CN110823654A - 一种采用流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的方法、解离液及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及猕猴桃育种技术领域，具体涉及一种适用于流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的解离液，解离液中无机盐的摩尔浓度为0.8~1.2mol/L，解离液中缓冲剂的摩尔浓度为3~10mmol/L，解离液中聚乙烯吡咯烷酮的质量分数为0.8~1.2%，解离液中聚乙二醇辛基苯基醚的质量分数为0.2~0.3%；所述解离液的pH为7.0~8.0。制备方法为将所有物质混溶后低温保存。采用流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的方法包括：将猕猴桃细胞在上述解离液中解离、多次离心后进行染色，即可上机检测。本发明解决了现有技术中没有针对猕猴桃倍性鉴定的解离液的问题，提供的解离液适用于猕猴桃样本的细胞提取，药品配制简单，适用于批量检测。
Description
技术领域
本发明涉及猕猴桃育种技术领域，具体涉及一种采用流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的方法、解离液及制备方法。
背景技术
植物细胞核DNA含量和倍性水平对于研究生物的多样性至关重要，并可广泛应用于基础植物学和应用植物学的多个研究领域。这些研究的基础是C值，即真核生物细胞中单倍体细胞核所含DNA总量。流式细胞仪基于流式细胞术(FCM)，可以快速准确地测定植物样本G1期细胞核DNA含量，反映细胞倍性。流式细胞术广泛应用于植物遗传育种、植物分类学、逆境植物学、植物病理学等多个研究领域。
猕猴桃(kiwifruit)是猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia Lindl)的多年生藤本植物。猕猴桃属植物的种间和种内均具有丰富的倍性变异，利用多倍体的巨型性、抗逆性、抗病虫害及次生代谢产物增加的特性，改善性状，可得到优质、高产、抗逆性强的猕猴桃新品种，染色体组多倍化是猕猴桃育种研究的手段之一。所以，从细胞学层面上揭示不同基因组类型猕猴桃种质资源的真实倍性，可以为猕猴桃种质的基因组学、物种分类以及种群进化等相关研究提供参考依据。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种采用流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的方法、解离液及制备方法，解决了现有技术中没有针对猕猴桃倍性鉴定的解离液的问题。本发明的解离液适用于猕猴桃样本的细胞提取，尤其是针对多糖多酚的猕猴桃样品，药品配制简单，解离液中无有毒有害化学药品，避免堵管现象，适用于大批量猕猴桃样本倍性检测。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种适用于流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的解离液，所述解离液中无机盐的摩尔浓度为0.8～1.2mol/L，所述解离液中缓冲剂的摩尔浓度为3～10mmol/L，所述解离液中聚乙烯吡咯烷酮的质量分数为0.8～1.2％，所述解离液中聚乙二醇辛基苯基醚的质量分数为0.2～0.3％；所述解离液的pH为7.0～8.0。
因猕猴桃叶片组织中酚类、糖类糖物质含量较高，细胞解离液较为黏稠，在解离液中加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP-30)有利于帮助去黏，减少杂峰，避免了上机堵塞机器。加入聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)可以增加细胞通透性，快速裂解细胞组织。加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)，作为缓冲剂，使细胞组织维持稳定的pH范围。无机盐是电解质，有利于协调细胞膜内外离子平衡。此解离液适用于猕猴桃样本的细胞提取，药品配制简单，解离液中无有毒有害化学药品，避免堵管现象，适用于大批量猕猴桃样本倍性检测。
进一步优选地，所述解离液的pH为7.5。
解离液的pH维持在7.5左右，对细胞核的损伤最小。
进一步地，所述无机盐中氯化钾和硫酸镁的摩尔比为1：(18～22)；所述缓冲剂为羟乙基哌嗪乙硫磺酸。
无机盐是电解质，有利于协调细胞膜内外离子平衡。羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)作为缓冲剂可以使细胞组织维持稳定的pH范围。
进一步优选地，所述无机盐中氯化钾和硫酸镁的摩尔比为1：20；所述解离液中羟乙基哌嗪乙硫磺酸的摩尔浓度为5mmol/L。
进一步地，所述解离液中聚乙烯吡咯烷酮的质量分数为0.95～1.05％，所述解离液中聚乙二醇辛基苯基醚的质量分数为0.24～0.26％。
进一步优选地，所述解离液中聚乙烯吡咯烷酮的质量分数为1.0％，所述解离液中聚乙二醇辛基苯基醚的质量分数为0.25％。
