CN110839890B - 一种茶黄素健肌的膳食营养补充剂的及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有健肌作用的膳食营养补充剂及其制备方法，该补充剂功能成分是茶黄素（theaflavin，TF）、茶黄素‑3‑没食子酸酯（theaflavin‑3‑gallate，TF3G）、茶黄素‑3′‑没食子酸酯（theaflavin‑3′‑gallate，TF3’G）和茶黄素双没食子酸酯（theaflavin‑3,3′‑digallate，TFDG）四种主要单体的混合物。本发明的膳食营养补充剂能够促进肌肉再生，抑制肌肉蛋白质降解，抑制肌肉蛋白的氧化损伤，促进肌肉细胞的存活，提高运动能力，具有极为广阔的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于食品技术领域，具体涉及一种具有健肌作用的发酵茶叶提取物茶黄素TFs的膳食营养补充剂及其制备方法。
背景技术
骨骼肌约占人体总质量的40%，为生命活动的进行提供结构支撑、运动调控、能量存储，是机体维持正常生理功能的重要组成部分。骨骼肌具有相当的可塑性和适应性，可通过改变其大小、结构和功能，以应对突发的肌肉损伤和急性运动等刺激。因此，维持骨骼肌正常的代谢、大小以及收缩功能是保障全身健康的先决条件。肌肉性能的下降，往往与衰老和疾病相关。已明确可导致骨骼肌肌肉质量流失的因素可概括为如下三种：（1）慢性疾病（恶病质），如糖尿病、癌症、慢性阻塞性肺疾病、艾滋病和心/肾脏衰竭等；（2）肌肉萎缩，多由去神经支配、微重力、固化（immobolization）等引起；（3）衰老（肌肉减少症）。以上因素均可引起肌纤维横截面积，肌核数量，蛋白质含量和肌肉力量显著降低，肌肉易疲劳并出现胰岛素抵抗现象，进而导致患者死亡率上升。
迄今为止，运动是公认的可增强肌肉质量和功能的有效手段。然而，相当一部分的肌肉病症患者与老年人的活动往往受到疾病与身体状况的限制。因此，非锻炼式治疗成为该领域研究热点。过往报道多集中于通过服用/注射睾酮、雌激素、生长激素、血管紧缩素转化酶抑制物和肌酸激酶等药物干预来减轻肌肉丢失，但该类药物所发挥的作用较为有限，且具有一定的毒副反应。因此，从天然产物中寻找具有针对性的外源膳食营养补充剂以减缓肌肉萎缩、增强肌肉性能成为新的可能。
目前，已现有技术CN1785223A公开了一种能够治疗重症肌无力和肌肉萎缩的药物组方，包括人参和淫羊藿，能够明显的增强肌力。现有技术CN105431057A公开了一种儿茶素EGC能够增加肌肉血管内皮生长因子A(VEGF) 水平，减少肌肉生长抑制素水平，并且减少肌肉功能下降或改善肌肉功能。现有技术CN101978958A公开了一种由EGCG和白藜芦醇组成的营养组合物，用于预防和治疗哺乳动物中导致肌肉损耗、萎缩和肌肉消瘦和其他相关肌肉失调症。
尽管已有较多关于增强肌肉性能的营养物的报导，但尚未见有关茶黄素（theaflavin，TF）治疗肌肉萎缩，增强肌肉性能的报导。虽然中国专利文献CN1316245A中提及利用茶多酚及其氧化物（茶色素）用于制备治疗肌肉疾病的用途，但其并没有具体披露用何种茶色素及如何配比具有好的效果，其实施例仅提及茶多酚。因此，对于TFs的研究与产品开发具有广阔的应用前景。本发明者就此展开了长期研究，从而完成了本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种具有增肌作用的膳食营养补充剂及其制备方法，本发明首次公开一种用TFs作为膳食营养补充剂来增强肌肉性能的技术，且任何一种剂型均具有相同的性能。尤其要解决如何在制备过程中保证4种主要茶黄素组分的含量以及配比，以求达到最佳的增肌效果。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种含有四种茶黄素单体混合物在增肌健肌中的应用，其特征在于，所述四种茶黄素单体混合物是表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯的混合物。
优选地，茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3′-没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯所占重量分别为5-15%、20-40%、10-20%、30-45%。在一个具体实施方式中，茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3′-没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯所占重量分别为11%、32%、13%和37%。
