CN110840928A - 苦参总黄酮在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及苦参总黄酮在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。经动物模型实验证明，经口服给药的途径，苦参总黄酮可明显改善溃疡性结肠炎导致的体重下降、结肠组织溃疡、结肠长度变短、结肠出血等情况，并且相较于市面上的皮质类固醇或免疫抑制剂等药物的毒副作用或不良反应小，更加绿色安全。

Description

苦参总黄酮在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及苦参总黄酮在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。

背景技术

溃疡性结肠炎(UC)是发病确切机制尚不明确的慢性肠道炎症性疾病，其特征通常是在临床缓解期和疾病突发期间交替，临床症状为腹部疼痛、大便稀烂以及粪便有血液粘附、体重减轻和发热。病理表现是以肠道粘膜的慢性炎症细胞浸润，充血，糜烂。病变肠段主要是直肠、末端结肠或整个结肠。急性UC有较高死亡率，慢性UC病情易反复、痊愈可能性小，同时有较高的几率转变为直肠癌。近年来，UC的发病率在亚洲呈逐年上升趋势，一项在亚太13个国家或地区进行的前瞻性炎症性肠病人群研究表明，13个国家或地区平均每年的炎症性肠病发病率为1.50/10万人，中国每年的炎症性肠病发病率为3.64/10万人，因此系统地阐明溃疡性结肠炎的发病机制并运用合适的药物治疗显得十分重要。

临床上对溃疡性结肠炎的诊断和治疗存在问题，第一，目前诊断主要结合临床、实验室检查、影像学检查、内镜和组织病理学表现进行综合分析，在排除的基础上做出诊断，且无法区分UC和肠道感染；第二，现有的药物和疗法存在缺陷，西药治疗UC通过控制急性发作、黏膜修复、维持缓解。氨基水杨酸、单克隆抗体类药物不一定对所有患者都有效，且皮质类固醇或免疫抑制剂等药物的副作用或不良反应过大。此外，对临床上对治疗UC时的致病异质性了解不足，导致最近几种新型生物类药物研发失败，如针对溃疡性结肠炎的抗IL13药物。

在中医学上溃疡性结肠炎按临床症状被纳入“肠辟”、“久痢”、“泄泻”范畴。UC病程迁延、难愈多反复的病情特点，“久痢”更能准确的描述本病。本病的发生多由于感受湿热或饮食所伤或情志不畅或劳倦过度致脾气受损，湿从内生，湿滞日久，多从热化，湿热熏蒸，壅滞肠间，传导失司，与气血相搏结，损伤血络，气凝血滞，血败肉腐，内溃成疡。湿热蕴肠在UC病程的发生和发展中始终是一个重要因素，治当以清热燥湿为法。而现代医学尚不完全清楚UC发病的机制。总结已有的研究，目前普遍认同的UC发病机制包括黏膜屏障损伤，免疫屏障异常及生物屏障紊乱。肠道的黏膜屏障包括肠黏膜上皮间的紧密连接及肠道黏液层。上皮细胞间的紧密连接由咬合蛋白闭合蛋白、连接黏附分子和闭合小环蛋白等蛋白组成。UC发病过程中这些蛋白的缺乏导致成纤维细胞不能形成典型的紧密连接，肠黏膜屏障被破坏导致通透性升高，细菌、内毒素等转移至黏膜固有层，免疫细胞激活并释放炎性因子加重炎症。此外，UC时肠黏膜屏障受损导致抗原物质刺激肠黏膜，并激发肠道过度的免疫活动而诱发UC。辅助性T细胞和调节性T细胞的失衡、促炎和抑炎细胞因子的失衡都将促进UC的发生。再者，肠道菌群是结肠黏膜的生物屏障，溃疡性结肠炎患者与健康者的肠道菌群存在显著差异，UC患者肠道微生物种类减少，优势菌群的稳定性受损、有益菌减少、致病菌增多且其分泌的内毒素可使肠上皮细胞受损，破坏肠黏膜完整性。

