CN110831956B - 重组蛋白 - Google Patents

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Abstract

一种重组蛋白，其包含功能多肽和连接到所述功能多肽的N‑末端的N‑末端间隔区，所述间隔区的长度使得信号肽切割位点与所述功能多肽的N‑末端近端结构单元之间的氨基酸残基数为14‑24。

Description

重组蛋白
发明的技术领域
本发明涉及重组蛋白，且更特别是涉及在革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌(Escherichia coli)(E.coli)中表达的重组蛋白。本发明还涉及用于表达重组蛋白的核酸、载体和革兰氏阴性细菌，以及涉及具有共价连接的重组蛋白配体的分离基质，并且涉及在这样的基质上分离免疫球蛋白的方法。
发明背景
异源蛋白在大肠杆菌(E.coli)中的表达通常用于实验室和商业规模的重组蛋白。利用分泌在大肠杆菌中的表达通常意味着产生的蛋白质跨越分离细胞质和周质的内膜运输。通过分泌到周质，蛋白质也多次泄漏到细胞外培养基中( et al.,BiotechAdv 23,177-202,2005)。与细胞质表达相比，分泌具有许多优点，例如促进正确的蛋白折叠、正确的N-末端加工、简化下游处理和防止聚集成包涵体。然而，远远不是所有的蛋白质都已经以可溶性的形式在周质中成功地表达。可能出现的一些问题是分泌不良，以及没有加工或不正确地加工信号肽。有分泌不足的问题的蛋白质的具体例子是基于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A的天然或突变的Fc-结合结构域B或C的免疫球蛋白结合剂的表达中(LAbrahmsén et al.EMBO J 4(13B),3901-3906,1985)。这样的免疫球蛋白结合剂常在单克隆抗体(现代药物的主要种类)的亲和色谱分离中用作配体。
蛋白表达取决于起始信使核糖核苷酸(mRNA)的转录的启动子序列，接着是吸引翻译机器的核糖体-结合位点(RBS)，接着是有助于蛋白质运输到周质的信号肽序列。成熟蛋白通常在信号肽之后被克隆，成熟蛋白在通过膜时被信号肽酶从信号肽切割下来。然而，在信号肽后克隆构建体时的一个问题是，限制性内切酶通常需要特定的序列以切割DNA，这在信号肽序列之后留下了克隆疤痕。
因此，需要改进异源蛋白在大肠杆菌和其它革兰氏阴性细菌中的表达，特别是对于从金黄色葡萄球菌蛋白A的B和C结构域衍生的免疫球蛋白-结合蛋白而言。
发明简述
本发明的一个方面是提供在革兰氏阴性细菌如大肠杆菌中易于表达和分泌的功能蛋白。这用包含功能多肽和连接到所述功能多肽的N-末端的N-末端间隔区的重组蛋白实现，所述间隔区的长度使得信号肽切割位点和功能多肽的N-末端近端结构单元之间的距离为14-24个氨基酸残基。
一个优点是通过引入N-末端间隔区来提高表达水平。另一个优点是提高了信号肽切割的选择性。
本发明的第二个方面是提供一种编码重组蛋白的核酸分子。这用在5’至3’方向包含以下元件的核酸分子实现，所述元件被操作地连接：
a)诱导型或组成型启动子DNA序列；
b)编码信号肽的DNA序列；
c)编码N-末端间隔区的DNA序列；和
d)编码功能多肽或免疫球蛋白-结合多肽的DNA序列。
本发明的第三个方面是提供一种克隆载体，其表达任一项前述权利要求的重组蛋白并将其分泌到革兰氏阴性细胞的细菌周质中。这用包含以上核酸分子的克隆载体实现。
本发明的第四个方面是提供一种由克隆载体转化的革兰氏阴性细菌。
本发明的第五个方面是提供一种在革兰氏阴性细菌中表达和分泌重组蛋白的方法。这通过一种包括提供革兰氏阴性细菌和培养革兰氏阴性细菌的步骤的方法来实现。
本发明的第六个方面是提供一种包含共价连接到载体的重组蛋白的分离基质。
本发明的第七个方面是提供一种分离免疫球蛋白的方法，其包括以下步骤：
i)提供以上分离基质，其中重组蛋白包含免疫球蛋白-结合多肽；
ii)使分离基质与含有免疫球蛋白的液体样品接触，以结合免疫球蛋白；
iii)任选地用洗涤液洗涤分离基质；
iv)使分离基质与洗脱液接触，以洗脱免疫球蛋白。
本发明的进一步的适当实施方案在从属权利要求中被描述。
附图
图1显示其中插入了间隔区序列的克隆位点的示例序列。限制性内切酶切割位点被标记在序列的顶部。
图2显示来自IgG Sepharose 6FF Tricorn 10柱的洗脱液在237nm处的积分峰面积。
图3显示在210nm处的UV测量，积分峰面积。a)pGE120 OmpA-AQGT(参考)，52％的正确加工的信号肽，b)pGE144 OmpA-DsbA8AA，96％的正确的信号肽切割，c)pGE140 DsbA-DsbA8AA，97％的正确的信号肽切割。
图4显示了使用标准曲线的浓度分析，在热处理的发酵液中对于Zvar26(有和无DsbA8AAN-末端间隔区)测量的蛋白表达。箭头表示诱导时间。
图5显示在210nm处的UV测量，积分峰面积。a)pGE0002 OmpA-AQGT-Zvar26(参考)，b)pGE0180 OmpA-DsbA8AA-Zvar26。
图6显示出具有信号肽、N-末端间隔区和功能多肽的构建体的示意图。
图7显示了来自摇瓶培养的表达结果的总结。在适用的情况下，包括与一个标准差对应的误差条。对构建体pGE180进行了三次重复测量。对样品DsbA7和DsbA4进行了两次重复测量。对于所有其它构建体，进行了一次测量。
图8显示a)具有正确的信号肽切割的构建体(在本例中为pGE0180)和b)具有不正确的信号肽切割的构建体(在本例中为pGE0002)的相关总离子色谱(TIC)峰的实例。
图9显示在1M NaOH中孵育24小时后的去卷积TIC峰的实例。左侧图像显示pGE0180中所见到的典型模式(500和800m/z之间的峰群)。右侧图像显示DsbA8_noGT中的相同区域，其中没有峰，但存在背景。
图10显示在0小时(左上)、4小时(右上)和24小时(左下)后对应于不同长度的切割的N-末端序列的肽峰的积分萃取离子色谱(XIC)面积。面积以任意单位(AU)给出。
图11显示了最有希望的候选物的相关肽面积的放大视图。面积以任意单位(AU)给出。
图12显示在碱稳定性最低的构建体中在N-末端区最显著出现的肽的断裂。面积以任意单位(AU)给出。
图13显示了测量的蛋白质浓度、从280nm处的消光系数估算的蛋白质浓度、和在分批进料培养结束时的OD600。对pGE180进行了一次重复运行，所有其它构建体都只培养一次。如果数据是可利用的，包括与95％置信区间对应的误差条。
图14显示了使用具有类似干重、孔隙度和配体密度的基础基质，候选构建体(DsbA8_noGT和DsbA8_DT)、含Zvar2的参考样品和来自其它固定的先前数据的动态结合容量之间的比较。
定义
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在此可互换使用，且被理解为也包括抗体片段、包含抗体或抗体片段的融合蛋白以及包含抗体或抗体片段的缀合物。
术语“Fc-结合多肽”和“Fc-结合蛋白”分别意指能够与抗体的可结晶部分(Fc)结合的多肽或蛋白，并包括例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A和链球菌(Streptococcus)蛋白G，或其保持所述结合性质的任何片段或融合蛋白。
术语“Fab-结合多肽”和“Fab-结合蛋白”分别意指能够与抗体的抗原-结合部分(Fab)结合的多肽或蛋白，并包括例如大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus)蛋白L、链球菌(Streptococcus)蛋白G、天然金黄色葡萄球菌蛋白A或其保持所述结合性质的任何片段或融合蛋白。
术语“接头”此处是指将多聚体中的两个多肽单元、单体或结构域彼此连接的元件。
关于氨基酸序列的比较的术语“％同一性”通过标准比对算法，例如Altschul etal.(1990)J.Mol.Biol.,215:403-410中描述的Basic Local Alignment Tool(BLASTTM)确定。对此的基于网络的软件可以从US National Library ofMedicine，在
http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp&PAGE_TYPE＝BlastSearch&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome
免费获得。这里，算法“blastp(蛋白-蛋白BLAST)”用于将查询序列与主题序列进行比对，并确定i.a.％同一性。
此处的缩略语“DsbA”意指大肠杆菌，硫醇:二硫化物交换蛋白，UniProt P0AEG4。
此处的缩略语“OmpA”意指大肠杆菌，外膜蛋白A，UniProt P0A910。
此处的缩略语“PrA”意指金黄色葡萄球菌蛋白A，UniProt P38507。
此处的缩略语“GIII”意指来自噬菌体M13的基因3，UniProt P69168。
此处的术语“信号肽”意指存在于大多数新合成蛋白质的N-末端的短肽(通常为16-30个氨基酸长)，这些蛋白质预定要进入分泌途径。其也可以称为信号序列、靶向信号、定位信号、定位序列、转运肽、前导序列或前导肽。信号肽通常通过信号肽酶从蛋白质切割下来。
此处的术语“信号肽切割位点”意指二肽，在该二肽之间信号肽酶从成熟蛋白切割信号肽。在大多数(但不是全部)情况下，二肽是Ala-Ala。信号肽切割位点可用算法例如SignalP 4.1计算，这在http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/(Center forBiological Sequence Analysis,Technical University ofDenmark)可在线使用。
此处的术语“异源表达”意指基因或基因部分在宿主生物体中的表达，所述生物体天然不具有这种基因或基因片段。”分泌的”是指跨越革兰氏阴性细菌(如大肠杆菌)的内膜。
细胞质(细胞质的)是含有遗传物质的革兰氏阴性细菌的细胞内膜内部的空间。此处的术语“细胞质表达”意指细胞质内的蛋白表达。
周质是在革兰氏阴性细菌中内细胞质膜与细菌外膜之间的空间(称为周质空间)中的浓缩凝胶样基质。
此处的术语“启动子”意指启动特定基因的转录(写至mRNA)的DNA区域。启动子通常位于基因的转录起始位点附近，位于同一链上及DNA上游(指向有义链的5’区域)。启动子可以是诱导型的，这意味着可操作地连接到启动子的基因的表达可以通过诱导剂物质的存在而打开。或者，启动子可以是组成型的，即它不受任何诱导剂物质的调节。
此处的缩略语“RBS”意指核糖体-结合位点，或核糖体的结合位点。这是mRNA转录物的起始密码子上游的核苷酸的序列，其负责在蛋白质翻译启动过程中募集核糖体。
此处的缩略语“RhaBAD”意指基因RhaB、RhaA和RhaD的大肠杆菌鼠李糖操纵子启动子(也称为鼠李糖启动子)。这是一个广泛应用于分子生物学的启动子。
此处的缩略语“T5”意指用于大肠杆菌RNA聚合酶的噬菌体T5启动子，并带有嵌入的lac操纵基因。操纵基因是转录因子与其结合以通过抑制它来调节基因表达的一段DNA。
此处的缩略语“pD861-SR”指的是用于大肠杆菌蛋白表达的质粒，具有鼠李糖启动子(RhaBAD)和强核糖体-结合位点(SR)。
此处的缩略语“pJ401”指的是用于大肠杆菌蛋白表达的质粒，具有噬菌体T5启动子和在该启动子的每一侧镜像存在的双嵌入的lac操纵基因。
此处的缩略语“OptEc”意指对大肠杆菌表达进行优化，即选择密码子三联体来适应大肠杆菌翻译机器。
此处的缩略语“FspI”意指来自Fischerella物种(ATCC 29114)的DNA限制性内切酶。它在序列TGCGCA处平端切割。
此处的缩略语“KpnI”意指来自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)OK8(ATCC 49790)的DNA限制性内切酶。它在序列GGTACC处以悬突切割。
此处的缩略语“SRP”意指信号识别粒子途径，一条通过共翻译途径靶向多肽以供分泌的普遍保守的途径。
此处的缩略语“Sec”意指分泌或II型分泌途径，一种负责通过细胞膜分泌蛋白的系统。
此处的术语“大肠杆菌K12-017”意指如Olsson M.O.和Isaksson L.A.在Molec.Gen.Genet.169,251-257(1979)中描述的大肠杆菌表达菌株。
此处的术语“功能多肽”意指具有技术有用性质的多肽。这样的性质的实例有：a)与目标物类高度特异性结合(用作亲和结合剂，特别是作为亲和色谱的配体)，b)治疗性质(用作药物)，c)酶促性质(用作生物催化剂)和d)信号-发射性质(用作报告蛋白，如荧光报告蛋白)。
如本文所用的，术语"包含(comprises)"、"包含(comprising)"、"含有"、"具有"等可以具有在美国专利法中赋予它们的含义，并可意指"包括(includes)"、"包括(including)"等；"基本上由...组成"或"基本上包含"同样具有美国专利法所赋予的含义，且该术语是开放式的，允许超过所述事物的存在，只要所述事物的基本或新颖特征没有因超过所述事物的存在而改变，但排除现有技术实施方案。
实施方案的详细描述
在一个方面，由图1-3所示，本发明公开一种重组蛋白，其包含功能多肽和连接到功能多肽的N-末端的N-末端间隔区，所述间隔区的长度使得信号肽切割位点和功能多肽的N-末端近端结构单元之间的氨基酸残基数目为14-24。
