CN110862465B - 一种从凡纳滨对虾虾壳中提取甲壳素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术，具体的说是一种从凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)虾壳中提取甲壳素的方法。通过鼠李唐乳杆菌于虾壳中发酵，之后接种解淀粉芽孢杆菌再进行发酵脱掉虾壳粉中的蛋白质，进而得到通式I所示的甲壳素；本发明利用鼠李唐乳杆菌除碳酸钙，再通过解淀粉芽孢杆菌去除蛋白质，进而得以从凡纳滨对虾虾壳粉中提取甲壳素，本发明方法具有产率高、得到的甲壳素纯度高、不需要使用化学试剂的特点。

Description

一种从凡纳滨对虾虾壳中提取甲壳素的方法
技术领域
本发明涉及生物技术，具体的说是一种从凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)虾壳中提取甲壳素的方法。
背景技术
甲壳类废弃物管理是一个巨大的问题，由于缺乏科学的废弃物处理方式，大量的废弃物在不经过处理的情况下，作为加工废水被直接排放。甲壳类动物的外壳是最重要的商品甲壳素来源。近年来，甲壳素和壳聚糖在农业、食品、化学、医疗、制药、化妆品和生物医药行业的潜在用途被广泛认可。目前，从废弃的甲壳类生物的壳中提取甲壳素的方法主要还是化学法。多年以来，化学法由于简便、高效和成本低廉的原因，已被用于大规模制备甲壳素。在化学方法中，主要是利用大量强酸和强碱以去除甲壳类生物壳中的矿物质和蛋白质从而提取甲壳素，但是此方法的缺点也是十分明显的，由于使用大量的强酸和强碱，可能导致甲壳素的过度水解，导致甲壳素的理化性质不一致。此外，由于大量化学试剂的使用和未经处理的直接排放，导致其严重污染了生态环境，同时对人类和动物健康造成威胁。
时至今日，随着环境保护理念的发展，亟需开发一种大规模提取甲壳素的绿色环保方法。近年来，利用发酵法从虾蟹壳中提取甲壳素的方法引起了广泛关注，但是效率低下，脱钙率与脱蛋白率过低依然是此方法亟需解决的难点。
发明内容
本发明目的在于提供一种从凡纳滨对虾虾壳中提取甲壳素的方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种从凡纳滨对虾虾壳粉中提取甲壳素的方法，通过鼠李唐乳杆菌于虾壳中发酵，之后接种解淀粉芽孢杆菌再进行发酵脱掉虾壳粉中的蛋白质，进而得到通式I所示的甲壳素；
Figure BDA0002289291710000011
Figure BDA0002289291710000021
优选，将鼠李唐乳杆菌按体积比5～8％的接种量接种至虾壳和葡萄糖的混合物中发酵，去除虾壳中的矿物质，之后按体积比4～6％的接种量将解淀粉芽孢杆菌接种至发酵脱掉矿物质的虾壳和葡萄糖的混合物中继续发酵即得通式Ⅰ所示的甲壳素；其中，虾壳和葡萄糖质量比为3～5：5～8；发酵脱掉矿物质的虾壳和葡萄糖质量比为3～5：4～6。
所述虾壳粉为将凡纳滨对虾虾壳用蒸馏水清洗干净，然后将其烘干，之后将烘干的虾壳粉碎，待用。
进一步优选，将鼠李唐乳杆菌种子液接种到虾壳粉与葡萄糖的混合物中，调节体系PH 6.5～7.5，而后于30～40℃下培养24～48小时，将发酵液离心收集沉淀。将解淀粉芽孢杆菌种子液接种到脱掉矿物质的虾壳沉淀物和葡萄糖的混合物中，调节体系PH 6.5～7.5，而后于30～40℃下培养60～84小时，将发酵液离心收集沉淀、烘干即为甲壳素。
所述离心条件为4000rpm离心10～15分钟。
