WO2015087848A1 - タンパク質－磁性粒子複合体及びその製造方法 - Google Patents

タンパク質－磁性粒子複合体及びその製造方法 Download PDF

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WO2015087848A1
WO2015087848A1 PCT/JP2014/082469 JP2014082469W WO2015087848A1 WO 2015087848 A1 WO2015087848 A1 WO 2015087848A1 JP 2014082469 W JP2014082469 W JP 2014082469W WO 2015087848 A1 WO2015087848 A1 WO 2015087848A1
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binding
magnetic
complex
fusion
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知子 吉野
田中　剛
松永　是
泰博 菅又
亨 本多
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国立大学法人東京農工大学
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
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    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
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    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/705—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a protein-A fusion

Definitions

  • the present invention relates to a protein-magnetic particle complex and a method for producing the same.
  • a complex in which a functional protein or peptide such as an antigen or antibody (hereinafter collectively referred to as “protein”) is immobilized on the surface of the magnetic particle.
  • a functional protein or peptide such as an antigen or antibody
  • Patent Documents 1 to 3 Techniques for detecting antibodies or antigens by antigen-antibody reaction using a "complex” are proposed (Patent Documents 1 to 3). Complexes that have reacted with antibodies or antigens can be separated magnetically.
  • Such a protein-magnetic particle complex has been prepared by producing the target protein and magnetic particles in different systems and immobilizing the protein on the magnetic particles.
  • the target protein is produced using bacteria such as Escherichia coli and yeast, while the magnetic particles are magnetic bacteria that produce magnetic bacterial particles (hereinafter referred to as “BacMPs”) in the cells.
  • Baceinafter referred to as “BacMPs” magnetic bacteria that produce magnetic bacterial particles
  • the protein was immobilized on the magnetic particle by chemical treatment using a polyfunctional compound, a cross-linking agent, or the like to form a protein-magnetic particle complex.
  • a protein can be immobilized on a lipid bilayer on the surface of a magnetic particle by mixing the magnetic particle whose surface is modified with an amino group or a carboxyl group and a protein in the presence of a crosslinking agent.
  • Patent Documents 2 and 3 immobilizes the amino group and carboxyl group of the functional protein on the carrier at random, thereby causing denaturation and inactivation of the protein.
  • immobilization requires a lot of proteins, and the operation becomes complicated.
  • the target functional protein here, antibody
  • binding affinity are expressed on the gene that encodes the anchor protein localized in the lipid bilayer on the surface of magnetic bacterial particles (BacMPs).
  • a method using a plasmid prepared by fusing a gene encoding a protein having a protein here, an antibody binding domain
  • Patent Document 4 The plasmid obtained by introducing the plasmid into a magnetic bacterium is cultured to obtain magnetic bacterium particles displaying the anchor protein and the antibody binding domain.
  • the antibody can be immobilized on the magnetic particles by isolating the magnetic bacterial particles from the cells and adding a solution containing the antibody to the particles.
  • this technique also requires a complicated operation before obtaining the complex.
  • Japanese Patent No. 2948935 Japanese Laid-Open Patent Publication No. 5-20984 JP-A-5-099926 Japanese Patent No. 5119398
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a novel and useful protein-magnetic particle complex and to provide a method for producing the complex without requiring complicated operations. is there.
  • the gram-negative magnetic bacterium Magnetospirillum magneticum AMB-1 produces chain-sized nanosized BacMPs in the cytoplasm.
  • Various applications of recombinant BacMPs, such as immunoassays, ligand-receptor interactions or cell separations have been demonstrated by expressing the protein of interest on BacMPs, but the reducing environment is Gram negative Since disulfide bonds are not formed in the cytoplasm of magnetic bacteria, proteins that require the formation of intramolecular disulfide bonds for proper folding (hereinafter referred to as “disulfide bond proteins”) are retained on BacMPs while retaining their functions. It was difficult to express.
  • the present inventors have constructed a dual expression system in which disulfide-bonded proteins are expressed in the periplasm, which is an oxidative environment, and proteins that are docking partners of disulfide-bonded proteins are expressed in the cytoplasm. did. After culturing the bacteria, the cells are disrupted, and the magnetic bacterial particles and the disulfide bond protein are docked via the docking partner, whereby a complex in which the disulfide bond protein is functionally expressed on BacMPs can be produced. According to this method, a complex can be formed by docking a disulfide-bonded protein and a protein that is a docking partner thereof in vitro, and is referred to herein as “in vitro docking method”.
  • the first aspect of the present invention is (1) A method for producing a complex of disulfide bond protein and magnetic particles in Gram-negative magnetic bacteria, (I) in the bacteria, (A) a first fusion protein comprising a disulfide bond protein fused to a binding protein; and (b) a second fusion protein comprising a binding partner protein fused to a protein that can be bound or integrated into a magnetic bacterial particle.
  • a co-expression step wherein the expression of the first fusion protein is induced into the periplasm of the bacterium and the expression of the second fusion protein is induced into the cytoplasm of the bacterium; (Ii) a culturing step of culturing the bacterium of step (i) under conditions sufficient to produce the first and second fusion proteins; (Iii) a step of destroying a bacterial cell membrane in the step (ii), wherein a cell membrane disruption step in which a complex of the disulfide bond protein and magnetic bacterial particles is formed; Is a manufacturing method.
  • protein includes not only proteins but also peptides.
  • “Disulfide bond protein” refers to a protein containing at least one disulfide bond in the molecule.
  • binding protein and “binding partner protein” refer to proteins that have binding affinity for each other and can specifically form a bond.
  • magnetic bacterial particles refers to magnetic particles produced by magnetic bacteria, and is also referred to herein as “BacMPs”.
  • Protein that can be bound to or integrated with magnetic bacterial particles refers to a protein that can be bound to or integrated with magnetic bacterial particles, even if the protein is inherent in the organelle of magnetic bacteria. It may be a protein that is bound or integrated into magnetic bacterial particles by a technique.
  • One embodiment of the present invention includes (2) The production method according to (1), further including an isolation step (iv) for isolating the complex of the step (iii) from the disrupted cells.
  • preferred embodiments of the present invention include: (3) The production method according to (1) or (2), further including a recovery step of recovering the disulfide bond protein from the complex; (4) The production method according to any one of (1) to (3) above, wherein the binding protein is an immunoglobulin Fc domain; (5) The production method according to any one of (1) to (4) above, wherein the binding partner protein is a ZZ domain of protein A derived from Staphylococcus aureus ; (6) The production method according to any one of (1) to (5) above, wherein the disulfide-linked protein is a single-chain variable fragment (scFv); and (7) bound or integrated with the magnetic bacterial particle.
  • the production method according to any one of (1) to (7) above, wherein the protein to be obtained is Mms13 derived from Magnetospirum magneticum .
  • the present inventors have established a technique for immobilizing a plurality of target proteins on BacMPs in vivo using the magnetic bacterium Magnetospirillum magneticum AMB-1 as a protein expression host.
  • a scaffold protein is localized on BacMPs, and at the same time, a plurality of target proteins are each co-conjugated as a fusion protein fused with a tag protein (binding protein) that can bind to the scaffold protein (binding partner protein).
  • binding protein binding protein
  • a plurality of target proteins can be immobilized on BacMPs. Since this technique forms a complex by docking a plurality of target proteins and a scaffold protein in vivo, it is referred to as “in vivo docking method” in the present specification.
  • the second aspect of the present invention is (8) magnetic particles; A scaffold protein fused to a protein that can be bound to or integrated with magnetic particles and comprising a first binding partner protein and a second binding partner protein; A first fusion protein comprising a first binding protein and a first target protein fused to the first binding protein; A second fusion protein comprising a second binding protein and a second target protein fused to the second binding protein; A complex of protein and magnetic particles containing The first target protein is immobilized on the magnetic particle through the binding of the first binding protein and the first binding partner protein, The complex in which the second target protein is immobilized on the magnetic particle through the binding between the second binding protein and the second binding partner protein.
  • first binding protein and the “first binding partner protein” can form a bond with each other by affinity, and the same applies to the “second binding protein” and the “second binding partner protein”. Have the relationship.
  • the preferable aspect of this invention is: (9) The complex according to (8), wherein the function of one of the first target protein and the second target protein is expressed by the presence of the other protein.
  • Another aspect of the present invention is: (10) A method for producing a complex of a plurality of proteins and magnetic particles in a gram-negative magnetic bacterium, (I) in the bacteria, (A) a first fusion protein comprising a first binding protein and a first target protein fused to the first binding protein; (B) a second fusion protein comprising a second binding protein and a second target protein fused to the second binding protein, and (c) a fusion to a protein that can be bound to or integrated with magnetic bacterial particles.
  • a preferred embodiment of the present invention is: (11) (iii) a cell membrane disrupting step for destroying a bacterial cell membrane in the step (ii); (Iv) an isolation step of isolating the complex formed in the step (ii) from the cells destroyed in the step (iii);
  • a novel and useful protein-magnetic particle complex is provided. Moreover, the method of manufacturing this composite_body
  • FIG. 4 shows an in vitro docking method according to one embodiment of the present invention.
  • A The target disulfide bond protein migrates to the periplasm, while the bond protein is expressed on cytoplasmic BacMPs. Disulfide bond proteins dock to the binding proteins on BacMPs while magnetically separating BacMPs from cell lysates.
  • B Expression vector. All fusion genes represented here, M. It is expressed under the mms16 promoter from Magneticum AMB-1. An IgG binding assay is shown. Prior to cell lysis, alkaline phosphatase (AP) -conjugated donkey IgG was transformed into Mms13ZZ transformants or M. pylori . Added to Magneticum AMB-1 wild type.
  • AP alkaline phosphatase
  • BacMPs were extracted, and the binding of IgG-AP to Mms13-ZZ was detected by chemiluminescence. 2 shows the time course of scFv-Fc binding on ZZ-BacMPs.
  • BacMPs were magnetically recovered from the cell lysate at 0, 10, 30, and 60 minutes after cell disruption. Thereafter, the membrane protein extracted from BacMPs was subjected to Western blot using mouse anti-FLAG antibody and donkey anti-mouse IgG-AP. Shown are Western blot analyzes of Mms13-ZZ, Mms13-scFv and scFv-Fc prepared under reducing conditions ((A)) and non-reducing conditions ((B) and (C)).
  • scFv fusion protein was detected by anti-FLAG IgG-AP and Mms13-ZZ was detected by donkey anti-mouse IgG-AP.
  • C Mms13-ZZ and scFv fusion protein was detected with rabbit anti-human ⁇ light chain polyclonal antibody and AP-conjugated anti-rabbit IgG.
  • Mms13-ZZ is a BacMPs membrane protein derived from a transformant contained in pUM13ZZ
  • Mms13-ZZ + scFv-Fc is a BacMPs membrane protein derived from a transformant contained in pUM13ZZ / scFvFc
  • Mms13-scFv is 2 shows a BacMPs membrane protein derived from a transformant contained in pUM13scFv.
  • Figure 2 shows a ⁇ -galactosidase binding assay on BacMPs.
  • ZZ is BacMPs extracted from a transformant contained in pUM13ZZ
  • scFv BacMPs extracted from a transformant contained in pUM13scFv
  • ZZ + scFv ⁇ Fc is a trait contained in pUM13ZZ / scFvFc BacMPs extracted from the transformant are shown.
  • M.M. In silico analysis of magneticnetum AMB-1 DsbA protein is shown. Using the ClustalW 2.1, M. A comparison was made between DsbA derived from magneticum AMB-1 and E. coli. Shading indicates the confirmed sequence motif.
  • M.M In silico analysis of magneticnetum AMB-1 DsbB protein.
  • Figure 7 shows expression and localization analysis of Mms13-miniscaffolidin.
  • A shows Western blotting of membrane fraction of BacMPs
  • B shows antibody binding assay.
  • Lane 1, lane 2 and lane 3 show a transformant holding pUMtetDoc-M13miniscaf, a transformant holding pUMtetDoc and a wild type, respectively.
  • Figure 3 shows expression analysis of whole cell extracts by Western blotting.
  • A) was detected with an anti-GFP antibody
  • (B) was detected with an anti-mCherry antibody.
  • Lane 1, lane 2 and lane 3 show a transformant holding pUMtetDoc-M13miniscaf, a transformant holding pUMtetDoc and a wild type, respectively.
  • Figure 2 shows an antibody binding assay to the BacMPs surface. (A) was detected with an anti-GFP antibody, and (B) was detected with an anti-mCherry antibody.
  • Lane 1, Lane 2 and Lane 3 show BacMPs derived from a transformant holding pUMtetDoc-M13miniscaf, BacMPs derived from a transformant holding pUMtetDoc, and BacMPs derived from a wild type, respectively. The western blotting of the membrane fraction of BacMPs is shown.
  • Lanes 1 and 2 show the membrane fraction of BacMPs derived from the transformant carrying pUMtetDoc-M13miniscaf and the membrane fraction of BacMPs derived from the wild type, respectively.
  • (A) to (C) show the fluorescence images of the wild type, the transformant holding pUMtetDoc and the transformant holding pUMtetDoc-M13miniscaf, respectively.
  • 4 shows an in vivo docking method according to one embodiment of the present invention.
  • (A) shows a schematic diagram of an expression vector used for in vivo docking
  • (B) shows Mms13-miniscaffoldin, eMHC-DocC and DM-DocR.
  • the first aspect of the present invention relates to a method for producing a complex of a disulfide bond protein and magnetic particles in a gram-negative magnetic bacterium. That is, in the production method, a gram-negative magnetic bacterium is used to produce a recombinant protein-magnetic particle complex containing magnetic particles and disulfide bond protein immobilized on the magnetic particles.
  • the cytoplasm of gram-negative bacteria is a reducing environment. Therefore, when an exogenous protein in which a disulfide bond (hereinafter also referred to as “SS bond”) affects structure formation, for example, an antibody molecule or the like is expressed on magnetic bacterial particles existing in the cytoplasm, SS bond is formed. Do not form.
  • SS bond an exogenous protein in which a disulfide bond
  • the periplasm of Gram-negative bacteria is an oxidative environment, it is suitable for the expression of proteins containing SS bonds. Therefore, in this production method, the expression of disulfide bond protein is induced in the periplasm and BacMPs is produced in the cytoplasm. Magnetospirillum magneticum (M.
  • AMB-1 can be used as a gram-negative magnetic bacterium.
  • M.M. Magneticum AMB-1 synthesizes nanosized BacMPs arranged in a chain in the cytoplasm. BacMPs includes a lipid bilayer and pure magnetite (diameter 50 to 100 nm) surrounded by the lipid bilayer, and exhibits strong ferrimagnetism. Other Gram negative strains that produce similar magnetite can also be used in the present invention.
  • the manufacturing method includes steps (i) to (iii) described below.
  • (I) Co-expression step In this step, (a) a first fusion protein containing a disulfide bond protein fused to a binding protein and (b) a magnetic bacterial particle can be bound or integrated in a gram-negative bacterium. A second fusion protein containing a binding partner protein fused to the protein is co-expressed.
  • disulfide bond protein examples include scFv (single chain variable fragment) shown in FIG. 1 (A).
  • the scFv is generally readily available, and the Fc-fused scFv forms an antibody-like dimerization structure by interaction between the disulfide bond between the hinge region and the CH3 region, and the affinity of the bivalent binding Provide effect. It also improves the solubility and in vivo folding in the cytoplasm of E. coli.
  • Alternative approaches have been reported to functionally express single domain antibody fragments (referred to as sdAbs, VHHs or Nanobodies) on BacMPs in the cytoplasm.
  • sdAbs are suitable for in vivo application due to their tight folding and stability, they are limited in usefulness because they are prepared by immunization of camelids or sharks.
  • scFv is generally available and forms an antibody-like dimerization structure, which is expected to expand the possibility of developing antibodies and magnetic particle complexes.
  • the disulfide bond protein is not limited to the scFv shown in FIG. 1, but includes immunoglobulins (antibodies) such as IgG and IgM, surface antigens such as bacteria and viruses, interleukins and chemokines among antigens specifically recognized by these.
  • cytokines various growth factors such as EGF and TG, their receptors, fragments thereof, and mutants thereof can be used.
  • a binding protein is fused to the disulfide bond protein.
  • an immunoglobulin Fc domain Fc
  • the binding protein is not limited to this, and Strep-tag, p53, p16, E2F, a fragment thereof, and a mutation thereof
  • the body can be used.
  • the binding protein has binding affinity with the binding partner protein.
  • the binding partner protein is ZZ (the ZZ domain of protein A from Staphylococcus aureus ).
  • the binding partner protein is not limited to the ZZ domain, and Streptavidin, MDM2, Cyclin D, DP, fragments thereof and mutants thereof can be used.
  • K D value can be used in combination in the range of 10 -12 to 10 -6.
  • a combination of a binding protein and a binding partner protein includes a combination of Strep-tag and Streptavidin, a combination of p53 and MDM2, a combination of p16 and Cyclin D, and a combination of E2F and DP. It will be readily appreciated by those skilled in the art that the binding protein and the binding partner protein can be interchanged if desired.
  • Examples of the protein that can be bound to or integrated with magnetic bacterial particles include Mms13 derived from Magnetospirum magneticum shown in FIG. 1 (A).
  • the Mms13 protein is integrated with the lipid bilayer on the surface of magnetite and can bind tightly to the magnetite of BacMPs.
  • proteins that can be bound to or integrated with magnetic bacterial particles include Mms16 and Mms24, which are anchor proteins like Mms13, Mms5, Mms6, and Mms7 that are involved in magnetite formation, and iron ion transport protein MagA. Can be mentioned.
  • the expression of the first fusion protein (scFv-Fc in FIG. 1) is induced into the bacterial periplasm, and the expression of the second fusion protein (ZZ-Mms13 in FIG. 1) is induced. Induced into the bacterial cytoplasm. Therefore, the disulfide bond protein contained in the first fusion protein forms a disulfide bond and folds under the periplasmic oxidative environment. As a result, in the complex formed in the step (iii) described below, the disulfide bond protein is immobilized on the magnetic particle while maintaining its function.
  • Induction of the expression of the first fusion protein into the periplasm is performed by a signal peptide added to the N-terminus of the protein.
  • the signal peptide for example, those derived from E. coli DsbC shown in FIG. 1 can be used. Endogenous DsbC is a protein that should be efficiently transferred to the periplasm when the in vitro docking method is established, and has an advantage that fusion with the full-length DsbC can be assumed in the future.
  • other known signal peptides capable of inducing protein expression into the periplasm can also be used in the present invention.
  • Such signal peptides include those derived from E. coli DsbA, OmpA, PhoA, MdoD and TorA, from Erwinia carotovora PelB, and from M13 phage pIII.
  • the bacterium of the step (i) is cultured under conditions sufficient to produce the first and second fusion proteins and the scaffold protein.
  • the conditions sufficient for producing the fusion protein include, for example, a temperature of 25-29 ° C., pH 6.0-7.5, microaerobic conditions, using Magnetic spirillum growth medium (MSGM) medium. Culture conditions for culturing for 7 days.
  • (Iii) Cell membrane destruction step In this step, the bacterial cell membrane of the step (ii) is destroyed. By this step, a complex of disulfide bond protein and magnetic bacterial particles is formed. That is, when the cell membrane is disrupted, the binding protein and the binding partner protein can interact with each other, and the disulfide binding protein is captured on the magnetic bacterial particle to form a complex of the disulfide binding protein and BacMPs.
  • the destruction of the bacterial cell membrane may be carried out by methods well known in the art, alone or in combination.
