禽类、猪、猫、非人灵长类动物和本领域中已知的其他接受的动物模型受试者。可替代地，有效剂量可使用体外模型测定。使用此类模型，仅需要常规计算和调整以测定施用治疗有效量的化合物的合适浓度和剂量(例如，有效引起理想的免疫反应或者减轻靶向疾病的一个或多个症状的量)。在替代性实施方式中，有效量或有效剂量的脂肪酸衍生物可简单地抑制或增强与所治疗的疾病或病症相关的一种或多种所选择的生物活性，如本文所阐述的，以用于治疗或诊断目的。

脂肪酸衍生物的实际剂量将根据以下因素而变：诸如受试者的疾病体征和具体情况(例如，受试者的年龄、身材、健康、症状程度、易感因素等)，施用时间和途径，同时施用的其他药物或治疗，以及脂肪酸衍生物在受试者中引起所需活性或生物反应的具体药理学。剂量方案可进行调节以提供最佳治疗反应。治疗有效量也是在临床方面治疗有益作用胜过脂肪酸衍生物的任何毒性或有害副作用的量。本公开的方法和制剂中的治疗有效量的脂肪酸衍生物的非限制性范围可在以下范围内：0.01mg/kg体重到5g/kg体重，诸如10mg/kg至5g/kg体重或1g/kg至5g/kg体重。在一些实施方式中，脂肪酸衍生物可以有效提供0.1-100μm或1-5000μg/mL的血清脂肪酸衍生物浓度的量施用。

主治医生可以改变剂量以维持目标部位(例如，全身循环)所需浓度。可以根据递送模式(例如，口服、静脉内或局部递送)选择较高或较低的浓度。剂量也可以根据所施用的制剂的释放速率进行调整，例如，肺内喷雾剂相对于粉末剂，缓释口服剂对注射颗粒剂或透皮递送制剂等。

在一些实施方式中，所公开的脂肪酸衍生物具有治疗受试者的瘙痒(诸如慢性瘙痒)的用途。在此类实施方式中，施用治疗有效量的脂肪酸衍生物改善受试者的与瘙痒(诸如慢性瘙痒)相关的至少一种体征或症状。例如，脂肪酸衍生物可用于减少与发炎皮肤相关的瘙痒(诸如慢性瘙痒)，诸如受以下影响的皮肤：炎性皮肤病症(例如特应性皮炎、银屑病、接触性皮炎、荨麻疹、药物反应、类天疱疮、疱疹样皮炎)、寄生虫或感染性疾病(例如疥疮、真菌病、水痘)、自体免疫病症、淋巴瘤(例如，皮肤T-细胞淋巴瘤)，以及影响非原发性疾病的未发炎皮肤的瘙痒(诸如与神经性或精神性来源相关的瘙痒)或与继发性抓挠损伤相关的瘙痒，所述继发性抓挠损伤是因病人对初始瘙痒的反应所导致的抓挠损伤，并且包括脱皮、结硬皮、丘疹、结节和慢性继发性抓挠损伤如结节性痒疹。在一些实施方式中，对受试者施用治疗有效量的所公开的脂肪酸衍生物以治疗瘙痒与不进行治疗相比能使受试者的瘙痒减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或者甚至100％。可在动物模型中证实所公开的脂肪酸衍生物用于治疗瘙痒的活性，例如，通过评估小鼠针对组胺注射与相关脂肪酸衍生或对照的组合的瘙痒反应(参见，例如，以下实施例1)。

在一些实施方式中，所公开的脂肪酸衍生物具有治疗受试者的疼痛(诸如慢性疼痛)的用途。在此类实施方式中，施用治疗有效量的脂肪酸衍生物改善受试者与疼痛(诸如慢性疼痛)相关的至少一种体征或症状。例如，脂肪酸衍生物可用于减少与炎症(包括因组织损伤引起的炎症，炎性疼痛)相关的疼痛，由神经系统损伤诸如脱髓鞘引起的疼痛(神经性疼痛)、手术后疼痛、与组织损伤相关的疼痛、来自感染的疼痛(带状疱疹)、来自神经病症的疼痛和来自骨骼肌病症的疼痛。在一些实施方式中，向受试者施用治疗有效量的所公开的脂肪酸衍生物以治疗疼痛与不使用治疗相比可使受试者的疼痛减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或者甚至100％。例如，可通过以下方式在动物模型中确定所公开的脂肪酸衍生物用于治疗疼痛的活性：评估小鼠针对PEG2注射与相关脂肪酸衍生物或对照的结合的疼痛反应(参见，例如，以下实施例1)。

在一些实施方式中，所公开的脂肪酸衍生物具有治疗受试者的动脉粥样硬化的用途。在此类实施方式中，施用治疗有效量的脂肪酸衍生物改善受试者的与动脉粥样硬化相关的至少一种体征或症状。例如，对受试者施用治疗有效量的脂肪酸衍生物可用于逆转或延缓动脉粥样硬化的进程，例如通过存在动脉粥样硬化病变和/或该疾病的功能性体征来测量，诸如通过体征(诸如外周毛细血管再充盈)、症状(诸如胸部疼痛和间歇性跛行)或实验室证据(诸如通过EKG、血管造影术或其他成像技术获得)测得的心血管功能改善。在一些实施方式中，施用治疗有效量的脂肪酸衍生物增加了受试者的胆固醇通量。在一些实施方式中，施用治疗有效量的脂肪酸衍生物减少了受试者的LDL胆固醇水平，例如，与LDL胆固醇的基线水平相比。在一些实施方式中，向受试者施用治疗有效量的所公开的脂肪酸衍生物以治疗动脉粥样硬化与不进行治疗相比可使受试者的动脉粥样硬化减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或者甚至100％。在一个实例中，可通过以下方式指示所公开的脂肪酸衍生物用于治疗动脉粥样硬化的活性：检测通过ApoA1与脂肪酸衍生物的组合诱导的胆固醇通量相对于相关对照的增加(参见，例如，以下实施例14)。

在一些实施方式中，所公开的脂肪酸衍生物具有治疗受试者的自体免疫病症的用途。在此类实施方式中，施用治疗有效量的脂肪酸衍生物改善受试者的与自体免疫病症相关的至少一种体征或症状。例如，对受试者施用治疗有效量的脂肪酸衍生物可用于治疗、预防和/或改善类风湿性关节炎、桥本氏甲状腺炎、恶性贫血、艾迪生氏病、I型糖尿病、全身红斑狼疮、皮肌炎、干燥综合征、皮肌炎、红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、雷特氏综合征或格雷夫氏病等的症状。在一些实施方式中，向受试者施用治疗有效量的公开的脂肪酸衍生物以治疗自体免疫病症与不使用治疗相比可使受试者的自体免疫病症减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或者甚至100％。

在一些实施方式中，所公开的脂肪酸衍生物具有治疗受试者的关节炎(诸如退行性关节炎)的用途。在此类实施方式中，施用治疗有效量的脂肪酸衍生物改善受试者与关节炎相关的至少一种体征或症状，诸如减少臀部、膝盖、下腰椎和颈椎、近端和远端指(趾)间关节、第一腕掌关节和/或足部第一跖跗关节的疼痛和/或肿胀。例如，对受试者施用治疗有效量的脂肪酸衍生物可用于治疗、预防和/或改善关节炎的症状。在一些实施方式中，向受试者施用治疗有效量的所公开的脂肪酸衍生物以治疗关节炎与不使用治疗相比可使受试者的关节炎减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或者甚至100％。

在一些实施方式中，所公开的脂肪酸衍生物具有治疗受试者的神经退行性病症的用途。在此类实施方式中，施用治疗有效量的脂肪酸衍生物改善受试者的与神经退行性病症相关的至少一种体征或症状。例如，对受试者施用治疗有效量的脂肪酸衍生物可用于治疗、预防和/或改善阿尔茨海默病、血管性痴呆、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、多发性硬化或肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的症状。在一些实施方式中，向受试者施用治疗有效量的所公开的脂肪酸衍生物以治疗神经退行性病症与不使用治疗相比可使受试者的神经退行性病症减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或者甚至100％。

在一些实施方式中，所公开的脂肪酸衍生物具有治疗受试者的精神病症的用途。在此类实施方式中，施用治疗有效量的脂肪酸衍生物改善受试者的与精神病症相关的至少一种体征或症状。例如，对受试者施用治疗有效量的脂肪酸衍生物可用于治疗、预防和/或改善抑郁症、焦虑症和/或精神错乱的症状。在一些实施方式中，向受试者施用治疗有效量的所公开的脂肪酸衍生物以治疗精神病症与不使用治疗相比可使受试者的神经退行性病症减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或者甚至100％。

在一些实施方式中，所公开的脂肪酸衍生物具有治疗受试者的皮肤病症的用途。在此类实施方式中，施用治疗有效量的脂肪酸衍生物改善受试者与皮肤病症相关的至少一种体征或症状。例如，对受试者施用治疗有效量的脂肪酸衍生物可用于治疗、预防和/或改善特应性皮炎、脂溢性皮炎、痤疮、酒糟鼻、鱼鳞病、红皮病、脱发、皱纹、皮肤干燥症/水屏障功能、必需脂肪酸缺乏、白癜风、皮脂囊肿、藏毛囊肿、增生性瘢痕/瘢痕疙瘩、脂溢性角化病和光化性角化病的症状。在一些实施方式中，对受试者施用治疗有效量的脂肪酸衍生物可用于治疗、预防和/或改善具有水屏障功能障碍或者表皮失水(epidermal water loss)增加的病症的症状，诸如鱼鳞病、湿疹/特应性皮炎、银屑病和/或皮肤干燥症。例如，包含所公开的化合物的药物组合物可被局部施加给受试者以治疗、预防和/或改善具有水屏障功能障碍或者表皮失水增加的病症的症状，所述化合物是亚油酸的氧化衍生物，并且具有2-甲基或2,2-二甲基，并且是亚油酸的氧化衍生物(诸如化合物31-36、38-43或66-72中的任一种)。在一些实施方式中，向受试者施用治疗有效量的所公开的脂肪酸衍生物以治疗皮肤病症与不使用治疗相比可使受试者的神经退行性病症减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或者甚至100％。

在其他实施方式中，所述方法提供用于诊断受试者的疾病或病症，例如用于测定受试者(诸如健康受试者或者怀疑患有或有风险患疾病或病症的受试者)患疾病或病症的可能性或者在未来很可能发展疾病或病症的可能性。所述方法包括测量化合物1-16中任一种在来自受试者的生物样品中的水平，和如果在生物样品中检测到与相应对照(诸如，该化合物在没有疾病或病症或者没有发展疾病或病症风险的受试者中的水平)相比该化合物的水平有所改变(例如，水平升高，例如增加至少2倍)，则将该受试者诊断为患有疾病或病症或者有发展疾病或病症风险的受试者。在几个实施方式中，疾病或病症是选自以下之一：炎症、慢性瘙痒、慢性疼痛、自体免疫病症、皮肤病症和动脉硬化。在一些实施方式中，所测得的化合物1-16中任一种在来自受试者的生物样品中的水平可用于指导用于预防或控制疾病或病症的靶向干预或建议。例如，可让经鉴定在化合物1-16的任一种中含量增加的受试者接受减少化合物水平的饮食干预，例如多不饱和氨基酸减少的饮食。

在一些实施方式中，本文提供了评估炎症的方法，例如用于测定受试者(诸如健康受试者或者怀疑患有或有患炎症病症风险的受试者)患炎症病症的可能性或在未来将有可能发展炎症病症的可能性。所述方法包括测量化合物1-16中任一种在来自受试者的生物样品中的水平，和如果在生物样品中检测出与相应的对照(例如，该化合物在健康受试者中的相应水平)相比该化合物的水平升高(诸如升高的水平，例如至少增加2倍)，则将该受试者诊断为患有炎症病症或有患炎症病症风险的受试者。

在一些实施方式中，本文提供了评估慢性瘙痒的方法，例如用于测定受试者(诸如健康受试者或者怀疑患有或有患慢性瘙痒风险的受试者)患慢性瘙痒的可能性或在未来将有可能发展慢性瘙痒的可能性。所述方法包括测量化合物1-16中任一种在来自受试者的生物样品中的水平，和如果在生物样品中检测出与相应的对照(例如，该化合物在健康受试者中的相应水平)相比该化合物的水平升高(诸如升高的水平，例如至少增加2倍)，则该将受试者诊断为患有慢性瘙痒或有患慢性瘙痒风险的受试者。

在一些实施方式中，本文提供了评估慢性疼痛的方法，例如用于测定受试者(诸如健康受试者或者怀疑患有或有患慢性疼痛风险的受试者)患慢性疼痛的可能性或在未来将有可能发展慢性疼痛的可能性。所述方法包括测量化合物1-16中任一种在来自受试者的生物样品中的水平，和如果在生物样品中检测出与相应的对照(例如，该化合物在健康受试者中的相应水平)相比该化合物的水平升高(诸如升高的水平，例如至少增加2倍)，将将该受试者诊断为患有慢性疼痛或有患慢性疼痛风险的受试者。

