CN110862422A - β-半乳烯糖氮苷的合成方法及其在制药中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明一种β‑半乳烯糖氮苷化合物，结构式为：
Figure DDA0002268141350000011
其中，R1包括硅基、烷基、芳基或酯基中的任意一种；所述的R2包括氮杂环类化合物、酰胺、伯氨、或仲胺中的任意一种。其制备方法是将催化剂，配合物和化合物1中加入溶剂及糖受体，在无水无氧条件下进行室温搅拌反应，TLC检测反应进程，当烯糖原料完全消失后，终止反应，萃取收集有机相，减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，然后采用石油醚/乙酸乙酯溶液作为流动相进行柱层析获得β‑半乳烯糖氮苷化合物。本发明将所制备得到的β‑半乳烯糖氮苷化合物用于制备质量胃癌、乳腺癌、肝癌的药物上的应用。

Description

β-半乳烯糖氮苷的合成方法及其在制药中的应用
技术领域
本发明主要关于一种β-半乳烯糖氮苷的合成方法及其在制药中的应用，属于制药领域。
背景技术
氮糖苷广泛存在于自然界与生物体中，在人类的生命活动中发挥着重要作用。人体防御与自我修复的免疫系统，免疫识别的标志物是氮苷糖蛋白。遗传基因的组成DNA和蛋白质翻译模板RNA的核心成分核苷也都是氮苷。许多天然产物与活性分子都是氮苷，例如，蝴蝶霉素(Rebeccamycin)是一种新型抗肿瘤剂。因此研究高效立体选择性的合成氮糖苷具有重要意义。
经典的氮苷合成方法有采用饱和糖进行Fischer糖苷化反应和Koenigs-Knorr糖苷化反应，但是存在原料糖供体难以制备和不稳定，活化剂需要当量，产物立体选择性不高等不足。近年来随着过渡金属有机化学的发展，烯糖因具有配位性在立体选择性控制方面表现出独特的优势，而被越来越广泛应用在糖苷化反应之中。O’Doherty采用从头合成烯糖的原料方法钯催化合成了一系列氮苷，但是4号位是酮基无手性，不具有糖天然手性的优势(Org.Lett.2005,8,293-296)。烯糖供体由于本身活性低，通常需要严格较高或者较低的反应温度，有时需要额外的添加催化剂之外的活化剂，例如，美国的Nguyen教授报道三氯酰胺糖氮苷需要使用硅醛作为添加剂(Org.Lett.2007,9,4231-4234)。
发明内容
针对上述技术问题，本发明采用高效烯糖供体开发出高效合成氮苷的方法，并进行结构分析鉴定，应用于制药领域。
一种β-半乳烯糖氮苷化合物，结构式为：
Figure BDA0002268141330000011
其中，R1包括硅基、烷基(C1-C4烷基或者苄基)、芳基(包括苯基，三苯基甲基，吡啶基等)和酯基(苯甲酸酯，吡啶酸酯，喹啉甲酸酯等)；所述的R2包括氮杂环类化合物、酰胺、伯氨、仲胺等。
优选方案中，所述的R1为叔丁基二苯基氯硅烷，R2为咪唑。
本发明还提供一种β-半乳烯糖氮苷化合物的制备方法，包括如下步骤：将催化剂，配合物和化合物1中加入溶剂及糖受体，在无水无氧条件下进行室温搅拌反应，TLC检测反应进程，当烯糖原料完全消失后，终止反应，萃取收集有机相，减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，然后采用石油醚/乙酸乙酯溶液作为流动相进行柱层析获得β-半乳烯糖氮苷化合物，反应式如下
Figure BDA0002268141330000021
所述的催化剂包括Pd(PPh3)4、Pd(acac)2、Pd2(dba)3、Pd(OAc)2中的任意一种。
所述的配合物包括4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽、三苯基膦、三环己基膦、1,1'-双(二苯基膦)二茂铁、1,4-双(二苯膦)丁烷、2-二叔丁基膦-2′,4′,6′-三异丙基联苯中的任意一种。
所述的溶剂包括四氢呋喃、二氯甲烷、乙腈中的任意一种。
所述的糖受体包括咪唑、苯并咪唑、咔唑、吡咯、喹啉、酰胺及其衍生物中的任意一种。
确定了最优条件以后，本发明以咪唑及其衍生物作为糖基受体和化合物1a发生反应。带有各种取代基的氮杂环类化合物作为一个亲核试剂进攻半乳糖烯糖均能得到β-构型的目标产物，且化合物3a的构型已经通过单晶X射线衍射证实其构型。结果总结在图1中，其中化合物3d与其他目标化合物相比收率较低为54％，导致化合物3d收率较低的原因可能是由于2和5号位都有取代的氮杂环化合物空间位阻增大阻碍了氮原子发生亲核反应，导致其收率降低。其中无取代和带有供电子基团的咪唑类衍生物均有一个较高的收率和β-选择性，带有硝基强吸电子基的化合物(3d)也有一个较好的收率和β-选择性，因此该方法有很好的底物耐受性。化合物的结构类型如下所示：