  • a nonionic surfactant such as Triton X-100, Tween 20, or Briji 35
  • an amphoteric surfactant such as CHAPS or Zwittergent 3-12, or SDS or N -It is preferable to add an anionic surfactant such as lauroyl sarcosine.
  • a protease inhibitor such as PMSF is present in order to prevent degradation of disulfide bond protein and the like.
  • the production method of the present invention further comprises an isolation step (iv) of isolating the complex of disulfide bond protein and BacMPs formed in the step (iii) from the disrupted cell ) May be included.
  • the method for isolating the complex is not particularly limited, and may be a method well known in the art.
  • Isolation of a disulfide bond protein is performed, for example, by recovering BacMPs using magnetism.
  • Magnets such as columnar neodymium-boron (Nd-B) magnets are used for collection using magnetism.
  • the isolation of the complex may be performed immediately after the cells are completely solubilized, but preferably after 10 minutes or more have elapsed. At this timing, since the target disulfide bond protein is completely captured on the BacMPs by the interaction between the first fusion protein and the second fusion protein, the complex is simply obtained in a good yield. Can be separated.
  • Another embodiment of the present invention relates to a method for producing a disulfide bond protein.
  • the production method further includes a recovery step of recovering the disulfide bond protein from the complex.
  • the disulfide bond from the complex using an acidic buffer having a pH of 2 to 4, an alkaline buffer having a pH of 10 to 12, a high ionic strength buffer of 3 M or more, a specific competitive peptide for a binding protein or a binding partner protein, etc. Protein can be recovered.
  • a vector used in the production method and a transformant containing the vector will be described.
  • a transformant into which a vector has been introduced is usually cultured. Therefore, the scope of the present invention includes vectors used for the production of protein-magnetic particle complexes and transformants containing the vectors.
  • a vector according to one aspect of the present invention includes a gene encoding a first fusion protein; a gene encoding a second fusion protein; and a signal sequence linked to the gene encoding the first fusion protein.
  • the gene encoding the first fusion protein is a fusion of the gene encoding the binding protein and the gene encoding the disulfide bond protein, and the gene encoding the second fusion protein binds to BacMPs.
  • a gene encoding a protein that can be integrated and a gene encoding a binding partner protein are fused.
  • the signal sequence induces the first fusion protein containing a disulfide bond protein to the periplasm, which is an oxidative environment, so that a disulfide bond is formed in the molecule. Thereby, a protein-magnetic particle complex can be obtained in a state where the function of the disulfide bond protein is maintained.
  • FIG. 1B (c) of FIG. 1B An example of the vector of the present invention is shown in (c) of FIG.
  • the gene encoding the first fusion protein is “scFv-Fc”
  • the gene encoding the second fusion protein is “mms13-ZZ”
  • the signal sequence is “DsbC”.
  • the gene encoding the first fusion protein linked to the signal sequence and the gene encoding the second fusion protein may be incorporated into different vectors to transform the host cell.
  • the vector may contain a gene encoding a tag peptide that is advantageous for the separation and purification of the target protein.
  • the vector contains a gene encoding FLAG tag (FLAG) linked to the end of the scFv-Fc fusion gene.
  • the vector may further contain a gene for improving protein synthesis efficiency.
  • the vector should also contain a promoter that controls the expression of the gene encoding the first fusion protein and the gene encoding the second fusion protein.
  • a constitutively expressed mms16 promoter is used as the promoter, and the scFv-Fc fusion gene and the mms13-ZZ fusion gene are controlled by the mms16 promoter.
  • Any vector of the present invention can be used as long as it can transform a Gram-negative magnetic bacterium. Examples thereof include a plasmid vector and a cosmid vector. Among them, a plasmid vector can be preferably used.
  • a protein-magnetic particle complex can be obtained in which the prepared disulfide bond protein is immobilized on BacMPs. Therefore, the disulfide bond protein maintains its function in the obtained complex. More specifically, the cytoplasm of the magnetic bacterium from which BacMPs are produced is a reducing environment. Thus, conventional methods for expressing disulfide bond proteins in the cytoplasm do not form protein disulfide bonds on BacMPs.
  • disulfide bond formation depends on air oxidation during the extraction and purification process of BacMPs, and the rate and yield of disulfide bond formation by air oxidation is very slow compared to in vivo.
  • protein aggregation or degradation occurs due to misfielding or unfolding.
  • the expression of the second fusion protein containing a protein that can be bound or integrated with magnetic bacterial particles is induced into the cytoplasm of the bacteria, while the binding protein is Since the expression of the first fusion protein containing the fused disulfide bond protein is induced to the periplasm in an oxidative environment, a complex in which the disulfide bond protein is immobilized on the magnetic particle while maintaining the function could get.
  • preparation of the complex did not require a pre-process for purifying the target protein or forming an SS bond. The prepared complex was directly available after extraction from the cells.
  • a completely new method for preparing an SS binding protein (in vivo docking method) is provided.
  • the method is expected to extend the possibility of developing complexes of antibodies and BacMPs.
  • various disulfide bond proteins can be functionally expressed on magnetic bacterial particles, providing an innovative method for realizing high throughput screening of target ligands or lead compounds in drug discovery research. be able to.
  • the disulfide bond protein-BacMPs complex obtained by the production method is useful as a magnetic carrier for ligand-receptor interaction or affinity generation, and provides an efficient screening of potential ligands or drugs. .
  • the protein-magnetic particle complex includes a plurality of proteins (that is, first and second target proteins) that are target proteins, magnetic particles, and scaffold proteins.
  • the scaffold protein is bound or integrated with the magnetic particle, and a plurality of proteins are immobilized on the magnetic particle via the scaffold protein.
  • the first and second target proteins are indicated as fluorescent green protein (Green Fluorescent Protein (GFP)) and mCherry, respectively.
  • the magnetic particles are shown as magnetic bacterial particles (BacMPs), and the scaffold protein is shown as Mms13-miniscaffoldin.
  • the magnetic particles are shown as magnetic bacterial particles (BacMPs) produced by Gram-negative magnetic bacteria.
  • the magnetic particles are not related to the magnetic bacteria but other known ones. Magnetic particles produced by the above method may be used.
  • the scaffold protein includes a protein that can be bound or integrated into the magnetic particle, as well as a first binding partner protein and a second binding partner protein.
  • the protein that can be bound or integrated into the magnetic particle is denoted as Mms13
  • the first binding partner protein and the second binding partner protein are denoted as CohC and CohR, respectively.
  • the first binding partner protein and the second binding partner protein serve as a scaffold for the first binding protein and the second binding protein to bind to the scaffold protein.
  • the first binding protein and the second binding protein are different proteins.
  • the first binding partner protein and the second binding partner protein are usually connected by a peptide linker.
  • a peptide linker generally used in the art can be used, and it is a peptide consisting of 5 to 100 amino acids, preferably 5 to 20 amino acids.
  • a peptide represented by (N 4 S) n [wherein n is an integer] can be used.
  • the peptide linker used in the example shown in FIG. 11 is a (N 4 S) 2 peptide consisting of 10 amino acids.
  • either one of the first binding partner protein and the second binding partner protein and a protein that can be bound to or integrated with the magnetic particle are usually linked by a peptide linker.
  • peptide linker As the peptide linker, a peptide linker generally used in the art can be used, and it is a peptide consisting of 5 to 200, preferably 50 to 100 amino acids.
  • a first binding partner protein and a protein that can be bound to or integrated with a magnetic particle are linked by a peptide linker, and the peptide linker consists of 100 amino acids (N 4 S ) 20 peptides.
  • the first binding protein and the second binding protein bind to the first binding partner protein and the second binding partner protein, respectively, and the first and second target proteins on the magnetic particles through these bonds. To be fixed. That is, the first and second binding proteins serve as tags for binding the first and second target proteins to the scaffold, respectively.
  • K D values may be used in the range of 10 -10 to 10 -9.
  • Specific examples of combinations of binding protein and binding partner protein include, for example, a combination of cohesin and dockerin domain, a combination of Protein G and antibody Fc region domain, a combination of Protein A and antibody Fc region domain, a basic leucine zipper The combination of a motif and an acidic leucine zipper motif is mentioned.
  • the cohesin and dockerin domains of the protein complex cellulosome produced by cellulolytic bacteria were used as the binding protein and the binding partner protein, respectively.
  • the combination of Cohesin and Dockerin is, K D values strongly bound to the 10 -10 to 10 -9, further, there is a species specificity in Cohesin / dockerin binding. It was found that multiple proteins can be functionally immobilized on BacMPs by localizing multiple cohesin domains as scaffolds on BacMPs and co-expressing multiple fusion proteins that fuse the dockerin domain to the protein. .
  • FIG. 11 the cohesin and dockerin domains of the protein complex cellulosome produced by cellulolytic bacteria were used as the binding protein and the binding partner protein, respectively.
  • the combination of Cohesin and Dockerin is, K D values strongly bound to the 10 -10 to 10 -9, further, there is a species specificity in Cohesin / dockerin binding. It was found that multiple proteins can be functionally immobilized on BacMPs by local
  • the first binding protein and the second binding protein DocC and DocR bind to the first binding partner protein and the second binding partner protein CohC and CohR, respectively.
  • the first and second target proteins (GFP and mCherry) are immobilized on BacMPs.
  • a system in which the function of one of the first target protein and the second target protein is expressed by the presence of the other protein is an object of particular interest in the present invention.
  • the function of the protein is expressed means that the protein is correctly folded in addition to the activity of the protein being increased, and that the protein has the ability to bind to the target molecule. It is also intended that the structure of the protein is stabilized.
  • the combination of the first target protein and the second target protein for example, -A combination of GFP (Green Fluorescent Protein) and mCherry, -A combination of MHC II (class II major histocompatibility complex (MHC II)) and HLA-DM (Human leukocyte antigen DM), -Combination of Tropomysin receptor kinase A and p75 neurotrophin receptor, -A combination of Endoglucanase and beta-glucosidase, -Combination of Endoglucanase and Cellobiohydrolase, -A combination of beta-glucosidase and Cellobiohydrolase, -Combination of Horseradish peroxidase and Glucose oxidase-Combination of Acyl-ACP reductase and Aldehyde deforming oxygenase.
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • MHC II class II major histocompatibility complex
  • HLA-DM Human leukocyte
  • MHC II As a preferred combination of the first target protein and the second target protein, a combination of MHC II and HLA-DM is interesting.
  • eMHC II empty MHC II
  • MHC II is an important protein responsible for the human immune mechanism, and is associated with rejection of autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis and organ transplantation.
  • MHC II is a single-transmembrane protein of a heterodimer composed of an ⁇ chain and a ⁇ chain, and is expressed on a cell membrane to degrade antigen proteins derived from various diseases and pathogens (antigen peptides). To form an antigen peptide-MHC II complex (pMHC II).
  • HLA-DM is a protein similar in structure to MHC II, has a chaperone-like function that stabilizes the structure by interacting with eMHC II, and is involved in selection of antigen peptides that bind to MHC II. It is thought that
  • MHC II in a protein-magnetic particle complex in which MHC II and its HLA-DM having a chaperone-like function are colocalized on BacMPs, MHC II can retain antigen-binding ability due to the presence of HLA-DM.
  • Such protein-magnetic particles are useful for peptide binding tests for the purpose of screening antibody peptides, for example. Moreover, since it contains magnetic particles, separation from the mixture is easy. However, prior to the present invention, there was no evidence that two proteins could be functionally localized via a scaffold on magnetic particles.
  • the Gram-negative magnetic bacterium M. cerevisiae used in the first aspect of the present invention is used .
  • Magneticum AMB-1 can be used.
  • one embodiment of the second aspect of the present invention is a method for producing a magnetic particle-multiple protein complex comprising a magnetic particle and a plurality of proteins immobilized on the magnetic particle in a gram-negative magnetic bacterium. . More specifically, the following steps (i) and (ii) are included.
  • the first and second fusion proteins and the scaffold protein are co-expressed in a gram-negative magnetic bacterium. Specifically, (a) a first fusion protein containing a first binding protein and a first target protein fused to the first binding protein, (b) a second binding protein and the second A second fusion protein comprising a second target protein fused to the binding protein of Co-express a scaffold protein containing two binding partner proteins.
  • the above-described proteins can be used.
  • step (Ii) Culturing step
  • the bacterium of the step (i) is cultured under conditions sufficient to produce the first and second target proteins and the scaffold protein.
  • a sufficient condition for producing a fusion protein is the same condition as described in the first aspect of the present invention.
  • a complex of the first and second target proteins and BacMPs is formed. That is, both the first and second fusion proteins and the scaffold protein are expressed in the cytoplasm of magnetic bacteria. By culturing the bacterium under the above conditions, these proteins are generated in the cytoplasm, and the first and second target proteins are immobilized on the BacMPs via the scaffold protein by the binding affinity between the binding protein and the binding partner protein.
  • one or both of the proteins of interest may be disulfide bond proteins, for which the first aspect of the invention may be used. That is, the expression of one or both may be induced in the periplasm.
  • (Iii) Cell membrane destruction step In this step, the bacterial cell membrane of the step (ii) is destroyed.
  • the destruction of the bacterial cell membrane may be performed by the same method as described in the cell membrane disrupting step (iii) of the first aspect of the present invention.
  • Isolation step The production method further includes an isolation step (iv) for isolating the complex formed in the step (ii) from the cells destroyed in the step (iii). You may go out.
  • the isolation of the complex may be performed by the same method as described in the isolation step (iv) of the first aspect of the present invention.
  • the production method may further include a recovery step of recovering the first and second target proteins from the complex. This step is the same as the recovery step described in the first aspect.
  • a transformant into which a vector having the following configuration is introduced is cultured. Therefore, the scope of the present invention includes vectors used for the production of protein-magnetic particle complexes and transformants containing the vectors.
  • FIG. 11A shows an example of a vector used in the production method.
  • the vector includes a gene encoding a scaffold protein (Mms13-miniscaffolidin in FIG. 1) and a gene encoding a first fusion protein and a second fusion protein (Target-Dockerin in FIG. 1).
  • the gene encoding the scaffold protein includes a gene encoding a protein that can be bound or integrated with the magnetic particle (Mms13 in FIG. 11); a gene encoding a peptide linker (in FIG. 11, the NS polypeptide (N 4 of the hydrophilic polypeptide linker). S) 20 )); a gene encoding the first and second binding partner proteins (in FIG. 11, CohC and CohR of the cohehin domain); a gene encoding the first binding partner protein and the second binding partner protein A gene that encodes a peptide linker that links to a gene that encodes a gene; and a gene for confirming expression (c-myc tag in FIG. 11).
  • the genes encoding the first and second fusion proteins are respectively the genes encoding the first and second target proteins (GFP and mCherry in FIG. 11); and the first and second binding proteins. It consists of a gene to be encoded (DocC and DocR in FIG. 11).
  • the genes encoding the first and second binding proteins are linked to the genes encoding the first and second target proteins, respectively. That is, in FIG. 11, DocC is fused to the end of GFP (GFP-DocC), and DocR is fused to the end of Cherry (mCherry-DocR). As shown in FIG. 11, DocC is fused to the end of GFP (GFP-DocC), and DocR is fused to the end of Cherry (mCherry-DocR). As shown in FIG.
  • a ribosome binding site is preferably included between the gene encoding the first fusion protein and the gene encoding the first fusion protein.
  • these genes may be included on separate vectors.
  • the vectors that can be used in the second aspect of the invention are also those described for the first aspect of the invention.
  • the expression of the gene encoding the scaffold protein and the expression of the gene encoding the first fusion protein and the gene encoding the second fusion protein are each controlled by a promoter.
  • the expression of Mms13-miniscaffofdin is controlled by the constitutively expressed mms16 promoter
  • the expression of GFP-DocC and mCherry-DocR is an artificial operon that is a tetracycline expression induction system Pmsp1 (tetO ).
  • step (ii) of the above-described production method the vector having the above structure is introduced into a magnetic bacterium, and the produced transformant is cultured.
  • the expressed scaffold protein Mms13-miniscaffoldin is localized on BacMPs, and then GFP-DocC and mCherry-DocR whose expression is induced by addition of tetracycline are in Mms13-miniscaffoldin.
  • GFP-DocC and mCherry-DocR whose expression is induced by addition of tetracycline are in Mms13-miniscaffoldin.
  • the target proteins GFP and mCherry are immobilized on BacMPs via the Mms13-miniscaffoldin.
  • the method for producing a plurality of protein-magnetic particles according to the second aspect of the present invention and the vector and transformant used in the production method, production of functional proteins and immobilization onto the magnetic particles are possible. It can be performed in one step, and no complicated purification step for functional protein is required.
  • the binding protein sinaffold molecule
  • the binding partner protein tag molecule
  • a plurality of proteins can be immobilized in any number and at any position.
  • the binding protein serving as a tag and the target functional protein are gene-fused, it can be immobilized while maintaining the orientation.
  • the multiple protein-magnetic particle according to the second aspect of the present invention for example, it is possible to improve reaction efficiency by stabilizing an enzyme group that performs a series of metabolic reactions and to stabilize a target protein. Is expected to do.
  • a complex in which a target protein that requires a specific protein that becomes a chaperone or a cofactor for activation and the chaperone or a capture factor is colocalized is expected to be applied in the medical field or the like.
  • Example 1 Functional expression of scFv on magnetic bacterial particles by in vitro docking method (1-1) Sample Phusion DNA Polymerase (NEB) was used for PCR amplification of DNA fragment for expression vector construction. As reagents, In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) and Quick Ligation Kit (NEB) were used. AP (alkaline phosphatase) -labeled donkey anti-mouse IgG (Novus Biologicals, Littleton) is used for the IgG binding test, and biotin ⁇ -galactosidase (AVAVA Laboratories) was used.
  • NEB Sample Phusion DNA Polymerase
  • E. coli strain TOP10 (Life technologies, Carlsbad, Calif., USA) was used. Incubated at 0 ° C. Plasmid vectors are described in T.W. Yoshino, and T.K. Matsunaga. , Effective and Stable Display of Functional Proteins on Bacterial Magnetic Particles Using Mms13 as a Novel Anchor Molecule, Society. (2006) and was constructed based on pUM13ZZ described in (2006).
  • the transmembrane region was predicted using SOSUI (http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui) except for E. coli DsbB whose predicted region was reported in the literature.
  • ClustalW http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/ was used for homology analysis of Dsb protein.
  • DsbB was expected to have another cysteine pair in addition to the CXXC motif involved in DsbA oxidation, as in E. coli.
  • the membrane proteins DsbB and DsbD were predicted by SOSUI to have 4 and 8 transmembrane (TM) regions, respectively, as in E. coli.
  • Plasmids can be obtained by standard cloning techniques (J. Sambrook, DW Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 2001) or In-Fusion. It was constructed by cloning technology (Clontech, Mountain View, CA, USA).
  • a vector (pUM13ZZ / scFvFc) that expresses a fusion gene of an anti- ⁇ -galactosidase single chain antibody (scFv) and a constant region (Fc) of human IgG1 (FIG. 1B (c)) has NsiI sites at both ends.
  • Each expression plasmid (pUM13ZZ, pUM13scFv and pUM13ZZ / scFvFc) was transformed into Y. coli.
  • M ... magneticum AMB-1 the (ATCC 700264), T. Matsunaga, T .; Sakaguchi, F.A. Tadakoro, Magnetite formation by a magnetic battery, capatable of growing aerobically, Appl Microbiol. Biotechnol. 35 (1991) 651-655, and magnetically aerobically cultured at 28 ° C. in magnetic spirit growth medium (MSGM) .
  • Magneticum AMB-1 transformants were cultured under the same conditions using 5 ⁇ g / ml ampicillin.
