CN110819663A - 使用改良的肠杆菌科菌株制备l氨基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种重组的分泌L‑氨基酸的肠杆菌科微生物，其包含功能性地连接编码膜蛋白的多核苷酸的具有启动子活性的DNA片段，特征在于所述具有启动子活性的DNA片段包含SEQ ID NO:8。

Description

使用改良的肠杆菌科菌株制备L氨基酸的方法
发明领域
本发明涉及使用肠杆菌科的重组微生物发酵制备L-氨基酸如L苏氨酸的方法，所述重组微生物包含功能性地连接编码膜蛋白或氨基酸转运蛋白的多核苷酸的具有启动子活性的特定DNA片段，以及本发明涉及各种(respective)微生物。
发明背景
L-氨基酸，特别是L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸用于人类医学和制药工业、食品工业和动物营养。
已知L-氨基酸通过发酵肠杆菌科菌株、特别是大肠杆菌(E.coli)和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)制备。由于极其重要性，不断尝试改良制备过程。方法学的改良可涉及关于发酵技术的措施，例如搅拌和供氧，或者营养培养基的组成，例如使用的糖的选择或者发酵期间的糖浓度，或者产物形式的改进，例如通过离子交换层析法，或微生物自身固有性能特性。
在野生型菌株中，严格的调节机制阻止产生超过所述菌株所需的代谢产物如氨基酸及阻止释放到培养基中。因此，从制造商的观点来看，氨基酸过量产生菌株的构建需要克服这些代谢调控。
诱变、选择和突变体选择的方法用于除去所述控制机制和改良这些微生物的性能特性。这样获得对抗代谢物例如苏氨酸类似物α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)具有抗性的菌株，或者对于具有调节重要性的代谢物是营养缺陷型及产生L-氨基酸例如L-苏氨酸的菌株。例如，产生L异亮氨酸的菌株的特征在于对异亮氨酸类似物硫异亮氨酸(thiaisoleucine)的抗性。
多年来，重组DNA方法同样用于通过扩增例如单个氨基酸生物合成基因或改变特殊基因的性质并研究对生产的影响而以特定方式改良肠杆菌科的L-氨基酸生产菌株。关于大肠杆菌和沙门氏菌的细胞生物学和分子生物学的比较信息可见于Neidhardt(ed):Escherichia coli and Salmonella,Cellular and Molecular Biology,2nd edition,ASMPress,Washington,D.C.,USA,(1996)。关于L-苏氨酸代谢和产生的综述由Debabov(Advances in Biochemical Engineering Vol.79,113-136(2003))和Rieping andHermann (Microbiology Monographs,Vol.5,71-92,ISSN 1862-5576(印刷)和1862-5584(在线),Springer Verlag Berlin/Heidelberg(2007))出版发行。
先前已发现具有氨基酸输出蛋白活性的蛋白质(rhtC基因的基因产物)催化氨基酸L-苏氨酸的输出。因此，rhtC的过表达通过介导对苏氨酸的抗性导致这种代谢物的外部积累(Zakataeva et al.,FEBS Letters 452(3):228-32(1999),Kruse et al.,AppliedMicrobiological Biotechnology 59(2-3):205-10(2002))。氨基酸输出蛋白属于氨基酸输出蛋白Rht家族(Aleshin et al.,Trends in Biochemical Science 24(4):133-5(1999))，并且假定其具有苏氨酸/质子逆向转运蛋白的功能。
编码大肠杆菌氨基酸输出蛋白的野生型rhtC基因和上游区域的核苷酸序列通常可在国家医学图书馆(Bethesda，MD，USA)的国家生物技术信息中心(NCBI)的数据库中获得，登记号为NC000913(区域：4005780-4006400及上游)。
欧洲专利申请EP 1 013 765 A1描述了rhtC基因过表达对埃希氏菌属(Escherichia)菌株生产和制备不同氨基酸如L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-缬氨酸和L-亮氨酸的有益作用，在这种情况中所述过表达是通过增加rhtC基因的拷贝数或者通过将rhtC基因与在埃希氏菌属中有效的启动子结合而实现。
本发明人最近发现取决于表达系统，膜蛋白例如氨基酸转运蛋白及特别是氨基酸输出蛋白如rhtC的高表达水平，可导致希望的氨基酸的生产水平降低。特别地和对于氨基酸产量而言，强启动子系统不适合在相应的氨基酸生产系统中表达上述膜蛋白。
因此，对于膜蛋白，特别重要的是在发酵期间当高浓度的氨基酸积累在发酵液中时调节(组成型或诱导型)表达的正确水平。EP 1 013 765描述了通过扩增rhtC基因的拷贝数制备L-苏氨酸抗性细菌的方法，以及L-苏氨酸滴度相对于其中rhtC基因未增强的菌株是增加的。然而，没有描述在生产商业相关量的氨基酸的埃希氏菌属菌株中过表达的影响。
基因表达尤其受基因5'区域内的启动子区域控制。启动子通过转录因子和RNA聚合酶的相互作用启动转录。结果，启动子含有许多保守序列基序，这些基序可以基于其共有序列确定(Fournier et al.,Antimicrobial Agents and Chemotherapy 39(6):1365-1368(1995)；Chapon,EMBO Journal 1:369-374(1982)；Smith et al.,Journal ofBacteriological Chemistry 257:9043-9048(1982))。