在一些实施方式中，本文提供了评估自体免疫的方法，例如用于测定受试者(诸如健康受试者或者怀疑患有或有患自体免疫病症风险的受试者)患自体免疫病症的可能性或在未来将有可能发展自体免疫病症的可能性。所述方法包括测量化合物1-16中任一种在来自受试者的生物样品中的水平，和如果在生物样品中检测出与相应的对照(例如，该化合物在健康受试者中的相应水平)相比该化合物的水平升高(诸如升高的水平，例如至少增加2倍)，则将该受试者诊断为患有自体免疫病症或有患自体免疫病症风险的受试者。

在一些实施方式中，本文提供了评估动脉粥样硬化的方法，例如用于测定受试者(诸如健康受试者或者怀疑患有或有患动脉粥样硬化风险的受试者)患动脉粥样硬化的可能性或在未来将有可能发展动脉粥样硬化的可能性。所述方法包括测量化合物1-16中任一种在来自受试者的生物样品中的水平，和如果在生物样品中检测出与相应的对照(例如，该化合物在健康受试者中的相应水平)相比该化合物的水平升高(诸如升高的水平，例如至少增加2倍)，则将该受试者诊断为患动脉粥样硬化或有患动脉粥样硬化风险的受试者。在一些实例中，受试者可具有升高的胆固醇或甘油三酸脂水平、升高的C-反应蛋白水平、糖尿病或高血压。因此，本文公开的方法可用于确认先前对疾病的临床怀疑。

在一些实例中，生物样品是从用于评估的受试者得到的。生物样品可以是任何相关的生物样品，诸如但不限于，血清、血液、血浆、尿液、纯化细胞(例如，血细胞，诸如白细胞、B细胞、T细胞或单核细胞)、唾液、活检或组织(诸如皮肤)样品，诸如包括从受试者获得的血管、脂肪细胞、心脏组织、神经组织的样品用于预测受试者的疾病或病症(诸如炎症、慢性瘙痒、慢性疼痛、自体免疫病症和动脉粥样硬化)的风险。

V.实施例

以下实施例提供用于说明某些实施方式的具体特征，但权利要求的范围不应被限制于所例举的那些特征。

实施例1

用于发现疼痛和瘙痒的新介体(mediator)的系统方法

慢性疼痛和瘙痒是造成个人痛苦、残疾和社会支出的常见原因。当前的治疗常常仅提供部分或暂时的缓解并且具有实质性的副作用。需要发现新的内源介体以及疼痛和瘙痒的潜在机制以促进靶向性的、有效的、安全的干预措施的开发。

作为最大的感觉器官，皮肤被能感觉微环境的皮肤神经末梢丰富地支配。亚油酸(LA，18:2n-6)–迄今为止皮肤中最丰富的多不饱和脂肪酸–被称为“必需脂肪酸”，因为在饮食中需要有少量(能量的约0.5％)以形成预防经表皮失水(transepidermal water loss)的外在蜡质表皮屏障。由于瘙痒和疼痛是皮肤炎性疾病的常见表现，并且LA是转化为生物活性脂质介体的内源底物，因此，LA衍生的介体可能在调节皮肤瘙痒和疼痛方面具有独特的地位。

先前在大鼠中显示，饮食中LA的增加会在包括皮肤的许多组织中以剂量依赖的方式增加众所周知的LA衍生物。在人中，低LA饮食干预减轻头痛，并且减少与疼痛缓解相关的循环的LA，这表明LA衍生的脂质介体可能有助于感觉信号传导。然而，对于介导或调节其生物合成和信号转导中涉及的感觉以及分子途径的具体LA衍生物仍未完全了解。

据推测，皮肤中富含的新LA衍生的自体活性物质(autacoids)可能在疼痛和瘙痒的发生中起作用。通过在大鼠和人中应用基于系统的翻译方法(systems-based,translational approach)，对该假说进行研究从而：

(1)根据组织特异的前体丰度和生物合成基因的基因表达谱预测新的脂质介体；

(2)通过全化学合成来合成预测化合物；

(3)使用真实标准品和液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)在大鼠和人组织中鉴定和定量这些介体；

(4)确定是否可以通过饮食和慢性炎性状态改变这些化合物的水平；和

(5)使用盲法离体感觉神经元培养和体内行为测试来检验这些新脂质的止痛和引起瘙痒的活性。鉴定生物合成基因及其表达的这种方法和系统的综述鉴定了能调节炎性皮肤病症、瘙痒和伤害感受的新LA衍生脂质介质。

结果

基于前体丰度和生物合成基因表达谱预测介体

前体脂肪酸组合物和组织的基因表达谱用于指导新脂质介体的预测。观察到LA是大鼠皮肤和坐骨神经中丰度最高的多不饱和脂肪酸，分别占总脂肪酸的27.4％和24.6％。LA在感觉神经节中和在背侧脊髓中的丰度要低得多。

ALOX12B和ALOX15B基因(其编码能够过氧化包含1,4-顺式,顺式-戊二烯系统的多不饱和脂肪酸的酶)人类皮肤中被很好地表达；ALOX12B而非ALOX15B在大鼠皮肤中也被很好地表达。ALOX15B在人胫神经和背根神经节(DRG)中被相当好地表达，但在包括伤害感受回路的大鼠神经组织(即坐骨神经、DRG和脊髓背角)中表达较少或缺失。ALOXE3基因(其编码能够使脂肪酸氢过氧化物酶异构化以形成特定羟基-和-酮基-环氧化物衍生物的酶)在大鼠和人的皮肤中也良好表达，但在周围神经、感觉神经节和背索中表达较少或不存在。CYP2S1基因(其编码能够使脂肪酸氢过氧化物酶异构化的另一种酶)在大鼠皮肤，特别是坐骨神经中被很好地表达，但在人疼痛回路组织中表达较少或缺乏。总体上，这些基因表达和前体脂肪酸数据形成了预测新脂质介体的模板。

羟基-环氧基-和酮基-环氧基-十八碳烯酸的组织特异性分布

基于上面注意到的高水平的LA和编码生物合成酶的基因的中到高度的表达，预测了两种新的11-羟基-反式-环氧基-十八碳烯酸：

11-羟基(H)-12,13-反式-环氧基-(E)-十八碳烯酸(11H-12,13E-LA)

11-羟基(H)-9,10-反式-环氧基-(E)-十八碳烯酸(11H-9,10E-LA)

和两种新的11-酮基-反式-环氧基-十八碳烯酸：

11-酮基(K)-12,13-反式-环氧基-(E)-十八碳烯酸(11K-12,13E-LA)

11-酮基(K)-9,10-反式-环氧基-(E)-十八碳烯酸(11K-9,10E-LA)

以及4种先前鉴定的9-或13-羟基-或酮基-反式-环氧基-十八碳烯酸：

9-羟基(H)-12,13-反式-环氧基-(E)-十八碳烯酸(9H-12,13E-LA)

13-羟基(H)-9,10-反式-环氧基-(E)-十八碳烯酸(13H-9,10E-LA)

9-酮基(K)-12,13-反式-环氧基-(E)-十八碳烯酸(9K-12,13E-LA)

13-酮基(K)-9,10-反式-环氧基-(E)-十八碳烯酸(13K-9,10E-LA)

将在人和大鼠皮肤中大量存在。这些化合物如下所述：

在将这8种LA衍生物进行全化学合成以用作真实标准品后(参见材料和方法及以下实施例)，使用超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)定量大鼠和人组织中的这些介体。发现8种介体中有5种存在于大鼠皮肤中，但没有一种在大鼠背角中被检测到，表明该预测模型的组织特异性。在人类皮肤中检出了全部8种介体；通过匹配在特征保留时间处的真实标准品与人类皮肤提取物的离子光谱确认了这8种介体中的7种。

在发炎的银屑病人类皮肤中游离介体的水平升高

与无病变银屑病皮肤相比，银屑病损伤显示了编码脂酶介导释放(PLA2G2A，PLA2G2F)、酶促过氧化(ALOX12B)和氢过氧化物异构化(CYP2S1)的基因的较高表达。因此，酯化的、预先形成的脂质的局部生物合成和释放的增加将潜在地有助于在银屑病损伤中观察到的较高浓度的羟基-环氧基-和酮基-环氧基-十八碳烯酸。

在人银屑病皮肤损伤和非银屑病对照皮肤中，在未酯化(游离)脂质级分和总脂级分(游离与酯化的总和)中均测量了这些介体。在银屑病皮肤损伤和对照皮肤之间，在总脂质级分方面无显著差异。然而，与对照皮肤相比，在银屑病皮肤损伤中作为游离酸(生物活性池)的六种介体(11H-12,13E-LA、11H-9,10E-LA、11K-9,10E-LA、9H-12,13E-LA、9K-12,13E-LA和13H-9,10E-LA)显著升高。与对照皮肤相比，银屑病损伤中游离11H-12,13E-LA和9K-12,13E-LA的浓度分别高出>6倍和>30倍。在报告患有瘙痒的银屑病患者的病变中观察到最高浓度(图1)。

为进一步得到对每种介体生化状态的了解，将游离酸浓度除以总介体浓度以确定作为生物可利用的游离酸存在的每种介体的百分比。游离酸的百分比根据介体而明显不同。在对照人类皮肤中，游离酸的百分比的范围从13H-9,10E-LA的0.05％到11H-12,13E-LA的44.4％。在银屑病皮肤损伤中，11H-12,13E-LA、11K-12,13E-LA、9K-12,13E-LA和13H-9,10E-LA的游离酸百分比显著高于对照皮肤。这些发现支持以下假说：在慢性表皮炎症中，来自酯化脂质的游离酸的酶促合成和/或释放增加。

血清中的介体浓度与皮肤或银屑病状态不相关

为确定从循环血中获得的测量结果是否能提供皮肤炎症的替代标记物，接下来定量了来自银屑病患者和非银屑病对照的血清中的这些介体。与皮肤不同，这8种介体的血清浓度不因病情状况而不同。

新LA衍生物以区域选择性方式刺激大鼠感觉神经元

为测定这些介体是否敏化了DRG神经元，在成年大鼠DRG离体降钙素基因相关肽(CGRP)释放测定中测试了每种介体，PGE2用作阳性对照。在中性pH 1μm浓度下，无论是PGE2还是任何其他测试化合物都没有直接刺激CGRP释放。然而，11H-12,13E-LA和11H-9,10E-LA显著增强了低-pH引起的和辣椒素引起的CGRP释放。13H-9,10E-LA显著增强了低pH引起的CGRP释放，但对辣椒素引起的释放没有影响。无论是9H-12,13E-LA还是任何测试的酮基-环氧基-十八碳烯酸都没有增强低pH引起的或辣椒素引起的CGRP释放(图2A-2C)。这些观察结果表明十八碳烯酸诱导的敏化是区域选择性的，对于在碳11处和相邻的环氧基基团处均包含羟基的化合物观察到最有力的影响。这两种化合物均具有3-羟基-Z-戊烯基-E-环氧化物部分，将这种子结构鉴定为可能的介导伤害感受器敏化的药效团(图2D)。

皮内注射新介体在啮齿类动物中引发与疼痛和瘙痒相关的行为

接下来，测定了对皮内注射介体的行为反应，所述介体产生敏化，如通过对所引起的来自分离的感觉神经元的CGRP释放的增加来测量的。选择11H-12,13E-LA作为测试疼痛反应的第一介体，因为在发炎的人类皮肤中富含游离酸形式的这种物质，并且其增加了在大鼠感觉神经元中辣椒素和pH刺激的CGRP释放。

对于这些实验，将LA衍生物的影响与载体和经典的炎症介体PGE2(作为阳性对照)进行比较。观察到，在注射后，对于11H-12,13E-LA和PGE2，C纤维缩回潜伏期分别减少了28％(p＝0.03)和46％(p＝0.001)，表明伤害感受超敏性(图3)。皮内注射PGE2而非11H-12,13E-LA也显著提高了在用调谐至兴奋Aδ纤维的激光刺激后的缩回反应的比例。

接下来，为检验这8种介体对瘙痒的影响，采用小鼠模型以定量在皮内注射入颈背之后的前30分钟内与瘙痒相关的抓挠发作。在每组n＝3的所有8种介体的小规模测试中，与载体相比，2种介体(9K-12,13E-LA和13K-9,10E-LA)看起来均增加了抓挠发作。在每组n＝6-8的较大样本量的情况下，观察到9K-12,13E-LA而非13K-9,10E-LA诱导了与瘙痒相关的抓挠行为(p＝0.001)(图4A)。组合起来，与载体相比，9K-12,13E-LA+13K-9,10E-LA也显著增加了抓挠行为(p＝0.002)，但与单独使用9K-12,13E-LA所观察到的程度相同。9K-12,13E-LA引起的抓挠反应比组胺观察到的发作更慢，并且逐渐变弱。