  • Triton X-100 was added at a final concentration of 0.2%, and after gently stirring at room temperature for 0 to 120 minutes, the magnetic bacterial particle fraction was magnetically collected using an Nd-B magnet. Thereafter, it was washed 5 times with PBS-T to obtain purified magnetic bacterial particles.
  • IgG capture test was performed using an AMB-1 transformant of pUM13ZZ encoding the Mms13-ZZ fusion protein. From 0 to 2 ⁇ g / ml of AP-labeled donkey anti-mouse IgG was added to cell pellets (corresponding to 45 ml culture) of AMB-1 wild type or pUM13ZZ transformants, and magnetic bacterial particles were extracted. After 50 ⁇ g of each magnetic bacterial particle was suspended in 50 ⁇ l of PBS, 50 ⁇ l of Lumi-Phos 530 was added, followed by a substrate reaction at room temperature for 20 minutes, and then the luminescence intensity was measured using a luminometer.
  • Antigen-antibody reaction was performed using 1 ⁇ g / ml primary antibody or AP-labeled secondary antibody dissolved in PBS-T containing 2% BSA (2% BSA / PBS-T). After the secondary reaction, the PVDF membrane was washed 3 times with PBS-T, and AP activity was detected using BCIP / NBT-Blue.
  • Triton X-100 was added to cells partially disrupted with lysozyme and DNase I for 10 minutes to completely disrupt and solubilize the cells, and the magnetic bacterial particles were separated after 0, 10, 30 and 60 minutes. .
  • most of the binding between Fc and ZZ occurred at time 0, and reached the maximum level after 10 minutes after the addition of Triton X-100 (FIG. 3). From these results, in order to obtain magnetic bacterial particles bound with the Fc fusion protein from the AMB-1 transformant, it was shown that the recovery after 10 minutes from the complete disruption of the cells was sufficient.
  • the scFv-Fc monomer (52 kDa) was detected with anti-FLAG antibody under reducing conditions, but under non-reducing conditions, both dimer (105 kDa) and 3 quantities were obtained with both anti-FLAG antibody and anti-human VL- ⁇ . It was detected as two bands corresponding to the body (157 kDa) (FIG. 4).
  • Binding of biotin-labeled ⁇ -galactosidase was detected in magnetic bacterial particles extracted from a co-expressing transformant of scFv-Fc and Mms13-ZZ (FIG. 5, ZZ + scFv-Fc), whereas Mms13-ZZ alone or Mms13 -Not observed in magnetic bacterial particles extracted from transformants of scFv ( Figure 5, ZZ and scFv). This indicates that Mms13-scFv expressed in the cytoplasm did not function on magnetic bacterial particles, whereas scFv-Fc expressed in the periplasm was functionally expressed on magnetic bacterial particles.
  • the scFv (scFv13R4) used here is a mutant of anti- ⁇ -galactosidase scFv (scFv13) functionally modified to have high solubility and folding ability in the cytoplasm of E. coli.
  • scFv13R4 having high solubility was not functionally expressed on magnetic bacterial particles by the conventional direct expression method.
  • Examples 2 and 3 described below correspond to the second aspect of the present invention.
  • ⁇ Example 2> Co-localization of GFP and mCherry on magnetic bacterial particles by in vivo docking method
  • GFP and mCherry were used as a plurality of target proteins to be immobilized on BacMPs.
  • ALP alkaline phosphatase
  • Mouse-derived anti-GFP monoclonal antibody and mouse-derived anti-mCherry monoclonal antibody were purchased from Clontech Laboratories. Goat-derived ALP-labeled anti-mouse IgG antibody was purchased from Santa Cruz Biotechnology. Recombinant GFP and mCherry were purchased from CELL BIOLABS.
  • SH-9000 Corona Electric
  • Lumiphos 530 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used as the luminescent substrate for ALP.
  • magnetic bacteria M. as an expression host for the fusion protein were used .
  • E. coli TOP10 (Invitrogen) was used for plasmid construction.
  • Plasmid vectors are described in T.W. Yoshino, A .; Shimojo, Y. et al. Maeda, T .; Matsunaga. , Inducible Expression of Transmembrane Protein on Bacterial Magnetic Particles in Magnetospirillum magneticum AMB-1, Appl Environ Microb . (2010) and was constructed based on pUMtOR13GFP.
  • FIG. 11 (A) shows the plasmid construct pUMtetDoc-M13miniscaf constructed in this example.
  • the plasmid is a fusion protein (GFP-DocC) of GFP and Clostridium thermocellum CelS derived Dockerin (DocC), mCherry and Ruminococcus flacfaciens (DcRh-DocRh-DocRh-Rc) ), And downstream of the Pmms16 promoter, Mms13, NS linker, C.I. thermocellum from Cohesin (CohC), R.
  • the ⁇ mms13 strain was transformed by electroporation using each of the prepared plasmids.
  • Magnetic bacteria were cultured by using magnetic spirit growth medium (MSGM) as a medium, inoculating 1/1000 of preculture in 5 L of medium, and allowing to stand at 26-29 ° C. at room temperature. At the time of inoculation, a microaerobic state was created by bubbling with argon gas (15 minutes).
  • MSGM magnetic spirit growth medium
  • a microaerobic state was created by bubbling with argon gas (15 minutes).
  • a final concentration of 5.0 ⁇ g / ml ampicillin was added, and a final concentration of 500 ng / ml ATc was added in the middle of the logarithmic growth phase, followed by overnight culture.
  • Recovery of BacMPs was performed by the following method.
  • HEPES buffer containing 1 mM CaCl 2 was further added, and BacMPs were washed by magnetic separation (10 times). BacMPs were dispersed in an appropriate amount of PBS, absorbance (660 nm) was measured, and converted to dry weight from a calibration curve.
  • the supernatant was collected by centrifugation (18000 g, 5 minutes), 15 ⁇ l of 3 ⁇ SDS sample buffer was added to the sample, and heated at 99 ° C. for 5 minutes to obtain a particle membrane fraction sample.
  • recombinant GFP and recombinant mCherry were used.
  • ALP-labeled anti-c-myc antibody (1 ⁇ g / ml, PBST) or primary antibody, mouse-derived anti-GFP monoclonal antibody (0.05 ⁇ g / ml, PBST), mouse-derived anti-mCherry monoclonal antibody against the PVDF membrane after blotting (2 ⁇ g / ml, PBST), the Goat-derived ALP-labeled mouse IgG antibody (0.5 ⁇ g / ml, PBST) was reacted with the secondary antibody (room temperature, 1 hour). After washing with PBS-T for 10 minutes three times, NBT / BCIP-Blue Liquid Substrate was added as a substrate for color development. For analysis, pixel intensity was calculated using image analysis software Image J.
  • an antibody binding test on BacMPs was performed. 50 ⁇ g of WT and transformant-derived BacMPs were mixed with ALP-labeled anti-c-myc antibody (1 ⁇ g / ml, PBST), mouse-derived anti-GFP monoclonal antibody (1 ⁇ g / ml, PBST) or mouse-derived anti-mCherry monoclonal antibody (1 ⁇ g / ml, PBST). ) 100 ⁇ l was reacted at room temperature for 30 minutes.
  • the amounts of GFP-DocC and mCherry-DocR contained in the membrane fraction of purified BacMPs were quantified by Western blotting.
  • a calibration curve was created using GFP and mCherry of known concentrations, and analysis by Image J was performed (FIG. 15).
  • the binding amounts of GFP-DocC and mCherry-DocR were 380 ng and 570 ng per 1 mg BacMPs, respectively. Therefore, it was shown that the same level of GFP-DocC and mCherry-DocR were immobilized on BacMPs.
  • the reason why the binding amount of GFP-DocC is slightly lower than the binding amount of mCherry-DocR is considered to be that GFP-DocC is susceptible to protease degradation.
  • FRET Fluorescence resence energy transfer
  • GFP-DocC and mCherry-DocR are located in close proximity. From these results, it was found that in the transformant carrying pUMtetDoc-M13miniscaf, GFP-DocC and mCherry-DocR expressed in the microbial cells bind to and colocalize with Mms13-miniscaffoldin localized on BacMPs. Indicated.
  • Example 3 Functional expression of MHC by co-localization of MHC class II and chaperone-like protein HLA-DR on magnetic particles by in vitro docking method
  • target proteins to be immobilized on BacMPs eMHC II and HLA-DM were used.
  • FIG. 17A shows the vector construct pUMMHC II-DMDoc-M13miniscaf constructed in this example.
  • the vector comprises an extracellular domain of MHC II downstream of the Pmsp1 (tetO) promoter, a FLAG tag, a Clostridium thermocellum CelS-derived Dockerin (DocC) fusion protein (MHC II-DocC), HLA-DM, HA-tag, Ruminocous, flavefaciens of ScaA from Dockerin (DocR) of the fusion protein (DM-DocR), and downstream of the Pmms16 promoter Mms13, NS linker, C.
  • ⁇ mms13 strain was transformed by electroporation.
  • Magnetic bacteria are cultured by using magnetic spirit growth medium (MSGM) as a medium, inoculating 1/1000 of preculture in 5 L of medium, and allowing to stand at room temperature (26-29 ° C.). Went.
  • a microaerobic state was created by bubbling with argon gas (15 minutes).
  • a final concentration of 5.0 ⁇ g / ml ampicillin was added, and a final concentration of 500 ng / ml ATc was added in the middle of the logarithmic growth phase, followed by overnight culture.
  • the supernatant was collected by centrifugation (18000 g, 5 minutes), 15 ⁇ l of 3 ⁇ SDS sample buffer was added to the sample, and heated at 99 ° C. for 5 minutes to obtain a particle membrane fraction sample.
  • Each sample was subjected to SDS-PAGE using a gel having an acrylamide concentration of 12.5%.
  • the gel after electrophoresis was blotted on a PVDF membrane by a semi-dry method.
  • the PVDF membrane after blotting was reacted with ALP-labeled anti-FLAG monoclonal antibody (1 ⁇ g / ml, PBST) or ALP-labeled anti-HA tag monoclonal antibody (1 ⁇ g / ml, PBST) (room temperature, 1 hour).
  • NBT / BCIP-Blue Liquid Substate was added as a substrate for color development.
  • peptide binding assay was performed to evaluate the peptide binding ability of eMHC II-DocC. Specifically, influenza hemagglutinin-derived antigenic peptides (HA 306-318 ) against eMHC II-DocC and DM-DocR-bound BacMPs (eMHC II / DM-BacMPs) and eMHC II-DocC-bound BacMPs (eMHC II-BacMPs). ) was evaluated. The peptide was adjusted to 5 mg / ml with DMSO and stored at ⁇ 20 ° C. until use.
  • HA 306-318 influenza hemagglutinin-derived antigenic peptides
  • DM-DocR-bound BacMPs eMHC II / DM-BacMPs
  • eMHC II-DocC-bound BacMPs eMHC II-BacMPs
  • the sample was transferred to a 96-well microtiter plate, lumiphos 530 (50 ⁇ l) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 5 minutes. Then, the luminescence intensity was measured using a luminescence plate reader.
  • eMHC II which was difficult to produce conventionally, was successfully prepared by colocalizing eMHC II and chaperone HLA-DM in magnetic bacteria.
  • the MHC II molecule is an important protein responsible for the human immune mechanism, and binds to a degradation product (antigen peptide) of an antigen protein derived from various diseases and pathogens, resulting in an antigen peptide-MHC II complex ( pMHC II) is formed. Therefore, analysis of peptide binding ability of MHC II and identification of antigenic peptides are important.