Figure BDA0002268141330000022
氮糖苷产物分析与鉴定表征如下
化合物3a
Figure BDA0002268141330000031
Compound was prepared following the general procedure,3a as whitesolid(41.0mg,94％)after flash chromatography on silica(dichloromethane/methyl,25:1).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.66(dd,J＝7.9,1.4Hz,4H),7.55(d,J＝1.6Hz,1H),7.45–7.38(m,3H),7.36–7.32(m,4H),6.39(ddd,J＝10.0,5.7,1.8Hz,1H),6.27(t,J＝2.0Hz,1H),6.02(d,J＝1.6Hz,1H),5.97(dd,J＝1.6,1.4Hz,1H),4.11(dt,J＝5.6,1.6Hz,1H),4.00–3.92(m,2H),3.86(q,J＝5.0Hz 1H),3.17(s,1H),1.06(s,9H)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ140.46,135.62,135.54,133.47,133.11,131.58,129.65,129.62,129.00,128.01,127.62,127.61,106.32,81.13,77.45,63.18,61.36,26.79,19.20.
化合物3b
Figure BDA0002268141330000032
Compound was prepared following the general procedure,3b as whitesolid(39.4mg,89％)after flash chromatography on silica(dichloromethane/ethylacetate/triethylamine,30:2:1).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.66-7.64(m,4H),7.43-7.40(m,2H),7.36-7.33(m,4H),6.87(s,2H),6.37(ddd,J＝10.0,5.5,1.9Hz,1H),5.92(d,J＝10.1Hz,1H),5.82(d,J＝1.4Hz,1H),4.11(d,J＝5.5Hz,1H),3.94-3.86(m,3H),2.40(s,3H),1.05(s,9H)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ145.24,135.57,135.52,133.02,132.88,131.93,129.83,129.80,128.36,127.72,127.30,116.89,79.77,77.20,63.32,61.65,26.74,19.15,13.04.
化合物3c
Figure BDA0002268141330000033
Compound was prepared following the general procedure,3c as colorlesssyrup(26.5mg,54％)after flash chromatography on silica(dichloromethane/methyl,35:1).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.75(s,1H),7.64-7.62(m,4H),7.45-7.40(m,2H),7.38-7.33(m,4H),6.47(ddd,J＝10.0,5.6,1.8Hz,1H),5.91(dd,J＝10.1,1.1Hz,1H),5.87(d,J＝1.6Hz,1H),4.20–4.17(m,1H),3.95-3.89(m,3H),2.49(s,1H),2.44(s,3H),1.04(s,9H)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ146.49,145.12,135.51,135.44,133.25,132.87,132.59,129.98,129.94,127.79,126.48,117.88,80.38,77.21,63.22,61.41,26.73,19.15,13.21.