结合表明9K-12,13E-LA专门在瘙痒患者的银屑病损伤皮肤中升高的结果(图2B)，这些行为发现表明9K-12,13E-LA可能代表了一种新的瘙痒介体。

新介体受饮食LA调节，并且血浆水平降低与临床疼痛减少相关

接下来，为确定是否可以通过降低饮食中这些介体的前体LA的量来减少这些介体，使用了来自完全随机人临床试验中的血浆样本，测试在患有严重的慢性每日头痛的患者中进行为期12周的LA减少的饮食。观察到这8种介体中的5种存在于血浆中(图5)。通过LA减少的饮食干预显著减少了两种介体(11H-12,13E-LA和13H-9,10E-LA)；4种羟基-环氧化物-十八碳烯酸的总和减少了41％(p<0.001)(图5A)。此外，观察到饮食引发的这些介体之一(11H-12,13E-LA)的减少(但其他介体没有减少)与每日头痛小时数和每月头痛天数的减少密切相关(图5B和5B和5C)。11H-12,13E-LA的每个标准差降低与每日头痛小时数和每月头痛天数分别减少25％和11％(均为p<0.001)相关；11H-12,13E-LA的减少也倾向于与总体头痛影响(图5D)和身体功能的改善相关，但与心理困扰无关。

讨论

本实施例为啮齿动物和人类提供了一种跨学科的翻译方法，从而发现并表征了疼痛和瘙痒的内源脂质介体的一个新家族。如预测的那样，在人类皮肤中测得了显著浓度的11H-12,13E-LA、11H-9,10E-LA、11K-12,13E-LA和11K-9,10E-LA。相信这是这4种化合物中任何一种在任何物种中的首次证明。值得注意的是，在离体CGRP释放试验中，11H-12,13E-LA在发炎的银屑病人类皮肤中、在敏化的初级传入背根神经节神经元中升高，并且在大鼠中诱导C-纤维介导的疼痛相关超敏性。此外，血浆11H-12,13E-LA与人类的头痛频率和影响相关，并通过降低饮食中其饮食前体(LA)的量而降低。总的来说，这些发现表明11H-12,13E-LA可能是受饮食和炎症调节的疼痛介体。11H-9,10E-LA(其与11H-12,13E-LA具有相同的3-羟基-Z-戊烯基-E-环氧化物部分)在发炎的人类皮肤和敏化的大鼠感觉神经元中也升高，这表明它可能也有助于炎症相关的初级传入敏化。

除了鉴定出新的内源LA衍生物外，这些发现还证实了人类皮肤中先前鉴定出的羟基和酮基-环氧基-十八碳烯酸的存在，并为其潜在的生物作用提供了新见解。编码12-R-脂氧合酶(ALOX12B)、15-脂氧合酶-2(ALOX15B)和氢过氧化物异构酶e-脂氧合酶3(ALOXE3)的基因在皮肤中高度表达。以前曾有人提出，两种特异性酶12-R-脂氧合酶和e-脂氧合酶-3的连续作用将酰基-神经酰胺中酯化的LA氧化，形成13H-9,10E-LA的特定立体异构体(13-(R)羟基-9(R),10(R)-反式-环氧基-(11E)-十八碳烯酸和/或其三羟基LA衍生物，据称它们在角质细胞脂质包膜的形成中起关键作用)。所提出的对这些特定LA衍生物形成功能性水屏障的需求可以解释这种机理，即需要少量饮食LA来预防“必需脂肪酸缺乏症”的临床表现，包括皮肤干燥、增厚和脱屑。与先前的发现一致，在本文中在啮齿动物和人类皮肤中观察到相对高浓度的13H-9-E-LA。在人类皮肤中，13H-9-E-LA几乎仅在酯化脂质池中发现(中位数>99.5％)，这与其在表皮角质细胞脂质包膜形成中的拟议作用一致。另外，在这里首次报道了银屑病皮肤损伤中游离13H-9-E-LA的浓度比对照人类皮肤高9倍。结合在低pH环境中游离13H-9-E-LA增强感觉神经元CGRP释放的发现，银屑病皮肤中较高水平的这种游离酸表明，它可能潜在地导致伴随皮肤炎症的超敏性。

鉴定9-酮基-12,13-环氧基-十八碳烯酸为新的内源致痒原(pruritogen)

本实施例的另一个发现是将9K-12,13E-LA鉴定为内源致痒原，其在报告慢性瘙痒的银屑病患者的发炎的人类皮肤中升高，但在没有痒感特征的病变中不升高。先前已在人血浆中检测到9K-12,13E-LA，并有报道称其可刺激肾上腺类固醇生成，表明其具有生物活性。与13H-9,10E-LA相似，在对照人类皮肤中，观察到绝大多数(>99％)的9K-12,13E-LA在酯化脂质级分中发现。与对照皮肤相比，这种介体在银屑病皮肤损伤的游离脂肪酸脂质池中显著较高(>30倍)的浓度表明9K-12,13E-LA可能是皮肤炎症中的信号分子。与此一致的是，观察到将游离9K-12,13E-LA注射到小鼠真皮中会引起与瘙痒相关的抓挠行为。相信9K-12,13E-LA只是被报告为在啮齿动物瘙痒模型中诱导抓挠行为的第四脂质介体。不同于被认为仅以游离酸形式存在的其他已知脂类致痒原(白三烯B4、血栓烷A2、氢过氧-二十碳四烯酸)，大多数9K-12,13E-LA预先储存在酯化的皮肤脂质中。酯化脂质中的这种积累表明，脂肪酶可以释放预先形成的9K-12,13E-LA以直接刺激瘙痒，从而避免了从头进行生物合成的需要。就这一点而言，在大鼠皮肤以及尤其是发炎的人类皮肤中检测到可以发挥相关的脂肪酶功能的PLAG2A和PLAG2F的高表达。

通过饮食调节羟基-环氧基-十八碳烯酸和慢性头痛

先前在大鼠中证明，增加的饮食LA作为控制变量，显著增加了LA和其众所周知的氧化LA衍生物(例如，羟基十八烷酸(HODEs)、环氧基-十八碳烯酸、二羟基-十八碳烯酸)在与特发性疼痛综合征相关的组织(包括皮肤)中的丰度。此外，在患有严重慢性头痛的患者中，LA降低的饮食干预措施可减少头痛，并且循环LA的降低与临床疼痛减少相关，这表示LA或其自体活性物质衍生物可能导致人的疼痛。在本研究中，发现饮食诱导的循环11H-12,13E-LA的减少与临床疼痛减轻密切相关，这增加了高LA摄入可能有助于发展慢性疼痛或瘙痒的生化易感性的可能性，部分通过提高羟基-和酮基-环氧基-十八碳烯酸的组织水平。本报道向不断发展的疼痛和瘙痒的脂质介体的领域引入了新介体。该领域的绝大多数工作都集中在源自长链(≥20个碳)的多不饱和脂肪酸的介体，尤其是源自花生四烯酸(AA)的介体。由于LA在皮肤和某些上皮组织中的丰度远高于AA和其他多不饱和脂肪酸，并且其也是酶促转化为氧化介体的底物，由LA衍生的介体在调节这些组织中的伤害性和瘙痒性反应方面有独特地位。Hargreaves及同事(Patwardhan et al.,The Journal of clinicalinvestigation 120,1617,2010；Patwardhan et al.,P.N.A.S.,106,18820,2009)以前揭示9-HODE、13-HODE和其他总所周知的LA-衍生物在外周和中枢神经系统都具有伤害性反应。体内皮肤炎性反应的特征在于低pH和许多脂质和非脂质介体的同时升高，这些与炎症相关的超敏性相关(Han and Simon,Science signaling 4,er3,2011；Sun and Chen,Jdental research,95,135,2016)。在这些条件下，9-HODE和13-HODE能潜在地被细胞色素p450环氧化酶或脂氧合酶转化为9H-12,13E-LA、13H-9,10E-LA和其他生物活性LA衍生介体。

材料和方法

临床样品制备、啮齿动物行为测试、离体CGRP释放测定和所有实验室分析均由对临床数据和治疗组不知情的研究人员进行。

数据分析

正态分布的数据表示为平均值±标准误差，并使用学生t检验(Student’s t-test)(两组)或单向方差分析(多个组)进行了比较，并对图例中所述的多个比较进行了校正。非正态分布的数据表示为中位数和四分位距(interquartile range)，并使用威尔科克森秩和检验(Wilcoxon rank-sum test)(两组)和克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test)(多个组)进行比较，并针对图例中所述的多个比较进行了校正。进行多次比较调整后，p<0.05被认为是显著的。

大鼠组织采集

本研究中分析的大鼠组织是根据美国国家牙科与颅面研究所和临床中心的机构动物护理和使用委员会(the institutional Animal Care and Use Committees of theNational Institute of Dental and Craniofacial Research and the ClinicalCenter,NIH)批准的方案获得的。成对圈养雄性Sprague-Dawley大鼠，并随意取食啮齿动物NIH-31M改良配方食物(Ziegler)和水。为获得后爪、坐骨神经、DRG、TG和背角组织，用异氟烷麻醉大鼠，断头，并立即解剖组织。使用解剖刀收集后爪的足底表面的切片。从坐骨切迹远端开始切开坐骨神经，并延伸至坐骨神经三叉神经正上方。在椎板切除之后去除L4和L5DRG。使用注射器和盐水通过液压力将脊髓从脊柱中排出，并且分离左和右背侧象限。将组织立即在干冰上冷冻，并在-80℃下储存直至处理。在SRA数据库中的项目PRJNA313202下可获得大鼠DRG和坐骨神经RNA-测序数据。

大鼠疼痛回路组织的前体脂肪酸

如前所述分析组织脂肪酸(11)。简言之，根据Folch等(Ramsden et al.,Molecμlar pain 12,2016)的方法，将样品解冻，称重，并在丁基化羟甲苯(BHT)/甲醇中匀浆化以进行脂肪酸提取。在操作过程中，在甲醇中添加BHT以减少脂质氧化。将内标准品二十三烷酸甲酯(23:0)添加到每个样品中。在此之后用14％BF₃/甲醇进行甲基化。在氮流下将己烷萃取液浓缩至小体积，随后其转移至微量瓶中进行GC分析。使用配有火焰离子化检测器(Hewlett-Packard,Palo Alto,CA)和熔融石英毛细管色谱柱(DB-FFAP，15m×0.100mmi.d.×0.10μm膜厚，J&W Scientific,Folsom,CA)的HP-7890A气相色谱仪分析脂肪酸甲酯。检测器和进样器温度设置为250℃。烤箱温度程序从150℃开始0.25分钟，随后以10℃/min的速率升高到200℃，随后以3.5℃/min的速率升高到225℃并保持0.5分钟，最后以40℃/min的速率升高至245℃，最终保持15分钟。氢用作载气，直线速率为50cm/s。使用定制混合的、30种组分的、定量甲酯标准品(包含10-24个碳和0-6个双键)来确定保留时间，并确保准确定量(Nu Chek Prep462,Elysian,MN)。脂肪酸数据以总峰面积的％表示，这相当于重量％±5％，如通过定量标准品混合物所验证的。采用内标法计算组织脂肪酸浓度。

人疼痛回路组织的基因表达

用于RNA测序分析的组织采集和RNA纯化

4种人L3 DRG购自Anabios(San Diego,CA)，来自不同性别的四个正常器官捐献者。如Goswami等(Molecμlar pain 10,44,2014)所描述的，作为NIMH Human BrainCollection Core的采集程序的一部分，在椎体交叉的水平上收集3个人髓质背角样品，并通过解剖从新鲜组织中分离出背角的灰物。使用Fastprep 24匀浆器(MP Biomedicals,Santa Ana,CA)或使用Polytron匀浆器(IKA,Wilmi ngton,NC)在Qiazol试剂(Qiagen Inc,Valencia CA)中将大鼠和人样品匀浆，并使用RNeasy Mini kit(Qiagen Inc,ValenciaCA)用DNA酶消化来纯化。在使用Agilent生物分析仪(Agilent Technologies,SantaClara,CA)进行凝胶电泳之后，评估RNA完整数(RIN)。对于大鼠组织，对RIN大于8.5的样品测序。对于人DRG，对RIN高于7的样品测序。对于其他人类样品，获得了最高的可能RIN。这项研究中包含的最低样品为5.5。

RNA测序计数数据的比对和定量

通过(version 2.4.2a)(Dobin et al.(Bioinformatics 29,15,2013)和rn6基因组构建(Ensembl)来比对大鼠数据。使用QoRTs(version 0.3.18)(Hartley and Mμllikin,BMC bioinformatics 16,224,2015)定量得自该分析的bam文件，并将其转化为原始读取计数和FPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)。选择来自GTEx库的8个高质量样品(基于RIN)来评价人类皮肤(小腿)和胫神经的数据。从可通过协作(Consortium,Nature genetics 45,580,2013)得到的数据文件直接获取RPKM值。从SRA数据库(PRJNA236547)(Swindell et al.,Genome medicine 7,86,2015)评估银屑病皮肤样品。使用MAGIC pipeline(Zhang et al.,Genome biology 16,133,2015)和在2016年3月根据Refseq and Aceview annotations(Thierry-Mieg and Thierry-Mieg,Genomebiology 7Suppl 1,S12 1,2006)建立的基因组靶来比对和定量来自SRA的数据与其他人类数据。用于MAGIC比对的基因组靶文件可经请求获得。通过MAGIC进行基因计数的定量和标准化，并且以sFPKM报告。