如下普通细菌启动子元件基于在最佳研究的细菌模型生物大肠杆菌中借助于sigma-70因子转录的基因的共有序列进行分类(Rosenberg et al.,Nature 272:414-423(1978)；Hawley and McClure,Nucleic Acids Research 11(8):2237-2255(1983))：
-35区域(转录起始点上游35个碱基对的序列)，共有序列：5'-TTGACA-3'，
-10区域(这个序列可以在转录起始点上游的大约10个碱基对发现)，也称作Pribnow box，共有序列：5'-TATAAT-3'。
RNA聚合酶的sigma因子与这两个区域结合，然后所述聚合酶诱导下游基因转录。强和弱启动子的“共有序列”可以通过比较各个启动子的DNA序列得到。启动子元件彼此及与转录起始位点的位置也是重要的。共有序列中从-10区至转录起始位点的距离为5-7个碱基对，其中-10和-35区由16-18个碱基对分隔。然而，启动子与共有序列的相似性不一定在埃希氏菌属的每个菌株中提供高表达水平，控制表达水平的其它调节机制可能比优化的共有序列更重要。
鉴于上述关于膜蛋白表达水平的发现，仍然需要提供用于调节膜蛋白、特别是氨基酸输出蛋白如rhtC的表达水平的改良方法和工具，以进一步改良通过产生L氨基酸的肠杆菌科微生物发酵制备L-氨基酸，特别是L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-组氨酸。
发明内容
本发明涉及一种重组的分泌L-氨基酸的肠杆菌科微生物，其包含功能性地连接编码膜蛋白的多核苷酸的具有启动子活性的DNA片段，特征在于所述具有启动子活性的DNA片段包含SEQ ID NO：8。
本发明进一步提供了一种利用上述微生物制备L-氨基酸或者含有L-氨基酸的饲料添加剂的新方法或工艺。
此外，本发明涉及包含SEQ ID NO：8并且功能性地连接编码膜蛋白的多核苷酸的具有启动子活性的DNA片段。
最后，本发明涉及包含SEQ ID NO：8的DNA片段作为启动子，用于调节编码膜蛋白或氨基酸转运蛋白的基因的表达水平的应用。
具体实施方式
本发明涉及重组的分泌L-氨基酸的肠杆菌科微生物，其包含具有启动子活性、功能性地连接编码膜蛋白的多核苷酸的DNA片段，并且其分泌(即在细胞或培养基中产生和浓缩)增加量的L-氨基酸，特别是L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸，其中所述具有启动子活性的DNA片段包含SEQ ID NO：8。
根据SEQ ID NO：8的多核苷酸衍生自根据SEQ ID NO：7(wt)的多核苷酸(通过由胸腺嘧啶取代位置24的核碱基胞嘧啶)。
本发明人意外地发现使用上述特定的启动子序列能够以这样一种方式调节编码膜蛋白、特别是氨基酸转运蛋白如氨基酸输出蛋白如rhtC的基因的表达水平，所述方式是当商业意义浓度在发酵液中累积时，改良氨基酸的发酵生产的能力。
如在本发明上下文中所用，术语“表达水平的调节”是指设定导致氨基酸产物最佳产量的平衡表达水平。如下文详细描述的，基因表达水平可以适合细胞膜中丰富的转运蛋白的特定需要，通过在较高生产菌株中使用上述DNA片段作为启动子元件来调节编码膜蛋白或氨基酸转运蛋白的基因、特别是氨基酸输出蛋白基因如rhtC的表达水平，而不影响细胞的适应性和生产能力。
本发明进一步提供了包含具有启动子活性的DNA片段的微生物，其特征在于所述DNA片段在3'末端连接携带核糖体结合位点的第二DNA片段。
在根据本发明的一个实施方案的微生物中，上述DNA片段可在其3'末端连接具有SEQ ID NO：9的位置174-204的核苷酸序列的第二DNA片段，其是所述DNA片段的天然存在的3'-侧翼区。具有SEQ ID NO：9的位置174-204的核苷酸序列的所述第二DNA片段可在其3'末端连接编码膜蛋白的多核苷酸。
优选地，所述膜蛋白是具有氨基酸转运蛋白活性的蛋白质，特别是氨基酸输出蛋白，例如RhtC。
根据本发明的具有启动子活性的DNA片段可在5'末端连接具有SEQ ID NO：9的位置1-138的核苷酸序列的DNA片段，其是所述DNA片段的天然存在的5'-侧翼区。
根据本发明的微生物特别包括肠杆菌科的微生物，其中具有启动子活性且包含SEQ ID NO：8的DNA片段在3'末端功能性地连接其氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70％或至少80％、或至少90％、特别是至少95％、优选至少98％或至少99％、特别优选直至99.6％、非常特别优选直至100％相同的多核苷酸。
所述微生物包含选自下组的多核苷酸：
a)具有选自SEQ ID NO：1的核苷酸序列和与其互补的核苷酸序列的多核苷酸；
b)在遗传密码简并的背景下具有对应于SEQ ID NO：1的核苷酸序列的多核苷酸；
c)具有在严格条件下与序列SEQ ID NO：1的互补序列杂交的序列的多核苷酸序列，所述严格条件优选通过温度在64℃-68℃范围内及缓冲液的盐浓度在2×SSC至0.1×SSC范围内的洗涤步骤获得；
d)具有序列SEQ ID NO：1的多核苷酸，其包含功能性中性有义突变体，
优选具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸编码氨基酸输出蛋白。
优选地，所述氨基酸输出蛋白是RhtC。
具有启动子活性的DNA片段可存在于微生物的染色体中。或者，它可位于染色体外复制载体上。
基本上有两种基因表达的可能性。在连续表达中，基因通过组成型启动子连续表达，相应的蛋白质累积在细胞中。
另一方面，诱导型启动子可用于诱导的基因表达。通过诱导物能诱导靶基因的表达。如果(过)表达对生产生物体具有负面影响，则使用该方法。其原因可能是在生长期间高荷载的代谢源。结果是生长较慢并因此延长生物反应器的运行时间及与之相关联的工业生产情况中的成本增加。诱导的表达在细胞毒性产物的情况中也是有利的。在此，在诱导表达后发生自身中毒和细胞死亡。关于生产过程的经济性，因此试图将该过程细分为生长阶段和生产阶段。在生长阶段产生尽可能大量的生物质，然后在生产阶段通过诱导启动子产生靶蛋白质。以这种方式可以获得最大产量，从而该过程变得明显更经济。