大量循证医学及现代药理的证据证实中医药在防治溃疡性结肠炎及其并发症方面优势明显、疗效确切，具有不可替代的作用，中药干预治疗有针对多系统、多靶点整体调控的优点，且口服中药临床应用广泛副作用少，易于广大患者接受。苦参为豆科槐属植物苦参的干燥根，其性寒、味苦，归属于五味中的苦味，主入心经、脾经、肾经，具有清热燥湿的功效。《本草纲目》记载其具有“治肠风泻血，并热痢”的作用可治疗胃肠湿热之泄泻、赤白痢疾、腹痛、里急后重等证。近代临床使用苦参及以其为君药复方(如复方苦参汤、香参丸)治疗各种肠炎的报道亦多见，效果也颇为显著。苦参中的主要成分为苦参生物碱和苦参黄酮，从前人们对苦参中的生物碱作了大量研究，并将其应用于药物生产，对于苦参黄酮的研究则相对较晚和较少。同时，由于目前苦参入药以传统水煎煮的方法较多而打粉入药的较少(治疗溃疡性结肠炎时多打粉入药，如苦参片、香参丸等)，难溶于水的苦参黄酮类成分随同药渣被丢弃。随着对苦参药理作用的深入研究，苦参黄酮的抗糖尿病及糖网、抗炎、抗菌、抗癌的多种药理作用被挖掘，苦参黄酮提取分离单独给药或者与苦参生物碱联合给药显得尤为重要。在临床上，苦参生物碱经常被用于治疗溃疡性结肠炎，但是关于苦参黄酮治疗溃疡性结肠炎的研究却鲜有报道。

总结现有技术所述的苦参总黄酮的提取方法可分为两大类。一类是醇提酸沉法，如专利文献CN200710122642.9、CN201110200778.3、CN201610801529.2、CN201110045288.0等，还如发表文献“苦参总黄酮抗菌提取物中7种苦参成分的结构鉴定及含量测定研究”、“苦参总黄酮超声提取工艺及抑菌研究”等的研究。还有一类是醇提有机溶剂提取法，如专利文献CN200410030938.4、CN200410030937.X等，还如文献“苦参黄酮类化合物的提取分离和生物活性研究”、“苦参中黄酮类成分的研究”。由于醇提酸沉法需要先用乙醇提取，提取液用盐酸酸化后离心得到残渣，残渣还需用水洗至中性后浓缩干燥得到苦参黄酮提取物，中间酸化离心水洗的操作繁杂，因而有必要简化苦参黄酮的制备工艺。

发明内容

为了填补现有技术的空白，本发明提供了苦参总黄酮在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。经动物模型实验证明，经口服给药的途径，苦参总黄酮可明显改善溃疡性结肠炎导致的体重下降、结肠组织溃疡、结肠长度变短、结肠出血等情况，并且相较于市面上的皮质类固醇或免疫抑制剂等药物的毒副作用或不良反应小，更加绿色安全。

进一步地，所述药物为口服制剂。

进一步地，所述苦参总黄酮的制备方法包括以下步骤：

S1、取苦参，加入乙醇溶液，回流提取三次，每次提取2h，合并提取液；

S2、用真空旋转蒸发器除去提取液中的乙醇后水浴蒸干得到浸膏，用40～50℃温水将浸膏溶解，然后对浸膏水溶液进行过滤；

S3、将过滤后的浸膏水溶液用乙酸乙酯萃取至乙酸乙酯层颜色不再发生变化，合并乙酸乙酯层溶液；

S4、将乙酸乙酯层溶液用真空旋转蒸发器回收乙酸乙酯，得到苦参总黄酮浸膏，再经冷冻干燥得到苦参总黄酮粉末。

更进一步地，所述步骤S1中乙醇溶液的体积分数为80～95％。

更进一步地，所述步骤S1中苦参与乙醇溶液的料液比为1:(6～9)。

更进一步地，所述步骤S2中浸膏与温水的体积比为1:(6～10)。

更进一步地，所述步骤S3中浸膏水溶液与乙酸乙酯的体积比为1:1。

本发明苦参总黄酮制备方法的步骤简单、条件易控、适合工业化生产，同时其中活性成分含量高，疗效可靠、副作用少。经检测分析，本发明苦参总黄酮提取物中主要的药效成分包括黄酮醇、二氢黄酮、查尔酮、异黄酮、二氢黄酮醇、紫檀素类黄酮等结构类型化合物。

因此，与现有技术相比，本发明的优势在于：

(1)本发明提供了苦参总黄酮在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用，详细研究并阐述了苦参总黄酮的主要药效成分及其在治疗溃疡性结肠炎的作用机理，填补了现有技术的空白。

(2)本发明提取制得的苦参总黄酮可明显改善溃疡性结肠炎导致的体重下降、结肠组织溃疡、结肠长度变短、结肠出血等情况，并且相较于市面上的皮质类固醇或免疫抑制剂等药物的毒副作用或不良反应小，更加绿色安全，具有良好的市场前景。