羟基-环氧基-和酮基-环氧基-十八碳烯酸的全化学合成

每种化合物都是通过全化学合成完成的。通过快速色谱和/或正相HPLC纯化合成的化合物。NMR分析显示化学位移和耦合常数与每个化学结构一致。在氘代氯仿中通过质子NMR分析所示的游离酸或甲酯形式的羟基-环氧基-或酮基-环氧基-十八碳烯酸。

用LC-MS/MS鉴定和定量羟基-和酮基-环氧基-十八碳烯酸

通过全合成制备的真实标准品用于使用UPLC-MS/MS鉴定和定量人和大鼠组织中的这8种内源化合物。简言之，使用Strata X盒(33u,200mg/6mL,Phenomenex,PA)从生物基质中固相萃取(SPE)脂环素。在提取样品之前，将盒用6mL甲醇调节，随后加入6mL水。样品用6mL 10％甲醇洗涤。用6mL甲醇将脂环素洗脱到包含10μL 30％甘油的甲醇溶液的玻璃管中。将洗脱液在氮流下蒸发至干，并用40μL甲醇复液，将等分试样(10μL)注入LC/MS/MS系统。使用与Qtrap 5500(AB SCIEX,USA)偶联的UPLC(Shimadzu Scientific Instruments,Columbia,MD)进行定性和定量分析。简言之，在ZorBAX RRHD Eclipse+C18柱(100mm x4mm；1.8μm)(Agilent Corporation,Palo Alto,CA)上进行分离，其由(A)12mM乙酸铵溶液和乙酸(100:0.02v/v)和(B)12mM乙酸铵和乙腈/水/乙酸(90:10:0.02，v/v/v)组成。流速为0.5mL/min。柱箱温度设定为30℃。洗脱梯度条件如下：0-2.0min为25-40％B，2-8min为40-46％B，8-9min为46-57％B，9-20min为57-66％B，20-22min为66-76％B，22-27min为76-100％B，27-33min保持在100％B，33.1-35min为100-25％B。质谱仪使用预定的多反应监测(sMRM)在电喷雾负离子化中运行，以90s的保留时间窗获取每个分析物的MRM数据。源参数设置如下：离子喷雾电压，-4500V；雾化气体(GS1)，65psi；涡轮气体(GS2)，70psi；以及涡轮离子喷雾源温度(TEM)，500℃。使用MRM定量分析物。对于合成标准物中具有2或3个异构峰的羟基-环氧基-十八碳烯酸和酮基-环氧基-十八碳烯酸，通过如下进行定量：其相关峰面积分量的总峰面积比/由Analyst 1.6.2生成的峰面积IS，并在Microsoft Excel中绘制分析物总峰面积比/峰面积IS相对于浓度的最佳拟合，并拟合为方程y＝ax+b。使用增强产物离子扫描模式以1000Da/s的扫描速率获得MS/MS谱图。使用35V的碰撞能量和10的碰撞能量散布进行碰撞诱导的解离(CID)。使用分析软件(版本1.6.2,AB Sciex)进行数据处理。通过使用全离子模式对来自银屑病皮肤样品的内源LA衍生物的MS/MS谱图和保留时间与合成材料进行匹配确认了8种预期的内源化合物中7种的鉴定。

使用样品采集的人类研究

银屑病和对照参与者的皮肤活检和血清采集

该研究包括八个连续的银屑病参与者和7个非银屑病对照(年龄范围26–82岁)，所述研究被登记为银屑病和心脏代谢病的正在进行中的NIH观察性研究(NCT01778569)。研究程序已获得国家心肺血液研究所机构审查委员会(National Heart,Lung and BloodInstitute Institutional Review Board)批准。所有参与者在登记前均已提交书面知情同意书。简言之，皮肤科医生使用银屑病面积严重程度指数(Psoriasis Area SeverityIndex,PASI)对银屑病的诊断进行确认和定量。使用自我报告问卷记录了是否存在大量瘙痒。连续招募相应的对照来进行与银屑病参与者相同的测试。所有参与者在活检之前2周内未进行任何全身性抗银屑病治疗或局部治疗。在基线时，在局部麻醉下从银屑病斑块和未受影响的皮肤中获得4毫米的穿孔活检。根据活性斑块选择活检部位，并且在受试者之间有所不同。然而，未受影响的皮肤和对照皮肤的活检主要来自臀部。来自同一参与者的全血收集在血清分离管中，离心并立即在-20℃下储存直至分析。

慢性每日头痛(CDH)实验

CDH试验是一项为期12周的随机试验，其被设计用于测试低亚油酸饮食(L6干预)在患有CDH的人群中的临床和生化影响，所述低亚油酸饮食伴有或不伴有n-3脂肪酸的同时增加(H3-L6干预)。该试验于2009年4月至2011年11月在北卡罗来纳大学教堂山分校(University of North Carolina at Chapel Hill(UNC))进行。试验程序已获得UNC机构审查委员会(UNC Institutional Review Board)批准，并且之前已经描述了实验方案、饮食组成和主要临床发现和一些生化发现(Ramsden et al.,Trials 12,97,2011；MacIntoshet al.,The British journal of nutrition 110,559,28,2013)。简言之，招募符合头痛>4小时/天和>15天/月并持续至少3个月以及头痛史>2年的CDH头痛标准的成年人参加。在4周的干预前阶段，参与者继续进行日常护理和日常饮食，并且在每日头痛日记中记录头痛特征。完成磨合(run-in)阶段后，参与者随机分配到两种研究饮食中的一种，持续12周。通过限制消耗植物油和其他富含LA的来源并代之以富含单不饱和及饱和脂肪的植物油和食物来减少研究饮食中的LA。在基线和12周饮食阶段结束时收集血浆。先前有报道称，H3-L6干预可显著降低头痛频率和严重程度，并且提高生活质量和功能，同时减少使用急性止痛药物(Ramsden et al.,Pain 154,2441,2013；Ramsden et al.,Pain 156,587,2015)。n-6或n-3-衍生的脂质自体活性物质的一个或多个家族中饮食诱导的变化可能有助于这些临床益处；然而，导致这些影响的具体机制尚不清楚。在本研究中，干预前和干预后的血浆样品用于：(1)使用威尔科克森配对符号秩检验(Wilcoxon matched-pairs signed-rankstest)来探讨研究饮食是否改变了LA的羟基-和酮基-环氧基衍生物的血浆水平；和(2)使用针对每个结果和介体的基线值调整的回归模型，探讨介体浓度的变化是否与临床疼痛减轻相关。

制备用于LC-MS/MS分析的实体组织

将实体组织(人类皮肤、大鼠后爪、大鼠背角)转移到冰上的FastPrep裂解基质管中(MP Biomedicals,USA；裂解基质A用于皮肤和后爪，裂解基质D用于背角)，并且将体积至少多8倍的含0.02％BHT和0.02％EDTA的冰冷甲醇立即加入到每个试管中(v/v)。将已知量的内标物添加到每个样品中，并使用FastPrep-24匀浆器(MP Bio)将样品匀浆化。将组织匀浆转移至-80℃并保持1小时以沉淀蛋白质。将匀浆在4℃下以17000g离心10分钟，随后将上清液转移到新试管中。将一半上清液在-80℃下保存，直到进行SPE纯化和LC-MS/MS分析。为分析总脂质池，将另一半上清液于60℃在轻柔摇动下用2.6wt％碳酸钠皂化30分钟。随后使用乙酸中和溶液(pH 5-7)，并且在-80℃下储存过夜。将脂质提取物(游离和皂化的总量)添加到体积多9倍的冰冷水中，随后立即通过SPE和LC-MS-MS分析纯化。

制备用于LC-MS-MS分析的血浆和血清

将200μL血浆或血清转移至500μL含有0.02％BHT和0.02％EDTA的冰冷甲醇中，并转移至-80℃以沉淀蛋白质(如上所述)。随后加入已知量的内标物，样品离心并按上述方法收集上清液。如上所述，随后将上清液加到体积多9倍的冰冷水中，并用SPE纯化和通过LC-MS/MS分析。

离体感觉神经元敏化测定(CGRP释放测定)

对于释放实验，这项工作得到印第安纳波利斯印第安纳大学医学院的动物护理和使用委员会(Animal Care and Use Committee at Indiana University School ofMedicine,Indianapolis,IN)批准。如前所述制备成年大鼠感觉神经元培养物(Burkey,Hingtgen,and Vasko,Methods in molecμlar medicine 99,189,2004；Kelley et al.,PloS one 9,e106485,2014)。将细胞在F-12培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中于3％CO₂，37℃下保持10-12天，所述培养基补充有10％马血清、2mm谷氨酰胺、100μg/mlnormocin^TM、50μg/ml青霉素、50μg/ml链霉素、50μm5-氟代-2'-脱氧尿苷(Invitrogen)、150μm尿苷和30ng/ml NGF(Harlan Bioproducts for Science,Inc.Indianapolis,IN)。在释放实验当天，将培养物用HEPES缓冲液(25mm HEPES、135mm NaCl、3.5mm KCl、2.5mm CaCl₂、1mm MgCl₂、3.3mm D-葡萄糖和0.1％牛血清白蛋白，pH 7.4，并维持在37℃下)清洗。随后在药物存在或不存在下将培养物与0.4ml的相同缓冲液温育。通过如下方式测定基础释放：将细胞单独暴露于HEPES缓冲液10分钟，随后在介体存在下暴露于缓冲液10分钟以确定化合物是否刺激释放。随后在介体存在或不存在下将培养物暴露于包含30nM辣椒素的缓冲液或pH被调节至6.0的缓冲液。随后将细胞再暴露于不含药物的HEPES缓冲液中进行10分钟的温育以重新建立基础释放。在每次温育后，去除缓冲液以使用如前所述的放射免疫测定法来测量CGRP的量(Chen et al.,Peptides 17,31,1996)。在每次释放实验结束时，通过将培养物暴露于0.1M HCl 10分钟以低渗裂解细胞，并且获取等分试样以使用放射免疫测定法来测量培养物中的总CGRP含量。CGRP的总含量未因暴露于炎性介体而显著改变。释放数据以细胞/10分钟的fmol/孔表示，所述数据来自不同收获批次的三个独立实验。统计分析使用ANOVA和Tukey的事后检验进行。

啮齿动物行为测定

瘙痒感受(瘙痒)行为

将LA的羟基-和酮基-环氧化物衍生物(100μg)或组胺(50μg)皮内注射入雌性小鼠的颈背(C57BL/6J，来自Jackson Laboratory)。独立注射LA衍生物(9-酮基-12,13-环氧基-(10E)-十八碳烯酸或13-酮基-9,10-环氧基-(11E)-十八碳烯酸)和组合注射[9-酮基-12,13-环氧基-(10E)-十八碳烯酸+13-酮基-9,10-环氧基-(11E)-十八碳烯酸(各100μg)]。将瘙痒感受行为定量为在30分钟内评定的抓挠发作次数，如前所述(Mishra and Hoon,Science 340,968,2013)。

疼痛感受(疼痛)行为

将11-羟基-12,13-反式-环氧基-(9Z)-十八碳烯酸(30μg)皮内注射到雄性Sprague-Dawley大鼠的后爪中。注射前对所有测试进行基线测量。如先前所述(Mitchellet al.,Pain 155,733,2014)，测量了A-δ和C-纤维介导的后爪缩回反应。简言之，通过用100ms的激光脉冲刺激爪的足底表面，产生迅速缩回反应。激光脉冲由红外二极管激光器(LASS-10M；Lasmed,Mountain View,CA,USA)传送，并且在0.5mm直径下被校准至3500mA，并从1cm距离传送，通过向后爪足底表面传送缓慢的温度上升来测量C纤维介导的反应，当主动缩爪时终止刺激。将激光刺激调整为导致约10秒的缩回潜伏期(1000mA，13cm距离)。

实施例2

11-羟基-和11-酮基-反式-环氧基-十八碳烯酸

本实施例说明了示例性的11-羟基和11-酮基-反式-环氧基-十八碳烯酸化合物的制备。下面说明了示例性的反应过程：

在0℃下，向9-羟基壬酸甲酯(1g)的二氯甲烷(8ml)溶液中加入戴斯-马丁高碘烷(1.7当量；3.83g)。10分钟后移除冰浴，使反应进行最多2个小时(直到TLC检测没有残留起始材料为止)。将反应混合物用200ml 10％乙酸乙酯/己烷稀释，随后将其立即倒在硅胶上。用相同的溶剂洗脱，产生的醛产品收率为90％(890mg)。

用三乙胺(1.1当量；1.11ml)处理2.44g(甲酰甲基)三苯基氯化鏻在12ml甲苯中的溶液，并搅拌1小时，随后添加醛(890mg；4.78mmol)在甲苯中的溶液，并将反应在80℃下搅拌2小时。混合物随后通过硅藻土过滤，并且在硅胶上纯化(15％乙酸乙酯/己烷)，得到608mg烯醛产物。