功能多肽可以是免疫球蛋白-结合多肽。这样的多肽可例如包含一个或多个从细菌蛋白衍生的免疫球蛋白-结合结构域，所述细菌蛋白选自金黄色葡萄球菌蛋白A、大消化链球菌蛋白L和链球菌蛋白G，例如选自金黄色葡萄球菌蛋白A和大消化链球菌蛋白L。免疫球蛋白-结合结构域可例如与金黄色葡萄球菌蛋白A的结构域E、D、A、B或C，与蛋白Z(金黄色葡萄球菌蛋白A的结构域B的变体)、Zvar或Zvar2(蛋白Z的碱稳定的突变体)或与大消化链球菌蛋白L的结构域1、2、3、4或5具有至少80％，例如至少90或95％的序列同一性。在这方面，含免疫球蛋白的结构域可通过选自SEQ ID NO:1-11的氨基酸序列定义，或与其具有至少80％、例如至少90或95％序列同一性。SEQ ID NO.1-7(金黄色葡萄球菌蛋白A结构域E、D、A、B和C，蛋白Z和Zvar)列于图15中，且SEQ ID NO.8-11如下指示。
SEQ ID NO.8-Zvar2
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQA PK
SEQ ID NO.9–金黄色葡萄球菌蛋白A的截短结构域C
QQ NAFYEILHLP NLTEEQRNGF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQ
SEQ ID NO.10–Zvar的截短版本
QQ NAFYEILHLP NLTEEQRNGF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQ
SEQ ID NO.11-Zvar2的截短版本
AQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQ
SEQ ID NO.1-11均可被表征为由金黄色葡萄球菌蛋白A衍生的Fc-结合结构域。这样的结构域可通过天然结构域的突变而进一步是碱稳定的，如在Zvar和Zvar2中已进行的那样。这样的碱稳定的结构域的进一步的实例可以是SEQ ID NO.48-93(在实施例6中列出)，和其它实例例如在US 8,329,860、US 8,754,196、US 9,040,661、US 9,403,883、JP2006304633A、US 8,674,073、US2010/0221844、US2012/0208234、US 9,051,375、US 2014/0031522、US2014/0107315、US2013/0096276、US2013/0274451、US2005/0143566、US2016/0159855、US2016/0168209、US2016/0237124、WO 2014/146350、WO 2016/079033、WO 2016/079034、WO 2016/152946、PCT EP2017/061162、PCT EP2017/061164、PCT EP2017/061160、PCT EP2017/061158、PCT EP2017/061159、US 14/961164、US15/348699和US15/282367中给出，其全部通过引用以其整体并入本文。特别地，碱稳定的Fc-结合结构域可与选自SEQ IDNO.7-11、48-64和74-93的氨基酸序列具有至少80％，例如至少90％或至少95％的序列同一性。
免疫球蛋白-结合多肽可适当地为免疫球蛋白-结合结构域(例如Fc-结合结构域)的多聚体，如上文所讨论的。多聚体可例如是二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或七聚体，例如二聚体、四聚体或六聚体。适当地，多聚体可包含至少4个结构域。结构域可彼此直接连接(例如在SEQ ID NO.1-8、48-64和74-93的情况下)，但它们也可经由接头彼此连接，接头通常包含1-25(例如3-20)个氨基酸残基(例如在SEQ ID NO 9-11的情况下)。合适的接头的例子包括APKADNKFNKE、APKVDAKFDKE、APK、APKVDA、AKFDKE、APKVFDKE、APAKFDKE、VDAKFDKE、APKKFDKE、APKYEDGKQYTVDAKFDKE和APKYEDGVDAKFDKE。多聚体的一些具体例子包括SEQ ID NO.12(四聚体)、SEQ ID NO.13(六聚体)和SEQ ID NO.65-73(二聚体)。
SEQ ID NO 12-具有C-末端半胱氨酸的Zvar四聚体
VDAKFDKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
VDAKFDKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
VDAKFDKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
VDAKFDKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPKCSEQID NO 13-具有C-末端半胱氨酸的Zvar2六聚体
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
重组蛋白可包括在C-末端或N-末端处或邻近C-末端或N-末端(例如在C-末端处)的偶联部分。这种偶联部分可用于与如下文讨论的载体特异性偶联，并可包含半胱氨酸，允许通过硫醚键偶联。作为选择，或另外地，偶联部分可包含一个或多个赖氨酸，例如2-8个赖氨酸的群。
功能多肽或免疫球蛋白-结合多肽可具有二级和三级结构，且可适当地包含一个或多个结构单元，如由α螺旋、β折叠和/或β桶举例说明的。特别是，多肽可包含多个α螺旋，例如至少3个α螺旋。从金黄色葡萄球菌蛋白A衍生的Fc-结合结构域(例如SEQ ID NO.1-11、48-64和74-93)各自包含3个α螺旋，所以如上讨论的多聚体中的α螺旋的数目可以是多聚体中的结构域数目的3倍。如由SEQ ID NO.1-11、48-64和74-93所示例的结构域中的第一个α螺旋开始于第9位(使用图15的位置命名)，其在SEQ ID NO 1-7和9-10的情况下是谷氨酰胺，在SEQ ID NO.8、11、48-64和74-93的情况下是丙氨酸。
N-末端间隔区的长度适当地为使得信号肽切割位点和功能多肽或免疫球蛋白-结合多肽的N-末端近端结构单元之间的氨基酸残基数目为14-24。如上讨论的，这种结构单元可适当地为α螺旋(或者可选择地为β折叠或β桶)。功能多肽或免疫球蛋白-结合多肽的N-末端和N-末端近端结构单元之间的氨基酸残基数目可以是变化的，例如在0(SEQ ID NO.9-11)和11(SEQ ID NO.2)之间，因此，N-末端间隔区的长度可以是变化的，例如在3-24个氨基酸残基之间，例如在8-24个氨基酸残基或14-24个氨基酸残基之间。例如，如果N-末端间隔区连接于Fc-结合结构域(其与SEQ ID NO.1-8、48-64或74-93具有至少90％同一性)，则N-末端间隔区可例如具有8-12个氨基酸残基的长度，并且如果N-末端间隔区连接于Fc-结合结构域(其与SEQ ID NO.9-11具有至少90％同一性)，则N-末端间隔区可例如具有16-20个氨基酸残基的长度。N-末端间隔区可例如由选自丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸的氨基酸残基组成。为了改善碱稳定性，排除天冬酰胺可能是有利的。在这种情况下，N-末端间隔区可例如由选自丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸的氨基酸残基组成。如果N-末端间隔区不包含精氨酸或赖氨酸的任何群，和/或如果它包含最多2个选自赖氨酸和精氨酸的氨基酸残基，则可能是有利的。在一些实施方案中，N-末端间隔区的两个N-末端氨基酸残基可以是AQ(丙氨酸，接着是谷氨酰胺)。
特别是，N-末端间隔区可包含，基本包含或具有与选自SEQ ID NO.16-18、29-30、33-40、43-45和47的氨基酸序列具有至少80％序列同一性或由选自SEQ ID NO.16-18、29-30、33-40、43-45和47的氨基酸序列定义的氨基酸序列。N-末端间隔区可进一步包含，基本包含或具有与选自以下的氨基酸序列具有至少80％序列同一性或由选自以下的氨基酸序列定义的氨基酸序列：AQYEDGKQYTADNKFNKE、AQYEDGKQYTVDAKFDKE、AQKDQTWYTGVDAKFDKE、AQHDEAQQEAVDAKFDKE、AQGGGSGGGSVDAKFDKE、AQYEDGKQYGTVDAKFDKE、AQYEDGKQGTVDAKFDKE、AQYEDGKQYTTLEKGTVDAKFDKE、AQYEDGKQYTTLEKPVAGGTVDAKFDKE、AQYEDGKQYTVDAKFDKE、AQYEDGKQYTETVDAKFDKE、AQYEDGKQYTDTVDAKFDKE、AQYEDGKQYTATVDAKFDKE、AQYEDGKQYEDTVDAKFDKE、AQHHHHHHHHGTVDAKFDKE、AQHHHHHHGTVDAKFDKE和AQHDEAQQEAGTVDAKFDKE。后面的序列与从SEQ ID NO.9-11衍生的免疫球蛋白-结合多肽结合是尤其有利的。就碱稳定性而言，使用N-末端间隔区可进一步是有利的，所述间隔区包含，基本包含或具有与选自SEQ ID NO.35、37、38、40、43、44和47的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性或由选自SEQ ID NO.35、37、38、40、43、44和47的氨基酸序列定义的氨基酸序列。为了碱稳定性，N-末端间隔区还可包含，基本包含或具有与选自以下的氨基酸序列具有至少80％序列同一性或由选自以下的氨基酸序列定义的氨基酸序列：AQYEDGKQYTVDAKFDKE、AQYEDGKQYTETVDAKFDKE、AQYEDGKQYTDTVDAKFDKE、AQYEDGKQYEDTVDAKFDKE、AQHHHHHHHHGTVDAKFDKE、AQHHHHHHGTVDAKFDKE和AQHDEAQQEAGTVDAKFDKE。后面的序列与从SEQ ID NO.9-11衍生的免疫球蛋白-结合多肽结合是尤其有利的。
通过使用例如NHS-或马来酰亚胺偶联化学，将重组蛋白与SPR芯片(例如，如WO2016079033的实施例中描述的Biacore CM5传感器芯片)偶联，并在指定温度(例如22+/-2℃)下在碱性溶液中孵育之前和之后，测量芯片的免疫球蛋白-结合容量(通常使用多克隆人IgG)，可以评估重组蛋白的碱稳定性。例如，可在0.5M NaOH中执行孵化多个10min的周期，例如100、200或300个周期。在0.5M NaOH中在22+/-2℃下孵育100个10min周期后，基质的IgG容量可以为孵育前的IgG容量的至少55％，例如至少60％、至少80％或至少90％。或者，对如上测量的特定突变体进行100个周期后剩余的IgG容量可与亲代重组蛋白的剩余IgG容量进行比较。在这种情况下，突变体的剩余IgG容量可以为亲代重组蛋白的至少105％，例如至少110％、至少125％、至少150％或至少200％。
在第二个方面，本发明公开了一种编码如上公开的重组蛋白的核酸分子。该核酸分子在5’到3’方向包含以下可操作地连接的元件：
a)诱导型或组成型启动子DNA序列，例如RhaBAD或T5启动子序列。RhaBAD是可用鼠李糖诱导的，而T5是可用异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导的。组成型启动子的实例是spa启动子(天然存在的金黄色葡萄球菌蛋白A的启动子)；
b)编码信号肽的DNA序列，例如OmpA(SEQ ID NO.14)或DsbA(SEQ ID NO.15)信号肽，或与这些信号肽之一具有至少80％序列同一性的信号肽；
c)编码如上讨论的N-末端间隔区的DNA序列；和
d)编码如上讨论的功能多肽或免疫球蛋白-结合多肽的DNA序列。
核酸分子可进一步包含核糖体-结合位点(RBS)和复制起点。它还可以适当地包含抗生素抗性标记。
在第三个方面，本发明公开一种克隆载体，例如质粒，其表达如上文公开的重组蛋白并将其分泌到革兰氏阴性细胞(例如大肠杆菌)的细菌周质中。克隆载体包括如上讨论的核酸分子。
在第四个方面，本发明公开一种由上文公开的克隆载体转化的革兰氏阴性细菌。细菌可例如被鉴定为大肠杆菌(Escherichia coli)，特别是K12株的大肠杆菌(E.Coli)，例如大肠杆菌K12-017。革兰氏阴性细菌的其它例子包括例如，假单胞菌属(Pseudomonas)，例如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。例如，可以通过热休克法来实现所述转化，尽管其它方法例如电穿孔也是可能的。
在第五个方面，本发明公开一种在革兰氏阴性细菌中表达并分泌上文讨论的重组蛋白的方法。这种方法包括以下步骤：
i)提供上文公开的革兰氏阴性细菌；和
ii)培养革兰氏阴性细菌。
如果如上讨论的核酸分子包含诱导型启动子，该方法可进一步包括在革兰氏阴性细菌中诱导重组蛋白表达的步骤。
在第六个方面，本发明公开一种包含与载体共价连接的上文公开的重组蛋白的分离基质。
如技术人员应该理解的，表达的重组蛋白在固定到载体前应纯化至适当的程度。这样的纯化方法是本领域众所周知的，并且用标准方法很容易地将基于蛋白的配体固定到载体上。合适的方法和载体将在下面更详细地讨论。
基质的碱稳定性可以通过在指定温度(例如22+/-2℃)下在碱性溶液中孵育之前和之后，通常使用多克隆人IgG，测量免疫球蛋白-结合容量来评估。孵育可例如在0.5MNaOH中进行多个15min的周期，例如100、200或300个周期，对应于25、50或75h的总孵育时间。在0.5M NaOH中在22+/-2℃下在96-100个15min的孵育周期或24或25h的总孵育时间后，基质的IgG容量可以为孵育前的IgG容量的至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％。