本发明还涉及L-氨基酸特别是L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸的发酵制备方法，使用分泌L-氨基酸的重组肠杆菌科微生物，特别是甚至在使用根据本发明的具有启动子活性的DNA片段之前，并且其中编码膜蛋白或具有氨基酸转运蛋白如氨基酸输出蛋白如rhtC的活性的蛋白质的至少一种多核苷酸功能性连接所述具有启动子活性的DNA片段。
通过发酵本发明的重组微生物制备L-氨基酸的方法包含以下步骤：
(i)在培养基中发酵本发明的微生物；
(ii)富集发酵液和/或微生物细胞中的L-氨基酸；及任选地
(iii)分离L-氨基酸。
此外，本发明涉及具有启动子活性且包含SEQ ID NO:8的DNA片段，所述DNA片段功能性地连接编码膜蛋白的多核苷酸。
这种包含SEQ ID NO:8的DNA片段可用作调节编码膜蛋白或氨基酸转运蛋白的基因、特别是氨基酸输出蛋白基因如rhtC的表达水平的启动子。
如果在起始密码子上游的调节序列中进行突变，则必须注意作为序列和与起始密码子的距离的函数的这些元件的功能性。本文使用的表述“功能性连接”是指调节序列如启动子控制基因的表达。
在根据本发明使用具有启动子活性的DNA片段之前产生L-氨基酸的微生物在此不包括野生型菌株和常用的实验室菌株，例如DH5α、DH5αmcr、W3110、MG1655、MC4100、Y1089、H560和MM152。
如果下文提及L-氨基酸或氨基酸，是指选自如下一组的一或多种氨基酸，包括其盐：L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬氨酸和L-高丝氨酸。特别优选L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸。
在这方面，术语“使用具有启动子活性的DNA片段”或“使用包含SEQ ID NO:8的DNA片段作为启动子”描述了在结构基因上游掺入所述DNA片段以调节转录。
在用于本发明方法的微生物中使用的具有启动子活性的DNA片段中的取代可以通过使用例如现有技术中描述的定向诱变方法产生。
可以使用诱变寡核苷酸的定向诱变方法(T.A.Brown:Gentechnologie fürEinsteiger[Genetic engineering for beginners],Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg,1993)或者聚合酶链反应(PCR)，如Gait:Oligonucleotide synthesis:APractical Approach(IRL Press,Oxford,UK,1984)或者Newton and Graham(PCR,Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg,1994)所述。产生的诱变可以通过DNA测序确定和检测，例如通过Sanger et al.(Proceedings of the National Academy of ScienceUSA 74(12):5463-5467(1977))的方法。
为了在编码具有氨基酸输出蛋白活性的蛋白质的多核苷酸的启动子区域构建碱基取代，可以使用例如New England Biolabs GmbH(Frankfurt，Germany)的Q5 Site-Directed Mutagenesis试剂盒。在使用这些方法时，现有技术中描述的在编码具有氨基酸输出蛋白活性的蛋白质的核苷酸序列的5'区域中的大约200个碱基对的区域，从野生型菌株的总DNA开始，借助聚合酶链反应(PCR)扩增，克隆到合适的质粒载体中，然后对DNA进行诱变过程。点突变已经可以通过PCR利用“GeneSOEing”(Gene Splicing by OverlapExtension，Horton，Molecular Biotechnology 3：93-98(1995))获得。
此外，由高浓度氨基酸和/或相关分子引起的毒性使得能够通过增加相关菌株的抗性水平来筛选和选择启动子区域中的自发突变。
产生的启动子突变可以例如通过转化及基因或等位基因置换过程而掺入合适的菌株中。
Hamilton et al.(Journal of Bacteriology 174,4617-4622(1989))描述的一般方法是借助于条件复制pSC101衍生物pMAK705或者使用pKO3的等位基因置换方法(Linket al.,Journal of Bacteriology 179:6228-6237)。也可以利用现有技术领域描述的其它方法，例如Martinez-Morales et al.(Journal of Bacteriology 1999,7143-7148(1999))或者Boyd et al.(Journal of Bacteriology 182,842-847(2000))的方法。
也可以通过接合或转导将产生的启动子突变转移至多种菌株中。
因此，具有启动子活性的突变DNA片段可以稳定地整合到微生物的染色体中，从而使下游结构基因能够组成型表达。
具有启动子活性的突变DNA片段也可以存在于染色体外复制载体上，从而使得表达质粒上的下游结构基因的所得蛋白质过量产生。
关于遗传学和分子生物学概念的更详细解释可见于已知的遗传学和分子生物学教科书，例如Birge(Bacterial and Bacteriophage Genetics,4th ed.,Springer Verlag,New York(USA),2000)或者Berg,Tymoczko and Stryer(Biochemistry,5th ed.,Freemanand Company,New York(USA),2002)的教科书，或者手册Sambrook et al.(MolekularCloning,A Laboratory Manual,(3-Volume Set),Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor(USA),2001)。