本发明另一方面提供一种膳食营养补充剂，其特征在于：其健肌功能成分是表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯的混合物。
优选地，茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3′-没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯所占重量分别为5-15%、20-40%、10-20%、30-45%。在一个具体实施方式中，茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3′-没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯所占重量分别为11%、32%、13%和37%。
所述膳食营养补充剂，进一步还含有辅料，选自淀粉、纤维素、麦芽糊精、低聚糖中的一种或多种，更具体地含有茶黄素单体混合物100-150份，维生素C 0.2-0.8份、维生素D20.2-0.8份、维生素E 0.2-0.8份、矿物盐5-10份。
在一些实施方式中，所述膳食营养补充剂可以制备选自片剂、胶囊剂、冲剂、颗粒剂、或丸剂的剂型。
本发明还提供一种含有茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3′-没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯共四种茶黄素单体的制备方法，其包括如下步骤：
（1）按比例称取四种儿茶素组分，用去离子水充分溶解后，用柠檬酸调节至pH5.0〜6.0，加入多酚氧化酶，在20〜24℃温度下通氧发酵；其中所选四种儿茶素组分是表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯分别占重量比分别为15-20%、5-10%、18-25%、48-55%；优选地，表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯分别占重量比分别为18%、8%、22%、52%；
（2）萃取茶黄素：在发酵后的固液混合物中加入乙酸乙酯进行萃取，收集萃取物馏分，真空干燥即得茶黄素单体混合物；优选地，在发酵后的固液混合物中加入0.6倍体积量乙酸乙酯，萃取两次。
在一个实施方式中，所述多酚氧化酶由下述方法制备得到：取新鲜茶叶，加入一倍体积量、3〜5℃，pH7.5的NaHCO3缓冲液，混合均匀，然后打浆，再加入一倍体积量、pH7.5的NaHCO3缓冲液，混合均匀，然后纱布过滤得到滤液，在转速4000r/min， 4〜5℃温度下高速离心，得到上清液即为多酚氧化酶，放入-20℃温度下冷冻保存。
TFs是茶叶中多酚类物质氧化形成的一类化合物，具有极强的生理活性，有降血脂、预防心脑血管疾病、抗氧化、防癌抗癌、抗菌抗病毒等药理功能，但尚未见TFs，尤其是特定比例的茶黄素单体的混合物在预防和延缓肌肉相关病症上的相关报道。本发明通过试验验证了特定比例的茶黄素单体的混合物能够改善和治疗肌肉相关病症。通过对肌管分化标志物MyoD、MyoG和MyHC的mRNA的相对表达量的检测，以及对分化后肌管数量、长度、直径的测定，对本发明所得特定比例组成的TFs进行了促进C2C12细胞分化活性强弱的试验。结果显示该配比下TFs的促分化效果较好，随着浓度的增加，其促分化活性还有增强趋势，而且其作用也使分化后的肌管细胞显示出更长的肌管长度、直径和高度。
本发明所提供的膳食营养补充剂的有益效果在于：能增强肌肉强度，延缓衰老和疾病所引起的肌肉萎缩的发生，是维持肌肉稳态和对抗废用性肌肉萎缩的有希望的膳食营养补充剂。通过补充此膳食营养，能够实现预防、减轻、延缓甚至是治疗人和动物中由衰老和疾病所带来的肌肉相关病症。
附图说明
图1实施例1中萃取茶黄素的HPLC检测图谱。
图2A为空白对照及不同浓度TFs连续培养C2C12细胞分化4天后的肌管形貌图。
图2B为对细胞分化至第4天时进行的肌管分化标志物的检测，分别为MyoD、MyoG和MyHC的mRNA的相对表达量。
图2C统计细胞分化至第4天时肌管的数量、长度和直径（每个处理用显微镜拍照5张，统计均值）。
图3A为实验组和对照组分化第二天（分化中期），分化中的肌管平面和三维形态图。
图3B为实验组和对照组分化第五天（分化末期），分化成熟的肌管平面和三维形态图。
图3C为使用原子力电子显微镜对分化不同时期肌管（分化中期，分化末期）的粗糙度，粘附力进行检测。