根据本发明的基质的固体载体可以具有任何合适的熟知种类。传统的亲和分离基质通常具有有机性质，且基于将亲水性表面暴露在所使用的水性介质中，即将羟基(-OH)、羧基(-COOH)、羧酰氨基(-CONH2，可能以N-取代的形式存在)、氨基(-NH2，可能以取代形式存在)、寡聚乙烯氧基或多聚乙烯氧基暴露在其外表面以及还暴露在其内表面上(如果存在的话)的聚合物。固体载体可适当地为多孔的。孔隙度可以表示为例如根据Gel FiltrationPrinciples and Methods,Pharmacia LKB Biotechnology 1991,pp 6-13中所描述的方法，用反尺寸排阻色谱测量的Kav或Kd值(特定尺寸的探针分子可达到的孔体积的分数)。根据定义，这两个Kd和Kav值总是在0-1的范围内。Kav值可有利地为0.6-0.95，例如0.7-0.90或0.6-0.8，如用Mw 110kDa的葡聚糖作为探针分子测定的。这样的一个优点是，载体具有大分数的能够容纳本发明的重组蛋白和与重组蛋白结合的免疫球蛋白二者，并提供免疫球蛋白朝向和离开结合位点的大量运输的孔。
重组蛋白可以通过常规的偶联技术(使用例如在配体中存在的硫醇、氨基和/或羧基)连接到载体上。双环氧化物、表氯醇、CNBr、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等是众所周知的偶联剂。在载体和重组蛋白之间，可以引入称为间隔区的分子，这提高了重组蛋白的可用性，并促进了重组蛋白与载体的化学偶联。根据重组蛋白的性质和偶联条件，偶联可以是多点偶联(例如通过多个赖氨酸)或单点偶联(例如通过单个半胱氨酸)。或者，重组蛋白可以通过非共价键合连接到载体上，例如物理吸附或生物特异性吸附。
在一些实施方案中，基质包含偶联于载体的5-25，例如5-20mg/ml、5-15mg/ml、5-11mg/ml或6-11mg/ml的重组蛋白。偶联蛋白的量可由偶联过程中所用蛋白质的浓度、所用的活化和偶联条件和/或所用载体的孔结构来控制。作为一般规律，基质的绝对结合容量随着偶联蛋白的量而增加，至少达到孔通过偶联蛋白而变得显著缩小的点。在高偶联水平下，每mg偶联蛋白的相对结合容量将下降，导致在上述指定的范围内的最优成本效益。
在某些实施方案中，蛋白通过硫醚键偶联到载体上。用于执行这样的偶联的方法在本领域中是公知的，并且本领域技术人员使用标准技术和设备容易地执行。硫醚键是柔性的且稳定的，通常适用于亲和色谱。特别是，当硫醚键是通过重组蛋白上的末端或近-末端半胱氨酸残基时，偶联重组蛋白的移动性得到增强，从而提供了改进的结合容量和结合动力学。在一些实施方案中，重组蛋白通过在如上所述的蛋白上提供的C-末端半胱氨酸偶联。这使得半胱氨酸硫醇与载体上的亲电子基团(如环氧基团、卤代醇基团等)有效偶联，形成硫醚桥偶联。或者，重组蛋白可以通过一个或多个酰胺键与载体共价连接。这可以例如通过蛋白质中的一个或多个赖氨酸与载体上的一个或多个活化羧基之间的反应来实现。所述活化例如可以由通常已知的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)试剂进行。另一种选择是，蛋白质通过一个或多个仲胺键连接。这样的键可以由蛋白质中的赖氨酸和载体上的任一羟基形成，这些羟基已经使用例如三氟代乙烷磺酰氯(tresyl chloride)或甲苯磺酰氯化学活化，或通过赖氨酸和载体上的醛之间的还原胺化反应而被活化。例如，醛可以由载体上的邻二醇通过高碘酸氧化而成。
在某些实施方案中，载体包含多羟基聚合物，例如多醣。多醣的例子包括例如葡聚糖、淀粉、纤维素、普鲁兰多糖、琼脂、琼脂糖等。多糖本质上是亲水性的，具有低程度的非特异性相互作用，它们提供高含量的反应性(可活化的)羟基，并且它们对于在生物处理中使用的碱性清洁液通常是稳定的。
在一些实施方案中，载体包括琼脂或琼脂糖。本发明所用的载体可根据标准方法容易地制备，例如反向悬浮胶凝(S Hjertén:Biochim Biophys Acta 79(2),393-398(1964)。或者，基础基质是市售可得的产品，例如以SEPHAROSETMFF(GE Healthcare)的名称销售的交联琼脂糖珠。在特别有利于大规模分离的实施方案中，载体已经使用US6602990或US7396467中描述的方法，经修改以提高其刚性，这些专利文献通过引用以其整体并入本文，因此使得该基质更适合于高流速。
在某些实施方案中，载体例如多醣或琼脂糖载体是交联的，例如用羟烷基醚交联。产生这样的交联的交联剂可以是例如表卤代醇像表氯醇、双环氧化物像丁二醇二缩水甘油醚、烯丙基化试剂像烯丙基卤化物或烯丙基缩水甘油醚。交联有利于载体的刚性并提高化学稳定性。羟烷基醚交联是碱稳定的，并且不引起显著的非特异性吸附。
或者，固体载体基于合成聚合物，例如聚乙烯醇、多羟烷基丙烯酸酯、多羟烷基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺等。在疏水聚合物的情况下，例如基于二乙烯基和单乙烯基-取代的苯的基质，基质的表面通常经亲水化，以使上面定义的亲水性基团暴露在周围的水性液体中。这样的聚合物很容易按照标准方法生产，参见例如“Styrene basedpolymer supports developed by suspension polymerization”(R Arshady:Chimica eL'Industria 70(9),70-75(1988))。或者，使用市售可得的产品，例如SOURCETM(GEHealthcare)。在另一种替代方案中，根据本发明的固体载体包括无机性质的载体，例如二氧化硅、氧化锆等。
在某些实施方案中，固体载体以另一种形式存在，例如表面、芯片、毛细管或过滤器(例如膜或深度过滤基质)。
在第七个方面，本发明公开一种分离免疫球蛋白的方法，其包括以下步骤：
i)提供如上讨论的分离基质，其中重组蛋白包含免疫球蛋白-结合多肽，例如包含一个或多个从金黄色葡萄球菌蛋白A衍生的Fc-结合结构域；
ii)使分离基质与含有免疫球蛋白的液体样品接触，以结合免疫球蛋白；
iii)任选地用洗涤液洗涤分离基质；
iv)使分离基质与洗脱液接触，以洗脱免疫球蛋白；
v)任选地用清洗液用清洗分离基质。碱清洗液通常用于生物处理，并且只要重组蛋白是碱稳定的，清洗液可包含至少0.1M NaOH或KOH，例如至少0.5M NaOH或KOH，或0.5-2.5M NaOH或KOH。
实施例
首先，将两种不同的信号肽与4种不同的N-末端间隔区在一起测试，以寻找最佳的切割和蛋白表达。该实验(实施例1)使用RhaBAD启动子系统，用Zvar2单体进行。在实施例2中，将最有前景的信号肽和N-末端起始克隆到Zvar2六聚体中。在具有和不具有N-末端起始序列的情况下，在分批进料发酵中测试了该构建体。这项研究采用T5启动子表达系统进行。在实施例3中，对金黄色葡萄球菌蛋白A的所有天然结构域、Zvar单体(Zvar1)、Zvar2单体(Zvar21)和Zvar四聚体(Zvar4)用选择的信号肽和N-末端起始进行检测，以观察起始序列是否对密切相关的结构域也有影响。实施例3也是用T5表达系统进行的。实施例4用一组不同的N-末端间隔区进行，实施例5是使用几个选定的间隔区进行的规模放大发酵，和实施例6是使用AQYEDGKQYTGT N-末端间隔区结合免疫球蛋白-结合蛋白的不同突变体进行的研究。
材料和方法
构建体
表1中描述的基因是由合成基因的合同制造商(ATUM,CA,USA)合成的。根据氨基酸(AA)序列合成了双链二脱氧核糖核酸(DsDNA)，并对其在大肠杆菌中的表达用制造商专有算法进行了优化。将dsDNA与来自DsbA或OmpA的信号肽一起插入到表达载体pD861-SR或pJ401中(表2)。
表1.从ATUM订购的质粒
*E、D、A、B和C结构域具有A1V突变，以在序列的起始中添加限制性位点(VD)，和D结构域具有插入的D，以具有一致的载体多克隆位点。
表2.信号肽
N-末端的克隆
使用化学感受态细胞将所有质粒转化到大肠杆菌K12-017中。为了改变载体，在FspI和KpnI切割位点之间插入8AA的短间隔区序列。从OmpA(AQKDQTWYTGGT,SEQ ID NO16)、DsbA(AQYEDGKQYTGT,SEQ ID NO 17)、SpA(AQHDEAQQEAGT,SEQ ID NO 18)或来自M13噬菌体GIII AA 236-243(AQGGGSGGGSGT,SEQ ID NO 19)的柔性接头结构的成熟蛋白中第一个AA获得8AA序列，其中在OmpA中具有修饰以适合限制性位点，并在OmpA和SpA中具有修饰以将天冬酰胺突变为谷氨酰胺(图1)。此外，将一系列不同的序列克隆到质粒pGE0002中(表1)。
质粒的消化
质粒用限制性内切酶FspI和KpnI(New England Biolabs(NEB),MA,USA)切割，将6μl NEB缓冲液2.1与6μg质粒和2μl FspI混合在一起(共58μl)。将溶液在37℃下孵育1小时，然后加入KpnI。继续孵育2h，接着加入1μl小牛肠磷酸酶(CIP)，然后再孵育30min。使用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)，从消化的质粒除去切除的碱基。
杂交
从Integrated DNA technologies(IDT,IA,USA)订购寡核苷酸。所有寡核苷酸由制造商用5'磷酸基团修饰。将两个互补的寡核苷酸对混合在连接缓冲液中，并加热到95℃，4min，然后冷却到室温。用T4 DNA连接酶(NEB,MA,USA)将杂交片段连接到FspI和KpnI切割的质粒中。所用寡核苷酸的完整清单见表3。
表3.用于添加N-末端起始序列的寡核苷酸的列表
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克隆的构建体将连接的质粒转化至化学感受态大肠杆菌K12-017细胞中。细胞在冰上解冻30min，将100μl感受态细胞加入到10μl连接反应物。细胞在冰上孵育20min，然后在42℃下热休克1min，然后在冰上孵育5min。接着加入900μl SOC-培养基(NEB,MA,USA)。将转化反应物在37℃下，在旋转振荡培养箱中孵育60min，将100μl的各反应物在含有适当选择性抗生素的Luria琼脂平板上铺展开。
用聚合酶链反应(PCR)筛选阳性克隆，选择具有正确插入的克隆。将选择的克隆在含有适当抗生素的10ml Luria肉汤(LB)中生长过夜(o/n)，接着使用Qiagen PlasmidMiniprep试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)进行质粒制备。质粒被送往GATC Biotech进行序列验证(GATC Biotech,Cologne,Germany)。
表4.加入N-末端起始序列后生成的质粒
实施例1
摇瓶中的蛋白表达和纯化
将用重组质粒pGE0138-145转化的大肠杆菌菌株K12-017，在30℃下，在100mlTerrific肉汤(TB)培养基(每升含有12g胰蛋白胨、24g酵母提取物、5g甘油(85％)、2.31gKH2PO4、12.54g K2HPO4和50mg硫酸卡那霉素)中培养4h。当OD600nm达到1-2时，使用4mM L-鼠李糖(Sigma Aldrich,MO,USA)诱导培养物。于30℃进一步孵育培养物17-20h。在转位式转子中对培养液进行低速(4,000rpm)离心20min，以收集湿的细胞沉淀。使细菌细胞沉淀悬浮于20ml的25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，并在加热块中将细胞在85℃下经热处理溶解10min。然后经高速(13000rpm)离心10min，以分离上清液。然后上清液经0.2μm注射器滤器过滤，以除去任何残留的微粒，然后将其应用于IgG Sepharose 6FF(GE Healthcare Bio-Sciences,Uppsala,Sweden)亲和色谱柱。用加载缓冲液(25mM磷酸盐pH 7,250mM NaCl)平衡柱，然后加载样品。加载后，用5个柱体积(CV)的加载缓冲液和1个CV的低盐洗涤缓冲液(50mM乙酸盐PH 6)洗涤柱，然后用50mM乙酸(pH 2.8)洗脱。使用explorer 100色谱系统(GE Healthcare Bio-Sciences,Uppsala,Sweden)在线测量237nm处的吸光度，并在系统软件(Unicorn 5.1)中进行洗脱峰的峰积分。
2种信号肽和4种N-末端起始的摇瓶结果
在表达系统的第一次优化工作中，利用细胞中不同的分泌途径，测试了两种不同的信号肽。DsbA采用信号识别粒子(SRP)途径和OmpA采用Sec途径。来自使用DsbA和OmpA信号肽的蛋白表达的结果显示OmpA信号肽具有较高的蛋白表达；为DsbA信号肽的2-5倍。此外，信号肽切割位点后的第一个N-末端AA对表达水平有显著影响。在这项研究中，DsbA起始AA与两种信号肽一起具有最高的表达水平。利用两种信号肽，对于Flex8AA起始序列发现最低的表达水平。
液相色谱偶联质谱(LC/MS)结果
使用LC/MS(Waters,PA,USA)分析得自IgG Sepharose 6FF的洗脱液。结果显示，具有AQGT作为N-末端起始序列的参考构建体pGE0120的洗脱液具有一系列不同的信号肽切割位点(图3；a)。用正确处理的信号肽，具有正确质量的峰的积分面积占总面积的52％。其它峰对应于具有额外6AA、额外9AA、完整信号肽(额外21AA)和自主构建体缺失7AA的切割位点。加入来自DsbA的8-AA后，信号肽被正确地切割到96％(图3；b)。用DsbA信号肽和DsbA8AAN-末端见到相似结果，具有97％正确切割的信号肽。
实施例2
分批进料发酵罐中的蛋白表达