附图说明

图1为降苦参酮对照品和样品显色前后的吸收光谱图。

图2为各组对大鼠体重的影响统计结果图。

图3为各组对大鼠结肠长度的影响统计结果图。

图4为各组大鼠的结肠图。

图5为各组大鼠的DAI评分统计结果图。

图6为各组大鼠的便潜血测试结果图。

图7各组大鼠的HE染色病理切片结果图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

实施例1、苦参总黄酮的制备

S1、取苦参22kg，加入体积分数为90％的乙醇溶液176kg，回流提取三次，每次提取2h，合并提取液；

S2、用真空旋转蒸发器除去提取液中的乙醇后水浴蒸干得到浸膏，用浸膏体积8倍体积的45℃温水将浸膏溶解，然后对浸膏水溶液进行过滤；

S3、将过滤后的浸膏水溶液用乙酸乙酯以体积比1:1萃取至乙酸乙酯层颜色不再发生变化，合并乙酸乙酯层溶液；

S4、将乙酸乙酯层溶液用真空旋转蒸发器回收乙酸乙酯，得到苦参总黄酮浸膏，再经冷冻干燥得到苦参总黄酮粉末880g。

实施例2、苦参总黄酮的制备

S1、取苦参22kg，加入体积分数为80％的乙醇溶液198kg，回流提取三次，每次提取2h，合并提取液；

S2、用真空旋转蒸发器除去提取液中的乙醇后水浴蒸干得到浸膏，用浸膏体积6倍体积的50℃温水将浸膏溶解，然后对浸膏水溶液进行过滤；

S3、将过滤后的浸膏水溶液用乙酸乙酯以体积比1:1萃取至乙酸乙酯层颜色不再发生变化，合并乙酸乙酯层溶液；

S4、将乙酸乙酯层溶液用真空旋转蒸发器回收乙酸乙酯，得到苦参总黄酮浸膏，再经冷冻干燥得到苦参总黄酮粉末864g。

实施例3、苦参总黄酮的制备

S1、取苦参22kg，加入体积分数为95％的乙醇溶液132kg，回流提取三次，每次提取2h，合并提取液；

S2、用真空旋转蒸发器除去提取液中的乙醇后水浴蒸干得到浸膏，用浸膏体积10倍体积的40℃温水将浸膏溶解，然后对浸膏水溶液进行过滤；

S3、将过滤后的浸膏水溶液用乙酸乙酯以体积比1:1萃取至乙酸乙酯层颜色不再发生变化，合并乙酸乙酯层溶液；

S4、将乙酸乙酯层溶液用真空旋转蒸发器回收乙酸乙酯，得到苦参总黄酮浸膏，再经冷冻干燥得到苦参总黄酮粉末850g。

试验例一、苦参总黄酮粉末中总黄酮的含量测定

1.药品与试剂：

Hitachi U-2000型紫外-可见分光光度计(日本日立公司)；Sartorious BT 25S型1/100000电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)；KQ-500DE型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。

苦参药材购自山西省长治市武乡县，经鉴定为豆科植物苦参的干燥根。降苦参酮对照品，自制，经UV、IR、MS、1HNMR、13CNMR鉴定结构，HPLC检测，峰面积归一化法测定纯度大于98.50％，符合定量要求。乙腈(公司，色谱纯)；屈臣氏纯净水；其他试剂均为分析纯。

2.实验步骤：

2.1.对照品溶液与供试液的制备

对照品溶液：精密称取降苦参酮对照品适量(约3.8mg)，置10mL量瓶中，加70％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液：精密称取实施例1苦参总黄酮粉末约5mg，置5mL量瓶中，加70％乙醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液。

2.2.测定波长的确定

分别精密吸取降苦参酮对照品溶液和样品溶液0.5mL，置加有镁粉300mg的具塞刻度试管中。将试管置冷水浴(15℃左右)中，缓慢滴加浓HCl 3mL，并不时振摇试管。最后加70％乙醇至7mL，摇匀，置沸水浴中加热60min，取出，迅速冷却至室温后再加70％乙醇补足至7mL，摇匀，在400～700nm范围内扫描测定吸收光谱。降苦参酮对照品和样品显色前后的吸收光谱图见图1。由图1可知，对照品和样品均在483.5±2nm处有最大吸收，故确定483.5nm为测定波长。

2.3.紫外分光光度法测定含量

精密称取3批实施例1的苦参总黄酮样品各3份，每份约5mg，精密称定，置5mL量瓶中，加70％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述样品溶液0.5mL，降苦参酮对照品溶液0.3和0.6mL，分别置加有镁粉250mg的具塞刻度试管中。将试管置15℃冷水浴中，缓慢滴加浓盐酸，并不时振摇试管。最后加70％乙醇至7mL，摇匀，置沸水浴中加热60min，取出，迅速冷却至室温后加乙醇补足至7mL，摇匀，于483.5nm处测定吸光度。外标两点法计算含量，结果见表1。