化合物3d
Figure BDA0002268141330000041
Compound was prepared following the general procedure,3d as colorlesssyrup(40.6mg,85％)after flash chromatography on silica(dichloromethane/methyl,35:1).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.19(s,1H),8.07(s,1H),7.66-7.63(m,4H),7.44-7.33(m,6H),6.42(ddd,J＝10.0,5.7,1.7Hz,1H),6.00(d,J＝1.6Hz,1H),5.96(dd,J＝10.0,1.4Hz,1H),4.16(d,J＝5.0Hz,1H),4.00-3.88(m,3H),2.89(s,1H),1.05(s,9H)；13CNMR(CDCl3,100MHz)δ135.99,135.55,135.46,133.19,132.73,132.43,129.86,129.83,127.98,127.74,126.65,85.26,77.4,63.13,61.27,26.75,19.18.
化合物3e
Figure BDA0002268141330000042
Compound was prepared following the general procedure,3e as colorlesssyrup(37.4mg,86％)after flash chromatography on silica(dichloromethane/ethylacetate/acetate,30:1:1).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.66(dd,J＝7.9,1.4Hz,4H),7.55(d,J＝1.6Hz,1H),7.45-7.38(m,3H),7.36-7.32(m,4H),6.39(ddd,J＝10.0,5.7,1.8Hz,1H),6.27(t,J＝2.0Hz,1H),6.02(d,J＝1.6Hz,1H),5.97(dd,J＝10.0,1.4Hz,1H),4.13-4.10(m,1H),4.11(d,J＝5.6Hz,1H),3.94(td,J＝4.9,1.6Hz,1H),3.87-3.84(m,1H),3.17(s,1H),1.06(s,9H)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ140.46,135.62,135.54,133.47,133.11,131.58,129.65,129.62,129.00,128.01,127.62,127.61,106.32,81.13,77.45,63.18,61.36,26.79,19.20.
化合物3f
Figure BDA0002268141330000043
Compound was prepared following the general procedure,3f as colorlesssyrup(41.0mg,89％)after flash chromatography on silica(dichloromethane/petroleum ether/acetic acid,30:1:1).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.68(td,J＝7.9,1.4Hz,4H),7.43-7.39(m,2H),7.37-7.32(m,4H),6.38(ddd,J＝10.0,5.6,1.9Hz,1H),6.02(dd,J＝10.0,1.4Hz,1H),5.94(d,J＝1.6Hz,1H),5.86(s,1H),4.06(d,J＝5.6Hz,1H),3.98(m,1H),3.91(td,J＝5.8,1.6Hz,1H),3.85(m,1H),2.29(s,3H),2.22(s,3H),2.04(s,1H),1.07(s,9H)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ149.09,140.58,135.57,135.55,133.43,133.31,130.91,129.61,129.57,128.40,127.59,127.56,106.55,81.02,77.97,63.30,61.37,26.75,19.17,13.32,10.79.
化合物3g
Figure BDA0002268141330000051
Compound was prepared following the general procedure,3g as colorlesssyrup(37.3mg,86％)after flash chromatography on silica(dichloromethane/methyl,30:1).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.06(s,1H),7.93(s,1H),7.66-7.62(m,4H),7.42-7.32(m,6H),6.40(ddd,J＝10.0,5.7,1.8Hz,1H),6.06(d,J＝1.6Hz,1H),5.94(dd,J＝10.0,1.4Hz,1H),4.12-4.10(m,1H),4.00-3.96(m,1H),3.94(td,J＝5.1,1.6Hz,1H),3.89-3.86(m,1H),3.26(d,J＝8.4Hz,1H),1.04(s,9H)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ152.04,135.58,135.49,133.37,132.88,132.23,129.76,129.72,127.68,126.70,82.30,77.69,63.20,61.28,26.77,19.20.