使用了6个1L工作体积发酵罐，GRETA(Belach Bioteknik,Sweden)。起始体积设定为750ml，而最终体积约为1L。将充气设定为1L/min，自动控制温度、pH和消泡剂。通过加入25％氨和2M磷酸，将pH保持在设定值。当出现高发泡时，消泡控制自动添加BreoxFMT 30(BASF,Ludwigshafen,Germany)。pH和溶解氧(DO)由Broadley James(CA,USA)的探头控制。通过提高搅拌器转速从300rpm直至1500rpm，将DO保持稳定在30％。当搅拌器达到最大转速时，DO第二个设定点为20％，并且通过加入混合纯氧至气流中而保持稳定。补充有50mg/L卡那霉素或新霉素的Terrific肉汤(TB)被用于摇瓶预培养中，通过将100μl细胞悬液加入到补充有50μg/mL卡那霉素或新霉素的100mL TB中启动，并于37℃培养17h。用10ml预培养物接种主发酵培养基。含60％(w/v)的葡萄糖进料(VWR,PA,USA)在消耗初始批次葡萄糖后，按照预先设定的模式供给到发酵罐中。主发酵的总时长为26h。/>
使用标准曲线的浓度分析
在1.5ml管中，于85℃下热处理发酵样品5min。接着高速(13500rpm，在台式离心机中)离心5min以分离上清液。通过0.2μm注射器滤器过滤上清液，以除去任何残留的微粒，然后将它们应用于IgG Sepharose 6FF HiTrapTM柱(GE Healthcare Bio-Sciences,UppsalaSweden)。用加载缓冲液(磷酸盐缓冲盐水(Medicago,Uppsala,Sweden))平衡柱，接着加载50μl样品。加载后，用5CV加载缓冲液洗涤柱，然后用200mM磷酸盐缓冲液(pH2.9)洗脱。在线测量237nm处的吸光度，并在色谱系统软件中执行洗脱峰的峰积分。通过使用已知浓度的纯化蛋白的标准曲线，测定样品的蛋白质浓度。
发酵、蛋白表达结果
含有Zvar2六聚体(Zvar26)的质粒pGE0002用FspI和KpnI限制性内切酶切割。来自DsbA的N-末端起始被连接到切割的载体上，得到的质粒被称为pGE0180。将这两种载体转化至大肠杆菌K12-017，得到的构建体在分批进料发酵中表达，以观察蛋白表达和信号肽切割模式的差异。使用标准曲线的蛋白浓度分析表明，蛋白表达从3.5g/L增加至16.8g/L，即蛋白表达有超过4倍的增加(图4)。
LC/MS结果
使用LC/MS(Waters,PA,USA)分析来自IgG Sepharose的洗脱液。结果表明，来自参考构建体pGE0002的洗脱液显示出一系列不同的信号肽位点，包括带有额外6AA和9AA的切割位点，以前在实验1中观察到(图5，a)。然而，当在N-末端加入来自DsbA的8-AA时，信号肽被正确地切割，形成正确质量的清晰单峰(图5；b)。
实施例3
蛋白质在分批进料发酵罐中表达和如实施例2中采用标准曲线进行浓度分析。
蛋白制备
将过滤的样品(见上文)应用于IgG Sepharose 6FF Tricorn 10柱，CV为10.5ml(GE Healthcare Bio-Sciences,Uppsala,Sweden)。用高盐加载缓冲液(50mM磷酸盐，pH7.0，500mm NaCl)平衡柱，然后根据浓度计算加载0.5-5mL样品(见上文)。加载后，用5CV的加载缓冲液清洗柱，然后用100mM乙酸洗脱。使用Vivaspin 5，3000Da截止(GEHealthcare Bio-Sciences,Uppsala,Sweden)，收集洗脱的样品并浓缩至约1mg/ml。使用基于Pace et al.Protein Science 4,2411-2423,(1995)和Beer Lamberts定律计算的比吸光度系数，通过在280nm处的吸光度测量来估计蛋白质的量。使用洗脱池中的总蛋白质量和注入样品的体积对样品浓度进行反计算。用氨基酸分析证实浓度。在Waters Q-Tof(PA,USA)上用质谱法分析均匀度和分子量。
其它构建体的蛋白表达结果
为测定N-末端起始序列对来自金黄色葡萄球菌蛋白A的其它结构域和碱稳定结构域Zvar单体(Zvar1)和四聚体(Zvar4)的影响，用另外的N-末端构建了新的质粒，并利用质粒pJ401在分批进料发酵中表达。结果表明，在没有插入的情况下，E-结构域没有可测量的表达。然而，用8AA DsbA起始，蛋白表达被测量为2.9g/L。D-和A-结构域均显示出低表达，其通过添加N-末端起始未改善。C-和B-结构域二者(其在起始处具有相同的AA序列)显示出非常类似的表达，用8AA DsbA起始的表达明显增加。然而，在Zvar-和Zvar2单体(Zvar1和Zvar21)上观察到最大的表达增加，分别为超过4倍和10倍的蛋白表达。同样，Zvar四聚体(Zvar4)显示出8AADsbA起始的蛋白表达的显著增加，即使该增加并未如单体那么显著。
表5.在有和无N-末端起始序列的情况下，实施例蛋白，prA的所有结构域、Zvar和Zvar四聚体的蛋白表达
如上所述的标准曲线或蛋白制备方法。
在用N-末端间隔区的第一次实验中，对来自两种分泌途径的两种不同的信号肽进行了检测，和表明在该实验中，利用Sec依赖途径的OmpA信号肽具有最高的表达和信号肽切割。使用该途径的其它信号肽为例如PhoA(大肠杆菌碱性磷酸酶)、MalE(大肠杆菌麦芽糖结合蛋白)和PelB(胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)果胶裂解酶B)。相反，使用DsbA信号肽的参考构建体(具有AQGT起始)具有较高的蛋白表达和信号肽切割，表明它是信号肽和N-末端的组合。此外，对四种不同的N-末端进行了测试，与使用OmpA信号肽的参考构建体相比，它们的工作效果都更好。令人惊讶的是，当信号肽切割最有效时，蛋白质的表达也增加，表明信号肽酶的切割可能是蛋白质跨内膜运输的限速酶。不受理论的束缚，一种假设是蛋白“卡在”内膜的孔中，并在分泌不是最有效的情况下停止进一步的表达。在高蛋白质表达的培养中，在发酵液中的细胞外发现超过50％的蛋白质，表明周质泄漏到细胞外空间。当测试来自金黄色葡萄球菌蛋白A的其它结构域时，观察到E-结构域没有可测量的蛋白表达，这是始料未及的，因为它是在天然金黄色葡萄球菌蛋白A中信号肽之后的第一个结构域。然而，一个重要的区别是，为了克隆目的，切割位点后的第一个AA已经从AQHDEA变为AQGTVDEA，并且这种替换/插入可能对信号肽功能产生负面影响。另一个不同之处在于信号肽已经从天然的SpA替换为OmpA，这与N-末端起始的组合可能不是最佳的。当将8AA DsbAN-末端加入到与OmpA信号肽组合的E-结构域时，蛋白质转运和表达功能正常。此外，在N-末端近端结构单元中关系非常密切的A和D结构域表达差，且不能通过附加的AA来改善，而在该单元中相同的B和C-结构域用AQGT起始表达良好，和当在N-末端添加8AA DsbA时，表达另外增加。Zvar作为单体和四聚体，用附加的AA也增加表达。然而，Zvar2单体中观察到最显著的增加，其中蛋白质表达从0.68g/L增加到7.28g/L。不受理论的束缚，Zvar和Zvar2之间的区别的一个假设是Zvar2在第一个α螺旋的位置Q9和N11有两个突变，估计这在蛋白的起始中增加α-螺旋结构，如用在https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝/NPSA/npsa_gor4.html(PRABI,-Alpes Bioinformatics Center)在线获得的算法例如GORIV计算的，从而增加了信号肽酶切割新生蛋白的信号肽的空间位阻。
实施例4
N-末端间隔区的变体
N-末端插入各自被设计用于研究插入序列对一个或多个下列参数的影响：蛋白产量、信号肽切割和碱稳定性。设计可如下分为四个单独的类别：
1.更改现有插入长度而不作修饰。
2.在碱性条件下去除可疑截短部位(甘氨酸-苏氨酸)，同时改变剩余插入长度。
3.将已知截短位点中的甘氨酸替换为各种其它残基。
4.替换整个序列。
1类的目的主要是研究插入长度对信号肽切割和蛋白产量的影响，而在碱性条件下没有明确地处理可疑的截短位点。2和3类主要是为了解决碱稳定性问题，尽管它们也为其它两个问题提供了一些更多的数据。4类是一个更开放的类别，提供了一套更广泛的序列，以提供在所有三个感兴趣的领域中的数据。核苷酸序列对大肠杆菌进行了密码子优化，但在更多重复序列中增加了一些简并性。属于1和4类的插入物被设计为对5’端的FspI和3’端的KpnI的消化位点是互补的。由于甘氨酸-苏氨酸截短位点是KpnI限制性位点的一部分，属于2类和3类的插入物被设计改为与3’端的相邻AccI限制性位点互补，同时保留5’端对FspI的互补性。所有插入物的氨基酸序列在表6中示出。图6示出了一般构建体的示意图。
表6.用于实验的所有插入物。从限制性位点”疤痕”产生的残基用斜体标记。
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通过将不同的杂交寡核苷酸连接到pGE0002或pGE0180的质粒中装配构建体，所述质粒用相关限制性内切酶消化以去除原始N-末端插入物。连接后，将质粒转化至大肠杆菌K12-017细胞。用菌落PCR和电泳法筛选阳性菌落。
选择来自各构建体的两个或三个克隆并将其送至GATC biotech(Cologne,Germany)以供序列验证。
在摇瓶培养中，对每个构建体选择一个经序列验证的克隆以供蛋白表达。图7显示了用IgG Sepharose 6FF进行的不同摇瓶培养中蛋白产率的定量结果的总结。对于每个构建体，左侧条是使用5g/L和10g/L标准溶液作为参考的线性校正后的蛋白浓度。右侧条是这种浓度除以在培养结束时的OD600 nm。这个值意味着给出了一个概念，即低蛋白质浓度是由于每个细胞的实际低的蛋白产生速率导致，还是仅仅由于低的培养密度导致。注意，浓度是在将细胞沉淀并将它们重新悬浮于磷酸盐缓冲溶液(Medicago,Uppsala,Sweden)后测量的，因此不能直接与从例如多发酵器采集的样品的浓度进行比较。
使用IgG Sepharose 6FF(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)纯化从摇瓶培养得到的每个构建体的蛋白溶液。使用LC/MS分析(Waters,PA,USA)对纯化的蛋白样品进行信号肽切割研究。具有正确切割的信号肽的蛋白只有一个主质量(实例总离子计数(TIC)示于图8a中)，而具有不正确切割的信号肽的蛋白产生一个或多个次级峰(如图8b中所示)。主峰的左侧和右侧的侧峰可能是由于当从细胞培养物中提取蛋白时在热处理步骤期间来自细胞质的泄漏引起的。峰C1-C5、N1和N2可能是来自细胞质的不同部分消化形式的蛋白质。主峰右侧的小峰是含有未切割信号肽的蛋白质，这将合理地判断是否发生了来自细胞质的泄露。
在许多情况下，由于样品的纯度和液相色谱步骤中的分离不足，这些峰很难确切地得到解释。然而，可以观察到以下构建体具有正确的信号肽切割：pGE0180、DsbA7、DsbA6、DsbA8_noGT、DsbA8_DT、DsbA8_ET、DsbA8_AT、DsbA7_EDT、DsbA12、DsbA16、H8、H6和SPA。
在信号肽切割研究后，使用Capto Q ImpRes阴离子交换柱(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)进一步纯化具有正确信号肽切割的构建体的蛋白溶液。纯化的样品用1M氢氧化钠(NaOH)处理0、4和24小时。使用Vivaspin柱(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)将主蛋白与任何可能已被截短的小肽分离。使用LC/MS(Waters,PA,USA)对肽样品和主蛋白二者进行研究。
肽以+2电荷出现在质谱中，即质量比电荷(m/z)值对应于其分子量的一半。在这里研究的案例中，所有肽的分子量都在约800Da和1600Da之间。因此，相关的峰群出现在400和800m/z之间，如可在图9左边对pGE0180所示的。
如果存在多肽，则对TIC利用MassLynx搜索功能，以提取不同肽质量的峰，作为提取的离子色谱图(XIC)。对XIC峰积分，然后利用积分的面积来比较样品中不同肽的量。
图10显示了得自用未洗涤的Vivaspin柱进行的初始碱稳定性研究的结果总结。尽管有相当一些重叠的背景噪音，但在孵育24小时后，清晰的图案是可见的。
图11显示了最有希望的构建体的相同数据的不同见解(包括作为参考的pGE0180)，而图12给出了最显著切割构建体的分解。包括在切割位点周围的序列，以便了解哪些残基可能是易受影响的。值得注意的是，对于低峰面积(约5000个面积单位)，背景噪声有着显著的影响。
用异丙醇洗涤的旋转柱的第二次分析产生与初始运行基本相似的结果，虽然峰面积减少。值得注意的例外是DsbA6，它被发现有一些切割。这不是从肽分析中立即检测到的，而是在研究保留物时变得明显，其中DsbA6以与pGE0180非常相同的方式显示了明显的截短峰，而DsbA8_noGT和DsbA_DT未显示出这样的峰。
实施例5从摇瓶研究和纯化蛋白的随后分析中选择感兴趣的构建体，用于在多发酵器(Belach Bioteknik,Sweden)中进行更大规模的培养。在发酵结束时，测量OD600nm和蛋白浓度(见图13)。
由于不同的蛋白有略微不同的消光系数，毫无疑义它们在237nm处的吸光度也可能不同，这是估计蛋白浓度的情况。因此，利用pGE0180消光系数(0.294)和计算出的每种其它蛋白质的消光系数之间的比值来估计更“真”的值。
构建体DsbA8_noGT和DsbA8_DT的分批进料培养物经热处理以提取周质蛋白，离心和渗滤以去除细胞碎片。调节滤液以通过沉淀去除一些污染物，制备溶液用于用pH梯度进行Capto S ImpAct(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)纯化。还原洗脱液以去除二聚体，和在使用盐梯度的情况下将其脱盐以去除DTT，并获得正确的缓冲液用于阴离子交换纯化。最终纯化的溶液通过膜超滤浓缩，以达到在所需配体密度下固定所需的浓度。最终产物用SEC进行纯度分析，并用LC/MS进行分子量分析，结果令人满意。