蛋白质的浓度可以通过一维和二维蛋白质凝胶分级分离及随后使用适当的评估软件对凝胶中的蛋白质浓度进行光学鉴定而确定。制备所述蛋白质凝胶和鉴定蛋白质的常用方法是Hermann et al.(Electrophoresis,22:1712-23(2001))描述的方法。蛋白质浓度同样可以通过与特异于待检测蛋白质的抗体的Western印迹杂交(Sambrook et al.,Molecular cloning:a laboratory manual.2nd Ed.Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)及随后使用合适的浓度测定软件进行光学评估而确定(Lohaus and Meyer(1998)Biospektrum 5:32-39；Lottspeich,Angewandte Chemie38:2630-2647(1999))。
在化学上，基因或等位基因是多核苷酸。这里的替代术语是核酸，特别是脱氧核糖核酸。
在本文中，DNA片段是指核苷酸序列的一部分，其不编码蛋白质或多肽或核糖核酸。
术语多肽和蛋白质可互换使用。
开放读框(ORF)是指核苷酸序列的一部分，其编码或可编码根据现有技术不能指派其功能的蛋白质或多肽或核糖核酸。在将功能指派给所述讨论的核苷酸序列的某部分后，后者通常被称为基因。等位基因通常意指给定基因的替代形式。所述形式根据在核苷酸序列中的差异而区分。
基因产物通常是指由核苷酸序列编码的蛋白质或核糖核酸，即ORF、基因或等位基因。
微生物、特别是重组微生物，包含具有启动子活性、包含SEQ ID NO:8的DNA片段，所述DNA片段功能性地连接编码膜蛋白或具有氨基酸转运蛋白例如氨基酸输出蛋白如rhtC的活性的蛋白质的多核苷酸，所述微生物作为本发明的主题可以从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、合适的淀粉、合适的纤维素或者从甘油和乙醇及合适的话也可从混合物生产L-氨基酸。
本发明的微生物是肠杆菌科的代表微生物。例如其可以选自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌属(Erwinia)，普罗维登斯菌属(Providencia)和沙雷氏菌属(Serratia)。优选埃希氏菌属和沙雷氏菌属。特别值得一提的是埃希氏菌属的大肠杆菌和沙雷氏菌属的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。
重组微生物通常通过与包含所需基因、所需ORF、所述基因或ORF的等位基因或其一部分的载体和/或增强所述基因或ORF表达的启动子进行转化、转导或接合或者组合这些方法而产生。
为了制备肠杆菌科的L-氨基酸浓缩菌株，其包含具有启动子活性、包含SEQ IDNO:8的DNA片段，所述DNA片段与编码具有氨基酸输出蛋白活性的蛋白质的多核苷酸功能性连接，优选使用已经具有将所需L-氨基酸在细胞中浓缩和/或将其分泌至周围营养培养基中或将其在发酵液中积累的能力的菌株(起始菌株或亲本菌株)。这里也可以使用术语“产生”。更特别地，用于本发明措施的菌株具有在≤(不超过)120小时、≤96小时、≤48小时、≤36小时、≤24小时或≤12小时内在细胞和/或营养培养基或发酵液中浓缩或累积≥(至少)2.0g/l、≥8.0g/l、≥10.0g/l、≥50g/l、≥100g/l或≥150g/l的L-氨基酸的能力。所述菌株可以通过诱变和选择、通过重组DNA技术或通过组合这两种方法制备。
所述分泌L-氨基酸的菌株产生选自如下一组的一或多种、优选一种或基本上一种氨基酸：L-天冬酰胺，L-苏氨酸，L-丝氨酸，L-谷氨酸，L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-缬氨酸，L-甲硫氨酸，L-脯氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-组氨酸，L-赖氨酸，L-色氨酸，L-精氨酸，L-谷氨酰胺，L-天冬氨酸和L-高丝氨酸，优选选自L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸。术语L-氨基酸或氨基酸也包括其盐。
术语“一种或基本上一种氨基酸”考虑到除了希望的L-氨基酸外，还可以产生所述L-氨基酸的一或多种其它氨基酸(二级氨基酸)。基于希望的L-氨基酸的量，这些二级氨基酸的比例≥0至不超过40％，优选≥0至不超过20％，特别优选≥0至不超过10％，非常特别优选≥0至不超过5％。
可以提及作为合适的亲本菌株的实例、特别是产生或分泌L-苏氨酸的埃希氏菌属菌株、特别是大肠杆菌物种的菌株是：
-大肠杆菌H4581(EP 0 301 572)
-大肠杆菌KY10935(Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61(11)：1877-1882(1997))
-大肠杆菌VNIIgenetika MG442(US-A-4278,765)
-大肠杆菌VNIIgenetika M1(US-A-4,321,325)
-大肠杆菌VNIIgenetika 472T23(US-A-5,631,157)
-大肠杆菌TH 14.97(WO 02/26993)
-大肠杆菌TH 21.97(WO 02/26993)
-大肠杆菌BKIIM B-3996(US-A-5,175,107)
-大肠杆菌BKIIM B-3996ΔtdhΔpckA/pVIC40(WO 02/29080)
-大肠杆菌kat 13(WO 98/04715)
-大肠杆菌Kat 69.9(WO 02/26993)
-大肠杆菌KCCM-10132(WO 00/09660)
-大肠杆菌KCCM-10168(WO 01/14525)