表1：3批苦参总黄酮的含量及其RSD(％，n＝3)

批次	总黄酮含量	RSD
			1	60.59	2.30
2	60.63	2.22
			3	60.48	2.65

试验例二、苦参总黄酮中主要指标性成分的含量测定

1.仪器与试药

甲醇和甲酸购自Fisher Scientific公司。蒸馏水购自中国广州屈臣氏食品饮料有限公司。10个标准化合物Trifolirhizin，Genistein，2’-hydroxy-Isoxanthohumol，3β，7，4’-trihydroxy-5-methoxy-8-prenylflavanone，3α，7，4’-trihydroxy-5-methoxy-8-prenylflavanone，Isoxanthohumol，Kushenol N，Kurarinone，Norkurarinone，Kuraridin由本实验室制取，纯度均大于98％。Dionex Ultimate 3000RS高效液相色谱—Q-Exactive混合四级杆-Orbitrap质谱仪生产自Thermo Scientific公司。

1.1.液相质谱联用条件

在高效液相色谱系统中使用ACQUITY BEH C18色谱柱(2.1×100mm内径，粒径1.7μm，美国沃特斯)进行化合物的分离。流动相的A相由0.1％甲酸的水溶液构成和B相是乙腈。流速为0.3mL/min，梯度洗脱的程序为0～2min，20～30％B；2～12min，30～40％B；12～16min，40～55％B；16～19min，55～70％B；19～22min，70～90％B。柱温40℃，自动进样盘温度为4℃，进样量为2μL。

2.对照品溶液和供试品溶液的制备

对照品溶液的制备：精确称量上述10种标准品并溶解在甲醇中以制备用于定量分析的储备液，储备液中标准品1-10的最终浓度为30.8、19.0、24.0、21.4、28.2、28.2、22.0、29.8、24.6和20.6μg/mL。为了制作标准曲线，将储备溶液用甲醇逐步稀释以制备一系列工作溶液。

供试品溶液的制备：精密称取实施例1苦参总黄酮约5mg置250mL量瓶中，加甲醇超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，备用。

3.方法学考察

精密吸取上述各对照品储备液适量，配制成一系列不同浓度的混合对照品溶液，按上述色谱及质谱条件进行测定分析。以对照品的峰面积为纵坐标对浓度进行线性回归处理得到各对照品的回归方程加权(1/X2)最小二乘线性回归分析用于确定斜率，截距和相关系数。所有校准曲线均显示出良好的线性(R2≥0.9967)。结果如表2所示。

在最佳条件下，根据混合标准溶液的六次重复进样结果评估一天内的日内精密度，并在连续三天中进样考察日间精密度。取供试品溶液5μL注入液质联用仪，按上述色谱质谱条件，测定各化合物的峰面积，计算各成分的含量，求出6份样品中同一成分的RSD值。使用相对标准偏差(RSD)来评估精密度和重复性。结果如2表所示。

为了进行方法回收率的评估，将适当浓度的各类黄酮化合物标准品(约等于样品浓度)添加到125mg样品中，计算6份样品中各成分的加样回收率，并求出加样回收率的RSD值。根据以下公式计算每种黄酮的回收率：回收率(％)＝10种类黄酮的UPLC-MS定量方法验证数据(检测量–原始量)/添加量×100。结果如表2所示。

表2：十种黄酮化合物的UPLC-MS定量方法学验证数据

4.样品中指标性成分的含量测定

精密称取3批实施例1苦参总黄酮样品3份，每份约5mg，置250mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。溶液使用0.45μm的滤膜过滤，取2μL的滤液进样分析，测定色谱峰峰面积。基于标准曲线计算样品中的每个黄酮化合物的量。结果如表3所示。

表3：苦参总黄酮样品中10种黄酮成分的含量测定(％，n＝3)

试验例三、苦参总黄酮对UC大鼠治疗作用

(一)实验材料：

1.实验动物：50只200±20g的SPF级SD雄性大鼠。

2.实验药品试剂：实施例1苦参总黄酮；美沙拉嗪购于葵花药业集团佳木斯鹿灵有限公司；苦参生物碱片(心律宁片)购于酒泉大得利制药股份有限公司；硫酸葡聚糖钠盐(DSS)购于麦克林公司；联苯胺购于麦克林公司；3％过氧化氢溶液购自江西草珊瑚消毒药品有限公司；水合氯醛购于麦克林公司；4％多聚甲醇组织固定液购自biosharp lifesciences公司。