本发明所具有的优点：
1.本发明从凡纳滨对虾虾壳粉中提取甲壳素，为甲壳素的绿色生产提供了方法指导。
2.本发明利用鼠李唐乳杆菌除碳酸钙，再通过解淀粉芽孢杆菌去除蛋白质，进而得以从凡纳滨对虾虾壳粉中提取甲壳素，本发明方法具有产率高、得到的甲壳素纯度高、不需要使用化学试剂的特点。
附图说明：
图1为本发明实施例提供的采用本发明方法所得甲壳素(A)与商品甲壳素(B)的红外光谱图，其特征吸收峰为3102、3255、3427、1554、1652等。
图2为本发明实施例提供的采用本发明方法所得甲壳素(A)与商品甲壳素(B)的固态核磁谱图。
具体实施例
以下结合附图和实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
实施例1：
1)凡纳滨对虾虾壳粉的制备：首先将凡纳滨对虾虾壳用蒸馏水清洗干净，然后将其放入烘箱烘干两天。之后将烘干的虾壳用粉碎机粉碎至0.5～1.0mm，待用；
2)菌种种子液的准备：将鼠李唐乳杆菌按照常规方式进行活化，活化后接种到MRS培养基中培养12小时；将解淀粉芽孢杆菌按照常规方式进行活化，活化后接种到LB培养基中培养12小时。
3)将上述步骤2)的鼠李唐乳杆菌种子液按体积比4％的接种量将其接种到5g上述步骤1)虾壳粉与5g葡萄糖混合物中；将体系调节至pH6.5，而后于37℃,发酵培养48小时；之后将发酵液在4000rpm离心10分钟收集沉淀，此时沉淀中碳酸钙的去除率达到97.5％，灰分含量为1.2％。
4)将上述步骤2)的解淀粉芽孢杆菌按体积比6％的接种量接种到5g步骤3)所得沉淀与4g葡萄糖的混合物中，将体系调节至pH6.5，而后于37℃,发酵培养84小时。之后将发酵液在4000rpm离心10分钟收集沉淀。将沉淀至于60℃烘箱1天，此时沉淀中蛋白质的去除率为96.8％，蛋白质含量为1.5％，所得产物即为甲壳素(参见通式I和图1-2)。
甲壳素为通式I所示：
Figure BDA0002289291710000031
由红外光谱可见：1652和1620cm-1对应的是甲壳素的酰胺Ⅰ谱带；1554为酰胺Ⅱ谱带；在3427和3255cm-1处的分别是O-H和N-H特征吸收峰。
由固态核磁光谱可见：δ＝23.79ppm处为甲壳素的甲基吸收峰，δ＝56.4ppm为甲壳素的2位碳的吸收峰。δ＝76ppm附近为3位碳和5位碳的吸收峰，δ＝85ppm为4位碳的吸收峰，δ＝61.95ppm为6位碳的吸收峰。综上，证明所得产物为纯的甲壳素。
实施例2：
1)凡纳滨对虾虾壳粉的制备：首先将凡纳滨对虾虾壳用蒸馏水清洗干净，然后将其放入烘箱烘干两天。之后将烘干的虾壳用粉碎机粉碎至0.5～1.0mm，待用；
2)菌种种子液的准备：将鼠李唐乳杆菌按照常规方式进行活化，活化后接种到MRS培养基中培养12小时；将解淀粉芽孢杆菌按照常规方式进行活化，活化后接种到LB培养基中培养12小时。
3)将上述步骤2)的鼠李唐乳杆菌种子液按体积比2％的接种量将其接种到5g上述步骤1)虾壳粉与5g葡萄糖混合物中；将体系调节至pH6.5，而后于37℃,发酵培养48小时；之后将发酵液在4000rpm离心10分钟收集沉淀，此时沉淀中碳酸钙的去除率为92.5％，灰分含量为2.5％。
4)将上述步骤2)的解淀粉芽孢杆菌按体积比3％的接种量接种到5g步骤3)所得沉淀与4g葡萄糖的混合物中，将体系调节至pH6.5，而后于37℃,发酵培养84小时。之后将发酵液在4000rpm离心10分钟收集沉淀。将沉淀至于60℃烘箱1天，此时沉淀中蛋白质去除率为89.5％，蛋白质含量为3.5％。