-大肠杆菌KCCM-10133(WO 00/09661)
可以提及的产生或分泌L-苏氨酸的沙雷氏菌属的合适亲本菌株、特别是粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)物种的实例是：
-粘质沙雷氏菌HNr21(Applied and Environmental Microbiology 38(6):1045-1051(1979))
-粘质沙雷氏菌TLr156(Gene 57(2-3):151-158(1987))
-粘质沙雷氏菌T-2000(Applied Biochemistry and Biotechnology 37(3):255-265(1992))。
产生或分泌L-苏氨酸的肠杆菌科菌株优选具有例如选自如下一组的一或多种遗传或表型特征：对α-氨基-β-羟基戊酸的抗性，对硫代赖氨酸的抗性，对乙硫氨酸的抗性，对α-甲基丝氨酸的抗性，对二氨基琥珀酸的抗性，对α-aminobutteric acid的抗性，对borrelidine的抗性，对环戊烷-羧酸的抗性，对利福平的抗性，对缬氨酸类似物例如缬氨酸异羟肟酸(valine hydroxamate)抗性，嘌呤类似物例如6-二甲基氨基嘌呤的抗性，需要L-甲硫氨酸，适当的是部分或可补偿的需要L-异亮氨酸，需要内消旋-二氨基庚二酸，关于含苏氨酸的二肽的营养缺陷型，对L-苏氨酸的抗性，对苏氨酸-萃余液的抗性，对L-高丝氨酸的抗性，对L-赖氨酸的抗性，对L-甲硫氨酸的抗性，对L-谷氨酸的抗性，对L-天冬氨酸的抗性，对L-亮氨酸的抗性，对L-苯丙氨酸的抗性，对L-丝氨酸的抗性，对L-半胱氨酸的抗性，对L-缬氨酸的抗性，对氟丙酮酸的敏感性，缺陷的苏氨酸脱氢酶，适当的利用蔗糖的能力，增强的苏氨酸-操纵子，增加的高丝氨酸脱氢酶I-天冬氨酸激酶I，优选反馈抗性形式，增加的高丝氨酸激酶，增加的苏氨酸合酶，增加的天冬氨酸激酶，适当的是反馈抗性形式，增加的天冬氨酸半醛脱氢酶，增加的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，适当的是反馈抗性形式，增加的磷酸烯醇丙酮酸合酶，增加的转氢酶，增加的RhtB基因产物，增加的YfiK基因产物，增加的丙酮酸羧化酶，以及减弱的乙酸形成。
可以提及的分泌或产生L-高丝氨酸的合适埃希氏菌属亲本菌株，特别是大肠杆菌种的实例是：
-大肠杆菌NZ10rhtA23/pAL4 (US 6,960,455)。
产生或分泌L-高丝氨酸的肠杆菌科菌株优选具有例如选自如下一组的一或多种遗传或表型特征：需要L-苏氨酸，需要L-甲硫氨酸，需要L-异亮氨酸，缺陷的高丝氨酸激酶，适当的是利用蔗糖的能力，增加的高丝氨酸脱氢酶I/天冬氨酸激酶I，优选反馈抗性形式，增加的RhtA基因产物。
可以提及的分泌或产生L-赖氨酸的合适埃希氏菌属亲本菌株，特别是大肠杆菌种的实例是：
-大肠杆菌VL613(VKPM B-3423) (EP1149911)
-大肠杆菌AJ11442(FERM BP-1543) (US4,346,170)
产生或分泌L-赖氨酸的肠杆菌科菌株优选具有例如选自如下一组的一或多种遗传或表型特征：对赖氨酸类似物例如氧代赖氨酸、赖氨酸异羟肟酸、(S)-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)、γ-甲基赖氨酸、氯己内酰胺等的抗性，脱敏的天冬氨酸激酶，脱敏的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶。
可以提及的分泌或产生L-色氨酸的合适的埃希氏菌属亲本菌株，特别是大肠杆菌物种的实例是：
-大肠杆菌JP4735/pMU3028(DSM10122) (US 5,756,345)
-大肠杆菌JP6015/pMU91(DSM10123) (US 5,756,345)
-大肠杆菌AGX17(pGX44)(NRRL B-12263) (US 4,371,614)
产生或分泌L-色氨酸的肠杆菌科菌株优选具有例如选自如下一组的一或多种遗传或表型特征：选自如下至少一种酶的活性可进一步增强：邻氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脱氢酶(serA)、3-脱氧-D-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸合酶(aroG)、3-脱氢喹尼酸合酶(aroB)、莽草酸脱氢酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL)、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(aroA)，分支酸合酶(aroC)，预苯酸脱水酶，分支酸变位酶和色氨酸合酶(trpAB)；分支酸变位酶/预苯酸脱水酶或分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶的活性可进一步弱化，邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶的一或多种从L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制中释放。
可以提及的分泌或产生L-异亮氨酸的合适的埃希氏菌属亲本菌株，特别是大肠杆菌种的实例是：
-大肠杆菌H-8670(FERM BP-4051) (US5,460,958)
-大肠杆菌H-8683(FERM BP-4052) (US5,460,958)
-大肠杆菌FERM BP-3628 (US5,362,637)
-大肠杆菌FERM BP-3629 (US5,362,637)
-大肠杆菌FERM BP-3630 (US5,362,637)
-大肠杆菌H-9146(FERM BP-5055) (US5,695,972)
-大肠杆菌H-9156(FERM BP-5056) (US5,695,972)