作为另一优选方案，本发明以3,4-O-碳酸酯半乳烯糖为原料制备氮糖苷，具体是将三(二亚苄基丙酮)二钯,1,4-双(二苯基膦)丁烷和3,4-O-碳酸酯半乳烯糖1加入二氯甲烷和糖受体。无水无氧条件下进行室温搅拌，TLC检测反应进程，当烯糖原料完全消失后，终止反应，萃取收集有机相，减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，然后采用石油醚/乙酸乙酯溶液作为流动相进行柱层析获得4-羟基-2,3-不饱和氮苷，反应式如下：
Figure BDA0002268141330000052
所述的PG可为硅基(叔丁基二苯基硅基TBDPS、叔丁基二甲基硅基TBDMS、叔丁基二异丙基硅基TIPS，等)、烷基(甲基，乙基，丙基，丁基，苄基，三苯基甲基，等)、芳基、酯基(叔丁氧羰基，异戊酸酯，乙酸酯，苯甲酸酯，吡啶酸酯，喹啉酸酯，等)。
本发明的技术方案将所述的β-半乳烯糖氮苷化合物在制备治疗抗胃癌的药物上的应用。
本发明的技术方案将所述的β-半乳烯糖氮苷化合物在制备治疗抗乳腺癌的药物上的应用。
本发明的技术方案将所述的β-半乳烯糖氮苷化合物在制备治疗抗肝癌的药物上的应用。
附图说明
图1为化合物3a的单晶X-射线衍射图。
具体实施方式
合成实验试剂
三(二亚苄基丙酮)二钯(98％，百灵威科技有限公司)、1,4-双(二苯基膦)丁烷(百灵威科技有限公司)、石油醚(沸程60-90℃，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、乙酸乙酯(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)、无水硫酸钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、氘代氯仿-d(氘原子含量99.8％，TMS含量0.03％V/V，10*0.5mL/盒，瑞士ARMAR公司)；核磁管(5mm 100/pk 2 ST500-8，美国Norell公司)。
ZXZ-4型旋片式真空泵(临海市谭氏真空设备有限公司)、DZF-6020型真空干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)、SHB-IIIA循环水式多用途真空泵(上海豫康科教仪器设备有限公司)、CL-4型平板磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司)、EYELA SB-1100旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)、FA2104B分析天平(上海越平科技仪器有限公司)、XRC-1型微熔点测定仪(四川大学科仪厂)、DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂)、GZX-9240MBE数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、ZF-6型三用紫外分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)、Ultrashied 400MHz Plus核磁共振仪(瑞士Bruker公司)、API 4000 LC-MS/MS质谱仪(德国布鲁克道尔顿公司)
制备过程
Figure BDA0002268141330000061
Figure BDA0002268141330000062
Figure BDA0002268141330000071
所有试验采用0.1mmol半乳烯糖与0.2mmol咪唑，5mol％Pd催化剂，15mol％膦配体在2mL溶剂中室温下搅拌反应，分离产率，N.R.表示未反应.