将纯化的蛋白质(纯度>90％)偶联到高度交联的琼脂糖珠上，目的是使配体密度类似于先前实验(其中Zvar2被固定在性质相似的基础基质上，并对其动态结合容量进行分析)。偶联的凝胶被填充到Tricorn 5/100柱(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)中。通过丙酮峰的不对称性来评价凝胶床的填充。用填充柱测定凝胶使用IgG的动态结合容量。每个构建体进行一次测量。结果总结在表7中。图14示出了在这种情况下进行的测量和在先前提及的实验中进行的测量之间的比较。
表7.不同蛋白偶联凝胶的不对称和动态结合容量值
Zvar2 DsbA8_noGT DsbA8_DT
Qb10(mg IgG/mL凝胶) 73.7 74.2 71.6
Qb80(mg IgG/mL凝胶) 93.6 92.2 90.7
实施例6
使用OmpA信号肽，将N-末端间隔区AQYEDGKQYTGT和C-末端半胱氨酸引入到Zvar2的许多单体和二聚体的其它突变体中(如下所列出的)。因此，成熟蛋白的结构是：AQYEDGKQYTGT-IgG-结合多肽-C。
质粒被转化至化学感受态大肠杆菌K12-017细胞。将细胞在冰上解冻30min，将50μl感受态细胞加入到20ng质粒。细胞在冰上孵育20min，接着于42℃热休克1min，然后在冰上孵育5min并加入400μl SOC-培养基(NEB,MA,USA)。将转化反应物在37℃下，在旋转振荡培养箱中孵育60min，将200μl的每种反应物在含有适当选择性抗生素的Luria琼脂平板上铺展开。
将用重组质粒(表8)转化的大肠杆菌菌株K12-017于37℃，在100ml Terrific肉汤(TB)培养基(每升含有12g胰蛋白胨、24g酵母提取物、5g甘油(85％)、2.31g KH2PO4、12.54gK2HPO4和50mg硫酸卡那霉素)中培养。当OD600nm达到1时，使用1mM IPTG(SigmaAldrich,MO,USA)诱导培养物。培养物于30℃下进一步孵育17-20h。在转位式转子中对培养液进行低速(4,000rpm)离心20min，以收集湿的细胞沉淀。使细菌细胞沉淀悬浮于10ml的25mM磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)中，在加热块中将细胞在85℃下经热处理溶解15min。然后高速(10000x g)离心10min，以分离上清液。然后上清液经0.2μm注射器滤器过滤，以除去任何残留的微粒，然后将其应用于XK 16-6IgG Sepharose 6FF(GE Healthcare Bio-Sciences,Uppsala,Sweden)。用加载缓冲液(25mM磷酸盐pH7、250mM NaCl)平衡柱，然后加载样品。加载后，用5个柱体积(CV)的加载缓冲液和一个CV的低盐洗涤缓冲液(50mM乙酸盐PH 6)洗涤柱，然后用50mM乙酸(pH 2.8)洗脱。使用explorer 100(GE Healthcare Bio-Sciences,Uppsala,Sweden)在线测量237nm处的吸光度，并在系统软件(Unicorn 5.1)中进行洗脱峰的峰积分。
洗脱IgG-结合流分并将其收集在池中，记录池的体积和蛋白质浓度-参见表8。在几种情况下表达的IgG-结合蛋白的量高于回收的量，这是由于分泌到培养基中的蛋白质的损失和/或IgG柱的过载导致。
表8.具有N-末端间隔区AQYEDGKQYTGT和具有C-末端半胱氨酸的IgG-结合蛋白的表达
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本书面描述使用实施例来公开本发明，包括最佳模式，并还使本领域的任何技术人员能实践本发明，包括制造和使用任何设备或系统，以及执行任何结合的方法。本发明的可专利范围由权利要求书限定，并且可以包括本领域技术人员想到的其它实施例。这样的其它实施例意欲落入权利要求的范围内，如果它们具有与权利要求书的字面语言并非不同的结构元件，或者如果它们包括具有与权利要求书的字面语言不显著的差异的等效结构元件的话。本文提及的任何专利或专利申请通过引用以其整体结合到本文中，如同它们单独结合一样。
<110> 思拓凡生物工艺研发有限公司
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<130> 319573-1
<160> 129
<170> PatentIn version 3.5
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<223> 蛋白A结构域变体
<400> 10
Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu
1 5 10 15
Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val
20 25 30
Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln
35 40 45
<210> 11
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 11
Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu
1 5 10 15
Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val
20 25 30
Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln
35 40 45
<210> 12
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体的多聚体
<400> 12
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp
50 55 60
Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Asn Ala
115 120 125
Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn
130 135 140
Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu
145 150 155 160
Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp
165 170 175
Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His
180 185 190
Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu
195 200 205
Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys
210 215 220
Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Cys
225 230
<210> 13
<211> 349
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体的多聚体
<400> 13
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp
50 55 60
Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala
115 120 125
Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn
130 135 140
Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile
145 150 155 160
Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp
165 170 175
Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His
180 185 190
Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu
195 200 205
Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys
210 215 220
Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu
225 230 235 240
Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu
245 250 255
Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val
260 265 270
Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala
275 280 285
Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr
290 295 300
Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe
305 310 315 320
Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala
325 330 335
Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Cys
340 345
<210> 14
<211> 21
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 14
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala
20
<210> 15
<211> 19
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 15
Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser
1 5 10 15
Ala Ser Ala
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 16
Ala Gln Lys Asp Gln Thr Trp Tyr Thr Gly Gly Thr
1 5 10
<210> 17
<211> 12
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 17
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Gly Thr
1 5 10
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 18
Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Glu Ala Gly Thr
1 5 10
<210> 19
<211> 12
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 19
Ala Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr
1 5 10
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 20
gcagaaagat cagacctggt acaccggcgg tac 33
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 21
cgccggtgta ccaggtctga tctttctgc 29
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 22
gcagcatgat gaagcgcagc aggaagcggg tac 33
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 23
ccgcttcctg ctgcgcttca tcatgctgc 29
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 24
gcagtatgaa gatggcaaac agtacaccgg tac 33
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 25
cggtgtactg tttgccatct tcatactgc 29
<210> 26
<211> 33
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 26
gcagggtggc ggttctggcg gtggcagcgg tac 33