图4A 为LPS诱导肌管炎症因子NF-Kb以及ROS的表达水平。
图4B 为TF1处理后，炎症肌管的炎症因子NF-kB,以及ROS的表达水平。
注：各图中，*,代表P≤0.05，***代表p≤0.01。
具体实施方式
下面结合以下实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
（1）制备多酚氧化酶：取新鲜茶叶100g，加入一倍体积量、3〜5℃，pH7.5的NaHCO3缓冲液，混合均匀，然后打浆，加入一倍体积量、pH7.5的NaHCO3缓冲液，混合均匀，然后纱布过滤得到滤液，在转速4000r/min， 4〜5℃温度下高速离心，得到上清液即为多酚氧化酶，放入-20℃温度下冷冻保存，备用；
（2）进行发酵：按一定比例称取儿茶素组分总计1000g，包括表儿茶素(epicatechin,EC)、表没食子儿茶素(epigallocatechin, EGC)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate, ECG)及表没食子儿茶素没食子酸酯( epigallocatechingallate, EGCG)，所选儿茶素单体分别占重量比分别为18%、8%、22%、52%。10倍重量的去离子水，充分溶解后，用10%柠檬酸调节至pH5.0〜6.0，加入步骤（1）得到的多酚氧化酶，在20〜24℃温度下通氧发酵2h;将发酵后的固液混合物冷冻，备用；
（3）萃取茶黄素：在发酵后的固液混合物中加入0.6倍体积量乙酸乙酯，萃取两次。收集萃取物馏分，60℃真空干燥即得按特定比例组成的茶黄素混合物，其中四个茶黄素所占质量分数分别为TF（11%）、TF3G（32%）、TF3’G（13%）、TFDG（37%），其HPLC检测图谱详见图1。
对比例：
方法步骤与实施例1相同，但第(2)步中是根据普通茶叶中各儿茶素的含量比例，即称取各儿茶素单体总计1000g，包括表儿茶素(epicatechin,EC)、表没食子儿茶素(epigallocatechin, EGC)、表儿茶素没食子酸酯( epicatechin gallate, ECG)及表没食子儿茶素没食子酸酯( epigallocatechin gallate, EGCG)，以及儿茶素(catechin, C)，所选儿茶素单体分别占重量比分别为8%、25%、12%、45%、10%。
经测定所得到的四个茶黄素单体含量按占质量分数计，分别为TF（31%）、TF3G（14%）、TF3’G（28%）、TFDG（19%）。
健肌效果评价：
1、为了评估TFs对增强C2C12细胞分化活性强弱的影响，以实施例1中所得到的特定比例组成的茶黄素混合物为评估对象，以对照例中所述普通比例组成的茶黄素混合物为对照组，并挑选了两种浓度10μM和20μM（以步骤4所得膳食营养补充剂中四种茶黄素组分含量及摩尔质量换算出平均摩尔浓度为基准）分别作用C2C12细胞4天后，对肌管的表型和分化标志物（differentiation markers）进行统计，具体评估条目为肌管的数量、长度、直径，生肌调节因子MyoD、MyoG和肌球蛋白重链（myosin heavy chain, MyHC）的mRNA的相对表达量。
具体实施过程如下：
1、RNA的提取
（1）不同诱导分化时间的成肌细胞，用PBS清洗2-3次，加入500 uL Trizol裂解液，室温裂解1-2 min，用移液枪轻轻吹下细胞并吸至EP管中，上下轻柔颠倒10次，室温静置5min；
（2）加入100 μl的氯仿（按1 mL Trizol : 0.2 mL氯仿 : 0.5 mL异丙醇的比例进行添加），用力震荡15-30 s后，于冰上放置5 min；
（3）4℃高速离心，12000 rpm/20min；
（4）取上层水相于预冷的EP管中，加入250 μl异丙醇，用漩涡混合器混匀，-20℃静置1小时；
（5）4℃高速离心，12000 rpm/30min，弃上清；
（6）加入预冷的75%乙醇1 mL，漩涡震荡混匀；
（7）4℃高速离心，7600 rpm/5min，弃上清；可重复（6）（7）步骤一次；
（8）闪离10 s，用移液枪吸弃上清，倒置干燥；
（9）加入20-30 μl 无酶水，测RNA浓度和OD值。于-20℃冰箱中储存RNA，以待进行后续逆转录反应。
2、逆转录PCR反应
参照abm公司所提供的5×All-In-One RT MasterMix操作程序，在冰上配制如下反应体系：
| 试剂 | 用量 |
| total RNA | 2 μg |
| AccuRT Reaction Mix (4X) | 2 μl |
| Nuclease-Free water | 加至8 μl |