反应条件筛选试验表明，除了PdCl2(entry 1)未参与反应外，所有的Pd(0)和Pd(Ⅱ)作为催化剂在四氢呋喃中反应1h后均能提供一个β-构型的目标产物(entries 1-6)，其中Pd2(dba)3被发现能够提供一个最高的收率(entry 5),为了进一步提高目标产物的收率，随后筛选了多组膦配体(entries 7-11),发现以DPPB为膦配体时(entriy 10)收率最高可达91％,随后又对反应溶剂进行筛选(entries 12-15),只有乙腈组(entry 13)未反应，其余各组均有较好的收率，在二氯甲烷作溶剂(entriy 12)的情况下收率最高为94％，其中发现在未加膦配体的情况下(entry 16)，也能得到目标产物，但是反应时间长达48h,加入膦配体以后能明显缩短反应时间。最终根据条件筛选的结果，最优的条件被确定为(entry12),以Pd2(dba)3为催化剂、DPPB作为膦配体、二氯甲烷为反应溶剂。且化合物3a的构型已经通过单晶X-射线衍射确认为β-N-糖苷。
在上述路线的情况下，本发明还以3,4-O-碳酸酯半乳烯糖为原料制备氮糖苷的技术路线：
Figure BDA0002268141330000081
将三(二亚苄基丙酮)二钯(Pd2(dba)3，4.6mg,0.005mmol),1,4-双(二苯基膦)丁烷(DPPB,4.3mg,0.0010mmol)和3,4-O-碳酸酯半乳烯糖1(0.1mmol)加入2mL的二氯甲烷和糖受体(咪唑)(0.2mmol)。无水无氧条件下进行室温搅拌，TLC检测反应进程，当烯糖原料完全消失后，终止反应，萃取收集有机相，减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，然后采用石油醚/乙酸乙酯溶液作为流动相进行柱层析或者4-羟基-2,3-不饱和氮苷。
活性评价
实验细胞
人胃癌细胞HGC-27、人宫颈癌细胞Caski、人肝癌细胞HepG2购自中国科学院上海细胞研究所。
主要试剂和仪器
1640培养基：美国Gibco公司；碳酸氢钠：国药集团化学试剂有限公司；Hepes：美国Sigma公司；氯化钠：国药集团化学试剂有限公司；氯化钾：国药集团化学试剂有限公司；磷酸氢二钠：国药集团化学试剂有限公司；磷酸二氢钾：国药集团化学试剂有限公司；胎牛血清：杭州四季青公司；二甲基噻唑二苯基四唑嗅盐(MTT)：美国Sigma公司；二甲基亚砜(DMSO)：美国Sigma公司；电子分析天平：中国上海梅特勒-托利多有限公司；涡旋振荡器：美国奥然科技有限公司；高压灭菌锅：日本Hirayama公司；倒置显微镜：日本Olympus公司；CO2培养箱：日本Sanyo公司；洁净工作台：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；台式高速离心机：德国Eppendof公司；Tecan多功能酶标仪：瑞士TECAN集团公司。多功能显微镜及图像分析系统：德国Leica公司。
溶液的配制
RPMI 1640培养液的配制：取1袋RPMI 1640干粉培养基(10.4g)溶于800mL灭菌冷却的超纯水中，加入2.0g碳酸氢钠(NaHCO3)，2.0g Hepes，0.5％青霉素、链霉素(100U/mL、100μg/mL)，搅拌使其充分溶解，定容至1000mL，在无菌条件下经0.22μm正压过滤器过滤，分装，4℃保存备用，使用时加入10％胎牛血清；
胎牛血清：56℃灭活30min，无菌分装，-20℃保存备用；
磷酸盐缓冲溶液(PBS)：准确称取氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠2.89g，溶于1000mL超纯水中，高压灭菌(121℃，30min)。4℃保存备用；
0.25％胰蛋白酶：准确称取胰蛋白酶粉1.25g，溶于500mL PBS中，经0.22μm正压过滤器过滤，分装，4℃保存备用；
MTT溶液：精确避光称取MTT 250mg，加入50mL PBS中，充分溶解，得终浓度为5mg/mL的MTT溶液，0.22μm滤膜过滤除菌分装，-20℃保存备用；
药物母液(100nmol/mL)：称取药物，计算其摩尔质量，以1mmol溶于10μLDMSO吸取对应体积的DMSO溶液超声涡旋溶药制成100nmol/mL的药物储备液，加药时用培养液稀释为工作液。
细胞培养