向庚炔(1.5当量；0.562ml)在5ml THF中的冷却(-78℃)溶液中逐滴加入烯醛(608mg；2.87mmol)在2ml THF中的溶液。在-78℃下搅拌1-2小时后，TLC表明反应完成，因此将其用乙醚稀释并用1M HCl洗涤直至pH为7，随后用水，然后用盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，随后将产物在硅胶上纯化(用20-30％乙酸乙酯/己烷洗脱)，得到503mg(57％收率)的羟基烯炔。

向羟基烯炔(250mg；0.812mmol)在二氯甲烷中的冷却溶液中加入77％m-CPBA(1.5当量；272mg)。10分钟后移除冰浴，反应进行至TLC表明完成(约3小时)。将反应倒入饱和硫代硫酸钠中，分层，随后将有机层用10％碳酸氢钠洗涤，随后用硫酸钠干燥。在硅胶上纯化(15-20％乙醚/己烷洗脱)，得到166mg(63％)的环氧基炔。

在配有包含5ml乙醇的气球装置的2颈100ml RBF中，添加四水合Ni(OAc)₂(12.5％mol；15.9mg)。用真空清除气氛，并用氢气3x回填，随后在氢气氛下搅拌直至完全溶解。加入固体硼氢化钠(12.5％mol；2.42mg)，再次用真空/氢清除气氛，黑色混合物在氢气氛下搅拌45分钟。随后加入乙二胺(25％mol；8.5μl)，再次用真空/氢清除气氛，将反应搅拌45分钟。将环氧基炔(166mg)溶解在1ml乙醇中，并通过注射器添加到混合物中。用真空/氢清除气氛，反应进行过夜。随后将反应物用乙醚稀释并倒入水中。分层，将水层用乙醚再萃取4次，随后合并有机层并用盐水洗涤，随后用硫酸钠干燥。在硅胶上蒸发和纯化(15-20％乙醚/己烷)，得到155mg环氧基烯烃产物。将在甲醇中的酯用0.5M(水性的)K₂CO₃水解，得到游离酸：11-羟基-9,10-反式-环氧基-(12Z)-十八碳烯酸(11H-9,10E-LA)：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.63(tt，J＝7.46，11.39Hz，1H)，5.26-5.52(m,1H)，4.66(dd，J＝2.84，8.69Hz)和4.28(ddd，J＝0.91，5.35，8.74Hz，1H)，3.01(dt，J＝2.38，5.58Hz，1H)，2.92(dt，J＝2.38，5.67Hz，1H)，2.74-2.82(m,1H)，2.34(t，J＝7.41Hz，2H)，1.97-2.24(m,2H)，1.46-1.69(m,5H)，1.22-1.46(m,16H)，0.88(t，J＝6.77Hz，3H)

在0℃下，向11-羟基-9,10-反式-环氧基-(12Z)-十八碳烯酸甲酯(75mg)在7ml二氯甲烷的溶液中加入戴斯-马丁高碘烷(1.7当量；166mg)。在20分钟后，TLC显示反应完成，因此将反应混合物用5％乙醚/己烷稀释，并立即在硅胶上纯化，得到70mg烯酮。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.26(td,J＝7.30,11.57Hz,1H),6.13-6.18(m,1H),3.66(s,3H),3.20(d,J＝1.65Hz,1H),2.99-3.04(m,1H),2.64(q,J＝7.44Hz,2H),2.20-2.34(m,2H),1.53-1.67(m,5H),1.22-1.49(m,16H),0.87(br t,J＝6.86Hz,3H)。

在0℃下，向20mg烯酮在3ml THF的溶液中添加MeMgCl(3.0M，1.3当量；27μl)。使反应温度升至室温并搅拌直至起始材料大部分被消耗掉。将其用乙醚稀释并用1M HCl(至pH6-7)迅速洗涤，随后用水和盐水洗涤。用硫酸钠干燥并且在硅胶上纯化(20-30％乙醚/己烷)，得到15mg羟甲基环氧化物：1H NMR(400MHz,甲醇-d4)

5.31-5.48(m,2H),3.64(s,3H),3.02(dt,J＝2.20,5.58Hz,1H),2.72-2.80(m,1H),2.76(d,J＝2.20Hz,1H),2.30(q,J＝6.83Hz,4H),1.50-1.62(m,4H),1.27-1.48(m,18H),1.18-1.27(m,1H),0.90(t,J＝6.86Hz,3H)。

实施例3

11-羟基-和11-酮基-反式-环氧基-十八碳烯酸

本实施例说明了示例性的11-羟基和11-酮基-反式-环氧基-十八碳烯酸化合物的制备。下面说明了示例性的反应过程：

向9-癸酸甲酯(1g；5.49mmol)在8ml THF的溶液中滴加n-BuLi(2.5M；1.1当量；2.41ml)。将反应在0℃下搅拌45分钟，随后将其冷却至-78℃，并添加2-E-辛烯(0.9当量；735μl)在1.5ml THF中的溶液。随着温度升至室温，反应进行了2-3小时(直到TLC显示完成)。随后将其用乙醚稀释并用1M HCl洗涤(pH值为6-7)，随后用水和盐水洗涤。将其用硫酸钠干燥，并且在硅胶上纯化(用5-10％乙酸乙酯/己烷洗脱)，得到1.16g(68％)。

在0℃下，向羟基烯炔(650mg)在10ml二氯甲烷的溶液中加入77％m-CPBA(1.5当量；699mg)。在10分钟后移除冰浴，反应进行至完成。如前所述进行处理，随后纯化(15-30％乙醚/己烷)，制得环氧基炔产物，627mg(59％)。

如实施例1那样进行半氢化和酯水解，产生123mg 11-羟基-12,13-反式-环氧基-(9Z)-十八碳烯酸(11H-12,13E-LA)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.59(td,J＝7.48,11.02Hz,1H),5.26-5.50(m,1H),4.62-4.67和4.25(tdd,J＝1.37,5.51,8.58Hz,1H),4.12-4.19(m,1H),3.02(dt,J＝2.20,5.49Hz,1H),2.88-2.95(m,1H),2.76-2.81(m,1H),2.32(dt,J＝1.37,7.46Hz,2H),1.98-2.21(m,2H),1.22-1.68(m,18H),0.82-0.93(m,3H)。

如实施例1那样从醇衍生酮基-环氧化物。11-酮基-12,13-反式-环氧基-(9Z)-十八碳烯酸甲酯(11K-12,13E-LA甲酯)：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.19-6.29(m,1H),6.11-6.18(m,1H),3.65(s,3H),3.19(d,J＝1.83Hz,1H),3.01(dt,J＝2.20,5.49Hz,1H),2.56-2.68(m,2H),2.28(t,J＝7.51Hz,2H),1.36-1.70(m,9H),1.23-1.35(m,11H),0.84-0.92(m,3H)。

如实施例1那样由酮制得了羟甲基衍生物：1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ5.33-5.47(m,2H),4.85(s,2H),3.64(s,3H),3.02(dt,J＝2.01,5.49Hz,1H),2.76(d,J＝1.65Hz,1H),2.26-2.34(m,4H),1.45-1.64(m,5H),1.28-1.45(m,16H),0.85-0.97(m,3H)。

实施例4

13-羟基-和13-酮基-反式-环氧基-十八碳烯酸

本实施例说明了示例性13-羟基-和13-酮基-反式-环氧基-十八碳烯酸化合物的制备。以下说明了示例性的反应过程：

按照实施例1中所述的相同步骤，制备烯醛(400mg)。将其缓慢加入到膦酸盐(3当量；1.25g)和无水LiCl(3当量；237mg)在12ml THF中的混合物中。随后加入三乙胺(3.3当量；876μL)，使反应进行3-4小时(直到TLC显示完成)。将反应用乙醚稀释并依次用水和盐水洗涤。用硫酸钠干燥，在硅胶上纯化，用10-15％乙醚/己烷洗脱。有371mg(64％)的二烯酮。将其通过正相HPLC(960/40的庚烷/MTBE，275nm)进一步纯化，得到348mg白色固体。

将二烯酮(348mg)溶于13ml二氯甲烷中，冷却至0℃，随后加入77％m-CPBA(1.5当量；374mg)。15分钟后，移除冰浴，使反应进行至完成(3小时)。将其用二氯甲烷稀释，并用饱和硫代硫酸钠洗涤，随后用10％碳酸氢钠洗涤，随后用水洗涤。用硫酸钠干燥，并且在硅胶上纯化(15-30％乙醚/己烷)，得到226mg(62％)白色固体：13-酮基-9,10-反式-环氧基-(11E)-十八碳烯酸(13K-9,10E-LA)：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.47-6.54(m,1H),6.34-6.43(m,1H),3.20(dd,J＝1.83,6.86Hz,1H),2.89(dt,J＝2.01,5.58Hz,1H),2.41-2.60(m,2H),2.25-2.37(m,2H),1.56-1.71(m,4H),1.40-1.53(m,2H),1.11-1.38(m,12H),0.82-0.94(m,3H)。

如实施例1那样从酮制备羟甲基衍生物：1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ5.98(d,J＝15.74Hz,1H),5.35(dd,J＝7.96,15.65Hz,1H),3.64(s,2H),3.14(dd,J＝2.20,7.87Hz,2H),2.83(dt,J＝2.20,5.58Hz,2H),2.31(t,J＝7.41Hz,2H),1.42-1.62(m,7H),1.25-1.39(m,12H),1.22-1.25(m,3H),0.89(t,J＝6.95Hz,3H)。

通过以下制备羟基混合物：将酮在甲醇和硼酸盐缓冲液(pH 8.5)的1:1混合物中于0℃进行硼氢化钠还原，然后在甲醇中用稀碳酸钾进行酯水解，得到13-羟基-9,10-反式-环氧基-(11E)-甲基-十八碳烯酸(13H-9,10E-LA甲酯)：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.91(dd,J＝6.40,15.55Hz,1H),5.40(dd,J＝7.87,15.55Hz,1H),3.90-4.17(m,1H),3.65(s,3H),3.08(dd,J＝2.10,7.78Hz,1H),2.80(dt,J＝2.01,5.58Hz,1H),2.29(t,J＝7.50Hz,2H),1.69(br.s.,1H),1.48-1.63(m,6H),1.24-1.45(m,13H),0.87(t,J＝6.59Hz,3H)

实施例5

9-羟基-和9-酮基-反式-环氧基-十八碳烯酸

本实施例说明了示例性的9-羟基-和9-酮基-反式-环氧基-十八碳烯酸化合物的制备。以下说明了示例性的反应过程：

按照与Sayre等在J.Org.Chem.2007,72,9471-9480中所公开相似的方法制备9-酮基-12,13-反式-环氧基-(10E)-甲基-十八碳烯酸(9K-12,13E-LA甲酯)，改进之处在于在通过Wittig反应产生的二烯酮上安装环氧化物，而不是如Sayre所公开的在烯醛上安装环氧化物(在Wittig反应之前)。如实施例3那样制备羟基化合物：9-羟基-12,13-反式-环氧基-(10E)-十八碳烯酸(9H-12,13E-LA)：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.91(dd,J＝6.22,15.55Hz,1H),5.41(dd,J＝7.87,15.55Hz,1H),4.12(quin,J＝5.95Hz,1H),3.04-3.16(m,1H),2.82(dt,J＝1.92,5.54Hz,1H),2.33(t,J＝7.50Hz,2H),1.49-1.64(m,5H),1.27-1.47(m,11H),1.09-1.27(m,3H),0.79-0.93(m,3H)。

如实施例1那样从酮制备羟甲基衍生物：1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ5.97(d,J＝15.74Hz,1H),5.35(dd,J＝8.05,15.74Hz,1H),3.64(s,3H),3.14(dd,J＝2.01,8.05Hz,1H),2.84(dt,J＝2.01,5.58Hz,1H),2.30(t,J＝7.41Hz,2H),1.38-1.63(m,9H),1.28-1.37(m,13H),1.18-1.27(m,4H),0.86-0.96(m,3H)。

实施例6

2,2-二甲基-13-羟基-和2,2-二甲基-13-酮基-反式-环氧基-十八碳烯酸

本实施例说明了示例性的2,2-二甲基-13-羟基-和2,2-二甲基-13-酮基-反式-环氧基-十八碳烯酸化合物的制备。以下说明了示例性的反应过程：

在-78℃下，向异丁酸甲酯(2g；19.60mmol)在25ml THF中的溶液中逐滴添加二异丙基酰胺锂(2.0M，1.2当量；11.77ml)。30分钟后，缓慢加入7-溴-1-庚烯(1.2当量；4.14g)在5ml THF中的溶液。将反应于室温搅拌1-2小时(直到TLC显示完成)，随后将其用乙醚稀释并用1M HCl洗涤，随后用水和最后用盐水洗涤。将其用硫酸钠干燥，并且在硅胶上纯化(5％乙酸乙酯/己烷)，得到3.25g(87％)。