  • MHC II (eMHC II) that is not bound to the antigenic peptide is unstable in structure and forms an aggregate.
  • recombinant MHC II is produced, for example, by separately producing ⁇ -chain and ⁇ -chain as inclusion bodies, then mixing with antigenic peptide and refolding, and this method requires complicated operations.
  • eMHC II having peptide binding ability can be produced by adding HLA-DM to pMHC II into which UV-degradable antigen peptide is introduced and irradiating UV.
  • a high concentration of HLA-DM is required. That is, conventionally, in order to evaluate the peptide binding ability of MHC II with a target antigen peptide candidate, a complicated experimental step is required, or a very high concentration sample is required.
  • eMHC II and HLA-DM which is a chaperone, were colocalized in the magnetic bacterium, so that the function of eMHC II, which was difficult to produce conventionally, was easily and efficiently maintained.
  • eMHC II and HLA-DM are co-expressed in a limited space of magnetic bacteria, and co-localized via a scaffold protein, and eMHC II and HLA-DM are co-expressed.
  • eMHC II and HLA-DM are immobilized on BacMps, they can be easily recovered using an external magnetic field, so that simplification and application of antigen peptide screening technology can be expected.

Abstract

（ｉ）グラム陰性磁性細菌中で、（ａ）結合タンパク質に融合したジスルフィド結合タンパク質を含んだ第１の融合タンパク質、及び、（ｂ）磁性細菌粒子に結合又は一体化され得るタンパク質に融合した結合パートナータンパク質を含んだ第２の融合タンパク質を共発現させる共発現工程であって、前記第１の融合タンパク質の発現が前記細菌のペリプラズムへと誘導され、前記第２の融合タンパク質の発現が前記細菌の細胞質へと誘導される工程と；（ｉｉ）前記第１及び第２の融合タンパク質を生産するのに充分な条件下で前記工程（ｉ）の細菌を培養する培養工程と；（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）の細菌の細胞膜を破壊する細胞膜破壊工程であって、前記ジスルフィド結合タンパク質と磁性細菌粒子との複合体が形成される工程と；を含む、グラム陰性磁性細菌における、ジスルフィド結合タンパク質と磁性粒子との複合体の製造方法。

Description

タンパク質－磁性粒子複合体及びその製造方法
　本発明は、タンパク質－磁性粒子複合体及びその製造方法に関する。
　磁性粒子は、磁石により簡単に分離及び誘導することができ、且つ、それらの操作を比較的簡便に自動化できるため、近年、医療及び環境等の分野における応用が期待されている。例えば、医療分野における応用として、磁性粒子の表面上に、抗原又は抗体のような機能性タンパク質又はペプチド（以下、「タンパク質」と総称する）を固定化した複合体（以下、「タンパク質－磁性粒子複合体」という）を使用して、抗原抗体反応により、抗体又は抗原を検出する技術が提案されている（特許文献１～３）。抗体又は抗原と反応した複合体は、磁気的に分離することができる。
　このようなタンパク質－磁性粒子複合体は、目的のタンパク質と磁性粒子とをそれぞれ別の系で産生し、該タンパク質を該磁性粒子上に固定化することによって調製されていた。例えば、目的のタンパク質は、大腸菌や酵母等の細菌を用いて産生し、他方、磁性粒子は、菌体内で磁性細菌粒子（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（以下、「ＢａｃＭＰｓ」という））を生産する磁性細菌を用いて産生し、そして、該タンパク質を、多官能化合物や架橋剤等を用いた化学的処理によって該磁性粒子上に固定化することにより、タンパク質－磁性粒子複合体を形成していた。具体的には、表面をアミノ基またはカルボキシル基で修飾した磁性粒子と、タンパク質とを架橋剤存在下で混合することによって、タンパク質を磁性粒子表面の脂質二重膜に固定化できることが報告されている（特許文献２及び３）。しかし、このような手法は機能性タンパク質のアミノ基やカルボキシル基をランダムに担体上に固定化することから、該タンパク質の変性や失活を招く。更に、固定化には、多くのタンパク質が必要となることに加え、操作も煩雑となる。
　また、遺伝子工学的手法を用いて、磁性細菌粒子（ＢａｃＭＰｓ）表面の脂質二重膜に局在するアンカータンパク質をコードする遺伝子に、目的の機能性タンパク質（ここでは、抗体）と結合親和性を有するタンパク質（ここでは、抗体結合ドメイン）をコードする遺伝子を融合させて作製したプラスミドを利用する方法も提案されている（特許文献４）。該プラスミドを磁性細菌に導入して得られた形質転換体を用いて培養して、アンカータンパク質と前記抗体結合ドメインとをディスプレイした磁性細菌粒子を得る。そして、菌体から該磁性細菌粒子を単離し、当該粒子に抗体を含んだ溶液を添加することにより、抗体を前記磁性粒子上に固定化することができる。しかし、この手法も前記複合体を得るまでに煩雑な操作を必要とする。
特許第２９４８９３５号公報 特開平５－２０９８８４号公報 特開平５－０９９９２６号公報 特許第５１１９３９８号公報
　近年、組み換えタンパク質－磁性粒子複合体の用途の拡大に伴い、様々な機能性分子で磁性粒子を修飾することにより、該複合体を多機能化及び高機能化することが求められている。また、煩雑な操作を必要とすることなく、タンパク質－磁性粒子複合体を製造するための方法の開発も求められている。
　従って、本発明が解決しようとする課題は、新規且つ有用なタンパク質－磁性粒子複合体を提供すること、及び、煩雑な操作を必要とすることなく該複合体を製造する方法を提供することである。
　グラム陰性磁性細菌であるＭａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１は、鎖状に配列したナノサイズのＢａｃＭＰｓを細胞質で生産する。例えば、免疫学的検定、リガンド－受容体相互作用又は細胞分離等、遺伝子組み換えＢａｃＭＰｓの種々の適用が、目的タンパク質をＢａｃＭＰｓ上に発現させることにより証明されてきたが、還元的環境であるグラム陰性磁性細菌の細胞質ではジスルフィド結合が形成されないため、適切なフォールディングのために分子内ジスルフィド結合の形成が必要であるタンパク質（以下、「ジスルフィド結合タンパク質」という）を、機能を保持した状態でＢａｃＭＰｓ上に発現させることが難しかった。
　本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、ジスルフィド結合タンパク質を、酸化的環境であるペリプラズム内で発現させ、ジスルフィド結合タンパク質のドッキングパートナーであるタンパク質を、細胞質内で発現させる二重発現系を構築した。細菌培養後、細胞を破砕し、磁性細菌粒子とジスルフィド結合タンパク質とを前記ドッキングパートナーを介してドッキングさせることで、ＢａｃＭＰｓ上にジスルフィド結合タンパク質を機能的に発現した複合体を製造することができる。この方法によれば、ジスルフィド結合タンパク質と、そのドッキングパートナーであるタンパク質とを、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでドッキングさせることにより複合体を形成することができるため、本明細書において「ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｄｏｃｋｉｎｇ法」と称する。
　即ち、本発明の第１の側面は、
（１）グラム陰性磁性細菌における、ジスルフィド結合タンパク質と磁性粒子との複合体の製造方法であって、
　（ｉ）前記細菌中で、
　（ａ）結合タンパク質に融合したジスルフィド結合タンパク質を含んだ第１の融合タンパク質、及び
　（ｂ）磁性細菌粒子に結合又は一体化され得るタンパク質に融合した結合パートナータンパク質を含んだ第２の融合タンパク質
を共発現させる共発現工程であって、前記第１の融合タンパク質の発現が前記細菌のペリプラズムへと誘導され、前記第２の融合タンパク質の発現が前記細菌の細胞質へと誘導される工程と；
　（ｉｉ）前記第１及び第２の融合タンパク質を生産するのに充分な条件下で前記工程（ｉ）の細菌を培養する培養工程と；
　（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）の細菌の細胞膜を破壊する工程であって、前記ジスルフィド結合タンパク質と磁性細菌粒子との複合体が形成される細胞膜破壊工程と；
を含む、製造方法である。
　ここで、「タンパク質」の語には、タンパク質だけでなくペプチドも含まれるものとする。「ジスルフィド結合タンパク質」とは、分子中にジスルフィド結合を少なくとも１つ含むタンパク質をいう。また、「結合タンパク質」及び「結合パートナータンパク質」とは、互いに結合親和力を有し、特異的に結合を形成することのできるタンパク質同士をいう。更に、「磁性細菌粒子」とは、磁性細菌によって生成される磁性粒子をいい、本明細書では「ＢａｃＭＰｓ」とも称される。「磁性細菌粒子に結合又は一体化され得るタンパク質」とは、磁性細菌粒子に結合又は一体化することのできるタンパク質をいい、磁性細菌のオルガネラに本来備わっているタンパク質であっても、遺伝子工学的手法により磁性細菌粒子に結合又は一体化されるタンパク質であってもよい。
　また、本発明の一態様は、
（２）前記工程（ｉｉｉ）の前記複合体を前記破壊した細胞から単離する単離工程（ｉｖ）を更に含む、上記（１）に記載の製造方法である。
　更に、本発明の好ましい態様は、
（３）前記複合体から、前記ジスルフィド結合タンパク質を回収する回収工程を更に含む、上記（１）又は（２）に記載の製造方法；
（４）前記結合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃドメインである、上記（１）～（３）のいずれかに記載の製造方法；
（５）前記結合パートナータンパク質がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ由来のタンパク質ＡのＺＺドメインである、上記（１）～（４）のいずれかに記載の製造方法；
（６）前記ジスルフィド結合したタンパク質が単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、上記（１）～（５）のいずれかに記載の製造方法；及び
（７）前記磁性細菌粒子へ結合又は一体化され得るタンパク質が、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｌｌｕｍ　ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ由来のＭｍｓ１３である、上記（１）～（７）のいずれかに記載の製造方法
である。
　先述の通り、タンパク質－磁性粒子複合体の用途の拡大に伴い、多機能化及び高機能化が求められており、様々な機能性分子で磁性粒子を修飾する試みがなされている。例えば、ｉｎ　ｖｉｖｏでのオルガネラへの機能性タンパク質の固定化において、ペプチドリンカーを介して複数のタンパク質を融合し単一の融合タンパク質として発現することで、複数のタンパク質を固定化する方法がある。しかし、構造の複雑なタンパク質の融合や、複数のタンパク質の融合によって、凝集塊の形成、ミスフォールディング及びプロテアーゼによる分解が誘発される可能性がある。それ故、上記のような問題を伴うことなく、複数の機能性タンパク質を効率的にオルガネラへ固定化する技術が求められていた。
　本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、タンパク質発現ホストに前記磁性細菌Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１を用い、ｉｎ　ｖｉｖｏで複数の目的タンパク質をＢａｃＭＰｓ上に固定化する技術を確立した。この手法によれば、足場タンパク質をＢａｃＭＰｓ上に局在させると同時に、複数の目的タンパク質をそれぞれ、該足場タンパク質（結合パートナータンパク質）に結合可能なタグタンパク質（結合タンパク質）と融合した融合タンパク質として共発現させることで、複数の目的タンパク質をＢａｃＭＰｓ上に固定化することができる。該手法は、複数の目的タンパク質と、足場タンパク質とをｉｎ　ｖｉｖｏでドッキングさせることにより複合体を形成するため、本明細書では「ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｄｏｃｋｉｎｇ法」と称する。
　即ち、本発明の第２の側面は、
（８）磁性粒子と；
　磁性粒子に結合又は一体化され得るタンパク質に融合し、且つ、第１の結合パートナータンパク質と第２の結合パートナータンパク質とを含んだ足場タンパク質と；
　第１の結合タンパク質と、該第１の結合タンパク質に融合した第１の目的タンパク質とを含んだ第１の融合タンパク質と；
　第２の結合タンパク質と、該第２の結合タンパク質に融合した第２の目的タンパク質とを含んだ第２の融合タンパク質と；
を含んだ、タンパク質と磁性粒子との複合体であって、
　前記第１の目的タンパク質は、前記第１の結合タンパク質と前記第１の結合パートナータンパク質との結合を介して前記磁性粒子上に固定化され、
　前記第２の目的タンパク質は、前記第２の結合タンパク質と前記第２の結合パートナータンパク質との結合を介して前記磁性粒子上に固定化されている、複合体。
　ここで、「第１の結合タンパク質」及び「第１の結合パートナータンパク質」は、親和力によって互いに結合を形成することができ、「第２の結合タンパク質」及び「第２の結合パートナータンパク質」も同様の関係を有する。
　また、本発明の好ましい態様は、
（９）前記第１の目的タンパク質及び前記第２の目的タンパク質のうち一方のタンパク質の機能が、他方のタンパク質の存在により発現する、上記（８）に記載の複合体である。
　また、本発明の別の側面は、
（１０）グラム陰性磁性細菌における、複数タンパク質と磁性粒子との複合体の製造方法であって、
　（ｉ）前記細菌中で、
　（ａ）第１の結合タンパク質と該第１の結合タンパク質に融合した第１の目的タンパク質とを含んだ第１の融合タンパク質、
　（ｂ）第２の結合タンパク質と該第２の結合タンパク質に融合した第２の目的タンパク質とを含んだ第２の融合タンパク質、及び
　（ｃ）磁性細菌粒子に結合又は一体化され得るタンパク質に融合し、且つ、第１の結合パートナータンパク質と第２の結合パートナータンパク質とを含んだ足場タンパク質を共発現させる共発現工程と；
　（ｉｉ）前記第１及び第２の目的タンパク質、並びに、前記足場タンパク質を生産するのに充分な条件下で前記工程（ｉ）の細菌を培養する培養工程であって、前記第１及び第２の目的タンパク質と該磁性細菌粒子との複合体が形成される工程と；
を含む、製造方法である。
　本発明の好ましい態様は、
（１１）（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）の細菌の細胞膜を破壊する細胞膜破壊工程と；
　（ｉｖ）前記工程（ｉｉ）で形成された前記複合体を、前記工程（ｉｉｉ）で破壊された細胞から単離する単離工程と；
を更に含む、（１０）に記載の製造方法である。
　本発明によれば、新規且つ有用なタンパク質－磁性粒子複合体が提供される。また、煩雑な操作を必要とすることなく該複合体を製造する方法も提供される。
本発明の一態様に係るＩｎ　ｖｉｔｒｏ　ｄｏｃｋｉｎｇ法を示す。（Ａ）目的のジスルフィド結合タンパク質はペリプラズムに移動し、一方、結合タンパク質は細胞質のＢａｃＭＰｓ上に発現する。ジスルフィド結合タンパク質は、細胞溶解液からＢａｃＭＰｓを磁気的に分離する間に、ＢａｃＭＰｓ上の結合タンパク質にドッキングする。（Ｂ）発現ベクター。ここで示される融合遺伝子の全てが、Ｍ．Ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１由来のｍｍｓ１６プロモーターの下で発現される。 ＩｇＧ結合アッセイを示す。細胞溶解前にアルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合ｄｏｎｋｅｙ　ＩｇＧをＭｍｓ１３ＺＺ形質転換体又はＭ．Ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１野生型に添加した。ＢａｃＭＰｓを抽出し、ＩｇＧ－ＡＰのＭｍｓ１３－ＺＺへの結合を化学発光により検出した。 ＺＺ－ＢａｃＭＰｓ上へのｓｃＦｖ－Ｆｃ結合の経時変化を示す。ＢａｃＭＰｓを、細胞破壊の０、１０、３０及び６０分後に細胞の溶解液から磁気的に回収した。その後、マウス抗ＦＬＡＧ抗体及びｄｏｎｋｅｙ抗マウスＩｇＧ－ＡＰを使用して、ＢａｃＭＰｓから抽出した膜タンパク質をウェスタンブロットに供した。 還元条件（（Ａ））及び非還元条件（（Ｂ）及び（Ｃ））下で調製されたＭｍｓ１３－ＺＺ、Ｍｍｓ１３－ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖ－Ｆｃのウェスタンブロット分析を示す。（Ａ）及び（Ｂ）：ｓｃＦｖ融合タンパク質を抗ＦＬＡＧ　ＩｇＧ－ＡＰによって、Ｍｍｓ１３－ＺＺをｄｏｎｋｅｙ抗マウスＩｇＧ－ＡＰによって検出した。（Ｃ）：Ｍｍｓ１３－ＺＺ及びｓｃＦｖ融合タンパク質を、ウサギ抗ヒトλ軽鎖ポリクローナル抗体とＡＰ結合抗ウサギＩｇＧとによって検出した。「Ｍｍｓ１３－ＺＺ」は、ｐＵＭ１３ＺＺに含まれる形質転換体由来のＢａｃＭＰｓ膜タンパク質；「Ｍｍｓ１３－ＺＺ＋ｓｃＦｖ－Ｆｃ」は、ｐＵＭ１３ＺＺ／ｓｃＦｖＦｃに含まれる形質転換体由来のＢａｃＭＰｓ膜タンパク質；「Ｍｍｓ１３－ｓｃＦｖ」は、ｐＵＭ１３ｓｃＦｖに含まれる形質転換体由来のＢａｃＭＰｓ膜タンパク質を示す。 ＢａｃＭＰｓ上でのβ－ガラクトシダーゼ結合アッセイを示す。「ＺＺ」は、ｐＵＭ１３ＺＺに含まれる形質転換体から抽出されたＢａｃＭＰｓ；「ｓｃＦｖ」は、ｐＵＭ１３ｓｃＦｖに含まれる形質転換体から抽出されたＢａｃＭＰｓ；「ＺＺ＋ｓｃＦｖ－Ｆｃ」は、ｐＵＭ１３ＺＺ／ｓｃＦｖＦｃに含まれる形質転換体から抽出されたＢａｃＭＰｓを示す。 Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１　ＤｓｂＡタンパク質のｉｎ　ｓｉｌｉｃｏ解析を示す。ＣｌｕｓｔａｌＷ　２．１を用いて、Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１由来のＤｓｂＡと大腸菌由来のものとを比較した。陰影は、確認された配列モチーフを示す。 Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１　ＤｓｂＢタンパク質のｉｎ　ｓｉｌｉｃｏ解析を示す。ＣｌｕｓｔａｌＷ　２．１を用いて、Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１由来のＤｓｂＢと大腸菌由来のものとを比較した。濃い陰影は、確認された配列モチーフを、薄い陰影は予測された配列モチーフを示す。 Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１　ＤｓｂＣタンパク質のｉｎ　ｓｉｌｉｃｏ解析を示す。ＣｌｕｓｔａｌＷ　２．１を用いて、Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１由来のＤｓｂＣと大腸菌由来のものとを比較した。濃い陰影は、確認された配列モチーフを、薄い陰影は予測された配列モチーフを示す。 Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１　ＤｓｂＤタンパク質のｉｎ　ｓｉｌｉｃｏ解析を示す。ＣｌｕｓｔａｌＷ　２．１を用いて、Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１由来のＤｓｂＤと大腸菌由来のものとを比較した。濃い陰影は、確認された配列モチーフを、薄い陰影は予測された配列モチーフを示す。 Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１　ＤｓｂＧタンパク質のｉｎ　ｓｉｌｉｃｏ解析を示す。ＣｌｕｓｔａｌＷ　２．１を用いて、Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１由来のＤｓｂＧと大腸菌由来のものとを比較した。濃い陰影は、確認された配列モチーフを、薄い陰影は予測された配列モチーフを示す。 本発明の一態様に係るｉｎ　ｖｉｖｏ　ｄｏｃｋｉｎｇ法を示す。（Ａ）は、ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｄｏｃｋｉｎｇに用いた発現ベクターの概略図を示し、（Ｂ）は、Ｍｍｓ１３－ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎ、ＧＦＰ－ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲを示す。 Ｍｍｓ１３－ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｉｄｉｎの発現及び局在化分析を示す。（Ａ）はＢａｃＭＰｓの膜画分のウェスタンブロッティングを、（Ｂ）は抗体結合アッセイを示す。レーン１、レーン２及びレーン３はそれぞれ、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ－Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃを保持する形質転換体及び野生型を示す。 ウェスタンブロッティングによる全細胞抽出物の発現分析を示す。（Ａ）は抗ＧＦＰ抗体によって、（Ｂ）は抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体によって検出した。レーン１、レーン２及びレーン３はそれぞれ、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ－Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃを保持する形質転換体及び野生型を示す。 ＢａｃＭＰｓ表面への抗体結合アッセイを示す。（Ａ）は抗ＧＦＰ抗体によって、（Ｂ）は抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体によって検出した。レーン１、レーン２及びレーン３はそれぞれ、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ－Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体由来のＢａｃＭＰｓ、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃを保持する形質転換体由来のＢａｃＭＰｓ及び野生型由来のＢａｃＭＰｓを示す。 ＢａｃＭＰｓの膜画分のウェスタンブロッティングを示す。（Ａ）は抗ＧＦＰ抗体によって、（Ｂ）は抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体によって検出した。レーン１及び２はそれぞれ、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ－Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体由来のＢａｃＭＰｓの膜画分、及び、野生型由来のＢａｃＭＰｓの膜画分を示す。 上から順に、（Ａ）～（Ｃ）はそれぞれ、野生型、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃを保持する形質転換体、及び、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ－Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体の蛍光画像を示す。 本発明の一態様に係るＩｎ　ｖｉｖｏ　ｄｏｃｋｉｎｇ法を示す。（Ａ）はｉｎ　ｖｉｖｏ　ｄｏｃｋｉｎｇに用いた発現ベクターの概略図を示し、（Ｂ）は、Ｍｍｓ１３－ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎ、ｅＭＨＣ－ＤｏｃＣ及びＤＭ－ＤｏｃＲを示す。