<210> 27
<211> 29
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 27
cgctgccacc gccagaaccg ccaccctgc 29
<210> 28
<211> 4
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 28
Ala Gln Gly Thr
1
<210> 29
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 29
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Gly Thr
1 5 10
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 30
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Gly Thr
1 5 10
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 31
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gly Thr
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 32
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Gly Thr
1 5
<210> 33
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 33
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Thr Leu Glu Lys Gly Thr
1 5 10 15
<210> 34
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 34
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Thr Leu Glu Lys Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Gly Thr
20
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 35
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr
1 5 10
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 36
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln
1 5
<210> 37
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 37
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Glu Thr
1 5 10
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 38
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Asp Thr
1 5 10
<210> 39
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 39
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Ala Thr
1 5 10
<210> 40
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 40
Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Asp Thr
1 5 10
<210> 41
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 41
Ala Gln Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Thr
1 5 10
<210> 42
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 42
Ala Gln Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly Thr
1 5 10
<210> 43
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 43
Ala Gln His His His His His His His His Gly Thr
1 5 10
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 44
Ala Gln His His His His His His Gly Thr
1 5 10
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 45
Ala Gln His His His His Gly Thr
1 5
<210> 46
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 46
Ala Gln Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Thr
1 5 10
<210> 47
<211> 12
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 47
Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Glu Ala Gly Thr
1 5 10
<210> 48
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 48
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 49
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 49
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ser Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 50
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 50
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Tyr Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 51
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 51
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gln Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 52
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 52
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Thr Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 53
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 53
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Asn Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 54
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 54
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Phe Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 55
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 55
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Leu Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 56
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 56
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Trp Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 57
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 57
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ile Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 58
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 58
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Met Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 59
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 59
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Val Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 60
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 60
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Asp Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 61
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 61
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Glu Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 62
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 62
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn His Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 63
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 63
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Arg Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 64
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 64
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Lys Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 65
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体的二聚体
<400> 65
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Phe Asp Lys Glu Ala
50 55 60
Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu
65 70 75 80
Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser
85 90 95
Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro
100 105 110
Lys
<210> 66
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体的二聚体