向搅拌着的0.5M 9-BBN的THF(1当量；20ml)溶液中加入2,2-二甲基壬烯酸甲酯(2g；10.10mmol)的THF溶液。将溶液搅拌2小时，随后将其冷却至0℃，并加入6ml的乙醇，随后加入2.2ml 6N NaOH和3.4ml 30％过氧化氢。将反应加热至50℃并搅拌1小时，随后冷却至室温并用乙酸乙酯稀释并用水洗涤，随后用盐水洗涤。用硫酸钠干燥并且在硅胶上纯化，得到1.61g(76％)。

其余的合成按实施例3进行。

2,2-二甲基-13-羟基-9,10-反式-环氧基-(11E)-十八碳烯酸：1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δ5.88-5.97(m,1H),5.41(dddd,J＝1.01,3.09,7.88,15.57Hz,1H),4.05-4.20(m,1H),3.06-3.13(m,1H),2.79-2.86(m,1H),2.04(s,1H),1.33-1.61(m,10H),1.20-1.32(m,9H),1.18(s,5H),0.81-0.96(m,3H)。

2,2-二甲基-13-酮基-9,10-反式-环氧基-(11E)-甲基-十八碳烯酸：1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δ6.63(dd,J＝6.59,15.75Hz,1H),6.50(dd,J＝6.96,16.11Hz,1H),

6.34-6.41(m,1H),3.64(s,3H),3.37-3.46(m,1H),3.18(dd,J＝1.83,6.96Hz,1H),2.84-2.92(m,1H),2.51(t,J＝7.32Hz,2H),2.38-2.45(m,1H),2.22-2.33(m,1H),1.53-1.63(m,4H),1.38-1.50(m,4H),1.16-1.37(m,11H),1.14(s,6H),0.87(t,J＝6.77Hz,3H)

2,2-二甲基-13-羟基-13-甲基-9,10-反式-环氧基-(11E)-十八碳烯酸：1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δ5.95(d,J＝15.74Hz,1H),5.39(br dd,J＝7.78,15.65Hz,1H),3.64(s,3H),3.39-3.63(m,1H),3.09(br d,J＝7.78Hz,1H),2.78-2.90(m,1H),1.32-1.67(m,13H),1.17-1.32(m,20H),1.15(s,6H),0.87(br t,J＝6.59Hz,5H)

实施例7

2,2-二甲基-11-羟基-、甲基-2,2-二甲基-11-酮基-和甲基-2,2-二甲基-11-羟基-反式-环氧基-十八碳烯酸

本实施例说明了示例性的2,2-二甲基-11-羟基-、甲基-2,2-二甲基-11-酮基-和甲基-2,2-二甲基-11-羟基-反式-环氧基-十八碳烯酸化合物的制备。以下说明了示例性的反应过程：

所示的2,2-二甲基-11-羟基-、甲基-2,2-二甲基-11-酮基-和甲基-2,2-二甲基-11-羟基-反式-环氧基-十八碳烯酸化合物可以如实施例6和2所示制备，并根据上述反应过程进行改进。

实施例8

2,2-二甲基-11-羟基-、甲基-2,2-二甲基-11-羟基-、甲基-2,2-二甲基-11-酮基-反式-环氧基-十八碳烯酸

本实施例说明了示例性2,2-二甲基-11-羟基-、甲基-2,2-二甲基-11-羟基-、甲基-2,2-二甲基-11-酮基-反式-环氧基-十八碳烯酸化合物的制备。以下说明了示例性的反应过程：

所示的2,2-二甲基-11-羟基-、甲基-2,2-二甲基-11-羟基-、甲基-2,2-二甲基-11-酮基-反式-环氧基-十八碳烯酸化合物可以如实施例6和3所示制备，并根据上述反应过程和以下描述进行改进。

2,2-二甲基-11-羟基-12,13-反式-环氧基-(9Z)-十八碳烯酸：1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δ5.54-5.83(m,1H),5.40-5.54(m,1H),5.16-5.40(m,1H),4.66(br dd,J＝2.06,8.74Hz,1H),4.26(dd,J＝5.67,8.51Hz,1H),3.03(br dd,J＝2.97,8.46Hz,1H),2.87-2.98(m,1H),2.80(dd,J＝2.24,5.44Hz,1H),1.97-2.20(m,2H),1.47-1.59(m,3H),1.20-1.45(m,14H),1.18(s,4H),0.79-0.96(m,3H)。

2,2-二甲基-11-酮基-12,13-反式-环氧基-(9Z)-十八碳烯酸甲酯：1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δ6.20-6.29(m,1H),6.13-6.18(m,1H),3.64(s,3H),3.20(d,J＝1.83Hz,1H),3.00-3.06(m,1H),2.63(q,J＝7.32Hz,2H),2.36-2.48(m,1H),1.53-1.67(m,2H),1.37-1.50(m,6H),1.17-1.35(m,11H),1.14(s,6H),0.83-0.94(m,3H)。

2,2-二甲基-11-羟基-11-甲基-12,13-反式-环氧基-(9Z)-十八碳烯酸甲酯：1HNMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δ5.60-5.76(m,1H),5.44(td,J＝7.24,12.05Hz,1H),5.26-5.38(m,1H),5.07-5.26(m,1H),3.65(s,3H),2.95-3.07(m,1H),2.74-2.95(m,1H),2.24-2.47(m,1H),2.09-2.24(m,2H),1.34-1.58(m,8H),1.19-1.34(m,10H),1.13-1.19(m,5H),0.88(br d,J＝3.93Hz,3H)。

实施例9

2,2-二甲基-9-羟基-、甲基-2,2-二甲基-9-酮基-、甲基-2,2-二甲基-9-羟基-反式-环氧基-十八碳烯酸

本实施例说明了示例性2,2-二甲基-9-羟基-、甲基-2,2-二甲基-9-酮基-、甲基-2,2-二甲基-9-羟基-反式-环氧基-十八碳烯酸化合物的制备。以下说明了示例性的反应过程：

所示的2,2-二甲基-9-羟基-、甲基-2,2-二甲基-9-酮基-、甲基-2,2-二甲基-9-羟基-反式-环氧基-十八碳烯酸化合物可以如实施例6和7所示制备，并根据上述反应过程进行改进。

实施例10

1,5-环氧基药效团

本实施例说明了示例性1,5-环氧基药效团化合物的制备。以下说明了示例性的反应过程：

在0℃下，向巴豆醛(1g)在15ml甲醇中的溶液中添加30％过氧化氢(>3当量；6.5ml)，随后添加NaHCO₃(1.2当量；1.44g)。15分钟后，移除冰浴，将反应搅拌2小时。将其用二氯甲烷稀释并用盐水洗涤，随后用硫酸铝干燥并浓缩至约8ml。随后将其冷却至0℃，并逐滴加入1-(三苯基亚磷基)-2-丙酮(1.1当量；4.85g)在15ml二氯甲烷中的溶液。使反应于室温搅拌4-5小时。随后将其用水洗涤，并且在硫酸钠上干燥。在硅胶上纯化(5-15％乙酸乙酯/己烷)以得到200mg1,5-环氧基(酮基)药效团：1H NMR(82MHz,)δ6.20–5.66(m,1H),2.94–2.41(m,1H),1.82(s,3H),1.10–0.9(m,3H)。

在0℃下，将硼氢化钠(1当量；7.5mg)加入到酮(25mg)在2ml 1:1甲醇:硼酸盐缓冲液(pH 8.5)中的溶液中。20分钟后，反应完成，并且用乙酸乙酯稀释，并先后用饱和氯化铵和盐水洗涤。用硫酸钠干燥。1,5-环氧基(羟基)药效团的产量为25mg。

向酮(55mg)在4ml THF中的溶液中加入1M HCl(8-9滴)。将其放置过夜，随后将其稀释并用水洗涤，随后用盐水洗涤。用硫酸钠干燥并且在硅胶上纯化，得到63mg酮基-二羟基化合物：1H NMR(82MHz,)δ6.62(dd,J＝15.8,7.8Hz,1H),6.07(d,J＝15.9Hz,1H),4.25(dd,J＝7.8,4.4Hz,1H),4.04–3.50(m,2H),2.02(d,J＝11.3Hz,4H),1.07(d,J＝6.1Hz,3H)。

使用与酮二醇相同的方法制备三羟基化合物。

实施例11

1,3-环氧基药效团

本实施例说明了示例性1,3-环氧基药效团化合物的制备。以下说明了示例性的反应过程：

在0℃下，向0.5M丙炔基溴化镁(1.2当量；68ml)的THF溶液中缓慢加入巴豆醛(2g)在2ml THF中的溶液。使反应于室温保持5小时，随后将其用乙醚稀释并先后用1M HCl、水和盐水洗涤。用硫酸钠干燥并且在硅胶上纯化，得到3.13g(>99％)。

在0℃下，将77％m-CPBA(1.3当量；8.29g)加入到烯炔(3.13g)在25ml二氯甲烷中的溶液中。20分钟后移除冰裕，并将反应搅拌5小时。将其通过硅藻土过滤，然后用饱和硫代硫酸氢钠洗涤，然后用饱和碳酸氢钠洗涤，然后用硫酸钠干燥。在硅胶上纯化，得到3g被无法分离的杂质污染的油状物。

在配有包含16ml乙醇的气球装置的2颈100ml RBF中，添加四水合Ni(OAc)₂(12.5％mol；385mg)。真空清除气氛，用氢3x回填，随后使其在氢气氛下搅拌直至完全溶解。加入固体硼氢化钠(12.5％mol；61mg)，再次真空/氢清除气氛，在氢气氛下搅拌黑色混合物45分钟。随后，加入乙二胺(25％mol；206ml)，再次真空/氢清除气氛，反应搅拌45分钟。将环氧基炔(1.56g)溶于2ml乙醇，并通过注射器添加到混合物中。真空/氢清除气氛，反应进行过夜。随后将反应物用乙醚稀释并倒入水中。分层，将水层用乙醚再萃取4次，随后合并有机层并用盐水洗涤，随后用硫酸钠干燥。在硅胶上蒸发和纯化，得到894mg(56％)1,3-环氧基(羟基)药效团：1H NMR(82MHz,)δ5.07(h,J＝5.4Hz,2H),4.00-3.67(m,J＝7.5,3.8Hz,1H),3.01(s,1H),2.71–2.11(m,2H),1.21(d,J＝5.7Hz,3H),0.81(d,J＝5.2Hz,3H)。

将羟基环氧化物(142mg)溶解在4ml二氯甲烷中，随后加入戴斯-马丁高碘烷(1.7当量；787mg)。3小时后，将其用5％乙酸乙酯/己烷稀释并且通过硅胶过滤并纯化以得到39mg(28％)1,3-环氧基(酮基)药效团：1H NMR(82MHz,)δ6.27–5.62(m,2H),2.77(d,J＝4.3Hz,2H),1.76(d,J＝5.9Hz,3H),1.20–0.81(m,3H)。

将羟基环氧化物(62mg)溶于2ml的叔丁醇中，随后添加1ml的LiOH(8ml)。将反应搅拌过夜，随后将其用1M HCl(pH 3-4)猝灭，用水稀释，随后通过1g C18 SPE洗脱(水，随后用甲醇)。蒸发甲醇层并在硅胶上纯化部分粗品，得到3mg三醇药效团。

酮基二羟基化合物可以使用碱性或酸性水解方法从酮基环氧化物制备。

实施例12

7-羟基-5,6-反式-环氧基-(8Z)-十八碳烯酸(7H-5E-SA)

本实施例说明了示例性化合物7-羟基-5,6-反式-环氧基-(8Z)-十八碳烯酸化合物的制备。以下说明了示例性的反应过程：

实施例13

9-羟基-5,6-反式-环氧基-(7E)-十八碳烯酸(9H-5E-SA)

本实施例说明了示例性化合物9-羟基-5,6-反式-环氧基-(7E)-十八碳烯酸化合物的制备。以下说明了示例性的反应过程：

实施例14

5-羟基-8,9-反式-环氧基-(6E)-十八碳烯酸(5H-8E-SA)

本实施例说明了示例性5-羟基-8,9-反式-环氧基-(6E)-十八碳烯酸化合物的制备。以下说明了示例性的反应过程：

实施例15

5-羟基-8,9-反式-环氧基-(6E)-十八碳烯酸(5H-8E-SA)

本实施例说明了示例性5-羟基-8,9-反式-环氧基-(6E)-十八碳烯酸化合物的制备。以下说明了示例性的反应过程：

实施例16

9-羟基-5,6-反式-环氧基-(7E,11Z)-二十碳二烯酸(9H-5E-MA)

本实施例说明了示例性9-羟基-5,6-反式-环氧基-(7E,11Z)-二十碳二烯酸化合物的制备。以下说明了示例性的反应过程：

实施例17

7-羟基-5,6-反式-环氧基-(8Z,11Z)-二十碳二烯酸(7H-5E-MA)

本实施例说明了示例性7-羟基-5,6-反式-环氧基-(8Z,11Z)-二十碳二烯酸化合物的制备。以下说明了示例性的反应过程：

实施例18

9-羟基-5,6-反式-环氧基-(7E,11Z,14Z)-二十碳三烯酸(9H-5E-AA)