产生或分泌L-异亮氨酸的肠杆菌科菌株优选具有例如选自如下一组的一或多种遗传或表型特征：对异亮氨酸类似物如硫代异亮氨酸的抗性，对乙硫氨酸的抗性，对精氨酸异羟肟酸的抗性，对S(2氨基乙基)-L-半胱氨酸的抗性，对D-丝氨酸的抗性。
可以提及的分泌或产生L-缬氨酸的合适埃希氏菌属亲本菌株，特别是大肠杆菌种的实例是：
-大肠杆菌AJ11502(NRRL B-12288) (US-A-4391907)
可以提及的分泌或产生L-亮氨酸的合适埃希氏菌属亲本菌株，特别是大肠杆菌种的实例是：
-大肠杆菌H-9070(FERM BP-4704) (US5,744,331)
-大肠杆菌H-9072(FERM BP-4706) (US5,744,331)
产生或分泌L-亮氨酸的肠杆菌科菌株优选具有例如选自如下一组的一或多种遗传或表型特征：对亮氨酸类似物如4-氮亮氨酸或5,5,5-三氟亮氨酸的抗性，对β-2-噻吩丙氨酸的抗性，适当的是利用蔗糖的能力，增强的亮氨酸操纵子，增加的2-异丙基苹果酸合酶，增加的3-异丙基苹果酸脱氢酶，增加的异丙基苹果酸异构酶，增加的亮氨酸转氨酶，增加的亮氨酸氨基转移酶，增加的亮氨酸输出蛋白。
可以提及的分泌或产生L-丙氨酸的合适埃希氏菌属亲本菌株，特别是大肠杆菌种的实例是：
-大肠杆菌菌株K88(FERM BP-4121) (US5,559,016)
产生或分泌L-丙氨酸的肠杆菌科菌株优选具有例如异源L-丙氨酸脱氢酶基因，优选来自节杆菌属(Arthrobacter)或芽孢杆菌属(Bacillus)或放线菌(actinomycetes)菌属，特别优选来自节杆菌种(Arthrobacter sp.)HAP1。
可以提及的分泌或产生L-组氨酸的合适埃希氏菌属亲本菌株，特别是大肠杆菌种的实例是：
-大肠杆菌AJ 11388(FERM-P 5048,NRRL B-12121)(US4,388,405)
产生或分泌L-组氨酸的肠杆菌科菌株优选具有例如选自如下一组的一或多种遗传或表型特征：对组氨酸类似物如2-噻唑丙氨酸、1,2,4-三唑丙氨酸、2-甲基组氨酸和组氨酸异羟肟酸的抗性，适当的是利用蔗糖的能力，增强的组氨酸操纵子，增加的ATP磷酸核糖基转移酶，增加的磷酸核糖ATP焦磷酸水解酶，增加的磷酸核糖基AMP环化水解酶，增加的环化酶HisF，增加的谷氨酰胺酰胺转移酶HisH，增加的1-(5-磷酸核糖)-5-[(5-磷酸核糖基氨基)亚甲基-氨基]咪唑-4-甲酰胺异构酶，增加的咪唑磷酸甘油酯脱水酶，增加的组氨酸磷酸转氨酶，增加的组氨醇磷酸磷酸酶，增加的组氨醇脱氢酶。
在本发明所基于的研究中，根据本发明的包含具有启动子活性的DNA片段(其与编码膜蛋白或具有氨基酸转运蛋白如氨基酸输出蛋白如rhtC的活性的蛋白质的多核苷酸功能性连接)的肠杆菌科的微生物，被发现产生增加量的L-氨基酸，特别是L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸，及将其浓缩在细胞或培养基中。
大肠杆菌的基因或开放读框(ORF)的核苷酸序列是现有技术的一部分，可见于Blattner et al.(Science 277:1453–1462(1997))公开的大肠杆菌基因组序列。已知宿主的内源性酶(甲硫氨酸氨肽酶)能除去N末端氨基酸甲硫氨酸。
也已知编码具有同属于肠杆菌科的肠炎沙门菌(Salmonella enterica)和胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)的氨基酸输出蛋白(rhtC基因)活性的蛋白质的多核苷酸的核苷酸序列(登记号：NC_003198 (REGION:complementary(3454404-3455024)及登记号：NC_004547 (REGION:complementary(4661556-4662179))。在如下肠杆菌科中发现rhtC基因的进一步的核苷酸序列：弗氏志贺菌(Shigella flexneri)(登记号：CP000266,AE005674,AE014073)；鲍氏志贺菌(Shigella boydii)(登记号：CP000036)；痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)(登记号：CP000034)；宋氏志贺菌(Shigella sonnei)(登记号：CP000038)；伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)(登记号：AE008884)；Sodalisglossinidius(登记号：AP008232)。
大肠杆菌K12的rhtC基因例如通过以下信息描述：
名称：氨基酸输出蛋白
功能：通过苏氨酸/质子反向转运蛋白功能催化L-苏氨酸氨基酸输出
参考文献：Zakataeva et al.,FEBS Letters 452(3):228-32(1999)；
Kruse et al.,Applied Microbiological Biotechnology 59(2-3):205-10(2002)
登记号：NC000913(Region:4005780-4006400)
编码的多肽长度为206个氨基酸。
替代基因名称(来自EcoCyc:Encyclopedia of Escherichia coli K-12 Genesand Metabolism,SRI International,Menlo Park,USA):b3823,yigJ
核酸序列可见于国家医学图书馆(Bethesda，MD，USA)的国家生物技术信息中心(NCBI)的数据库，欧洲分子生物学实验室(EMBL,Heidelberg,Germany和Cambridge,UK)的核苷酸序列数据库，或日本的DNA数据库(DDBJ，Mishima，Japan)。
为清楚起见，揭示的大肠杆菌rhtC基因序列如SEQ ID NO:1描述。这个读框编码的蛋白质如SEQ ID NO:2描述。揭示的包括上游和下游核苷酸序列的大肠杆菌rhtC基因序列如SEQ ID NO:10描述，由这个读框编码的蛋白质如SEQ ID NO:11描述(相应于SEQ ID NO:2)。