　以下、本発明についてより詳細に説明する。
＜１＞Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｄｏｃｋｉｎｇによるタンパク質－磁性粒子複合体の創製
　本発明の第１の側面は、グラム陰性磁性細菌において、ジスルフィド結合タンパク質と磁性粒子との複合体を製造する方法に関する。即ち、該製造方法では、グラム陰性磁性細菌を使用し、磁性粒子と、該磁性粒子上に固定化されたジスルフィド結合タンパク質とを含んだ、組み換えタンパク質－磁性粒子複合体を製造する。
　一般に、グラム陰性細菌の細胞質内は還元的環境である。そのため、ジスルフィド結合（以下、「Ｓ－Ｓ結合」ともいう）が構造形成に影響する外来タンパク質、例えば、抗体分子などを、細胞質内に存在する磁性細菌粒子上に発現させるとＳ－Ｓ結合を形成しない。一方、グラム陰性細菌のペリプラズムは酸化的環境であるため、Ｓ－Ｓ結合を含むタンパク質の発現に適している。そこで、該製造方法では、ジスルフィド結合タンパク質の発現をペリプラズムに誘導し、ＢａｃＭＰｓの産生を細胞質にて行う。
　グラム陰性磁性細菌としてはＭａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ（Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ）　ＡＭＢ－１を使用することができる。Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１は、鎖状に配列したナノサイズのＢａｃＭＰｓを細胞質で合成する。ＢａｃＭＰｓは、脂質二重膜と、該脂質二重膜に囲まれた純粋なマグネタイト（直径５０～１００ｎｍ）とを含み、強力なフェリ磁性を示す。同様なマグネタイトを生成する他のグラム陰性菌株も、本発明において使用可能である。
　該製造方法は、以下で説明する工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を含む。
　（ｉ）共発現工程
　本工程では、グラム陰性細菌中で、（ａ）結合タンパク質に融合したジスルフィド結合タンパク質を含んだ第１の融合タンパク質と、（ｂ）磁性細菌粒子に結合又は一体化され得るタンパク質に融合した結合パートナータンパク質を含んだ第２の融合タンパク質とを共発現させる。
　ジスルフィド結合タンパク質としては、例えば、図１（Ａ）に示すｓｃＦｖ（単鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ））が挙げられる。ｓｃＦｖは、一般的に入手が容易であり、Ｆｃ融合ｓｃＦｖは、ヒンジ領域間でのジスルフィド結合とＣＨ３領域間での相互作用によって抗体様の二量化構造を形成し、二価の結合の親和性効果を提供する。また、大腸菌の細胞質における溶解性とｉｎ　ｖｉｖｏフォールディングとを改善する。
　単一ドメインの抗体フラグメント（ｓｄＡｂ、ＶＨＨ又はナノボディという）を細胞質においてＢａｃＭＰｓ上で機能的に発現させる代替的なアプローチが報告されている。ｓｄＡｂは、その厳密な折り畳み及び安定性のため、体内への適用に適しているが、それらはラクダ科の動物又はサメの免疫によって調製されるため、有用性が限定される。それに対し、ｓｃＦｖは一般に入手可能であり、抗体様の二量化構造を形成するため、抗体及び磁性粒子錯体の開発の可能性を拡張することが予想される。
　ジスルフィド結合タンパク質は、図１に示すｓｃＦｖに限定されず、ＩｇＧ及びＩｇＭ等の免疫グロブリン（抗体）や、これらが特異的に認識する抗原のうち細菌やウイルス等の表面抗原、インターロイキン類及びケモカイン類等の各種サイトカイン、ＥＧＦ及びＴＧ等の各種増殖因子、それらの受容体、それらの断片、並びに、それらの変異体を使用することができる。
　ジスルフィド結合タンパク質には、結合タンパク質が融合される。
　図１に示す例では、結合タンパク質として免疫グロブリンＦｃドメイン（Ｆｃ）が用いられているが、結合タンパク質はこれに限定されず、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ、ｐ５３、ｐ１６、Ｅ２Ｆ、それらの断片及びそれらの変異体を使用することができる。
　結合タンパク質は、結合パートナータンパク質と結合親和性を有する。結合パートナータンパク質は図１ではＺＺ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ由来のタンパク質ＡのＺＺドメイン）である。
　結合パートナータンパク質としては、該ＺＺドメインに限られず、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＭＤＭ２、Ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ、ＤＰ、それらの断片及びそれらの変異体を使用することができる。
　結合タンパク質と結合パートナータンパク質との適切な組み合わせを選択することにより、これらの相互作用によって目的のジスルフィド結合タンパク質をＢａｃＭＰｓ上に効率的に固定化することができる。
　例えば、ＫＤ値が１０－１２～１０－６の範囲にある組み合わせを使用することができる。具体的には、結合タンパク質と結合パートナータンパク質との組み合わせとしてＳｔｒｅｐ－ｔａｇとＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎとの組み合わせ、ｐ５３とＭＤＭ２との組み合わせ、ｐ１６及びＣｙｃｌｉｎ　Ｄとの組み合わせ、Ｅ２ＦとＤＰとの組み合わせが挙げられる。なお、望むならば、結合タンパク質と結合パートナータンパク質とが相互に入れ替え可能であることを当業者は容易に理解するであろう。
　磁性細菌粒子に結合又は一体化され得るタンパク質としては、図１（Ａ）に示すＭａｇｎｅｔｏｓｐｉｌｌｕｍ　ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ由来のＭｍｓ１３が挙げられる。Ｍｍｓ１３タンパク質は、マグネタイトの表面上の脂質二重膜と一体化しており、ＢａｃＭＰｓのマグネタイトと強固に結合することができる。
　磁性細菌粒子に結合又は一体化され得るタンパク質としては、Ｍｍｓ１３以外にも、Ｍｍｓ１３と同様にアンカータンパク質であるＭｍｓ１６及びＭｍｓ２４や、マグネタイト形成に関与するＭｍｓ５、Ｍｍｓ６及びＭｍｓ７や、鉄イオン輸送タンパク質ＭａｇＡが挙げられる。
　該工程（ｉ）では、第１の融合タンパク質（図１では、ｓｃＦｖ－Ｆｃ）の発現が前記細菌のペリプラズムへと誘導され、第２の融合タンパク質（図１では、ＺＺ－Ｍｍｓ１３）の発現が前記細菌の細胞質へと誘導される。そのため、第１の融合タンパク質に含まれるジスルフィド結合タンパク質は、ペリプラズムの酸化的環境下でジスルフィド結合を形成し、折り畳まれる。その結果、以下で説明する工程（ｉｉｉ）で形成される複合体において、ジスルフィド結合タンパク質は、その機能を維持した状態で磁性粒子上に固定化される。
　前記第１の融合タンパク質の発現のペリプラズムへの誘導は、該タンパク質のＮ末端に付加されるシグナルペプチドにより行われる。該シグナルペプチドとしては、例えば、図１に示す大腸菌ＤｓｂＣ由来のものを使用することができる。内在性のＤｓｂＣは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｄｏｃｋｉｎｇ法が成立する上で効率的にペリプラズムに移行すべきタンパク質であり、また、将来的な全長ＤｓｂＣとの融合も想定し得るという利点がある。勿論、タンパク質の発現をペリプラズムに誘導できる他の公知のシグナルペプチドも本発明に利用可能である。そのようなシグナルペプチドとしては、大腸菌のＤｓｂＡ、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、ＭｄｏＤ及びＴｏｒＡ由来のもの、Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａのＰｅｌＢ由来のもの、並びに、Ｍ１３ファージのｐＩＩＩ由来ものなどが挙げられる。
　（ｉｉ）培養工程
　本工程では、前記第１及び第２の融合タンパク質、並びに、前記足場タンパク質を生産するのに充分な条件下で前記工程（ｉ）の細菌を培養する。ここで、融合タンパク質を生産するのに充分な条件とは、例えば、温度２５～２９℃、ｐＨ６．０～７．５、微好気条件において、Ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｇｒｏｗｔｈ　ｍｅｄｉｕｍ（ＭＳＧＭ）培地を用いて３～７日間培養を行う培養条件である。
　（ｉｉｉ）細胞膜破壊工程
　本工程では、前記工程（ｉｉ）の細菌の細胞膜を破壊する。そしてこの工程により、ジスルフィド結合タンパク質と磁性細菌粒子との複合体が形成される。
　即ち、細胞膜が破壊されることによって結合タンパク質と結合パートナータンパク質との相互作用が可能となり、ジスルフィド結合タンパク質が磁性細菌粒子上に捕捉され、ジスルフィド結合タンパク質とＢａｃＭＰｓとの複合体が形成される。
　前記細菌の細胞膜の破壊は、当該分野で周知の方法を単独でまたは組み合わせて行ってもよい。例えば、リゾチーム等により細胞壁を破壊した時に、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ　２０、Ｂｒｉｊｉ　３５等の非イオン性界面活性剤、ＣＨＡＰＳ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ　３－１２等の両イオン性界面活性剤、又は、ＳＤＳやＮ－ｌａｕｒｏｙｌ　ｓａｒｃｏｓｉｎｅ等の陰イオン性界面活性剤などを添加することが好ましい。なお、本工程中、ジスルフィド結合タンパク質等の分解を防止するために、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を存在させることも望ましい。
　（ｉｖ）単離工程
　本発明の製造方法は、更に、前記工程（ｉｉｉ）で形成された、ジスルフィド結合タンパク質とＢａｃＭＰｓとの複合体を、前記破壊された細胞から単離する単離工程（ｉｖ）を含んでいても良い。
　前記複合体を単離する方法は、特に限定されず、当該分野で周知の方法であってよい。ジスルフィド結合タンパク質の単離は例えば、磁気を利用してＢａｃＭＰｓを回収することにより行われる。磁気を利用した回収には、ｃｏｌｕｍｎａｒ　ｎｅｏｄｙｍｉｕｍ－ｂｏｒｏｎ（Ｎｄ－Ｂ）磁石等の磁石が使用される。
　前記複合体の単離は、細胞が完全に可溶化してから直ちに行ってもよいが、好ましくは１０分以上経過した後に行われ得る。このタイミングであれば、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との相互作用により、目的のジスルフィド結合タンパク質が完全にＢａｃＭＰｓ上に補足されているため、良好な収率で前記複合体を単離することができる。
　本発明の別の態様は、ジスルフィド結合タンパク質の製造方法に関する。
　該製造方法は、前記工程（ｉ）～（ｉｉｉ）に加え、更に、前記複合体から前記ジスルフィド結合タンパク質を回収する回収工程を含む。
　例えば、ｐＨ２～４の酸性緩衝液、ｐＨ１０～１２のアルカリ性緩衝液、３Ｍ以上の高イオン強度緩衝液、結合タンパク質もしくは結合パートナータンパク質に対する特異的競合ペプチド等を用いて、前記複合体から前記ジスルフィド結合タンパク質を回収することができる。
　次いで、前記製造方法で使用されるベクター及び該ベクターを含んだ形質転換体について説明する。
　前記製造方法では、前記工程（ｉｉ）において、通常はベクターを導入した形質転換体が培養される。従って、本発明の範囲には、タンパク質－磁性粒子複合体の製造に使用されるベクター及び該ベクターを含んだ形質転換体も含まれる。
　本発明の一態様に係るベクターは、第１の融合タンパク質をコードする遺伝子と；第２の融合タンパク質をコードする遺伝子と；該第１の融合タンパク質をコードする遺伝子に連結されたシグナル配列とを含む。
　ここで、第１の融合タンパク質をコードする遺伝子は、結合タンパク質をコードする遺伝子とジスルフィド結合タンパク質をコードする遺伝子とを融合したものであり、第２の融合タンパク質をコードする遺伝子は、ＢａｃＭＰｓに結合又は一体化され得るタンパク質をコードする遺伝子と結合パートナータンパク質をコードする遺伝子とを融合したものである。
　シグナル配列は、ジスルフィド結合タンパク質を含んだ第１の融合タンパク質を、酸化的環境であるペリプラズムへと誘導するため、分子内でジスルフィド結合が形成される。これによって、ジスルフィド結合タンパク質が機能を保持した状態で、タンパク質－磁性粒子複合体を得ることができる。
　本発明のベクターの一例が、図１（Ｂ）の（ｃ）に示される。図１（Ｂ）の（ｃ）に示す例において、第１の融合タンパク質をコードする遺伝子は「ｓｃＦｖ－Ｆｃ」、第２の融合タンパク質をコードする遺伝子は「ｍｍｓ１３－ＺＺ」、シグナル配列は、「ｄｓｂＣ」である。ただし、シグナル配列に連結した第１の融合タンパク質をコードする遺伝子と、第２の融合タンパク質をコードする遺伝子とは、それぞれ別のベクターに組み込まれて宿主細胞を形質転換してもよい。
　また、ベクターは、目的タンパク質の分離及び精製等に有利なタグペプチドをコードする遺伝子を含んでいてもよい。図１（Ｂ）に示す例では、ベクターは、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合遺伝子の末端に連結されたＦＬＡＧ　ｔａｇをコードする遺伝子（ＦＬＡＧ）を含んでいる。
　ベクターは更に、タンパク質合成効率を向上させるための遺伝子を含んでいてもよい。
　また、ベクターは、第１の融合タンパク質をコードする遺伝子及び第２の融合タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターを含んでいるべきである。
　図１（Ｂ）に示す例では、当該プロモーターとして、恒常的に発現するｍｍｓ１６プロモーターが使用され、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合遺伝子及びｍｍｓ１３－ＺＺ融合遺伝子は、ｍｍｓ１６プロモーターによって制御される。
　本発明のベクターは、グラム陰性磁性細菌を形質転換できるものであれば、いずれでも使用可能であるが、例えば、プラスミドベクター、コスミドベクターが挙げられる。中でも、好適には、プラスミドベクターを使用することができる。
　本発明の第１の側面にかかるタンパク質－磁性粒子の製造方法、並びに、該製造方法で使用されるベクター及び形質転換体によれば、煩雑な作業を伴うことなく、ワンステップで、正確にフォールディングされたジスルフィド結合タンパク質をＢａｃＭＰｓ上に固定した、タンパク質－磁性粒子複合体を得ることができる。従って、得られた複合体においてジスルフィド結合タンパク質はその機能を維持している。
　より詳細に説明すると、ＢａｃＭＰｓが生産される磁性細菌の細胞質は、還元的環境である。従って、細胞質でジスルフィド結合タンパク質を発現させる従来の方法では、ＢａｃＭＰｓ上でのタンパク質のジスルフィド結合は形成されない。このような従来の方法では、ジスルフィド結合の形成は、ＢａｃＭＰｓの抽出及び精製プロセス中の空気酸化に依存し、空気酸化によるジスルフィド結合形成の速度と収率は、ｉｎ　ｖｉｖｏと比較して非常に遅く、且つ、ミスフィールディング又はアンフォールディングのために、タンパク質の凝集又は分解が生ずる懸念があった。本発明の第１側面にかかる製造方法等では、磁性細菌粒子に結合又は一体化され得るタンパク質を含んだ第２の融合タンパク質の発現が前記細菌の細胞質へと誘導される一方で、結合タンパク質に融合したジスルフィド結合タンパク質を含んだ第１の融合タンパク質の発現は、酸化的環境にあるペリプラズムへと誘導されるため、機能を維持した状態でジスルフィド結合タンパク質を磁性粒子上に固定化させた複合体を得ることができた。
　また、複合体の調製のために、ターゲットタンパク質の精製やＳ－Ｓ結合形成を行うための前工程等を必要としなかった。調製された複合体は、細胞から抽出後、直接利用できた。
　以上の事実から、本発明の第１の側面によれば、全く新しいＳ－Ｓ結合タンパク質の調製法（ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｄｏｃｋｉｎｇ法）が提供される。該方法は、抗体とＢａｃＭＰｓとの複合体の開発の可能性を拡張することが期待される。
　また、抗体のみならず、様々なジスルフィド結合タンパク質の磁性細菌粒子上への機能発現が可能となり、創薬研究における標的リガンド又はリード化合物スクリーニングのハイスループット化を実現する画期的な方法を提供することができる。例えば、該製造方法により得られたジスルフィド結合タンパク質－ＢａｃＭＰｓ複合体は、リガンド－受容体相互作用又はアフィニティー生成の磁性キャリアとして有用であり、可能性のあるリガンド又は薬剤の効率的なスクリーニングを提供する。
　以下、本発明の第２の側面について説明する。
　＜２＞Ｉｎ　ｖｉｖｏドッキングによる複数タンパク質－磁性粒子複合体の創製
　本発明の別の側面は、複数のタンパク質と磁性粒子との複合体に関する。
　該複合体について、図１１を参照しながら説明する。
　本側面に係るタンパク質－磁性粒子複合体は、目的タンパク質である複数のタンパク質（即ち、第１及び第２の目的タンパク質）と、磁性粒子と、足場タンパク質と、を含む。該複合体において、足場タンパク質は磁性粒子に結合又は一体化され、複数のタンパク質は足場タンパク質を介して該磁性粒子上に固定されている。
　図１１に示す例では、第１及び第２の目的タンパク質はそれぞれ、蛍光緑色タンパク質（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ））及びｍＣｈｅｒｒｙとして示される。また、磁性粒子は磁性細菌粒子（ＢａｃＭＰｓ）、足場タンパク質はＭｍｓ１３－ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎとして示される。この例では、磁性粒子はグラム陰性磁性細菌によって産生された磁性細菌粒子（ＢａｃＭＰｓ）として示されるが、本側面に係るタンパク質－磁性粒子複合体において、磁性粒子は磁性細菌によらずに他の公知の方法で作製した磁性粒子であってもよい。
　上記のように、足場タンパク質は、該磁性粒子に結合又は一体化され得るタンパク質、並びに、第１の結合パートナータンパク質及び第２の結合パートナータンパク質を含んでいる。
　図１１の例では、磁性粒子に結合又は一体化され得るタンパク質はＭｍｓ１３として、第１の結合パートナータンパク質及び第２の結合パートナータンパク質はそれぞれ、ＣｏｈＣ及びＣｏｈＲとして示される。ここで、第１の結合パートナータンパク質及び第２の結合パートナータンパク質は、第１の結合タンパク質及び第２の結合タンパク質が足場タンパク質に結合するための足場の役割を果たす。典型的には、第１の結合タンパク質と第２の結合タンパク質とは異なるタンパク質である。
　第１の結合パートナータンパク質と第２の結合パートナータンパク質とは、通常、ペプチドリンカーで連結されている。ペプチドリンカーとしては、当該分野で一般的に使用されるペプチドリンカーを使用することができ、５～１００個、好ましくは５～２０個のアミノ酸からなるペプチドである。
　ペプチドリンカーとしては、例えば、（Ｎ４Ｓ）ｎ［式中、ｎは整数］で示されるペプチドを使用することができる。図１１に示す例で使用したペプチドリンカーは、１０個のアミノ酸からなる（Ｎ４Ｓ）２ペプチドである。
　また、第１の結合パートナータンパク質及び第２の結合パートナータンパク質のいずれか一方と、磁性粒子に結合又は一体化され得るタンパク質との間も、通常、ペプチドリンカーで連結されている。ペプチドリンカーとしては、当該分野で一般的に使用されるペプチドリンカーを使用することができ、５～２００個、好ましくは５０～１００個のアミノ酸からなるペプチドである。図１１に示す例では、第１の結合パートナータンパク質と、磁性粒子に結合又は一体化され得るタンパク質とがペプチドリンカーで連結されており、該ペプチドリンカーは、１００個のアミノ酸からなる（Ｎ４Ｓ）２０ペプチドである。
　第１の結合タンパク質及び第２の結合タンパク質は、前記第１の結合パートナータンパク質及び第２の結合パートナータンパク質とそれぞれ結合し、これらの結合を介して第１及び第２の目的タンパク質が磁性粒子上に固定化される。即ち、第１及び第２の結合タンパク質はそれぞれ、第１及び第２の目的タンパク質が前記足場に結合するためのタグのような役割を果たす。
　結合タンパク質と結合パートナータンパク質の組み合わせとしては、ＫＤ値が１０－１０～１０－９の範囲のものを使用することができる。
　結合タンパク質と結合パートナータンパク質との組み合わせの具体例として、例えば、ｃｏｈｅｓｉｎとｄｏｃｋｅｒｉｎドメインとの組み合わせ、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇと抗体Ｆｃ領域ドメインとの組み合わせ、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａと抗体Ｆｃ領域ドメインとの組み合わせ、塩基性ロイシンジッパーモチーフと酸性ロイシンジッパーモチーフとの組み合わせが挙げられる。
　図１１に示す例では、結合タンパク質及び結合パートナータンパク質としてそれぞれ、セルロース分解菌が生産するタンパク質複合体セルロソームのｃｏｈｅｓｉｎ及びｄｏｃｋｅｒｉｎドメインを用いた。Ｃｏｈｅｓｉｎ及びｄｏｃｋｅｒｉｎの組み合わせは、ＫＤ値が１０－１０～１０－９と結合が強く、更に、Ｃｏｈｅｓｉｎ／ｄｏｃｋｅｒｉｎ結合には種特異性がある。ＢａｃＭＰｓ上に足場として複数のｃｏｈｅｓｉｎドメインを局在させ、タンパク質にｄｏｃｋｅｒｉｎドメインを融合した融合タンパク質を複数、共発現させることで、ＢａｃＭＰｓ上に複数のタンパク質を機能的に固定化できることが見出された。
　図１１に示す例では、第１の結合タンパク質及び第２の結合タンパク質であるＤｏｃＣ及びＤｏｃＲがそれぞれ、第１の結合パートナータンパク質及び第２の結合パートナータンパク質であるＣｏｈＣ及びＣｏｈＲに結合することにより、第１及び第２の目的タンパク質（ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ）をＢａｃＭＰｓ上に固定化している。
　ここで、前記第１の目的タンパク質と前記第２の目的タンパク質のうち一方のタンパク質の機能が、もう一方のタンパク質の存在によって発現される系は、本発明において特に興味のある対象である。ここで、「タンパク質の機能が発現される」とは、該タンパク質の活性が増強されることの他に、該タンパク質が正確にフォールディングされること、該タンパク質に、その対象分子との結合能力を付与すること、該タンパク質の構造が安定化されることも意図する。
　第１の目的タンパク質と第２の目的タンパク質との組み合わせの具体例としては、例えば、
－ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）とｍＣｈｅｒｒｙとの組み合わせ、
－ＭＨＣ　ＩＩ（ｃｌａｓｓ　ＩＩ　ｍａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ（ＭＨＣ　ＩＩ））とＨＬＡ－ＤＭ（Ｈｕｍａｎ　ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ａｎｔｉｇｅｎ　ＤＭ）との組み合わせ、
－Ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｋｉｎａｓｅ　Ａとｐ７５　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒとの組み合わせ、
－Ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅとｂｅｔａ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅとの組み合わせ、
－ＥｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅとＣｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅとの組み合わせ、
－ｂｅｔａ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅとＣｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅとの組み合わせ、
－Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅとＧｌｕｃｏｓｅ　ｏｘｉｄａｓｅとの組み合わせ
－Ａｃｙｌ－ＡＣＰ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅとＡｌｄｅｈｙｄｅ　ｄｅｆｏｒｍｙｌａｔｉｎｇ　ｏｘｙｇｅｎａｓｅとの組み合わせ
が挙げられる。
　第１の目的タンパク質と第２の目的タンパク質との好ましい組み合わせとしては、ＭＨＣ　ＩＩとＨＬＡ－ＤＭとの組み合わせが興味深い。
　ｅＭＨＣ　ＩＩ（ｅｍｐｔｙ　ＭＨＣ　ＩＩ）は、ヒトの免疫機構を担う重要なタンパク質であり、関節リウマチといった自己免疫疾患や臓器移植の際の拒絶反応に関連している。そして、ＭＨＣ　ＩＩは、α鎖とβ鎖から構成されるヘテロ二量体の一回膜貫通タンパク質であり、細胞膜上に発現して種々の疾患及び病原体由来の抗原タンパク質の分解産物（抗原ペプチド）と結合し、抗原ペプチド－ＭＨＣ　ＩＩ複合体（ｐＭＨＣ　ＩＩ）を形成する。ＭＨＣ　ＩＩに結合した抗原ペプチドが特異的にＴ細胞受容体を介してヘルパーＴ細胞に認識されることで、細胞が活性化する。よって、抗原ペプチドをワクチンに用いたペプチドワクチン療法の開発では、ＭＨＣ　ＩＩの抗原ペプチドとの結合能の解析や該抗原ペプチドの同定が重要である。
　一方、ＨＬＡ－ＤＭはＭＨＣ　ＩＩと構造が類似したタンパク質であり、ｅＭＨＣ　ＩＩと相互作用することで構造を安定化するシャペロン様の機能を有する他、ＭＨＣ　ＩＩに結合する抗原ペプチドの選択に関与していると考えられている。
　よって、ＭＨＣ　ＩＩとそのシャペロン様機能を有するＨＬＡ－ＤＭとをＢａｃＭＰｓ上に共局在させたタンパク質－磁性粒子複合体において、ＭＨＣ　ＩＩが、ＨＬＡ－ＤＭの存在によって抗原結合能を保持し得ることの利点は、当業者にとって明らかであろう。このようなタンパク質－磁性粒子は、例えば、抗体ペプチドのスクリーニングを目的としたペプチド結合試験等に有用である。また、磁性粒子を含んでいるため、混合物からの分離が容易である。しかしながら、本発明以前に、磁性粒子上で２種のタンパク質が足場を介して機能的に局在化され得るという証拠はなかった。
　本発明の好適な態様では、本発明の第１の側面でも用いたグラム陰性磁性細菌Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１を使用することができる。従って、本発明の第２の側面の一態様は、グラム陰性磁性細菌において、磁性粒子と該磁性粒子に固定化された複数のタンパク質とを含んだ磁性粒子－複数タンパク質複合体の製造方法である。
　より詳細には、以下の工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む。
　（ｉ）共発現工程
　本工程では、グラム陰性磁性細菌中で、前記第１及び第２の融合タンパク質と、前記足場タンパク質とを共発現させる。
　具体的には、（ａ）第１の結合タンパク質と該第１の結合タンパク質に融合した第１の目的タンパク質とを含んだ第１の融合タンパク質、（ｂ）第２の結合タンパク質と該第２の結合タンパク質に融合した第２の目的タンパク質とを含んだ第２の融合タンパク質、及び（ｃ）磁性細菌粒子に結合又は一体化され得るタンパク質に融合し、且つ、第１の結合パートナータンパク質と第２の結合パートナータンパク質とを含んだ足場タンパク質を共発現させる。
　該工程で使用することのできる、第１及び第２の目的タンパク質、第１及び第２の結合タンパク質、並びに、第１及び第２の結合パートナータンパク質としては、上述したタンパク質を使用することができる。
　（ｉｉ）培養工程
　本工程では、前記第１及び第２の目的タンパク質、並びに、前記足場タンパク質を生産するのに充分な条件下で前記工程（ｉ）の細菌を培養する。ここで、「融合タンパク質を生産するのに充分な条件」とは、本発明の第１の側面で説明したのと同様の条件である。
　本工程では、前記第１及び第２の目的タンパク質とＢａｃＭＰｓとの複合体が形成される。即ち、第１及び第２融合タンパク質並びに足場タンパク質はいずれも、磁性細菌の細胞質で発現される。該細菌を上記条件で培養することにより、細胞質内にこれらのタンパク質が生成し、結合タンパク質と結合パートナータンパク質との結合親和力によって、第１及び第２目的タンパク質がＢａｃＭＰｓ上に足場タンパク質を介して固定され、複数タンパク質－磁性粒子複合体が形成される。勿論、目的のタンパク質の一つ又は両方がジスルフィド結合タンパク質である、それらに対して、本発明の第１の側面を使用してもよい。つまり、その一つ又は両方の発現をペリプラズムに誘導してもよい。
　（ｉｉｉ）細胞膜破壊工程
　本工程では、前記工程（ｉｉ）の細菌の細胞膜を破壊する。
　前記細菌の細胞膜の破壊は、本発明の第１の側面の細胞膜破壊工程（ｉｉｉ）で説明したのと同様の方法によって行われてよい。
　（ｉｖ）単離工程
　該製造方法は、更に、前記工程（ｉｉ）で形成された前記複合体を、前記工程（ｉｉｉ）で破壊された細胞から単離する単離工程（ｉｖ）を更に含んでいてもよい。複合体の単離は、本発明の第１の側面の単離工程（ｉｖ）で説明したのと同様の方法によって行われてよい。
　また、該製造方法は、更に、前記複合体から、第１及び第２の目的タンパク質を回収する回収工程を更に含んでいてもよい。該工程は第１の側面において説明した回収工程と同様の工程である。
　前記製造方法では、前記工程（ｉｉ）において、以下の構成を有するベクターを導入した形質転換体が培養される。従って、本発明の範囲には、タンパク質－磁性粒子複合体の製造に使用されるベクター及び該ベクターを含んだ形質転換体も含まれる。
　図１１（Ａ）は、前記製造方法で使用されるベクターの一例を示す。該ベクターは、足場タンパク質をコードする遺伝子（図１では、Ｍｍｓ１３－ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｉｄｉｎ）と、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質をコードする遺伝子（図１では、Ｔａｒｇｅｔ－Ｄｏｃｋｅｒｉｎ）とを含む。
　足場タンパク質をコードする遺伝子は、磁性粒子に結合又は一体化され得るタンパク質をコードする遺伝子（図１１ではＭｍｓ１３）と；ペプチドリンカーをコードする遺伝子（図１１では親水性ポリペプチドリンカーのＮＳ　ｌｉｋｅｒ（Ｎ４Ｓ）２０））と；第１及び第２の結合パートナータンパク質をコードする遺伝子（図１１ではｃｏｈｅｈｉｎドメインのＣｏｈＣ及びＣｏｈＲ）と；第１の結合パートナータンパク質をコードする遺伝子と第２の結合パートナータンパク質をコードする遺伝子とを連結するペプチドリンカーをコードする遺伝子と；発現確認用の遺伝子（図１１では、ｃ－ｍｙｃ　ｔａｇ）と；で構成されている。
　第１及び第２の融合タンパク質をコードする遺伝子（Ｔａｒｇｅｔ－Ｄｏｋｅｒｉｎ）はそれぞれ、第１及び第２の目的タンパク質をコードする遺伝子（図１１ではＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ）と；第１及び第２結合タンパク質をコードする遺伝子（図１１ではＤｏｃＣ及びＤｏｃＲ）とで構成されている。第１及び第２結合タンパク質をコードする遺伝子はそれぞれ、第１及び第２の目的タンパク質をコードする遺伝子に連結されている。即ち、図１１では、ＧＦＰの末端にはＤｏｃＣが融合しており（ＧＦＰ－ＤｏｃＣ）、Ｃｈｅｒｒｙの末端にはＤｏｃＲが融合している（ｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲ）。
　そして、図１１（Ｂ）にも示す通り、第１の融合タンパク質をコードする遺伝子と第１の融合タンパク質をコードする遺伝子との間には、リボソーム結合サイト（ＲＢＳ）が含まれることが好ましい。或いは、それらの遺伝子を別々のベクター上に含ませてもよい。本発明の第２の側面で使用できるベクターも、本発明の第１の側面について記載したものである。
　足場タンパク質をコードする遺伝子の発現、並びに、第１の融合タンパク質をコードする遺伝子及び第２の融合タンパク質をコードする遺伝子の発現は、それぞれ、プロモーターによって制御される。
　図１１に示す例では、Ｍｍｓ１３－ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｆｄｉｎの発現は、恒常的に発現するｍｍｓ１６プロモーターによって制御され、ＧＦＰ－ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲの発現は、人工オペロンを構築しテトラサイクリン発現誘導システムであるＰｍｓｐ１（ｔｅｔＯ）によって制御される。
　上述の製造方法の工程（ｉｉ）では、上記構成を有するベクターを磁性細菌に導入し、作製した形質変換体を培養する。
　図１１（Ｂ）に示す例では、発現した足場タンパク質Ｍｍｓ１３－ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎは、ＢａｃＭＰｓ上に局在し、その後、テトラサイクリンの添加により発現が誘導されたＧＦＰ－ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲが、Ｍｍｓ１３－ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎ中のＣｏｈＣ及びＣｏｈＲに結合する。その結果、目的タンパク質であるＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙが、前記Ｍｍｓ１３－ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎを介してＢａｃＭＰｓ上に固定化される。
　本発明の第２の側面にかかる複数タンパク質－磁性粒子の製造方法、並びに、該製造方法で使用されるベクター及び形質転換体によれば、機能性タンパク質の生産及び磁性粒子上への固定化をワンステップで行うことができ、機能性タンパク質の煩雑な精製ステップが必要ない。また、結合タンパク質（足場分子）と結合パートナータンパク質（タグ分子）との組み合わせにより、複数のタンパク質を任意の数で、任意の位置に固定化することができる。更に、タグの役割を果たす結合タンパク質と目的の機能性タンパク質とを遺伝子融合しているため、配向性を維持した状態で固定化することができる。
　これまでに、ｉｎ　ｖｉｖｏでのオルガネラへの機能性タンパク質の固定化において、ペプチドリンカーを介して複数のタンパク質を融合し、単一の融合タンパク質として発現させることで、複数のタンパク質を固定化する方法があったが、構造の複雑なタンパク質の融合や複数のタンパク質の融合によって、凝集塊の形成、ミスフォールディング及びプロテアーゼによる分解が誘発されるという問題があった。本発明の製造方法、並びに、ベクター及び形質転換体によれば、足場タンパク質を介して複数のタンパク質を発現させているため、このような問題を伴うことなく複数のタンパク質を磁性粒子上に固定化することが可能である。
　また、本発明の第２の側面にかかる複数タンパク質－磁性粒子によれば、例えば、一連の代謝反応を行う酵素群を固定化することによる反応効率の向上や、目的タンパク質の安定化を可能にすることが期待される。また、活性化にシャペロンや補因子となる特定のタンパク質が必要な目的タンパク質と、該シャペロンや捕因子とを共局在化させた複合体は、医療分野等での応用が期待される。
　以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
　＜実施例１＞Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｄｏｃｋｉｎｇ法による磁性細菌粒子上でのｓｃＦｖの機能的発現
　（１－１）試料
　発現ベクター構築のためのＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅にはＰｈｕｓｉｏｎ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）を、遺伝子クローニング用の試薬としてＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及びＱｕｉｃｋ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を使用した。ＩｇＧ結合試験にはＡＰ（アルカリホスファターゼ）標識ｄｏｎｋｅｙ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ｎｏｖｕｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ）を、Ａｎｔｉ－β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ　ｓｃＦｖの結合活性評価にはｂｉｏｔｉｎ　β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（ＡＶＩＶＡ　ＳＹＳＴＥＭＳ）及びＡｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。
　遺伝子クローニングの宿主としては、大腸菌株ＴＯＰ１０（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用し、大腸菌形質転換体を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含んだＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で、３７℃で培養した。
　プラスミドベクターは、Ｔ．Ｙｏｓｈｉｎｏ，ａｎｄ　Ｔ．Ｍａｔｓｕｎａｇａ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ａｎｄ　Ｓｔａｂｌｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ　ｏｆ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｎ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ｍｍｓ１３　ａｓ　ａ　Ｎｏｖｅｌ　Ａｎｃｈｏｒ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｓｏｃｉｅｔｙ．（２００６）に記載されたｐＵＭ１３ＺＺを基にして構築した。
　（１－２）Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１由来Ｄｓｂタンパク質ファミリーのｉｎ　ｓｉｌｉｃｏ解析
　Ｍ.．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１の各Ｄｓｂタンパク質の配列はＮＣＢＩのＰｒｏｔｅｉｎ　ｄａｔａｂａｓｅ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein）より検索した。Ｄｓｂタンパク質のシグナルペプチドについては、まずＳｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｗｅｂｓｉｔｅ（http://www.signalpeptide.de/）におけるデータベースを用い、実験的に確定されているか又は配列から予測されているか、或いはデータベース上にないかどうかを調べた。データベース上にないものについては、ＰｒｅｄｉＳｉ（http://www.predisi.de/）を用いてシグナル配列の予測を行った。膜貫通領域については、文献上で予測領域が報告されている大腸菌ＤｓｂＢ以外はＳＯＳＵＩ（http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui）を用いて予測を行った。
　また、Ｄｓｂタンパク質の相同性解析にはＣｌｕｓｔａｌＷ（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/）を使用した。
　ＮＣＢＩのＰｒｏｔｅｉｎ　ｄａｔａｂａｓｅよりＭ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１由来のＤｓｂタンパク質ファミリーを検索した結果、大腸菌と同様、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ及びＤｓｂＧが見つかった。一方、ｏｘｉｄａｓｅ機能を持つＤｓｂＡに相当するタンパク質は見つからなかった。各Ｄｓｂタンパク質について、大腸菌で解析されているモチーフやＳ－Ｓ結合部位を中心に、図６～図１０にまとめた。
　ＤｓｂＡを除いたＭ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１由来の各Ｄｓｂタンパク質は大腸菌とは相同性がほとんどないものの、触媒部位のＣＸＸＣモチーフを有していた。また、ＤｓｂＢは大腸菌と同様に、ＤｓｂＡの酸化に関わるＣＸＸＣモチーフに加え、もう１組のシステインのペアを有すると予想された。膜タンパク質であるＤｓｂＢ及びＤｓｂＤについては、大腸菌と同様、それぞれ４つ及び８つの膜貫通（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ：ＴＭ）領域を有することがＳＯＳＵＩによって予測された。
　解析したＭ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１からはＤｓｂＡが見つからなかったが、機能的にＤｓｂＢのパートナー分子であることから、ＮＣＢＩのデータベースの元となったＭ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１株ではｄｓｂＡ遺伝子を含むゲノムの一部が欠落した可能性が考えられる。あるいは別の可能性として、大腸菌ではＳ－Ｓ結合ｉｓｏｍｅｒａｓｅであるｄｓｂＣ遺伝子の過剰発現がｄｓｂＡ欠損株の機能を補完することから、Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１においてもＤｓｂＣがＤｓｂＡの機能の一部を担っていることも考えられる。
　以上の解析結果から、Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１も大腸菌と同様、ペリプラズムにおけるＳ－Ｓ結合タンパク質の酸化とそれに伴うフォールディング機構を備えていることが示唆された。このことは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｄｏｃｋｉｎｇ法が機能する前提として重要な知見である。
　（１－３）プラスミドの構築と磁性細菌の培養
　プラスミドを、標準的なクローニング技術（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ，２００１）又はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニング技術（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって構築した。
　抗β－ガラクトシダーゼ単鎖抗体（ｓｃＦｖ）とヒトＩｇＧ１の定常領域（Ｆｃ）の融合遺伝子とを発現するベクター（ｐＵＭ１３ＺＺ／ｓｃＦｖＦｃ）（図１（Ｂ）の（ｃ））は、両端にＮｓｉＩ部位を持ち、かつ５’末端に大腸菌ペリプラズムタンパク質であるＤｓｂＣのシグナル配列（ＤｓｂＣｓｓ）およびＦＬＡＧタグをコードする配列を持つように人工合成したｓｃＦｖ－Ｆｃ融合遺伝子を、アンカータンパク質Ｍｍｓ１３をコードするｍｍｓ１３とＰｒｏｔｅｉｎ　ＡのＩｇＧ結合ドメイン（ＺＺ）の融合遺伝子を発現するｐＵＭ１３ＺＺ（図１（Ｂ）の（ａ））のＮｓｉＩ部位（Ｍｍｓ１３－ＺＺ遺伝子の開始コドンに相当）に挿入することで構築した。なお、ｍｍｓ１６プロモーターからｓｃＦｖ１３Ｒ４－Ｆｃ融合遺伝子およびＭｍｓ１３－ＺＺ融合遺伝子までを単一オペロンとして発現させるために、ｓｃＦｖ－Ｆｃ遺伝子の挿入により失われたＳｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列をＭｍｓ１３－ＺＺ遺伝子の上流に付加するよう人工合成遺伝子を設計した。
　一方、コントロールベクターとして従来型のＭｍｓ１３融合タンパク質として発現するＭｍｓ１３－ｓｃＦｖ発現ベクターを構築するため、ＳｓｐＩ消化したｐＵＭ１３ＺＺに対し、両端にＳｓｐＩ部位を持つようにＰＣＲ増幅したｓｃＦｖ遺伝子を挿入した（ｐＵＭ１３ｓｃＦｖ）（図１（Ｂ）の（ｂ））。
　各発現プラスミド（ｐＵＭ１３ＺＺ、ｐＵＭ１３ｓｃＦｖ及びｐＵＭ１３ＺＺ／ｓｃＦｖＦｃ）を、Ｙ．Ｏｋａｍｕｒａ，Ｈ．Ｔａｋｅｙａｍａ，Ｔ．Ｓｅｋｉｎｅ，Ｔ．Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ａ．Ｔ．Ｗａｈｙｕｄｉ，Ｒ．Ｓａｔｏ，ｅｔ　ａｌ．，Ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｎｅｗ　Ｃｒｙｐｔｉｃ－Ｐｌａｓｍｉｄ－Ｂａｓｅｄ　Ｓｈｕｔｔｌｅ　Ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　Ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｎｅｗ　Ｃｒｙｐｔｉｃ－Ｐｌａｓｍｉｄ－Ｂａｓｅｄ　Ｓｈｕｔｔｌｅ　Ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ，Ｓｏｃｉｅｔｙ．（２００３）に記載された方法に従って、エレクトロポレーションによってＭ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１に形質転換した。
　Ｍ.．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１（ＡＴＣＣ　７００２６４）を、Ｔ．Ｍａｔｓｕｎａｇａ，Ｔ．Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｆ．Ｔａｄａｋｏｒｏ，Ｍａｇｎｅｔｉｔｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｂｙ　ａ ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃａｐａｂｌｅ　ｏｆ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ，Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５（１９９１）６５１－６５５に記載される方法従い、２８℃でｍａｇｎｅｔｉｃ　ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｇｒｏｗｔｈ　ｍｅｄｉｕｍ（ＭＳＧＭ）で磁性微好気的に培養し、作製したＭ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１形質転換体は同じ条件下、５μｇ／ｍｌのアンピシリンを用いて培養した。
　（１－４）磁性細菌粒子の調製
　集菌したＡＭＢ－１野生株もしくは各形質転換体（２５０ｍｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ相当）を２．５ｍｌのＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ　Ａ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，５ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に懸濁したのち、リゾチーム及びＰＭＳＦをそれぞれ終濃度０．４ｍｇ／ｍｌおよび２ｍＭとなるよう添加し、室温で５分間静置した。続いて、０．５ｍｌのＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｂ（１．５Ｍ　ＮａＣｌ，０．１Ｍ　ＣａＣｌ２，０．１Ｍ　ＭｇＣｌ２，０．０２ｍｇ/ｍｌ　ＤＮａｓｅ　Ｉ）を加え、室温で５分間静置した。次にＴｒｉｔｏｎＸ－１００を終濃度０．２％加え、室温にて０～１２０分間穏やかに撹拌した後、Ｎｄ－Ｂ磁石を用いて磁性細菌粒子画分を磁気回収した。その後、ＰＢＳ－Ｔで５回洗浄し、精製磁性細菌粒子を得た。