(二)实验方法：

将SD大鼠按照随机分组法分为苦参黄酮组、苦参生物碱组、美沙拉嗪组、模型组、空白组。①空白组：每日给予去离子水自由饮用；②模型组：每日给予5％的葡聚糖硫酸钠(DDS)溶液自由饮用；③苦参黄酮组：每日给予5％DDS溶液自由饮用的同时给予80mg/kg实施例1苦参总黄酮灌胃；④苦参生物碱组：每日给予5％DDS溶液自由饮用的同时给予100mg/kg苦参生物碱灌胃；美沙拉嗪组：每日给予5％DDS溶液自由饮用的同时根据人的临床用量换算成大鼠剂量给药。

(三)实验结果：

1.苦参总黄酮对UC大鼠体重影响

造模前称量各组大鼠的体重，造模并给药后每日称量大鼠体重统计结果。其统计结果如图2所示(图2：各组大鼠体重，###表示与空白组相比有显著性，p<0.001，***表示与模型组相比有显著性，p<0.001)，发现模型组大鼠的体重显著低于空白组和给药组，其中，苦参总黄酮给药组能够显示出与对照药美沙拉嗪相当的恢复大鼠体重的效果，且其体重与苦参生物碱组相比稍重。

2.苦参总黄酮对UC大鼠结肠长度的影响

造模给药7天后取下大鼠结肠测量长度并统计，统计结果如图3所示(图3：各组大鼠结肠长度，###表示与空白组相比有显著性，p<0.001，***表示与模型组相比有显著性，p<0.001，*表示与模型组相比有显著性，p<0.05)，由此可知DDS可诱导大鼠溃疡性结肠炎并导致结肠长度显著变短，而苦参总黄酮治疗后，可使其结肠长度大致恢复至空白组大鼠的长度，且其恢复结肠长度的效果较苦参生物碱组好。

3.苦参总黄酮对UC大鼠DAI评分(便潜血)的影响

在大鼠取材前将取适量大鼠粪便于载玻片中，滴加适量生理盐水混匀后再加入适量联苯胺混匀，最后滴加适量过氧化氢溶液，待体系反应10min后显色拍照。由DAI评分(图5：各组DAI评分，###表示与空白组相比有显著性，p<0.001，***表示与模型组相比有显著性，p<0.001)和大鼠便潜血测试(图6)可知DDS可诱导大鼠溃疡性结肠炎，肠道出血。苦参总黄酮治疗的效果显著，可与对照药美沙拉嗪及苦参生物碱疗效相比拟，显著减轻大鼠肠道出血的情况。

4.苦参总黄酮对UC大鼠结肠病理情况的影响

由各组大鼠的HE染色病理切片结果如图7所示，空白组大鼠结肠组织的细胞结构完好，而模型组大鼠病变结肠腺体结构紊乱，黏膜和黏膜下单核细胞和多核细胞浸润，粘膜上皮细胞坏死，杯状细胞，隐窝等减少甚至消失。苦参总黄酮干预后，从结肠组织的病理结果可知，溃疡性结肠炎大鼠的腺体结构逐渐恢复正常，隐窝和杯状细胞逐渐增多，证明苦参总黄酮能够有效地治疗溃疡性结肠炎。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (7)

1.苦参总黄酮在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。

2.根据权利要求1所述苦参总黄酮在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述苦参总黄酮的制备方法包括以下步骤：

S1、取苦参，加入乙醇溶液，回流提取三次，每次提取2h，合并提取液；

S2、用真空旋转蒸发器除去提取液中的乙醇后水浴蒸干得到浸膏，用40～50℃温水将浸膏溶解，然后对浸膏水溶液进行过滤；

S3、将过滤后的浸膏水溶液用乙酸乙酯萃取至乙酸乙酯层颜色不再发生变化，合并乙酸乙酯层溶液；

S4、将乙酸乙酯层溶液用真空旋转蒸发器回收乙酸乙酯，得到苦参总黄酮浸膏，再经冷冻干燥得到苦参总黄酮粉末。

3.根据权利要求2所述苦参总黄酮在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述步骤S1中乙醇溶液的体积分数为80～95％。

4.根据权利要求2所述苦参总黄酮在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述步骤S1中苦参与乙醇溶液的料液比为1:(6～9)。

5.根据权利要求2所述苦参总黄酮在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述步骤S2中浸膏与温水的体积比为1:(6～10)。

6.根据权利要求2所述苦参总黄酮在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述步骤S3中浸膏水溶液与乙酸乙酯的体积比为1:1。

7.根据权利要求1所述苦参总黄酮在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述药物为口服制剂。

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