逆转录PCR上机设定的反应程序如下：
25℃ 10 min
42℃ 15 min
85℃ 5 min
3、实时定量PCR
将逆转录反应产物稀释5倍后，参照abm公司所提供的EvaGreen 2×qPCRMasterMix操作程序，在冰上配制如下反应体系：
| 试剂 | 用量 |
| EvaGreen 2×qPCR MasterMix | 5 μl |
| Forward and Reverse Primer | 2 μl |
| Templated DNA | 2 μl |
| Nuclease-Free water | Up to 10 μl |
实时定量PCR上机设定的反应程序如下：（Cycle×39）
| 温度 | 时间 |
| 95℃ | 10分钟 |
| Cycle1 95℃ | 15秒 |
| Cycle2 60℃ | 1分钟 |
| 65℃ | 5秒 |
| 95℃ | 10秒 |
实时定量PCR仪在完成上述反应后，Cq值以内参基因β-actin进行标化，使用2-∆∆t计算基因的显著性，判定基因的表达差异，并采用unpaired t-test检验计算P值。
引物由擎科生物技术公司合成（长沙，湖南，中国）：MyoD 正向引物(CCATCCGCTACATCGAAGGT) 和反向引物 (GTAGTAGGCGGTGTCGTAGC)；MyoG 正向引物(ATCTGCACTCCCTTACGTCC)和反正向引物 (GACAGCCCCACTTAAAAGCC)；MyHC 正向引物(CCAGGGGCAAACAGGCATTCACT) 和反向引物 (CTTCCACTGGGCCACTTCACTGTT)；β-Actin正向引物(TCACCAACTGGGACGACATG) 和反向引物 (GTCACCGGAGTCCATCACGAT)。
4、结果
图2A为空白对照及不同浓度TFs连续培养C2C12细胞分化4天后的肌管形貌图，由图中可以看出，TFs诱导分化的C2C12细胞，分化的肌管数量较对照比数量更多。图2C是经过Image J对肌管数量和长度的量化统计，TFs诱导的肌管数量较对照上调了约1-2倍，其中又以10Um浓度的最为有效。图2B为对细胞分化至第4天时进行的肌管分化标志物的检测，分别为MyoD、MyoG和MyHC的mRNA的相对表达量。由结果可以看出，经实施例1所得特定比例茶黄素混合物作用后肌管的分化标志物相对对照例中普通比例组成的茶黄素混合物处理组有较高的表达量（见图2B），其中又以myod和myhc最为明显，分别达到1.5倍的差异表达，说明实施例1所得特定比例茶黄素混合物与对照相比具更强的促分化效应。
图3A与图3B分别为原子力电子显微镜对不同分化阶段肌管（分化中期，分化末期）的平面和三维形态扫描图。并且通过对扫描数据的分析，统计分析了实验组和对照组在不同分化阶段，肌管的粘附力和细胞粗糙程度的变化。由结果可以看出，特定比例的茶黄素在分化中期，可以降低分化中肌管的粘附力，便于肌管的迁移，从而促进与未分化的成肌细胞接触，进而融合，促进分化。随着肌管的成熟，粘附力又开始回升，便于成熟肌管之间的相互粘结，从而发育成为成束肌纤维。细胞的粗糙程度随着用药，逐渐下降，说明特定比例的茶黄素促进了分化中期和分化末期肌管的表面光滑程度，与粘附力的结果相呼应，更加有力的证明了特定比例的茶黄素对骨骼肌细胞分化的促进作用。
此外，为了从表型上更直观的展现TFs的促分化效应强弱，还同时统计了细胞分化至第4天时肌管的数量、长度和直径（每个处理用显微镜拍照5张，统计均值），如图2C所示。结果表明在10μM和20μM浓度下，相对对照例中普通比例组成的茶黄素混合物，实施例1中特定比例组成的TFs都展示了较强的促进作用(见图3C)。
对茶黄素TFs作用于骨骼肌细胞的性能进行了试验，结果显示实施例1中特定比例组成的TFs表现出能增强骨骼肌性能的功效，主要体现在能诱导肌源干细胞分化，抗炎抗氧化等（通过对肌管分化标志物MyoD、MyoG和MyHC的mRNA的相对表达量的检测，以及对分化后肌管数量、长度、直径的测定，对实施例1所得特定比例组成的TFs进行了促进C2C12细胞分化活性强弱的试验。结果显示该配比下TFs的促分化效果较好，随着浓度的增加，其促分化活性还有增强趋势，而且其作用也使分化后的肌管细胞显示出更长的肌管长度、直径和高度（见图3C）。