　（１－５）ＩｇＧ捕捉試験
　本発明のコンセプト証明を行うため、Ｍｍｓ１３－ＺＺ融合タンパク質をコードするｐＵＭ１３ＺＺのＡＭＢ－１形質転換体を用いたＩｇＧ結合試験を行った。
　ＡＭＢ－１野生株もしくはｐＵＭ１３ＺＺ形質転換体の細胞ペレット（４５ｍｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ相当）に対し、０から２μｇ/ｍｌのＡＰ標識ｄｏｎｋｅｙ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧを加え、磁性細菌粒子を抽出した。磁性細菌粒子各５０μgを５０μｌのＰＢＳに懸濁したのち、Ｌｕｍｉ－Ｐｈｏｓ５３０を５０μｌ加え、室温で２０分間基質反応を行った後、ルミノメーターを用いて発光強度を測定した。
　その結果、ＩｇＧ－ＡＰの容量依存的な結合が認められ、少なくとも１６ｎｇ／ｍｌの低濃度であっても検出することが可能であることが示された（図２）。Ｄｏｎｋｅｙ　ＩｇＧとＰｒｏｔｅｉｎ　Ａとの結合はヒトＩｇＧ１と比べると弱いものの、この濃度は僅か０．１８μｇ／ｌ　ｃｕｌｔｕｒｅに相当し、機能性分子の発現量が非常に低い場合であっても本システムが機能することが示された。
　（１－６）ウェスタンブロッティング
　ＡＭＢ－１野生株もしくは各ＡＭＢ－１形質転換体より得られた磁性細菌粒子０．１～０．２ｍｇに対し、還元の場合は１０ｍＭ　ＤＴＴおよび５ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１％ＬＤＳ溶液を、非還元の場合は５ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１％ＳＤＳ溶液を１０～２０μｌ加え、９５℃で１５分間熱処理を行い、磁気分離により上清を回収したものを粒子膜画分とした。得られた上清をサンプルバッファーと混合しＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（１０～２０％　ｇｒａｄｉｅｎｔ）にて泳動したのち、Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｂｕｆｆｅｒ（４８ｍＭ　Ｔｒｉｓ，３９ｍＭ　Ｇｌｙｃｉｎｅ，２０％　Ｍｅｔｈａｎｏｌ）を用いたセミドライ法でＰＶＤＦ膜にブロッティングした。抗原抗体反応は２％ＢＳＡを含むＰＢＳ－Ｔ（２％ＢＳＡ／ＰＢＳ－Ｔ）に溶解した１μｇ／ｍｌの１次抗体もしくはＡＰ標識２次抗体を用いて行った。２次反応後、ＰＶＤＦ膜をＰＢＳ－Ｔで３回洗浄したのち、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ－Ｂｌｕｅを用いてＡＰ活性の検出を行った。
　（１－６－１）ｓｃＦｖ－ＦｃとＭｍｓ１３－ＺＺとの結合タイムコースの解析
　次に、モデルタンパク質である変異型ヒト抗β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ　ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質とＭｍｓ１３－ＺＺの共発現ベクター（ｐＵＭ１３／ｓｃＦｖＦｃ）のＡＭＢ－１形質転換体を用いてＦｃとＺＺとの結合に必要な時間を調べた。ここで用いた変異型ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ１３Ｒ４）は、大腸菌の細胞質内において高レベルで可能性発現するように改変されたものである。
　リゾチームおよびＤＮａｓｅ　Ｉで１０分間部分的に破砕処理した細胞に対し、細胞を完全に破砕し可溶化するためにＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を加え、０、１０、３０及び６０分後に磁性細菌粒子を分離した。その結果、予想に反しＦｃとＺＺとの結合の大部分がｔｉｍｅ０で起こり、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００の添加後１０分以降に最大レベルに達した（図３）。これらの結果から、ＡＭＢ－１形質転換体からＦｃ融合タンパク質が結合した磁性細菌粒子を得るためには、細胞を完全に破砕してから１０分後の回収で十分であることが示された。
　（１－６－２）ｓｃＦｖ融合タンパク質の発現解析
　Ｍｍｓ１３－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ各融合遺伝子発現ベクターのＡＭＢ－１形質転換体における発現レベルを確かめるため、リニアエピトープもしくは構造エピトープの抗体をそれぞれ用いたウェスタンブロッティングを行った。
　その結果、Ｍｍｓ１３－ｓｃＦｖは、還元条件および非還元条件で、リニアエピトープ認識の抗ＦＬＡＧ抗体により予想された４１ｋＤａの単一のバンドとして検出されたが、構造エピトープ認識の抗ヒトλ　ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ（ＶＬ－λ）抗体では検出されなかった（図４）。一方、ｓｃＦｖ－Ｆｃの単量体（５２ｋＤａ）は還元条件では抗ＦＬＡＧ抗体で検出されたが、非還元条件では抗ＦＬＡＧ抗体および抗ヒトＶＬ－λの両方で２量体（１０５ｋＤａ）および３量体（１５７ｋＤａ）に相当する２本のバンドとして検出された（図４）。
　これらの結果から、Ｍｍｓ１３－ｓｃＦｖは、細胞質において磁性細菌粒子上で正しくフォールディングされなかったが、一方で、ペリプラズム内に発現したｓｃＦｖ－ＦｃはＦｃのヒンジ領域を介すると思われる２量体、又は、２量体に非共有結合が加わった３量体としてＳ－Ｓ結合を伴い正しくフォールディングされたものと考えられる。なお、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質の多量体形成は他のグループでも報告されている。
　（１－７）β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ結合試験
　磁性粒子上に捕捉されたｓｃＦｖ－Ｆｃが抗原結合能を持っているかどうかを確かめるため、β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅの結合試験を行った。
　ｐＵＭ１３ＺＺ、ｐＵＭ１３ｓｃＦｖもしくはｐＵＭ１３ＺＺ／ｓｃＦｖＦｃを導入したＡＭＢ－１から抽出した磁性細菌粒子各５０μｇに対し、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ－Ｔに懸濁したｂｉｏｔｉｎ－β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（１μｇ／ｍｌ）を加え、室温で１５分静置した。２００μｌのＰＢＳ－Ｔで１回洗浄したのち、Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（１μｇ/ｍｌ）を加え、室温で１５分静置した。２００μｌのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄したのち、５０μｌのＰＢＳに懸濁した。これにＬｕｍｉ－Ｐｈｏｓ５３０を５０μｌ加えて３０分間反応させ、ルミノメーターにより発光強度を測定した。
　ｓｃＦｖ－ＦｃとＭｍｓ１３－ＺＺの共発現形質転換体から抽出した磁性細菌粒子ではビオチンラベルしたβ－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅの結合が検出されたのに対し（図５、ＺＺ＋ｓｃＦｖ－Ｆｃ）、Ｍｍｓ１３－ＺＺ単独もしくはＭｍｓ１３－ｓｃＦｖの形質転換体から抽出した磁性細菌粒子では認められなかった（図５、ＺＺ及びｓｃＦｖ）。このことから、細胞質で発現したＭｍｓ１３－ｓｃＦｖは磁性細菌粒子上で機能発現しなかったのに対し、ペリプラズムに発現したｓｃＦｖ－Ｆｃは磁性細菌粒子上で機能発現していることが示された。
　ここで用いたｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ１３Ｒ４）は、大腸菌の細胞質において高い可溶性とフォールディング能を持つよう機能改変された抗β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ１３）の変異体である。しかしながら、高い可溶性を持つｓｃＦｖ１３Ｒ４であっても従来の直接発現法では磁性細菌粒子上で機能発現しなかった。
　以下で説明する実施例２及び３は、本発明の第２の側面に対応する。
＜実施例２＞Ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｄｏｃｋｉｎｇ法による磁性細菌粒子上でのＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの共局在
　本実施例では、ＢａｃＭＰｓに固定化する複数の目的タンパク質として、ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙを使用した。
　（２－１）試料
　試薬類は全て研究用の市販特級品またはそれに準じたものを用い、試薬等の調製は蒸留水及び蒸留水をＭｉｌｌｉＱ　Ｌａｂ（日本ミリポア）で処理した純水を用いた。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ｍｏｕｓｅ由来ａｎｔｉ－ｃ－ｍｙｃモノクローナル抗体は、ＡＣＲＩＳより購入した。Ｍｏｕｓｅ由来抗ＧＦＰモノクローナル抗体及び、ｍｏｕｓｅ由来抗ｍＣｈｅｒｒｙモノクローナル抗体はＣｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより購入した。Ｇｏａｔ由来ＡＬＰ標識抗ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより購入した。組み換えＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙはＣＥＬＬ　ＢＩＯＬＡＢＳより購入した。プレートリーダーにはＳＨ－９０００（コロナ電気）を用いた。ＡＬＰの発光基質には和光純薬株式会社のルミホス５３０を用いた。
　また、本実施例では融合タンパク質の発現ホストとして磁性細菌Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１株のｍｍｓ１３遺伝子欠損株（Δｍｍｓ１３株）を使用した。プラスミド構築には、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
　プラスミドベクターは、Ｔ．Ｙｏｓｈｉｎｏ，Ａ．Ｓｈｉｍｏｊｏ，Ｙ．Ｍａｅｄａ，Ｔ．Ｍａｔｓｕｎａｇａ．，Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｎ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｉｎ　Ｍａｍｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１，Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０１０）に記載されたｐＵＭｔＯＲ１３ＧＦＰを基にして構築した。
　（２－２）プラスミドの構築と磁性細菌の培養
　図１１（Ａ）に、本実施例で構築したプラスミドコンストラクトｐＵＭｔｅｔＤｏｃ－Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを示す。該プラスミドは、Ｐｍｓｐ１（ｔｅｔＯ）プロモーターの下流にＧＦＰとＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍのＣｅｌＳ由来Ｄｏｃｋｅｒｉｎ（ＤｏｃＣ）の融合タンパク質（ＧＦＰ－ＤｏｃＣ）、ｍＣｈｅｒｒｙとＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓのＳｃａＡ由来Ｄｏｃｋｅｒｉｎ（ＤｏｃＲ）の融合タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲ）、及びＰｍｍｓ１６プロモーターの下流にＭｍｓ１３、ＮＳ　ｌｉｎｋｅｒ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来Ｃｏｈｅｓｉｎ（ＣｏｈＣ）、Ｒ．ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ由来Ｃｏｈｅｓｉｎ（ＣｏｈＲ）、ｃ－ｍｙｃ　ｔａｇの融合タンパク質（Ｍｍｓ１３－ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎ）の遺伝子を含む。
　更に、Ｐｍｍｓ１６プロモーターの下流にＧＦＰ－ＤｏｃＣ、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲの遺伝子を含むｐＵＭｔｅｔＤｏｃ（図示せず）を構築した。
　作製した各プラスミドを用いて、エレクトロポレーション法によりΔｍｍｓ１３株の形質転換を行った。磁性細菌の培養には、ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｇｒｏｗｔｈ　ｍｅｄｉｕｍ（ＭＳＧＭ）を培地として用い、５Ｌの培地に、プレカルチャーを１／１０００植菌し、室温２６～２９℃で静置することで培養を行った。植菌時には、アルゴンガスでバブリング（１５分間）することにより微好気状態を作った。また、形質転換体の培養の際は終濃度５．０μｇ／ｍｌアンピシリンを添加し、対数増殖期中期に終濃度５００ｎｇ／ｍｌ　ＡＴｃを添加し、一晩培養した。ＢａｃＭＰｓの回収は、以下に示す方法で行った。
　（２－３）磁性細菌粒子の調製
　菌体培養後、遠心分離（９０００ｇ、４℃、１０分間）を行い、培養液から磁性細菌を回収した。回収した磁性細菌は、１ｍＭ　ＣａＣｌ２を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）に懸濁し、フレンチプレス（有限会社大岳製作所，５５０１Ｍ）を使用して１８００ｋｇ／ｃｍ２で菌体破砕を行った（３回）。破砕液をガラスの容器に移し、Ｎｄ－Ｆｅ－Ｂ（ネオジウム－鉄－ボロン）磁石を添付することにより、ＢａｃＭＰｓを回収した。上清を取り除き、更に１ｍＭ　ＣａＣｌ２を含むＨＥＰＥＳ緩衝液を加え、磁気分離することでＢａｃＭＰｓの洗浄を行った（１０回）。ＢａｃＭＰｓを適量のＰＢＳに分散させ吸光度（６６０ｎｍ）を測定し、検量線より乾燥重量に換算した。
　（２－４）ウェスタンブロッティング及びＢａｃＭＰｓ上での抗体結合試験
　野生型（ＷＴ）及び各形質転換体の菌体培養液を遠心分離（８０００ｇ、１０分間）し、菌体を回収した。菌体２×１０９　ｃｅｌｌｓに対して１％ＳＤＳ溶液２０μｌを添加し９９℃で３０分間煮沸した。更に、３×ＳＤＳ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒを添加し、９９℃で５分間加熱し、菌体サンプルとした。また、ＷＴ及び各形質転換体から得られたＢａｃＭＰｓ２５～５００μｇに対し、１％ＳＤＳ溶液３０μｌを添加後、超音波により拡散させながら煮沸した（１００℃、３０分間)。遠心分離（１８０００ｇ、５分間）により上清を回収し、３×ＳＤＳ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒをサンプルに１５μｌ加え、９９℃で５分間加熱し、粒子膜画分サンプルとした。コントロールとして、組み換えＧＦＰ及び組み換えｍＣｈｅｒｒｙを用いた。
　各サンプルをアクリルアミド濃度１５％のゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。泳動後のゲルをＰＶＤＦ膜へセミドライ法でブロッティングを行った。ブロッティング後のＰＶＤＦ膜に対し、ＡＬＰ標識抗ｃ－ｍｙｃ抗体（１μｇ／ｍｌ、ＰＢＳＴ）または、一次抗体に、ｍｏｕｓｅ由来抗ＧＦＰモノクローナル抗体（０．０５μｇ／ｍｌ、ＰＢＳＴ）、ｍｏｕｓｅ由来抗ｍＣｈｅｒｒｙモノクローナル抗体（２μｇ／ｍｌ、ＰＢＳＴ）、二次抗体にＧｏａｔ由来ＡＬＰ標識ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ抗体（０．５μｇ／ｍｌ、ＰＢＳＴ）を反応させた（室温、１時間）。ＰＢＳ－Ｔを用いて１０分間の洗浄を３回繰り返した後、基質としてＮＢＴ／ＢＣＩＰ－Ｂｌｕｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを加え発色させた。また、解析には画像解析ソフトＩｍａｇｅ　Ｊを用いてピクセル強度を算出した。
　次に、ＢａｃＭＰｓ上での抗体結合試験を行った。
　ＷＴ及び形質転換体由来ＢａｃＭＰｓ　５０μｇにＡＬＰ標識抗ｃ－ｍｙｃ抗体（１μｇ／ｍｌ、ＰＢＳＴ）、ｍｏｕｓｅ由来抗ＧＦＰモノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ、ＰＢＳＴ）またはｍｏｕｓｅ由来抗ｍＣｈｅｒｒｙモノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ、ＰＢＳＴ）１００μｌを室温で３０分間反応させた。洗浄後、ｍｏｕｓｅ由来抗ＧＦＰモノクローナル抗体またはｍｏｕｓｅ由来抗ｍＣｈｅｒｒｙモノクローナル抗体を反応させたＢａｃＭＰｓは、更に二次抗体としてｇｏａｔ由来ＡＬＰ標識抗ｍｏｕｓｅＩｇＧ抗体（１μｇ／ｍｌ）を反応させた。洗浄後、ＴＢＳ　５０μｌにＢａｃＭＰｓを懸濁した。９６穴プレートに移した後にルミホス５３０を５０μｌ添加し、５分後の発光強度を測定した。
　（２－４－１）形質転換体におけるＭｍｓ１３－ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎの局在確認
　Ｍｍｓ１３－ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎのＣ末端に融合したｃ－ｍｙｃ　ｔａｇに対する抗体を用いて、形質転換体におけるＭｍｓ１３－ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎ（５７ｋＤａ）の発現確認を行った。ウェスタンブロッティングの結果、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ－Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体において、Ｍｍｓ１３－ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎの発現を確認することができた（図１２（Ａ）、レーン１）。
　また、上記ＢａｃＭＰｓへの抗体結合試験により、精製したＢａｃＭＰｓ上でのＭｍｓ１３－ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎの局在を確認した。その結果、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ－Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体から精製したＢａｃＭＰｓにおいて、抗ｃ－ｍｙｃ抗体の結合が確認された（図１２（Ｂ）、レーン１）。
　以上の結果より、形質転換体内で発現したＭｍｓ１３－ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎはＢａｃＭＰｓ膜上に局在し、固定化されていることが示された。
　（２－４－２）形質転換体におけるＧＦＰ－ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲの発現並びにＢａｃＭＰｓ上への結合確認
　形質転換体におけるＧＦＰ－ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲの発現を確認するために、ウェスタンブロッティングによるＧＦＰ－ＤｏｃＣ（３６ｋＤａ）、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲ（３８ｋＤａ）の検出を行った。その結果、形質転換体において、ＧＦＰ－ＤｏｃＣ、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲの発現を確認することができた（図１３（Ａ）及び（Ｂ）、レーン１）。
　また、各形質転換体のＧＦＰ－ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲのバンドを画像解析ソフトＩｍａｇｅ　Ｊを用いて解析し、ピクセル強度の比較を行った。ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ－Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体のＧＦＰ－ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲのピクセル強度を１００％としたとき、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃを保持する形質転換体において、ＧＦＰ－ＤｏｃＣが１８％、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲが６９％であった。よって、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃを保持する形質転換体では、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ－Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体に比べ、ＧＦＰ－ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲの発現量が低下していることが示された。Ｄｏｃｋｅｒｉｎは、Ｃｏｈｅｓｉｎと結合していない状態では構造が不安定となり、細胞内でプロテアーゼにより分解されることが報告されている。従って、Ｍｍｓ１３－ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎを発現しないｐＵＭｔｅｔＤｏｃを保持する形質転換体では、ＧＦＰ－ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲが分解され、発現量が低下したと考えられる。
　また、ＧＦＰ抗体及び抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体を用いたＢａｃＭＰｓ上への抗体結合試験の結果、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ－Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体から精製したＢａｃＭＰｓにおいて、抗ＧＦＰ抗体及び抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体の結合を確認できた（図１４（Ａ）及び（Ｂ）、レーン１）。よって、形質転換体内で発現したＧＦＰ－ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲは、Ｍｍｓ１３－ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎが局在したＢａｃＭＰｓ上に結合していることが示された。
　これらの結果から、足場となるＭｍｓ１３－ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎ及びＧＦＰ－ＤｏｃＣ、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲを共発現させることで、ＢａｃＭＰｓ上にワンステップで２種類のタンパク質を固定化できることが示された。
（２－４－３）ＢａｃＭＰｓ上でのＧＦＰ－ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲの共局在の確認