上述适用于流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的解离液的制备方法，包括：将无机盐、缓冲剂、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇辛基苯基醚按照上述配比称量后加入容器中，加入双蒸水定容，再用氢氧化钠溶液调节pH至7.0～8.0，在4℃下保存即可。
解离液的制备过程简单，解离液中无有毒有害化学药品，避免堵管现象，适用于大批量猕猴桃样本倍性检测。
一种采用流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的方法，包括如下步骤：
步骤一、将猕猴桃叶子放入2～6℃的上述解离液中，再将猕猴桃叶子切成丝状，解离4～6min，得到第一次解离样品待用；
步骤二、将第一次解离样品用40μm的细胞筛网过滤，将滤液在2～6℃下进行第一次离心，弃上清液后补加上述解离液进行第二次离心，弃上清液得到第二次解离样品待用；
步骤三、向第二次解离样品中加入染色液，在10～30℃下染色10～20min，将染色后的样品转移到流式细胞仪的上样管，上机检测即可。
采用流式细胞仪鉴定植物倍性通常取少量植物样品组织，使用标准剃须刀片将植物组织切碎并浸泡于解离液中，过滤含植物细胞核的匀浆以去除大的碎片。
采用流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性是将猕猴桃叶子在特定的解离液(上述针对猕猴桃倍性鉴定的解离液)中使得猕猴桃细胞破碎，分散细胞器，进而解离出细胞核，同时上述解离液还可防止细胞核间相互粘连。用DNA特异性荧光染料(PI或DAPI)进行标记，然后在流式细胞仪上获取样品。样品细胞在一定压力下逐个通过喷嘴，进入流式照射室，细胞核所带的荧光素被激发，发射出荧光，根据荧光的发射波长，选择相应的荧光通道进行检测。最后，光信号再转化成电信号，经数据处理输入电脑，呈现出点图和峰图两种流式图谱，峰图纵坐标为粒子数，横坐标为荧光强度。由于细胞核G1期的DNA含量反映这个细胞的倍性，因此，根据每个细胞核的荧光强度来计算DNA含量，获取细胞的倍性。通过与已知标准品比较，可以用荧光强度换算出DNA含量的绝对值。
进一步优选地，所述步骤一中解离的温度为4℃，解离的时间为5min；所述步骤一中解离液和猕猴桃叶子的质量比为1：4。
进一步优选地，所述步骤二中第一次离心的温度为4℃，第一次离心的时间为5min，第一次离心的搅拌速率为1000r/min；所述步骤二中第二次离心的温度为4℃，第二次离心的时间为5min，第二次离心的搅拌速率为1000r/min。
进一步优选地，所述步骤三中染色液为PI/Rase染色液。
本发明的有益效果是：在解离液中加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP-30)有利于帮助去黏，减少杂峰，避免了上机堵塞机器。加入聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)可以增加细胞通透性，快速裂解细胞组织。加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)，作为缓冲剂，使细胞组织维持稳定的pH范围。无机盐是电解质，有利于协调细胞膜内外离子平衡。此解离液适用于猕猴桃样本的细胞提取，药品配制简单，解离液中无有毒有害化学药品，避免堵管现象，适用于大批量猕猴桃样本倍性检测。
附图说明
图1显示为实施例1中猕猴桃二倍体流式细胞仪检测的荧光信号图。
图2显示为实施例1中猕猴桃二倍体流式细胞仪检测的峰图。
图3显示为实施例1中猕猴桃四倍体流式细胞仪检测的荧光信号图。
图4显示为实施例1中猕猴桃四倍体流式细胞仪检测的峰图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1
一种适用于流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的解离液，包括如表1所示的组分以及相对应的浓度：
表格1
上述适用于流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的解离液的制备方法，包括：依次称取3.725g氯化钾(KCl)、2.46g的七水合硫酸镁(MgSO4·7H2O)、1.19g羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、10.00g聚乙烯吡咯烷酮(PVP-30)和2.5mL聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，依次少量多次搅拌溶解，定容至1000mL，用NaOH溶液调节pH至7.5，4℃保存。
采用流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性所需的材料与试剂
枪头、刀片(蓝吉列)、40μm细胞筛网(硕华货号：251100)、解离液、PI染液、滤纸、一次性手套、培养皿、1.5mL离心管、冰盒
采用流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性所需的仪器设备