根据本发明可以使用引文中描述的基因或开放读框。还可以使用所述基因或开放读框的等位基因，其是遗传密码简并或功能性中性有义突变的结果。优选使用内源基因或内源性开放读框。
“内源基因”或“内源核苷酸序列”是指存在于物种群中的基因或开放读框或等位基因或核苷酸序列。
含有功能性中性有义突变的rhtC基因的等位基因包括例如在其编码的蛋白质中导致不超过30或不超过20个、优选不超过10或不超过5个、特别优选不超过3或不超过2个或者至少1个保守氨基酸取代的那些。本发明涉及保守氨基酸取代，其中氨基酸由具有相似功能性、电荷、极性或疏水性的氨基酸取代。
在芳香族氨基酸的情况中，当苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸彼此取代时，取代被认为是保守的。在疏水性氨基酸的情况中，当亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸彼此取代时，取代被认为是保守的。在极性氨基酸的情况中，当谷氨酰胺和天冬酰胺彼此取代时，取代被认为是保守的。在碱性氨基酸的情况中，当精氨酸、赖氨酸和组氨酸彼此取代时，取代被认为是保守的。在酸性氨基酸的情况中，当天冬氨酸和谷氨酸彼此取代时，取代被认为是保守的。在含羟基的氨基酸的情况中，当丝氨酸和苏氨酸彼此取代时，取代被认为是保守的。
以相同的方式，还可以使用编码所述蛋白质变体的核苷酸序列，所述变体另外在N末端或C末端含有至少一个(1个)氨基酸的延伸或截短。所述延伸或截短不超过40、30、20、10、5、3或2个氨基酸或氨基酸残基。
合适的等位基因还包括编码其中已插入或缺失至少一个(1个)氨基酸的蛋白质的等位基因。这种称作插入缺失(indels)的改变的最大数量可以影响2、3、5、10个氨基酸，但在任何情况中都不会超过20个氨基酸。
合适的等位基因还包括可以通过杂交、特别是在严格条件下使用SEQID NO:1或其一部分或与其互补序列获得的那些等位基因。
本领域技术人员例如在Boehringer Mannheim GmbH提供的手册“The DIG SystemUser's Guide for Filter Hybridization”(Mannheim,Germany,1993)及Liebl et al.(International Journal of Systematic Bacteriology 41:255-260(1991))中发现通过杂交鉴别DNA序列的指导。杂交在严格条件下进行，即形成的唯一杂交体是其中探针和靶序列(即用探针处理的多核苷酸)至少70％相同的那些杂交体。已知通过改变缓冲液组成成分、温度和盐浓度可以影响和/或决定杂交的严格性，包括洗涤步骤。通常，杂交反应在与洗涤步骤相比相对低的严格性进行(Hybaid Hybridisation Guide，Hybaid Limited，Teddington，UK，1996)。
例如，相应于5×SSC缓冲液的缓冲液可以在大约50℃-68℃温度用于杂交反应。在这些条件下，探针还可以和与探针序列具有小于70％相同性的多核苷酸杂交。这些杂交体较不稳定，通过在严格条件下洗涤除去。这可以例如通过降低盐浓度为2×SSC及适当时随后降低为0.5×SSC(The DIG System User’s Guide for Filter Hybridization,Boehringer Mannheim,Mannheim,Germany,1995)及温度调节为大约50℃-68℃、大约52℃-68℃、大约54℃-68℃、大约56℃-68℃、大约58℃-68℃、大约60℃-68℃、大约62℃-68℃、大约64℃-68℃、大约66℃-68℃而实现。优选温度范围是大约64℃-68℃或者大约66℃-68℃。适当时可以将盐浓度降低为相应于0.2×SSC或0.1×SSC的浓度。通过逐步提高杂交温度，以大约1-2℃从50℃提高至68℃，可以分离例如与所用探针的序列或者与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有至少70％、或至少80％、或至少90％、至少91％,、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％相同性的多核苷酸片段。关于杂交的另外指导可以称作试剂盒的形式商购获得(例如DIG Easy Hyb，来自RocheDiagnostics GmbH,Mannheim,Germany,Catalog No.1603558)。
此外，当使用肠杆菌科的菌株产生L-氨基酸特别是L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸时，除了调节编码膜蛋白或具有氨基酸转运蛋白如氨基酸输出蛋白如rhtC的活性的蛋白质的基因的表达之外，在所述基因的启动子区域内通过上述任何诱变措施增加一种或多种已知生物合成途径或氨基酸转运的酶或者回补代谢的酶或者用于产生还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的酶或者糖酵解酶或者PTS酶或硫代谢酶可以是有利的。通常优选使用内源基因。
在这方面，术语“增强”描述的是增加在微生物中由相应DNA编码的一或多种酶或蛋白质的细胞内活性或浓度，通过将例如一或多个基因或一或多个ORF的拷贝数增加至少一个拷贝、功能性地连接强启动子与所述基因、或者使用编码具有高活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因或ORF而实现，及在适当时组合这些措施。
在适当的情况中，调节微生物中一种或多种酶/蛋白质的表达或产生水平可能是有利的，通过例如只是适度增加相应酶/蛋白质的细胞内浓度或活性，因为酶/蛋白质浓度的增加过高可能导致例如缺陷的细胞分裂或改变的细胞形态及甚至毒性(Guthrie andWickner,Journal of Bacteriology 172(10):5555-5562(1990)；Genevaux P.et al.；EMBO Reports 5(2):195-200(2004))。