<400> 66
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala
50 55 60
Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu
65 70 75 80
Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser
85 90 95
Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro
100 105 110
Lys
<210> 67
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体的二聚体
<400> 67
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu
50 55 60
Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg
65 70 75 80
Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala
85 90 95
Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
100 105 110
<210> 68
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体的二聚体
<400> 68
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Ala Gln Glu
50 55 60
Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg
65 70 75 80
Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala
85 90 95
Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
100 105 110
<210> 69
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体的二聚体
<400> 69
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala
50 55 60
Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu
65 70 75 80
Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser
85 90 95
Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro
100 105 110
Lys
<210> 70
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体的二聚体
<400> 70
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Lys Phe Asp Lys Glu Ala
50 55 60
Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu
65 70 75 80
Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser
85 90 95
Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro
100 105 110
Lys
<210> 71
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体的二聚体
<400> 71
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Gln Glu Ala Phe Tyr
50 55 60
Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe
65 70 75 80
Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala
85 90 95
Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
100 105
<210> 72
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体的二聚体
<400> 72
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Tyr Glu Asp Gly Lys Gln
50 55 60
Tyr Thr Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr
65 70 75 80
Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe
85 90 95
Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala
100 105 110
Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
115 120
<210> 73
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体的二聚体
<400> 73
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Tyr Glu Asp Gly Val Asp
50 55 60
Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His
65 70 75 80
Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu
85 90 95
Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys
100 105 110
Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
115 120
<210> 74
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 74
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu
1 5 10 15
His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser
20 25 30
Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys
35 40 45
Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 75
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 75
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys
35 40 45
Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 76
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 76
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys
35 40 45
Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 77
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 77
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ile Leu Ala Glu Ala Lys
35 40 45
Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 78
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 78
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Leu Ala Glu Ala Lys
35 40 45
Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 79
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 79
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Asn Phe Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 80
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 80
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Asn Tyr Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 81
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 81
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Asn Lys Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 82
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 82
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Asn Arg Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 83
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 83
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Phe Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 84
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 84
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Asn Phe Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 85
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 85
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Asn Tyr Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 86
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 86
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Asn Trp Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 87
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 87
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Asn Arg Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 88
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 88
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Asn Lys Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 89
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 89
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Phe Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 90
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 90