实验采用细胞培养液如表1所示，无菌培养于恒温37℃，5％CO2，相对饱和湿度条件。每日观察细胞生长情况，单层细胞贴壁达80％左右时进行传代。传代时弃上清，用PBS缓慢清洗细胞，洗2次，弃PBS，再用2mL 0.25％胰蛋白酶进行消化，加入含血清培养液终止消化，将贴壁细胞轻轻吹下，成为细胞悬液，1400rpm离心4min，弃上清，加入新鲜培养液将离心细胞吹打成单细胞悬液，以1:3传入新瓶，补入培养液至5mL(50T瓶)继续培养。实验时取对数生长期细胞。
表1细胞培养条件
Figure BDA0002268141330000091
MTT法检测hny-对HGC-27/Caski/GES-1细胞增殖的影响
取对数生长期的HGC-27/Caski/GES-1细胞，1400rpm离心4min收集细胞，吸弃上清液，将收集的细胞用新鲜培养液重悬，轻轻吹打成为单细胞悬液，血球计数板计数。稀释细胞浓度至1×105个/mL，接种于96孔板，分别设置正常组，100nmol/mL、50nmol/mL、25nmol/mL、12.5nmol/mL、6.25nmol/mL等五剂量组，共6组，每组设3个复孔。培养24h使其贴壁，贴壁后加入药物，继续培养24h及48h，用MTT法检测细胞增殖，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，培养4h后吸尽培养液，加入150μL DMSO，490nm波长测定OD值。
3.3.4 MTT法检测细胞抑制率计算
细胞抑制率(％)＝(实验组平均OD值-空白组平均OD值)/(空白组平均OD值)*100％。
Figure BDA0002268141330000101

Claims (10)

1.一种β-半乳烯糖氮苷化合物，其特征在于，结构式为：
Figure FDA0002268141320000011
其中，R1包括硅基、烷基、芳基或酯基中的任意一种；所述的R2包括氮杂环类化合物、酰胺、伯氨、或仲胺中的任意一种；所述的烷基包括C1-C4烷基，所述的芳基包括苄基、苯基、三苯基甲基、或吡啶基，所述的酯基包括苯甲酸酯、吡啶酸酯、或喹啉甲酸酯，所述的硅基包括叔丁基二苯基硅基TBDPS、叔丁基二甲基硅基TBDMS、或叔丁基二异丙基硅基TIPS。
2.根据权利要求1所述的β-半乳烯糖氮苷化合物，其特征在于，所述的R1为叔丁基二苯基氯硅烷，R2为咪唑。
3.根据权利要求1或2所述的β-半乳烯糖氮苷化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将催化剂，配合物和化合物1中加入溶剂及糖受体，在无水无氧条件下进行室温搅拌反应，TLC检测反应进程，当烯糖原料完全消失后，终止反应，萃取收集有机相，减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，然后采用石油醚/乙酸乙酯溶液作为流动相进行柱层析获得β-半乳烯糖氮苷化合物，反应式如下
Figure FDA0002268141320000012
4.根据权利要求3所述的β-半乳烯糖氮苷化合物的制备方法，其特征在于，所述的催化剂包括Pd(PPh3)4、Pd(acac)2、Pd2(dba)3、Pd(OAc)2中的任意一种。
5.根据权利要求3所述的β-半乳烯糖氮苷化合物的制备方法，其特征在于，所述的配合物包括4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽、三苯基膦、三环己基膦、1,1'-双(二苯基膦)二茂铁、1,4-双(二苯膦)丁烷、2-二叔丁基膦-2′,4′,6′-三异丙基联苯中的任意一种。
6.根据权利要求3所述的β-半乳烯糖氮苷化合物的制备方法，其特征在于，所述的溶剂包括四氢呋喃、二氯甲烷、乙腈中的任意一种。
7.根据权利要求3所述的β-半乳烯糖氮苷化合物的制备方法，其特征在于，所述的糖受体包括咪唑、苯并咪唑、咔唑、吡咯、喹啉、酰胺及其衍生物中的任意一种。
8.权利要求1或2所述的β-半乳烯糖氮苷化合物在制备治疗抗胃癌的药物上的应用。
9.权利要求1或2所述的β-半乳烯糖氮苷化合物在制备治疗抗乳腺癌的药物上的应用。
10.权利要求1或2所述的β-半乳烯糖氮苷化合物在制备治疗抗肝癌的药物上的应用。
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