流式细胞仪(BD)、移液枪、制冰机、低温离心机
采用流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性所需的操作步骤
步骤一、称取0.5g新鲜的猕猴桃嫩叶，纯水洗净表面尘土，滤纸吸干水分后置于预冷的培养皿内，加入2mL预冷的解离液，用一次性的锋利刀片快速切成细丝状，解离5min，整个过程保证样品浸没在解离液中，得到第一次解离样品待用；
步骤二、将第一次解离样品用40μm的细胞筛网过滤到1.5mL离心管中，将滤液在4℃下进行第一次离心，第一次离心的时间为5min，第一次离心的搅拌速率为1000r/min，弃上清液后补加1ml上述解离液，轻轻重悬细胞后进行第二次离心，第二次离心的温度为4℃，第二次离心的时间为5min，第二次离心的搅拌速率为1000r/min，弃上清液得到第二次解离样品待用；
步骤三、向第二次解离样品中加入500μL的PI/Rase染色液，在20℃下染色15min，将染色后的样品转移到流式细胞仪的上样管，上机检测即可。
PI/Rase染色液：BD Pharmingen公司的PI/RNase Staining Buffer Solution100mL(货号：550825)，工作浓度为0.5mL/mL。
通过上述方法检测的信号较为集中，峰图较好，杂峰少。其中图1的P2框中显示的是实施例1中猕猴桃二倍体流式细胞仪检测的荧光信号图，其中横坐标PI-W是PI荧光峰宽度(区分单细胞和粘连细胞)，纵坐标PI-A是PI荧光峰面积(反应细胞DNA含量)。图2显示为实施例1中猕猴桃二倍体流式细胞仪检测的峰图，其中横坐标PI-A是PI荧光峰面积(反应细胞DNA含量)，纵坐标Count是表达PI荧光的细胞数量。图3的P2框中显示的是实施例1中猕猴桃四倍体流式细胞仪检测的荧光信号图其中横坐标PI-W是PI荧光峰宽度(区分单细胞和粘连细胞)，纵坐标PI-A是PI荧光峰宽度(反应细胞DNA含量)。图4显示为实施例1中猕猴桃四倍体流式细胞仪检测的峰图，其中横坐标PI-A是PI荧光峰面积(反应细胞DNA含量)，纵坐标Count是表达PI荧光的细胞数量。
实施例2
一种适用于流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的解离液，包括如表2所示的组分以及相对应的浓度：
表格2
上述适用于流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的解离液的制备方法与实施例1相同，也是定容至1000mL，用NaOH溶液调节pH至7.3，4℃保存。
采用流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性所需的材料与试剂
枪头、刀片(蓝吉列)、40μm细胞筛网(硕华货号：251100)、解离液、PI染液、滤纸、一次性手套、培养皿、1.5mL离心管、冰盒
采用流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性所需的仪器设备
流式细胞仪(BD)、移液枪、制冰机、低温离心机
采用流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性所需的操作步骤
步骤一、称取0.6g新鲜的猕猴桃嫩叶，纯水洗净表面尘土，滤纸吸干水分后置于预冷的培养皿内，加入2mL预冷的解离液，用一次性的锋利刀片快速切成细丝状，解离5min，整个过程保证样品浸没在解离液中，得到第一次解离样品待用；
步骤二、将第一次解离样品用40μm的细胞筛网过滤到1.5mL离心管中，将滤液在4℃下进行第一次离心，第一次离心的时间为6min，第一次离心的搅拌速率为900r/min，弃上清液后补加1ml上述解离液，轻轻重悬细胞后进行第二次离心，第二次离心的温度为4℃，第二次离心的时间为6min，第二次离心的搅拌速率为900r/min，弃上清液得到第二次解离样品待用；
步骤三、向第二次解离样品中加入500μL的PI/Rase染色液，在20℃下染色15min，将染色后的样品转移到流式细胞仪的上样管，上机检测即可。
PI/Rase染色液：BD Pharmingen公司的PI/RNase Staining Buffer Solution100mL(货号：550825)，工作浓度为0.5mL/mL。
通过上述方法检测的信号较为集中，峰图较好，杂峰少。
实施例3
一种适用于流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的解离液，包括如表3所示的组分以及相对应的浓度：
表格3
上述适用于流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的解离液的制备方法与实施例1相同，也是定容至1000mL，用NaOH溶液调节pH至7.2，4℃保存。
采用流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性所需的材料与试剂
枪头、刀片(蓝吉列)、40μm细胞筛网(硕华货号：251100)、解离液、PI染液、滤纸、一次性手套、培养皿、1.5mL离心管、冰盒