实施例3：
1)凡纳滨对虾虾壳粉的制备：首先将凡纳滨对虾虾壳用蒸馏水清洗干净，然后将其放入烘箱烘干两天。之后将烘干的虾壳用粉碎机粉碎至0.5～1.0mm，待用；
2)菌种种子液的准备：将鼠李唐乳杆菌按照常规方式进行活化，活化后接种到MRS培养基中培养12小时；将解淀粉芽孢杆菌按照常规方式进行活化，活化后接种到LB培养基中培养12小时。
3)将上述步骤2)的鼠李唐乳杆菌种子液按体积比4％的接种量将其接种到1000g上述步骤1)虾壳粉与1000g葡萄糖混合物中；将体系调节至pH 6.5，而后于37℃,发酵培养48小时；之后将发酵液在4000rpm离心10分钟收集沉淀，此时沉淀中碳酸钙去除率为94.3％，灰分含量为2.3％。
4)将上述步骤2)的解淀粉芽孢杆菌按体积比6％的接种量接种到1000g步骤3)所得沉淀与800g葡萄糖的混合物中，将体系调节至pH6.5，而后于37℃,发酵培养84小时。之后将发酵液在4000rpm离心10分钟收集沉淀。将沉淀至于60℃烘箱1天，此时沉淀中蛋白质去除率为92.5％，蛋白质含量为2.9％。

Claims (2)

1.一种从凡纳滨对虾虾壳粉中提取甲壳素的方法，其特征在于：
1）凡纳滨对虾虾壳粉的制备：首先将凡纳滨对虾虾壳用蒸馏水清洗干净，然后将其放入烘箱烘干两天，之后将烘干的虾壳用粉碎机粉碎至0.5～1.0 mm，待用；
2）菌种种子液的准备：将鼠李糖乳杆菌进行活化，活化后接种到MRS培养基中培养12小时；将解淀粉芽孢杆菌进行活化，活化后接种到LB培养基中培养12小时；
3）将上述步骤2）的鼠李糖乳杆菌种子液按体积比4%的接种量将其接种到5g上述步骤1）虾壳粉与5g葡萄糖混合物中；将体系调节至pH 6.5，而后于37℃，发酵培养48小时；之后将发酵液在4000rpm离心10分钟收集沉淀，此时沉淀中碳酸钙的去除率达到97.5%，灰分含量为1.2%；
4）将上述步骤2）的解淀粉芽孢杆菌按体积比6%的接种量接种到5g步骤3）所得沉淀与4g葡萄糖的混合物中，将体系调节至pH6.5，而后于37℃，发酵培养84小时，之后将发酵液在4000rpm离心10分钟收集沉淀，将沉淀至于60℃烘箱1天，此时沉淀中蛋白质的去除率为96.8%，蛋白质含量为1.5%，所得产物即为甲壳素。
2.一种从凡纳滨对虾虾壳粉中提取甲壳素的方法，其特征在于：
1）凡纳滨对虾虾壳粉的制备：首先将凡纳滨对虾虾壳用蒸馏水清洗干净，然后将其放入烘箱烘干两天，之后将烘干的虾壳用粉碎机粉碎至0.5～1.0 mm，待用；
2）菌种种子液的准备：将鼠李糖乳杆菌进行活化，活化后接种到MRS培养基中培养12小时；将解淀粉芽孢杆菌进行活化，活化后接种到LB培养基中培养12小时；
3）将上述步骤2）的鼠李糖乳杆菌种子液按体积比4%的接种量将其接种到1000g上述步骤1）虾壳粉与1000g葡萄糖混合物中；将体系调节至pH 6.5，而后于37℃，发酵培养48小时；之后将发酵液在4000rpm离心10分钟收集沉淀，此时沉淀中碳酸钙去除率为94.3%，灰分含量为2.3%；
4）将上述步骤2）的解淀粉芽孢杆菌按体积比6%的接种量接种到1000g步骤3）所得沉淀与800g葡萄糖的混合物中，将体系调节至pH6.5，而后于37℃，发酵培养84小时，之后将发酵液在4000rpm离心10分钟收集沉淀，将沉淀至于60℃烘箱1天，此时沉淀中蛋白质去除率为92.5%，蛋白质含量为2.9%，所得产物即为甲壳素。
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