本实施例说明了示例性9-羟基-5,6-反式-环氧基-二十碳三烯酸化合物的制备。以下说明了示例性的反应过程：

实施例19

7-羟基-5,6-反式-环氧基-(8Z,11Z,14Z)-二十碳三烯酸(7H-5E-AA)

本实施例说明了示例性7-羟基-5,6-反式-环氧基-二十碳三烯酸化合物的制备。以下说明了示例性的反应过程：

实施例20

2,2-二甲基-5,6-环氧化物中间体合成

本实施例说明了2,2-二甲基-5,6-环氧化物中间体的制备。以下说明了示例性的反应过程：

中间体随后用于合成如前文所述的每种PUFA衍生物。

实施例21

2,2-二甲基-4-羟基-DHA合成

本实施例说明了2,2-二甲基-4-羟基-DHA的制备。以下说明了示例性的反应过程：

在0℃下，向二十二碳六烯酸(417mg)在无水二氯甲烷(7ml)中的溶液中加入2,6-二甲基吡啶，随后加碘。将反应于室温在氮气下搅拌过夜。将其用乙酸稀释并用10％硫代硫酸钠洗涤，随后用水和盐水洗涤。将其用硫酸钠干燥，随后通过快速色谱法纯化，得到570mg碘代内酯。

将碘代内酯溶于无水甲苯(6ml)中，并加入DBU，将混合物变成深棕色和粘稠状。将其在氮气氛下搅拌过夜。将其用乙酸乙酯稀释，用1M HCl洗涤，随后用水和盐水洗涤。用硫酸钠干燥，随后通过快速色谱法纯化，得到330mg浅黄色油状物，其逐渐变黑。将该材料用氩气冲洗并在-80℃下储存。

为制备二甲基类似物，将83mg内酯溶于2ml无水THF中并冷却至-78℃，随后添加LDA(2当量的2M溶液)。30分钟后，加入甲基碘(2当量)并搅拌45分钟，随后将其迅速用乙醚稀释并用1M HCl洗涤，随后用水和盐水洗涤。用硫酸钠干燥，随后通过快速色谱法纯化，得到61mg 2-甲基类似物。在纯化2,2-二甲基类似物后，使该物质的一部分(19mg)如上所述反应，得到17mg。LC-MS证实了两种类似物的身份。LC-MS(2-甲基-4-HDHA内酯)(m/z)341.2[M+H]⁺,358.2[M+H2O]⁺,379.2[M+K]⁺；LC-MS(2,2-二甲基-4-HDHA内酯)(m/z)355.2[M+H]⁺,372.2[M+H2O]⁺,393.2[M+K]⁺。

实施例22

脂肪酸衍生物对神经元活性的调节

本实施例说明了所公开的脂肪酸衍生物的实施方式在神经元中对Ca²⁺响应的调节。

分离并体外培养鼠背根神经节感觉神经元，并按前述方法进行检测(PMID:25297838)。将脂肪酸衍生物(1μm)施加到培养的神经元，并经由盲法方式测定任何所得的Ca²⁺响应。被测化合物包括：13H-9,10E-LA(化合物7)、2,2DM-13H-9,10E-LA(化合物53)、13-甲基-13H-9,10E-LA(化合物56)、2,2DM-13-甲基-13H-9,10E-LA(化合物55)、13K-9,10E-LA(化合物8)、11H-12,13E-LA(化合物1)、2,2DM-11H-12,13E-LA(化合物17)、11-甲基-11H-12,13E-LA(化合物26)、11K-12,13E-LA(化合物2)、9H-12,13E-LA(化合物5)、9-甲基-9H-12,13E-LA(化合物46)、11H-9,10E-LA(化合物3)和11-甲基-11H-9,10E-LA(化合物36)。结果在图6中显示。

另外，体外分离并培养了小鼠三叉神经感觉神经元。将脂肪酸衍生物应用于培养的神经元，并且以盲法方式测量任何所得的Ca²⁺响应。被测化合物包括：11H-12,13E-LA(化合物1)、11K-12,13E-LA(化合物2)、11H-9,10E-LA(化合物3)和11K-9,10E-LA(化合物4)。结果如图7A所示。浓度-响应曲线说明了对11H-12,13E-LA和11H-9,10E-LA(图7B)作出反应的细胞数量增加。

实施例23

脂肪酸衍生物对瘙痒反应的调节

本实施例说明了通过所公开的脂肪酸衍生物的实施方式对瘙痒反应的调节。

以盲法方式将脂肪酸衍生物9K-12,13E-LA(100μg)皮内注射到正常小鼠或肥大细胞敲除小鼠(图8)的颈背。瘙痒感受行为被定量为在30分钟内评定的抓挠发作次数，如前文所述(Mishra and Hoon,Science 340,968,2013).

实施例24

通过脂肪酸衍生物调节胆固醇流出物

本实施例说明了所公开的脂肪酸衍生物的实施方式对胆固醇流出物的调节。

以盲法方式，在亚油酸或几种不同的脂肪酸衍生物(50μm)存在下，将人THP-1细胞与ApoA1进行温育，并如先前所述(PMID:26879139)测量了所得的胆固醇流出物(图9)。亚麻酸酸增加了胆固醇流出物，并且11H-12,13E-LA和11K-12,13E-LA衍生物(50μm)抑制了ApoA1介导的单核细胞胆固醇流出物。使用新鲜分离的人PBMC，通过相同的胆固醇流出物测定，观察到相似的结果(图10)。

实施例25

通过脂肪酸衍生物调节PBMC细胞因子分泌

本实施例说明了所公开的脂肪酸衍生物的实施方式对PBMC细胞因子分泌的调节。

将新鲜分离的人PBMC用LPS预温育(图11A和11C)或不用LPS预温育(图11B和11D)，随后与阿魏酸(“FA”，100μm)和11H-12,13E-LA、11K-12,13E-LA、PBS或仅LPS一起温育24小时(盲法)。随后，用酶联免疫吸附检定法测定TNF-α(图11A和11B)或IL-β(图11C和11D)的介质浓度。结果显示11H-12,13E-LA和11K-12,13E-LA减少TNF-α分泌，而IL-β分泌无明显变化。

实施例26

2,2-二甲基-4-HDHA-d10的合成

实施例27

2,2-二甲基-14-HDHA的合成

实施例28

2,2-二甲基-16,17-环氧基-DHA的合成

实施例29

2,2-二甲基-7-HDHA的合成

实施例30

2,2-二甲基-17-HDHA的合成

实施例31

11-OH-7,8-环氧基-9,10-去氢肾上腺酸的合成

本实施例说明了示例性11-羟基和11-酮基-反式-环氧基-9,10-去氢二十二碳二烯酸化合物的制备。以下说明了示例性的反应过程：

实施例32

9-OH-7,8-环氧基-10,11-去氢肾上腺酸的合成

本实施例说明了示例性9-羟基和9-酮基-反式-环氧基-10,11-去氢二十二碳二烯酸化合物的制备。以下说明了示例性的反应过程：

实施例33

13-羟基-9,10-反式-环氧基-11,12-去氢-十八碳酸的合成

实施例34

9-羟基-12,13-反式-环氧基-10,11-去氢-十八碳酸的合成

如上所述(实施例6)制备2,2-二甲基9-羟基甲基壬酸，氧化成醛，随后在Wittig条件下反应，得到2,2-二甲基亚油酸的甲酯。用m-CPBA或其他非选择性环氧化试剂进行处理，可得到9,10和12,13的2,2-二甲基-EpOMEs的衍生物。这些可通过色谱法分离，通过1H NMR和质谱表征，并将甲酯水解。可替代地，这些化合物可以水解为相应的2,2-二甲基diHOME甲酯。甲酯如前所述水解产生游离酸。

实施例35

13-羟基-9(R),10(R)-环氧基-十八碳-11-烯酸的合成

本实施例说明了制备化合物7的各个非对映体及相关稳定类似物的示例性合成方案。

随后可以将非对映体色谱分离。使用适当修饰的原料，也可以制备2,2-二甲基类似物。

实施例36

13-羟基-9(S),10(S)-环氧基-十八碳-11-烯酸的合成

本实施例说明了制备化合物7的各个非对映体及相关稳定类似物的示例性合成方案。

随后可以将非对映体色谱分离。使用适当修饰的原料，也可以制备2,2-二甲基类似物。

实施例37

9,10,13-三羟基-十八碳-11-烯酸的合成

本实施例提供了制备化合物13的各个非对映体及相关稳定类似物的示例性方法。

改编自Y.Kurashina et.al.,Tetrahedron 62(2006)9483–9496。也可以使用这种方法通过适当修饰的起始材料制备2,2-二甲基衍生物，如13-甲基-13-羟基和2,2-二甲基-13-甲基-13-羟基衍生物。

实施例38

用于防止酯化的2,2-二甲基部分

本实施例说明了通过向氧化脂肪酸添加2,2二甲基修饰而提供的酯化抗性。

LC-MS条件：Agilent 1100LC

A：10mm NH4OAc，pH 7.4

B：乙腈+0.1％甲酸

0-1.50min：5％B

1.50-2min：5-90％B

2-10min：90％B

10.01-15min：5％B

DAD1 254nm

DAD2 215nm

Agilent Zorbax XDB-C18 5μm C18 50x 2.0mm

0.4ml/min

MS参数：Agilent 6120，电喷射离子化

干燥气体流量：11.0L/min

喷雾器压力：40psig

干燥气体温度：350C

正相毛细管电压：4000V

负相毛细管电压：3000V

将大约30mg硅胶添加到25mg甘油中，随后将其涡旋以将所有的二氧化硅都涂上甘油，直到混合物可以自由流动为止。将5-10mg该物质加入到游离酸的乙醚溶液中，并短暂涡旋。将该反应放置3天，随后在氮气下过滤并蒸发。残留物在乙醇中重新溶解，并通过LC-MS以正和负离子两种模式分析。在这些条件下反应的几种化合物的结果如图12-17所示。

通过LC-MS可检测到在这些条件下没有2,2-二甲基类似物被酯化，而除了4-HDHA(即使使用了其羧酸酯的锂盐，发现其仍易于内酯化)外，每种内源化合物都以高产率被酯化。稳定类似物2,2-二甲基-4-HDHA没有内酯化，也没有被脂酶酯化，因此进一步证实了来自2,2-二甲基的酯化抗性。

13-羟基-9,10-反式-环氧基-(11E)-十八碳烯酸2-甘油酯

甘油酯产物RT＝6.61min，(m/z)404.3[M+H2O]⁺，425.24[M+K]⁺385.30[M-H]^-

图12显示了在酯化条件下反应的13-羟基-9,10-反式-环氧基-(11E)-十八碳烯酸的正(图12A)和负(图12B)LC-MS模式的保留时间和质谱图。结果表明内源氧化脂肪酸被酯化。

9,10,13-三羟基-(11E)-十八碳烯酸2-甘油酯

甘油酯产物RT＝5.34-5.35min，(m/z)427.23[M+Na]⁺，443.20[M+K]⁺403.2[M-H]^-449[M-H+HCOOH]^-

图13显示了在酯化条件下反应的9,10,13-三羟基-(11E)-十八碳烯酸的正(图13A)和负(图13B)LC-MS模式的保留时间和质谱图。图13C显示了未反应的游离9,10,13-三羟基-(11E)-十八碳烯酸的负LC-MS模式(RT＝5.53min，(m/z)329.20[MH]-)。结果表明内源氧化脂肪酸已被酯化。

2,2-二甲基-13-羟基-9,10-反式-环氧基-(11E)-十八碳酸

未观察到酯化。未反应起始材料RT＝7.392min，(m/z)358.30[M+H2O]⁺，323.30[M+H-HO]⁺339.30[M-H]^-

图14显示了在酯化条件下反应的2,2-二甲基-13-羟基-9,10-反式-环氧基-(11E)-十八碳烯酸的正(图14A)和负(图14B)LC-MS模式的保留时间和质谱图。结果表明2,2-二甲基修饰的氧化脂肪酸具有酯化抗性。

将2,2-二甲基-13-羟基-9,10-反式-环氧基-(11E)-十八碳酸和2,2-DM-13,9,10三醇作为混合物运行。在RT＝6.537min时洗脱出2,2-二甲基-13,9,10三醇，(m/z)357.29[M-H]-。结果表明2,2-二甲基修饰的氧化脂肪酸三醇具有酯化抗性。

4-羟基-DHA和4-羟基-DHA内酯

图15显示了在酯化条件下反应的4-羟基-DHA在正LC-MS模式下的保留时间和质谱图。结果表明，氧化脂肪酸迅速发生内酯化。

4-HDHA内酯RT＝8.73min，(m/z)327.23[M+H]⁺，344.30[M+NH4]⁺

2-甲基-4-羟基-DHA

图16显示了在酯化条件下反应的2-甲基-4-羟基-DHA在正LC-MS模式下的保留时间和质谱图。结果表明2-甲基脂肪酸类似物由于竞争性内酯化而具有甘油酯化抗性(直接注入MS；(m/z)341.30[M+H]⁺，358.30[M+H2O]⁺，379.2[M+K]⁺)。