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Tyr Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 91
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 91
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Trp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 92
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 92
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Lys Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 93
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A结构域变体
<400> 93
Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Arg Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 94
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 94
gcagtatgaa gatggcaaac agtacggtac 30
<210> 95
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 95
cgtactgttt gccatcttca tactgc 26
<210> 96
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 96
gcagtatgaa gatggcaaac agggtac 27
<210> 97
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 97
cctgtttgcc atcttcatac tgc 23
<210> 98
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 98
gcagtatgaa gatggcaaag gtac 24
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 99
ctttgccatc ttcatactgc 20
<210> 100
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 100
gcagtatgaa gatggcggta c 21
<210> 101
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 101
cgccatcttc atactgc 17
<210> 102
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 102
gcagtatgaa gatggcaaac agtacaccgt 30
<210> 103
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 103
ctacggtgta ctgtttgcca tcttcatact gc 32
<210> 104
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 104
gcagtatgaa gatggcaaac aggt 24
<210> 105
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 105
ctacctgttt gccatcttca tactgc 26
<210> 106
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 106
gcagtatgaa gatggcaaac agtacaccga aaccgt 36
<210> 107
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 107
ctacggtttc ggtgtactgt ttgccatctt catactgc 38
<210> 108
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 108
gcagtatgaa gatggcaaac agtacaccga taccgt 36
<210> 109
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 109
ctacggtatc ggtgtactgt ttgccatctt catactgc 38
<210> 110
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 110
gcagtatgaa gatggcaaac agtacaccgc gaccgt 36
<210> 111
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 111
ctacggtcgc ggtgtactgt ttgccatctt catactgc 38
<210> 112
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 112
gcagtatgaa gatggcaaac agtacgaaga taccgt 36
<210> 113
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 113
ctacggtatc ttcgtactgt ttgccatctt catactgc 38
<210> 114
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 114
gcagtatgaa gatggcaaac agtacaccac cctggaaaaa ggtac 45
<210> 115
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 115
ctttttccag ggtggtgtac tgtttgccat cttcatactg c 41
<210> 116
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 116
gcagtatgaa gatggcaaac agtacaccac cctggaaaaa ccggtggcgg gcggtac 57
<210> 117
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 117
cgcccgccac cggtttttcc agggtggtgt actgtttgcc atcttcatac tgc 53
<210> 118
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 118
gcagcgccgt cgtcgccgtc gccgtcgtgg tac 33
<210> 119
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 119
cacgacggcg acggcgacga cggcgctgc 29
<210> 120
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 120
gcagaagaag aaaaagaaga agaaaaaggg tac 33
<210> 121
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 121
cctttttctt cttctttttc ttcttctgc 29
<210> 122
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 122
gcagcatcac caccatcacc atcaccatgg tac 33
<210> 123
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 123
catggtgatg gtgatggtgg tgatgctgc 29
<210> 124
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 124
gcagcatcac caccatcacc atggtac 27
<210> 125
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 125
catggtgatg gtggtgatgc tgc 23
<210> 126
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 126
gcagcatcac caccatggta c 21
<210> 127
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 127
catggtggtg atgctgc 17
<210> 128
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 128
gcagtggagc catccgcagt ttgaaaaagg tac 33
<210> 129
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区变体
<400> 129
ctttttcaaa ctgcggatgg ctccactgc 29

Claims (23)

1.一种重组蛋白，其由Fc-结合多肽和连接到所述Fc-结合多肽的N-末端的N-末端间隔区组成，其中所述N-末端间隔区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 17所示，并且其中所述Fc-结合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1、4、5、7、8、11、12、13和48-93中的任一个所示。
2.权利要求1的重组蛋白，其还包含在C-末端或邻近C-末端的偶联部分。
3.权利要求2的重组蛋白，其中所述偶联部分包含半胱氨酸残基和/或多个赖氨酸残基。
4.一种编码权利要求1-3中任一项的重组蛋白的核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向包含以下元件，所述元件被操作地连接：
a) 诱导型或组成型启动子DNA序列；
b) 编码信号肽的DNA序列；
c) 编码N-末端间隔区的DNA序列；和
d) 编码Fc-结合多肽的DNA序列。
5.权利要求4的核酸分子，其中所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 14所示。
6.一种克隆载体，其表达权利要求1-3中任一项的重组蛋白并将其分泌到革兰氏阴性细胞的细菌周质中，所述克隆载体包含权利要求4-5中任一项的核酸分子。
7.一种革兰氏阴性细菌，其由权利要求6的克隆载体转化。
8.权利要求7的革兰氏阴性细菌，其被鉴定为大肠杆菌(Escherichia coli)。
9.权利要求8的革兰氏阴性细菌，其被进一步表征为大肠杆菌K12。
10.权利要求8或9的革兰氏阴性细菌，其被进一步表征为大肠杆菌K12-017。
11.一种在革兰氏阴性细菌中表达并分泌权利要求1-3中任一项的重组蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
i) 提供权利要求7-10中任一项的革兰氏阴性细菌；和
ii) 培养所述革兰氏阴性细菌。
12.一种分离基质，其包含共价连接到载体的权利要求1-3中任一项的重组蛋白。
13.权利要求12的分离基质，其中所述载体包含多孔颗粒。
14.权利要求13的分离基质，其中所述多孔颗粒包含交联多糖。
15.权利要求12-14中任一项的分离基质，其中所述重组蛋白通过硫醚键与所述载体共价连接。
16.权利要求12-14中任一项的分离基质，其中所述重组蛋白通过一个或多个酰胺键与所述载体共价连接。
17.权利要求12-14中任一项的分离基质，其中所述分离基质是碱稳定的。
18.权利要求17的分离基质，其中在0.5 M NaOH中于22±2℃孵育24小时后，基质的IgG容量为孵育前IgG容量的至少80%。
19.一种分离免疫球蛋白的方法，其包括以下步骤：
i) 提供权利要求12-18中任一项的分离基质；
ii) 使所述分离基质与含有免疫球蛋白的液体样品接触，以结合所述免疫球蛋白；
iii) 任选地用洗涤液洗涤所述分离基质；
iv) 使所述分离基质与洗脱液接触，以洗脱所述免疫球蛋白。
20.权利要求19的方法，其中所述方法还包括在步骤iv)后用清洗液清洗所述分离基质的步骤v)。
21.权利要求20的方法，其中所述清洗液包含至少0.1 M NaOH或KOH。
22.权利要求20的方法，其中所述清洗液包含至少0.5 M NaOH或KOH。
23.权利要求20的方法，其中所述清洗液包含0.5-2.5 M NaOH或KOH。
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