使用正常的分化培基，诱导成肌细胞分化五天，形成肌管，加入LPS诱导肌管产生炎症应激和氧化应激（通过Q-PCR检测炎症标志物NF-KB，TNF-α，以及氧化应激标志物ROS，Nrf2验证模型是否成功）。加入LPS诱导后，正常肌管的NF-KB表达上调4倍以上，ROS的表达量也上调2倍以上，证明模型构建十分成功，是一个炎症与氧化应激的典型细胞模型（见图4A）。模型构建完成后，加入含TFs的正常培养基，连续培养48H后，损伤肌管的得到缓解与修复。由炎症因子与氧化应激因子的表达可知，加入TFs治疗后，NF-KB显著下调3-4倍，ROS的表达也得到有效缓解逐步恢复到正常水平（见图4B）。这些实验证明特定比例的TFs对骨骼肌损伤具有显著的修复效果，可以抵抗骨骼肌炎症与氧化应激。
Claims (9)
1.四种茶黄素单体混合物在增肌健肌中的应用，其特征在于，所述四种茶黄素单体混合物是茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3′-没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯的混合物，茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3′-没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯所占重量分别为5-15%、20-40%、10-20%、30-45%。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3′-没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯所占重量分别为11%、32%、13%和37%。
3.一种用于增肌健肌的膳食营养补充剂，其特征在于：其健肌功能成分是茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3′-没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯的混合物，茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3′-没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯所占重量分别为5-15%、20-40%、10-20%、30-45%。
4.根据权利要求3所述的膳食营养补充剂，其特征在于：茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3′-没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯所占重量分别为11%、32%、13%和37%。
5.根据权利要求3或4所述的膳食营养补充剂，其特征在于：含有茶黄素单体混合物100-150份，维生素C 0.2-0.8份、维生素D2 0.2-0.8份、维生素E 0.2-0.8份、矿物盐5-10份。
6.根据权利要求5所述的膳食营养补充剂，其特征在于：其剂型选自片剂、胶囊剂、冲剂、颗粒剂、或丸剂。
7.一种含有权利要求1或权利要求3中所述的茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3′-没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯共四种茶黄素单体混合物的制备方法，其包括如下步骤：
（1）按比例称取四种儿茶素组分，用去离子水充分溶解后，用柠檬酸调节至pH5.0〜6.0，加入多酚氧化酶，在20〜24℃温度下通氧发酵；其中所选四种儿茶素组分是表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯所占重量比分别为15-20%、5-10%、18-25%、48-55%；
（2）萃取茶黄素：在发酵后的固液混合物中加入乙酸乙酯进行萃取，收集萃取物馏分，真空干燥即得茶黄素单体混合物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯分别占重量比分别为18%、8%、22%、52%；步骤（2）中，在发酵后的固液混合物中加入0.6倍体积量乙酸乙酯，萃取两次。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于：所述多酚氧化酶由下述方法制备得到：取新鲜茶叶，加入一倍体积量、3〜5℃，pH7.5的NaHCO3缓冲液，混合均匀，然后打浆，再加入一倍体积量、pH7.5的NaHCO3缓冲液，混合均匀，然后纱布过滤得到滤液，在转速4000r/min， 4〜5℃温度下高速离心，得到上清液即为多酚氧化酶，放入-20℃温度下冷冻保存。
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