2,2-二甲基-4-羟基-DHA

图17示出了在酯化条件下反应的2,2-二甲基-4-羟基-DHA的正LC-MS模式的保留时间和质谱图。结果表明2,2-二甲基4-羟基-DHA类似物具有抗酯化作用，包括抗内部内酯化作用。未反应的原料在RT＝8.23min，(m/z)371.30[M-H]-上运行。

在4-HDHA和类似物上进行的三个实验表明，与2-甲基和没有修饰(两者都被快速内酯化)相比，2,2-二甲基修饰的酯化作用(包括内酯化作用)减少得更多。因此，2,2-二甲基修饰可用于预防酯化，包括内部内酯化。

实施例39

通过局部施用亚油酸的氧化衍生物的类似物来选择性操纵皮肤游离酸和酯化脂质池

本实施例说明了通过局部施用亚油酸的氧化衍生物的类似物来选择性操纵皮肤游离酸和酯化脂质池。

基于以下观察：饮食中缺乏亚油酸和/或编码亚油酸加氢过氧化和异构化的基因的突变会引起严重的表皮屏障功能障碍和经表皮失水，先前有人提出皮肤的酯化脂质池中的特定氧化亚油酸衍生物[13-羟基-9,10-环氧基-十八碳烯酸、13,9,10-三羟基-十八碳烯酸及其代谢衍生物]是关键的水屏障成分(参见，例如，Zheng et al.,J.Biol.Chem.,286(27):24046-24056,2001；Munoz-Garcia et al.,Biochim Biophys Acta,1841(3):401-408,2014；Nugteren et al.,Biochim Biophys Acta,834(3):429-436,1985)。游离池中的这些生物活性非酯化脂质可替代地提供化学信号以诱导水屏障形成或修复。因此，这些特异性氧化脂质向游离或酯化池的靶向递送可能对特征在于屏障功能障碍的疾病具有治疗意义，所述疾病包括鱼鳞病、特应性皮炎/湿疹、银屑病以及皮肤和粘膜的其他炎性或过度增殖性疾病。本研究的结果为可通过局部施用氧化亚油酸代谢物的2,2-二甲基类似物来选择性靶向氧化脂质的游离池以及可通过局部施用游离酸来选择性靶向酯化池的概念提供了证明。

将13-羟基-9,10-环氧基-十八碳烯酸和9,10,13-三羟基-十八碳烯酸的类似物(“治疗”)局部应用于小鼠。简言之，对雄性无毛小鼠(SKh1-e)，以每天30μL(10mg/mL)在相同的右背侧区域进行5天的治疗，该区域约为约1.5x 3.5cm，距离身体中线1cm，位于肩部和臀部之间。三个治疗组为13-羟基-9,10-环氧基-十八碳烯酸-d5(13-H-9,10-环氧基-LA-d5)、2,2-二甲基-13-羟基-9,10-环氧基-十八碳烯酸和包含2,2-二甲基-13-羟基-9,10-环氧基-十八碳烯酸和2,2-二甲基-9,10,13-三羟基-十八碳烯酸的混合物。在第六天，从治疗区内采集皮肤样本(0.02-0.05g)并立即冷冻。

将皮肤样本添加到7ml ck50mix Precellys裂解管中。将样品用附接到冷冻机(Bertin Corp)上的Precellys以8000rpm震荡6个长度为10秒的循环(两次循环之间暂停2分钟)。将已知量的LTB4-d4(Cayman Chemical)加入到每个磨碎的皮肤样品中，并用500μl包含(EDTA和BHT)的冰冷甲醇将每个样品从裂解管中提取到新的微量离心管中。重点是确保提取所有可见的实体皮肤，并将另外的500μl甲醇(含BHT和EDTA)添加到原来的裂解管中以提取剩余的样品。将提取物在-80℃下保存2小时，随后在离心机上旋转以沉淀蛋白质。收集上清液，将一半立即在氮气下于-80℃储存。剩余物用碳酸氢钠水解30分钟(用乙酸停止反应)，随后于-80℃在N₂下储存。使用Phenomenex Strata X柱通过固相萃取纯化所有样品，其中使用10％甲醇将样品加载到柱上并洗涤柱。样品用含BHT的甲醇洗脱，在N₂气下干燥，随后重装到GC小瓶中。

LC-MS结果如图19所示。由于假定的环氧化物对皮肤pH的敏感性，因此用作环氧化物的化合物以其相应的三羟基水解产物来测量。发现13-H-9,10-环氧基-十八碳烯酸-d5在总池中的丰度比在游离池中的高4倍，表明大部分局部施用的样品已被并入酯化(结构)脂质。发现总池和游离池中的2,2-二甲基-13-H-9,10-环氧基-十八碳烯酸大致相等，表明酯化程度很小甚至没有(图19)。

提出内源氧化亚油酸衍生物在表皮水屏障的形成中通过以下方式起重要作用：(1)用作形成屏障的酯化脂质的基本结构成分；或(2)用作提供化学信号以诱导水屏障形成的不稳定生物活性分子(参见例如Zheng et al.,J.Biol.Chem.,286(27):24046-24056,2001；Munoz-Garcia et al.,Biochim Biophys Acta,1841(3):401-408,2014；Nugterenet al.,Biochim Biophys Acta,834(3):429-436,1985)。这里证明了局部施用氧化亚油酸的2,2-二甲基衍生物[2,2-二甲基-13-羟基-9,10-环氧基-十八碳烯酸]选择性增加了仅在游离酸池中的2,2-二甲基-13,9,10-三羟基-亚油酸衍生物，而基本不掺入酯化脂质中。这可由游离酸(图19A)池中的2,2-二甲基-13,9,10-三羟基亚油酸酯的峰面积与总(游离加酯化的)脂质池(图19B)中的峰面积相当来证明。相比之下，局部施用d5标记的13-羟基-9,10-环氧基-十八碳烯酸(13-H-9,10-环氧基-LA-d5)游离酸使得总池(图19D)中的13,9,10-三羟基-亚油酸-d5(9,10,13-三羟基-LA-d5)衍生物与游离池(图19C)相比大幅增加。总体上，这些体内发现显示：(1)将2,2-二甲基部分加到氧化脂肪酸中防止了酯化，允许选择性操纵皮肤中游离酸池；和(2)被提出在水屏障形成中具有关键结构作用的特定氧化亚油酸代谢物[13-羟基-9,10-环氧基-十八碳烯酸和13,9,10-三羟基-十八碳烯酸]可经由局部施用其游离酸而被靶向酯化的结构脂质池。因此，游离和酯化的脂质池均可通过局部施用合成的氧化脂质或其稳定的类似物来选择性地改变。

显而易见的是，所述方法或组合物的精确细节可在不背离所述实施方式精神的情况下进行改变或修饰。我们要求保护落入权利要求的范围和精神之内的所有修饰和改变形式。

Claims (43)

1.一种化合物或其立体异构体、互变异构体或可药用盐，所述化合物具有根据下式的结构：

其中：

X是长度为1-16个碳的脂族基团；

Z是长度为1-16个碳的脂族基团或不存在；

Y选自：

R¹、R²和R³独立地是氢或低级烷基；

R⁴是低级烷基、羟基、羧基或胺；

R⁵是氢、低级烷基或卤化物；

R⁶是羟基或取代巯基；和

每个R⁷独立地是氢或氟化物或不存在，并且相邻的碳原子形成炔。

2.如权利要求1所述的化合物，其中Y选自以下中的任一个：

并且每个R⁷独立地是氢或氟化物。

3.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中X的长度为1-10个碳。

4.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中X的长度为6个碳。

5.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中Z的长度为1-10个碳。

6.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中Z的长度为4个碳。

7.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中X和Z的长度总共为8-14个碳。

8.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中X和Z的长度总共为10个碳。

9.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中X和Z独立地是烷基、取代烯基或未取代烯基。

10.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中X和Z独立地包含一个或多个氟烯烃、二氟烯烃和/或二烯丙基氘取代。

11.如权利要求1所述的化合物，其具有根据式(II)–(CII)中任一个的结构，其中，如果存在的话：

R¹是氢或低级烷基；

R²是氢或低级烷基；

R³是氢或低级烷基；

R⁴是低级烷基、羟基、羧基或胺；

R⁵是氢、低级烷基或卤化物；

R⁶是羟基或取代巯基；

每个R⁷独立地是氢或氟化物或不存在，并且相邻的碳形成炔；

每个R⁸独立地是氢或氟化物；和

每个R⁹独立地是氢或氘。

12.如权利要求11所述的化合物，其中每个R⁷独立地是氢或氟化物。

13.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R¹、R²、R³和R⁴独立地是甲基。

14.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R¹、R²、R³和R⁴是甲基。

15.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R⁵是氢。

16.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R⁶是羟基。

17.如权利要求1-5中任一项所述的化合物，其中R⁶是半胱氨酸或谷胱甘肽。

18.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中该化合物具有如化合物2、4、9-12、16-180、182-183、185-330中任一个所示的结构。

19.如权利要求1-17中任一项所述的化合物，其中该化合物不具有如化合物1、3、5-8、13、15、181或184中任一个所示的结构。

20.如权利要求1-17中任一项所述的化合物，其中该化合物不具有如化合物1-16中任一个所示的结构。

21.一种化合物或其立体异构体、互变异构体或可药用盐，所述化合物具有根据下式的结构：

其中：

X是长度为10-25个碳的脂族基团，并且包含一个或多个环氧、羟基或羧基取代；

R¹是氢或低级烷基；和

每个R²独立地是甲基或氢。

22.如权利要求21所述的化合物，其中X是取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的杂烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的杂炔基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基。

23.如权利要求21或权利要求22所述的化合物，其中每个R²是甲基。

24.如权利要求21或权利要求22所述的化合物，其中每个R²是氢。

25.如权利要求21-24所述的化合物，其中X包含一个或多个二烯丙基氘取代。

26.如权利要求21-25所述的化合物，其中X的长度为17个碳。

27.一种化合物或其立体异构体、互变异构体或可药用盐，所述化合物具有根据以下之一的结构：

其中：

R⁵是氢、低级烷基或卤化物；

每个R⁷独立地是氢或氟化物或不存在，并且相邻的碳形成炔；和

R¹⁰和R¹¹独立地是脂族基团。

28.如权利要求27所述的化合物，其中每个R⁷独立地是氢或氟化物。

29.如权利要求27或权利要求28所述的化合物，其中R⁵是氢。

30.如权利要求27-29中任一项所述的化合物，其中R¹⁰是甲基。

31.如权利要求27-30中任一项所述的化合物，其中R¹⁰和R¹¹独立地是取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的低级杂烷基、取代或未取代的低级烯基、取代或未取代的低级杂烯基、取代或未取代的低级炔基、取代或未取代的低级杂炔基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基。

32.如权利要求27-31中任一项所述的化合物，其中R¹¹是甲基。

33.如权利要求27-32中任一项所述的化合物，其中该化合物具有化合物263-270中任一个所示的结构。

34.药物组合物，其包含如权利要求1-33中任一项所述的化合物和可药用载体。

35.如权利要求34所述的药物组合物，其配制用于局部、肠胃外或口服施用。

36.治疗受试者的疾病或病症的方法，包括：

对患有或怀疑患有所述疾病或病症的受试者施用治疗有效量的权利要求34或权利要求35所述的药物组合物，

其中所述疾病或病症选自以下之一：炎症、慢性瘙痒、慢性疼痛、自体免疫疾病、动脉粥样硬化、皮肤病症、关节炎、神经退行性疾病或精神疾病。

37.如权利要求36所述的方法，其中药物组合物被局部施用到受试者皮肤或粘膜的的炎症、慢性疼痛、慢性瘙痒或皮肤病症部位。

38.如权利要求37所述的方法，其中皮肤病症是具有水屏障功能障碍或表皮失水增加的病症。

39.如权利要求38所述的方法，其中皮肤病症是鱼鳞病、湿疹、特应性皮炎、银屑病和/或皮肤干燥症。

40.如权利要求36-39中任一项所述的方法，其中药物组合物中的化合物包含2,2-二甲基，并且是亚油酸的氧化衍生物。

41.如权利要求36-40中任一项所述的方法，其中药物组合物中的化合物包括化合物31-36、38-43和66-72中的一个或多个。

42.诊断受试者的疾病或病症的方法，包括：

从受试者获得生物样品；

测量化合物1-16中的任一个在生物样品中的水平；

如果与正常对照相比，在生物样品中检测出所述化合物中任一个的水平升高，则将该受试者诊断为患有疾病或病症的受试者；

其中所述疾病或病症选自以下之一：炎症、慢性瘙痒、慢性疼痛、自体免疫疾病、动脉粥样硬化、皮肤病症、关节炎、神经退行性疾病或精神疾病。

43.如权利要求42所述的方法，进一步包括如果与正常对照相比在生物样品中检测出所述化合物中任一个的水平升高，则使该受试者接受多不饱和脂肪酸减少的饮食。

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