采用流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性所需的仪器设备
流式细胞仪(BD)、移液枪、制冰机、低温离心机
采用流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性所需的操作步骤
步骤一、称取0.6g新鲜的猕猴桃嫩叶，纯水洗净表面尘土，滤纸吸干水分后置于预冷的培养皿内，加入2mL预冷的解离液，用一次性的锋利刀片快速切成细丝状，解离5min，整个过程保证样品浸没在解离液中，得到第一次解离样品待用；
步骤二、将第一次解离样品用40μm的细胞筛网过滤到1.5mL离心管中，将滤液在4℃下进行第一次离心，第一次离心的时间为6min，第一次离心的搅拌速率为1100r/min，弃上清液后补加1ml上述解离液，轻轻重悬细胞后进行第二次离心，第二次离心的温度为4℃，第二次离心的时间为6min，第二次离心的搅拌速率为1100r/min，弃上清液得到第二次解离样品待用；
步骤三、向第二次解离样品中加入500μL的PI/Rase染色液，在15℃下染色20min，将染色后的样品转移到流式细胞仪的上样管，上机检测即可。
PI/Rase染色液：BD Pharmingen公司的PI/RNase Staining Buffer Solution100mL(货号：550825)，工作浓度为0.5mL/mL。
通过上述方法检测的信号较为集中，峰图较好，杂峰少。
实施例4
一种适用于流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的解离液，包括如表4所示的组分以及相对应的浓度：
表格4
上述适用于流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的解离液的制备方法与实施例1相同，也是定容至1000mL，用NaOH溶液调节pH至7.5，4℃保存。
采用流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性所需的材料与试剂
枪头、刀片(蓝吉列)、40μm细胞筛网(硕华货号：251100)、解离液、PI染液、滤纸、一次性手套、培养皿、1.5mL离心管、冰盒
采用流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性所需的仪器设备
流式细胞仪(BD)、移液枪、制冰机、低温离心机
采用流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性所需的操作步骤
步骤一、称取0.6g新鲜的猕猴桃嫩叶，纯水洗净表面尘土，滤纸吸干水分后置于预冷的培养皿内，加入2mL预冷的解离液，用一次性的锋利刀片快速切成细丝状，解离5min，整个过程保证样品浸没在解离液中，得到第一次解离样品待用；
步骤二、将第一次解离样品用40μm的细胞筛网过滤到1.5mL离心管中，将滤液在4℃下进行第一次离心，第一次离心的时间为6min，第一次离心的搅拌速率为1000r/min，弃上清液后补加1ml上述解离液，轻轻重悬细胞后进行第二次离心，第二次离心的温度为4℃，第二次离心的时间为6min，第二次离心的搅拌速率为1000r/min，弃上清液得到第二次解离样品待用；
步骤三、向第二次解离样品中加入500μL的PI/Rase染色液，在20℃下染色15min，将染色后的样品转移到流式细胞仪的上样管，上机检测即可。
PI/Rase染色液：BD Pharmingen公司的PI/RNase Staining Buffer Solution100mL(货号：550825)，工作浓度为0.5mL/mL。
通过上述方法检测的信号较为集中，峰图较好，杂峰少。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种适用于流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的解离液，其特征在于，所述解离液中无机盐的摩尔浓度为0.8～1.2mol/L，所述解离液中缓冲剂的摩尔浓度为3～10mmol/L，所述解离液中聚乙烯吡咯烷酮的质量分数为0.8～1.2％，所述解离液中聚乙二醇辛基苯基醚的质量分数为0.2～0.3％；所述解离液的pH为7.0～8.0。
2.根据权利要求1所述的一种适用于流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的解离液，其特征在于，所述解离液的pH为7.5。
3.根据权利要求1或2所述的一种适用于流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的解离液，其特征在于，所述无机盐中氯化钾和硫酸镁的摩尔比为1：(18～22)；所述缓冲剂为羟乙基哌嗪乙硫磺酸。
4.根据权利要求3所述的一种适用于流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的解离液，其特征在于，所述无机盐中氯化钾和硫酸镁的摩尔比为1：20；所述解离液中羟乙基哌嗪乙硫磺酸的摩尔浓度为5mmol/L。