　足場であるＭｍｓ１３－ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎは、それぞれＤｏｃＣ及びＤｏｃＲと結合するＣｏｈＣ及びＣｏｈＲを１ドメインずつ含んでいる。従って、Ｍｍｓ１３－ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎ上にＧＦＰ－ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲが共局在した場合、ＧＦＰ－ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲの結合量比が１：１になる。
　ＢａｃＭＰｓ上に結合したＧＦＰ－ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲの固定化量を算出するために、精製したＢａｃＭＰｓの膜画分に含まれるＧＦＰ－ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲ量をウェスタンブロッティングにより定量した。濃度既知のＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙを用いて検量線を作成し、Ｉｍａｇｅ　Ｊによる解析を行った（図１５）。
　その結果、ＧＦＰ－ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲの結合量はそれぞれ１ｍｇ　ＢａｃＭＰｓあたり３８０ｎｇ及び５７０ｎｇであった。よってＢａｃＭＰｓ上に同程度のＧＦＰ－ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲが固定化されていることが示された。ｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲの結合量と比較してＧＦＰ－ＤｏｃＣの結合量がわずかに低い理由は、ＧＦＰ－ＤｏｃＣがプロテアーゼによる分解を受けやすいことが影響していることにあると考えられる。
　（２－５）形質転換体の蛍光顕微鏡観察
　形質転換体のＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの蛍光顕微鏡観察を行い、細胞内での局在解析を行った。ＷＴ及び形質転換体の培養液を、２％アガロースゲルを塗布したスライドガラス上に滴下し、観察を行った。ＧＦＰ蛍光の検出にはＧＦＰ検出用フィルター（励起／検出：４６６ｎｍ：５２５ｎｍ）を用いた。ｍＣｈｅｒｒｙの検出にはＣＹ３フィルター（励起／検出：５１３－５５６ｎｍ／５７０－６１３ｎｍ）を用いた。ＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙのＦＲＥＴの観察には励起フィルター（４６０－４９５ｎｍ）及び検出フィルター（５８０ｎｍ）を組み合わせたＦＲＥＴ検出フィルター用いた。
　蛍光観察の結果、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃを保持する形質転換体においてｍＣｈｅｒｒｙの蛍光は検出されたが、ＧＦＰの蛍光は検出されなかった（図１６（Ｂ））。これはＧＦＰ－ＤｏｃＣの発現量が低いことが原因であると考えられる。ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ－Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体においてはＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの蛍光が検出された（図１６（Ｃ））。また、それらの蛍光から、ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙが細胞内で同一の位置に局在していることが示された。
　更に、ＧＥＰの励起波長を照射し、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光波長を検出することでＧＦＰとｍＣｈｅｒｒｙと間のＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）を観察した。ここで、ＦＲＥＴとは、２個の蛍光分子が近接して（１０ｎｍ以下）位置する場合に、一方の分子が吸収したエネルギーが、他方の分子に移動し、蛍光を発する現象である。
　観察の結果、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ－Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体において、ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの局在位置と同様の位置に、ＦＲＥＴによるｍＣｈｅｒｒｙの蛍光が検出された（図１６（Ｃ）の“ＦＲＥＴ”のレーン）。従って、ＧＦＰ－ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲが近接に位置していることが示された。
　これらの結果から、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ－Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体において、菌体内で発現したＧＦＰ－ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＤｏｃＲは、ＢａｃＭＰｓ上に局在したＭｍｓ１３－ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎに結合し共局在していることが示された。
　本実施例では、ｃｏｈｅｓｉｎドメインを有するｍｉｎｉｓｃａｆｏｌｌｄｉｎ及びｄｏｃｋｅｒｉｎを融合した蛍光タンパク質を磁性細菌ＡＭＢ－１において共発現することで、ＢａｃＭＰｓ上に共局在できることが示された。本手法は、タンパク質の精製や固定化のために煩雑な操作を行う必要が無く、非常に簡便にタンパク質－磁性粒子複合体を作製することができる。
＜実施例３＞Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｄｏｃｋｉｎｇ法によるＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　ＩＩ及びシャペロン様タンパク質ＨＬＡ－ＤＲの磁性粒子上への共局在によるＭＨＣの機能発現
　本実施例では、ＢａｃＭＰｓに固定化する複数の目的タンパク質として、ｅＭＨＣ　ＩＩ及びＨＬＡ－ＤＭとを使用した。
　（３－１）試料
　試薬類は全て研究用の市販特級品またはそれに準じたものを用い、試薬等の調製は蒸留水及び蒸留水をＭｉｌｌｉＱ　Ｌａｂ（日本ミリポア）で処理した純水を用いた。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体はシグマアルドリッチジャパンより購入した。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗ＨＡ　ｔａｇモノクローナル抗体はａｂｃａｍより購入した。Ｎ末端ビオチン標識ＨＡ３０６－３１８（ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ）は株式会社ベックスより購入した。ＡＬＰ標識ストレプトアビジンはＲｏｃｈｅより購入した。プレートリーダーにはＳＨ－９０００（コロナ電気）を用いた。ＡＬＰの発光基質には和光純薬株式会社のルミホス５３０を用いた。
　また、本実施例では融合タンパク質の発現ホストとして磁性細菌Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１株のｍｍｓ１３遺伝子欠損株（Δｍｍｓ１３株）を使用した。プラスミド構築には、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用した。
　プラスミドベクターは、Ｔ．Ｙｏｓｈｉｎｏ，Ａ．Ｓｈｉｍｏｊｏ，Ｙ．Ｍａｅｄａ，Ｔ．Ｍａｔｓｕｎａｇａ．，Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｎ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｉｎ　Ｍａｍｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ　ＡＭＢ－１，Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０１０）に記載されたｐＵＭｔＯＲ１３ＧＦＰを基にして構築した。
　（３－２）プラスミドの構築と磁性細菌の培養
　図１７（Ａ）に、本実施例で構築したベクターコンストラクトｐＵＭＭＨＣ　ＩＩ－ＤＭＤｏｃ－Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを示す。
　該ベクターは、Ｐｍｓｐ１（ｔｅｔＯ）プロモーターの下流にＭＨＣ　ＩＩの細胞外ドメイン、ＦＬＡＧ　ｔａｇ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍのＣｅｌＳ由来Ｄｏｃｋｅｒｉｎ（ＤｏｃＣ）の融合タンパク質（ＭＨＣ　ＩＩ－ＤｏｃＣ）、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＡ－ｔａｇ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓのＳｃａＡ由来Ｄｏｃｋｅｒｉｎ（ＤｏｃＲ）の融合タンパク質（ＤＭ－ＤｏｃＲ）、及びＰｍｍｓ１６プロモーターの下流にＭｍｓ１３、ＮＳ　ｌｉｎｋｅｒ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来Ｃｏｈｅｓｉｎ（ＣｏｈＣ）、Ｒ．ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ由来Ｃｏｈｅｓｉｎ（ＣｏｈＲ）、ｃ－ｍｙｃ　ｔａｇの融合タンパク質（Ｍｍｓ１３－ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎ）の遺伝子を含む。
　更に、Ｍｍｓ１３、ＮＳ　ｌｉｎｋｅｒ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来Ｃｏｈｅｓｉｎ（ＣｏｈＣ）、ｃ－ｍｙｃ　ｔａｇの融合タンパク質（Ｍｍｓ１３－ｃｏｈＣ）の遺伝子を含むベクターコンストラクトｐＵＭＭＨＣ　ＩＩ－ＤＭＤｏｃ－Ｍ１３ｃｏｈＣ（図示せず）を構築した。
　作製した各プラスミドを用いて、エレクトロポレーション法によりΔｍｍｓ１３株の形質転換を行った。
　また、磁性細菌の培養には、ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｇｒｏｗｔｈ　ｍｅｄｉｕｍ（ＭＳＧＭ）を培地として用い、５Ｌの培地に、プレカルチャーを１／１０００植菌し、室温（２６～２９℃）で静置することで培養を行った。植菌時には、アルゴンガスでバブリング（１５分間）することにより微好気状態を作った。また、形質転換体の培養の際は終濃度５．０μｇ／ｍｌアンピシリンを添加し、対数増殖期中期に終濃度５００ｎｇ/ｍｌ　ＡＴｃを添加し、一晩培養した。
　（３－３）磁性細菌粒子の調製
　磁性細菌粒子の調製は、上記実施例２の（２－３）で説明したのと同様の方法で行った。
　（３－４）ウェスタンブロッティング及びＢａｃＭＰｓ上での抗体結合試験
　ＷＴ及び各形質転換体の菌体培養液を遠心分離（８０００ｇ、１０分間）し、菌体を回収した。菌体２×１０９ｃｅｌｌｓに対して１％ＳＤＳ溶液２０μｌを添加し９９℃で３０分間煮沸した。更に、３×ＳＤＳ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒを添加し９９℃で５分間加熱し、菌体サンプルとした。ＷＴ及び各形質転換体から得られたＢａｃＭＰｓ２００μｇに対し、１％ＳＤＳ溶液３０μｌを添加後、超音波により拡散させながら煮沸した（１００℃、３０分間）。遠心分離（１８０００ｇ、５分間）により上清を回収し、３×ＳＤＳ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒをサンプルに１５　μｌ加えて９９℃で５分間加熱し、粒子膜画分サンプルとした。
　各サンプルを、アクリルアミド濃度１２．５％のゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。泳動後のゲルをＰＶＤＦ膜へセミドライ法でブロッティングを行った。ブロッティング後のＰＶＤＦ膜に対し、ＡＬＰ標識抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ、ＰＢＳＴ）またはＡＬＰ標識抗ＨＡ　ｔａｇモノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ、ＰＢＳＴ）を反応させた（室温、１時間）。ＰＢＳ－Ｔを用いて１０分間の洗浄を３回繰り返した後、基質としてＮＢＴ／ＢＣＩＰ－Ｂｌｕｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｓｕｂｓｔａｔｅを加え、発色させた。
　次に、形質転換体由来ＢａｃＭＰｓ上に、目的タンパク質であるｅＭＨＣ　ＩＩ－ＤｏｃＣ及びＤＭ－ＤｏｃＲが結合していることを確認するため、抗体結合試験を行った。
　ＷＴ及び形質転換体由来ＢａｃＭＰｓ５０μｇにＡＬＰ標識抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（１μｇ／ｍＬ、ＰＢＳＴ）、ＡＬＰ標識抗ＨＡ　ｔａｇモノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ、ＰＢＳＴ）１００μＬを、室温で３０分間反応させた。洗浄後、ＴＢＳ５０μｌにＢａｃＭＰｓを懸濁した。９６穴プレートに移した後、ルミホス５３０を５０μｌ添加し、５分後の発光強度を測定した。
　（３－４－１）ｅＭＨＣ　ＩＩ－ＤｏｃＣ及びＤＭ－ＤｏｃＲの発現確認
　図１７（Ａ）に示すように、プラスミドｐＵＭＭＨＣ　ＩＩ－ＤＭＤｏｃ－Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆは、ｅＭＨＣ－ＤｏｃＣ及びＤＭ－ＤｏｃＲはリボソーム結合サイト（ＲＢＳ）を介してオペロンを構成している。また、ｐＵＭＭＨＣ　ＩＩ－ＤＭＤｏｃ－Ｍ１３ｃｏｈＣ（図示せず）も同様の構成を有する。
　ウェスタンブロッティングの結果から、ｐＵＭＭＨＣ　ＩＩ－ＤＭＤｏｃ－Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体、及び、ｐＵＭＭＨＣ　ＩＩ－ＤＭＤｏｃ－Ｍ１３ｃｏｈＣを保持する形質転換体おいて、ｅＭＨＣ－ＤｏｃＣ及びＤＭ－ＤｏｃＲの発現を確認した。ここでは、ｅＭＨＣ－ＤｏｃＣに導入したＦＬＡＧ　ｔａｇ及びＤＭ－ＤｏｃＲに導入したＨＡ　ｔａｇに対する抗体を用いて検出を行った。
　（３－４－２）ｅＭＨＣ　ＩＩ－ＤｏｃＣ及びＤＭ－ＤｏｃＲのＢａｃＭＰｓ上への結合確認
　形質転換体由来ＢａｃＭＰｓ上にｅＭＨＣ　ＩＩ－ＤｏｃＣ及びＤＭ－ＤｏｃＲが結合していることを確認するために、抗体結合試験を行った。ｐＵＭＭＨＣ　ＩＩ－ＤＭＤｏｃ－Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体由来ＢａｃＭＰｓにおいては、ｅＭＨＣ　ＩＩ－ＤｏｃＣ及びＤＭ－ＤｏｃＲの結合を確認することができた。一方、ｐＵＭＭＨＣ　Ｉ－ＤＭＤｏｃ－Ｍ１３ｃｏｈＣを保持する形質転換体由来ＢａｃＭＰｓにおいては、ｅＭＨＣ　ＩＩ－ＤｏｃＣの結合が確認できた。
　（３－５）ペプチド結合アッセイ及びｅＭＨＣ　ＩＩ－ＤｏｃＣのペプチド結合能の評価
　ペプチド結合アッセイを行い、ｅＭＨＣ　ＩＩ－ＤｏｃＣのペプチド結合能の評価を行った。具体的には、ｅＭＨＣ　ＩＩ－ＤｏｃＣ及びＤＭ－ＤｏｃＲ結合ＢａｃＭＰｓ（ｅＭＨＣ　ＩＩ/ＤＭ－ＢａｃＭＰｓ）及びｅＭＨＣ　ＩＩ－ＤｏｃＣ結合ＢａｃＭＰｓ（ｅＭＨＣ　ＩＩ－ＢａｃＭＰｓ）に対して、インフルエンザヘマグルチニン由来抗原ペプチド（ＨＡ３０６－３１８）の結合能を評価した。
　ペプチドは、ＤＭＳＯを用いて５ｍｇ／ｍｌに調整し、使用するまで－２０℃で保存した。ＷＴ及び各形質転換体から得られたＢａｃＭＰｓ５０μｇに０．１～１０μＭ（ＰＢＳＴ）に調整したビオチン標識ＨＡ３０６－３１８１００μｌを加え、３７℃で３時間反応させた。その後１００μｌ　ＰＢＳを用いて３回洗浄を行い、ＡＬＰ標識ストレプトアビジン（ＡＬＰ－ＳＡ：０．５Ｕ/ｍｌ、ＰＢＳＴ）１００μＬを加え、３０分間室温で反応させた。その後、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）１００μｌを用いて２回洗浄を行い、ＴＢＳ　５０μｌに懸濁したものをサンプルとして使用した。９６－ｗｅｌｌ　ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒｐｌａｔｅに移し、ルミホス５３０（５０μｌ）を加え、５分間室温で反応させた後、発光プレートリーダーを用いて発光強度を測定した。
　その結果、ｅＭＨＣ　ＩＩ／ＤＭ－ＢａｃＭＰｓでは抗原ペプチドの結合が確認されたが、一方、ＤＭ－ＤｏｃＲが共局在していないｅＭＨＣ　ＩＩ－ＢａｃＭＰｓには、抗原ペプチドは結合しなかった。
　更に、ＨＡ３０６－３１８濃度、反応時間のカイネティクスを解析した。
　本実施例では、磁性細菌内でｅＭＨＣ　ＩＩ及びシャペロンであるＨＬＡ－ＤＭを共局在させることにより、従来生産が困難であったｅＭＨＣ　ＩＩの調製に成功した。
　既に述べた通り、ＭＨＣ　ＩＩ分子は、ヒトの免疫機構を担う重要なタンパク質であり、種々の疾患及び病原体由来の抗原タンパク質の分解産物（抗原ペプチド）と結合し、抗原ペプチド－ＭＨＣ　ＩＩ複合体（ｐＭＨＣ　ＩＩ）を形成する。それ故、ＭＨＣ　ＩＩのペプチド結合能の解析、抗原ペプチドの同定は重要である。
　抗原ペプチドと結合していない状態のＭＨＣ　ＩＩ（ｅＭＨＣ　ＩＩ）は構造が不安定であり、凝集塊を形成する。そのため、組み換えＭＨＣ　ＩＩは、例えば、α鎖及びβ鎖を封入体として別々に生産した後、抗原ペプチドと混合しリホールディングすることにより作製されており、この方法では、煩雑な操作が必要である。また、ＵＶ分解性抗原ペプチドを導入したｐＭＨＣ　ＩＩにＨＬＡ－ＤＭを添加し、ＵＶを照射することでペプチド結合能を有したｅＭＨＣ　ＩＩを作製されることが報告されているが、この系においてペプチド結合能を有したｅＭＨＣ　ＩＩを作製するためには、高濃度のＨＬＡ－ＤＭが必要になる。即ち、従来、ＭＨＣ　ＩＩの、目的の抗原ペプチド候補とのペプチド結合能を評価するためには、煩雑な実験ステップを必要とするか、又は、非常に高濃度の試料を必要としていた。加えて、親和性の高い抗原ペプチドを用いてｐＭＨＣ　ＩＩを作製しなければ充分な安定性が得られなかった。このような、組み換えＭＨＣ　ＩＩの作製の煩雑さ及び困難さがＭＨＣ　ＩＩ研究のボトルネックとなっていた。
　しかし、本実施例では、磁性細菌内でｅＭＨＣ　ＩＩ及びシャペロンであるＨＬＡ－ＤＭを共局在させることで、従来生産が困難であったｅＭＨＣ　ＩＩを簡便且つ効率的に、またその機能を維持した状態で調製することができた。本実施例においては、磁性細菌の菌体内という限られた空間内でｅＭＨＣ　ＩＩとＨＬＡ－ＤＭとを共発現させ、且つ、足場タンパク質を介してこれらを共局在させ、ｅＭＨＣ　ＩＩとＨＬＡ－ＤＭを近接した位置に配置できることから、ペプチド結合能を保持したｅＭＨＣ　ＩＩを効率的に生産することが可能である。更に、ｅＭＨＣ　ＩＩ及びＨＬＡ－ＤＭはＢａｃＭｐｓ上に固定化されていることから、外部磁場を用いて簡便に回収することが出来るため、抗原ペプチドスクリーニング技術の簡便化や応用が期待できる。

Claims (11)

  1. 　グラム陰性磁性細菌における、ジスルフィド結合タンパク質と磁性粒子との複合体の製造方法であって、
    　（ｉ）前記細菌中で、
    　（ａ）結合タンパク質に融合したジスルフィド結合タンパク質を含んだ第１の融合タンパク質、及び
    　（ｂ）磁性細菌粒子に結合又は一体化され得るタンパク質に融合した結合パートナータンパク質を含んだ第２の融合タンパク質
    を共発現させる共発現工程であって、前記第１の融合タンパク質の発現が前記細菌のペリプラズムへと誘導され、前記第２の融合タンパク質の発現が前記細菌の細胞質へと誘導される工程と；
    　（ｉｉ）前記第１及び第２の融合タンパク質を生産するのに充分な条件下で前記工程（ｉ）の細菌を培養する培養工程と；
    　（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）の細菌の細胞膜を破壊する細胞膜破壊工程であって、前記ジスルフィド結合タンパク質と磁性細菌粒子との複合体が形成される工程と；
    を含む、製造方法。
  2. 　（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）の前記複合体を前記破壊された細胞から単離する単離工程を更に含む請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記複合体から、前記ジスルフィド結合タンパク質を回収する回収工程を更に含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　前記結合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃドメインである請求項１～３のいずれかに記載の製造方法。
  5. 　前記結合パートナータンパク質がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ由来のタンパク質ＡのＺＺドメインである、請求項１～４のいずれかに記載の製造方法。
  6. 　前記ジスルフィド結合したタンパク質が単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１～５のいずれかに記載の製造方法。
  7. 　前記磁性細菌粒子に結合又は一体化され得るタンパク質が、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｌｌｕｍ　ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ由来のＭｍｓ１３である、請求項１～６のいずれかに記載の製造方法。
  8. 　磁性粒子と；
    　磁性粒子に結合又は一体化され得るタンパク質に融合し、且つ、第１の結合パートナータンパク質と第２の結合パートナータンパク質とを含んだ足場タンパク質と；
    　第１の結合タンパク質と、該第１の結合タンパク質に融合した第１の目的タンパク質とを含んだ第１の融合タンパク質と；
    　第２の結合タンパク質と、該第２の結合タンパク質に融合した第２の目的タンパク質とを含んだ第２の融合タンパク質と；
    を含んだ、タンパク質と磁性粒子との複合体であって、
    　前記第１の目的タンパク質は、前記第１の結合タンパク質と前記第１の結合パートナータンパク質との結合を介して前記磁性粒子上に固定化され、
    　前記第２の目的タンパク質は、前記第２の結合タンパク質と前記第２の結合パートナータンパク質との結合を介して前記磁性粒子上に固定化されている、複合体。
  9. 　前記第１の目的タンパク質及び前記第２の目的タンパク質のうち一方のタンパク質の機能は、他方のタンパク質の存在により発現し、
    　前記足場タンパク質が、当該第１及び第２の結合パートナーを連結するペプチドリンカーを更に含む、請求項８に記載の複合体。
  10. 　グラム陰性磁性細菌における、複数タンパク質と磁性粒子との複合体の製造方法であって、
    　（ｉ）前記細菌中で、
    　（ａ）第１の結合タンパク質と該第１の結合タンパク質に融合した第１の目的タンパク質とを含んだ第１の融合タンパク質、及び、第２の結合タンパク質と該第２の結合タンパク質に融合した第２の目的タンパク質とを含んだ第２の融合タンパク質と、
    　（ｂ）磁性細菌粒子に結合又は一体化され得るタンパク質に融合し、且つ、第１の結合パートナータンパク質と第２の結合パートナータンパク質とを含んだ足場タンパク質と
    を共発現させる共発現工程と；
    　（ｉｉ）前記第１及び第２の目的タンパク質、並びに、前記足場タンパク質を生産するのに充分な条件下で前記工程（ｉ）の細菌を培養する培養工程であって、前記第１及び第２の目的タンパク質と磁性粒子との複合体が形成される工程と；
    を含む、製造方法。
  11. 　（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）の細菌の細胞膜を破壊する細胞膜破壊工程と；
    　（ｉｖ）前記工程（ｉｉ）で形成された前記複合体を、前記工程（ｉｉｉ）で破壊された細胞から単離する単離工程と；
    を更に含む、請求項１０に記載の製造方法。
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