5.根据权利要求1或2所述的一种适用于流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的解离液，其特征在于，所述解离液中聚乙烯吡咯烷酮的质量分数为0.95～1.05％，所述解离液中聚乙二醇辛基苯基醚的质量分数为0.24～0.26％。
6.根据权利要求5所述的一种适用于流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的解离液，其特征在于，所述解离液中聚乙烯吡咯烷酮的质量分数为1.0％，所述解离液中聚乙二醇辛基苯基醚的质量分数为0.25％。
7.权利要求1～6任一项所述的一种适用于流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的解离液的制备方法，其特征在于，包括：将无机盐、缓冲剂、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇辛基苯基醚按照上述配比称量后加入容器中，加入双蒸水定容，再用氢氧化钠溶液调节pH至7.0～8.0，在4℃下保存即可。
8.一种采用流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、将猕猴桃叶子放入2～6℃的上述解离液中，再将猕猴桃叶子切成丝状，解离4～6min，得到第一次解离样品待用；
步骤二、将第一次解离样品用40μm的细胞筛网过滤，将滤液在2～6℃下进行第一次离心，弃上清液后补加上述解离液进行第二次离心，弃上清液得到第二次解离样品待用；
步骤三、向第二次解离样品中加入染色液，在10～30℃下染色10～20min，将染色后的样品转移到流式细胞仪的上样管，上机检测即可。
9.根据权利要求8所述的一种采用流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的方法，其特征在于，所述步骤一中解离的温度为4℃，解离的时间为5min；所述步骤一中解离液和猕猴桃叶子的质量比为1：4。
10.根据权利要求8所述的一种采用流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的方法，其特征在于，所述步骤二中第一次离心的温度为4℃，第一次离心的时间为5min，第一次离心的搅拌速率为1000r/min；所述步骤二中第二次离心的温度为4℃，第二次离心的时间为5min，第二次离心的搅拌速率为1000r/min；
所述步骤三中染色液为PI/Rase染色液。
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| CN201911076307.9A CN110823654A (zh) | 2019-11-06 | 2019-11-06 | 一种采用流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性的方法、解离液及制备方法 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111504746A (zh) * | 2020-04-29 | 2020-08-07 | 扬州大学 | 一种适用于流式细胞仪分析的大豆细胞核解离液及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104316373A (zh) * | 2014-10-22 | 2015-01-28 | 江苏省农业科学院 | 一种适于流式细胞分析的茄子叶片细胞核提取方法 |
| WO2015104358A1 (en) * | 2014-01-09 | 2015-07-16 | Syngenta Participations Ag | Embryo sampling method |
-
2019
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|---|---|---|---|---|
| WO2015104358A1 (en) * | 2014-01-09 | 2015-07-16 | Syngenta Participations Ag | Embryo sampling method |
| CN104316373A (zh) * | 2014-10-22 | 2015-01-28 | 江苏省农业科学院 | 一种适于流式细胞分析的茄子叶片细胞核提取方法 |
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|---|
| 施春晖 等: "流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性技术研究", 《植物研究》 * |
| 朱道圩 等: "用流式细胞仪鉴定中华称猴桃的多倍体", 《植物生理学通讯》 * |
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|---|---|---|---|---|
| CN111504746A (zh) * | 2020-04-29 | 2020-08-07 | 扬州大学 | 一种适用于流式细胞仪分析的大豆细胞核解离液及其应用 |
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