术语“适度增加”描述了相应蛋白质的细胞内活性或浓度基于野生型蛋白质或者基于相应酶或蛋白质非重组的微生物或亲本菌株中蛋白质的活性或浓度，增加不超过10倍、8倍、6倍、4倍、3倍、2倍或1.5倍。非重组微生物或亲本菌株是指要经历本发明的增强或过表达的微生物。
为了实现增强，可以增加例如基因或开放读框或等位基因的表达或蛋白质的催化性质。在适当的情况中，可以组合这两项措施。
为了实现过表达，可以增加例如相应基因或开放读框的拷贝数，或者突变启动子区和调节区或位于结构基因上游的核糖体结合位点。掺入结构基因上游的表达盒以相同方式起作用。还可以通过可诱导启动子在氨基酸发酵生产过程中增加表达；此外，使用允许不同时间顺序基因表达的基因表达启动子也是有利的。在基因表达的翻译调节水平上，可以增加起始频率(核糖体与mRNA的结合)或延伸率(延伸期)。通过延长mRNA寿命的措施同样改良了表达。此外，还通过防止酶蛋白分解以增强酶活性。ORF、基因或基因构建体可以存在于具有不同拷贝数的质粒中，或者在染色体中整合和扩增。或者，也可以通过改变培养基的组成成分和培养方式实现相关基因的过表达。
在现有技术中充分描述了过表达的方法，例如Makrides et al.(Microbiological Reviews 60(3),512-538(1996))。使用载体将拷贝数增加至少一个(1个)拷贝。使用的载体可以是质粒，如US 5,538,873中所述。使用的载体也可以是噬菌体，例如噬菌体Mu，如EP 0332448中所述，或噬菌体lambda(λ)。通过将另外的拷贝掺入染色体中的另一个位点例如噬菌体λ的att位点，也可以增加拷贝数(Yu and Court,Gene 223,77-81(1998))。
此外，用大肠杆菌中最常见的(77％)密码子ATG置换起始密码子可以显着改良翻译，因为AUG密码子比例如密码子GUG和UUG更有效2-3倍(Khudyakov et al.,FEBS Letters232(2):369-71(1988)；Reddy et al.,Proceedings of the National Academy ofSciences of the USA 82(17):5656-60(1985))。起始密码子周围的序列也可以优化，因为已经描述了起始密码子和侧翼区域的组合效应(Stenstrom et al.,Gene 273(2):259-65(2001)；Hui et al.,EMBO Journal 3(3):623-9(1984))。
技术人员在例如如下文献中可以发现关于这方面的一般指导：Chang and Cohen(Journal of Bacteriology 134:1141-1156(1978))，Hartley and Gregori(Gene 13:347-353(1981))，Amann and Brosius(Gene 40:183-190(1985))，de Broer et al.(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 80:21-25(1983))，LaVallie et al.(BIO/TECHNOLOGY 11:187-193(1993))，PCT/US97/13359，Llosa et al.(Plasmid 26:222-224(1991))，Quandt and Klipp(Gene 80:161-169(1989))，Hamilton et al.(Journal of Bacteriology 171:4617-4622(1989))，Jensen and Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58:191-195(1998))以及已知的遗传学和分子生物学教科书。
可以使用可在肠杆菌科中复制的质粒载体，如pACYC184衍生的克隆载体(Bartoloméet al.；Gene 102:75-78(1991))、pTrc99A(Amann et al.；Gene 69:301-315(1988))或者pSC101衍生物(Vocke and Bastia；Proceedings of the National Academyof Sciences USA 80(21):6557-6561(1983))。在根据本发明的方法中，可以使用用携带至少rhtC基因或编码其基因产物的核苷酸序列或等位基因的质粒载体转化的菌株。
术语“转化”应理解为意指宿主(微生物)对核酸的摄取。
可以使用例如现有技术中描述的定向诱变方法产生用于本发明方法的微生物中的等位基因。
因此，例如对于产生L-苏氨酸，可以同时增强、特别是过表达选自如下一组的一或多个基因：
·编码天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的thrABC操纵子的至少一个基因(US-A-4,278,765)，
·编码丙酮酸羧化酶的谷氨酸棒杆菌pyc基因(WO 99/18228)，
·编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因(Molecular and General Genetics 231(2)：332-336(1992)；WO 97/08333)，
·编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因(WO 02/064808)，
·编码吡啶转氢酶亚基的pntA和pntB基因(European Journal of Biochemistry158：647-653(1986)；WO 95/11985)，
·编码苏氨酸输出载体蛋白的谷氨酸棒杆菌thrE基因(WO 01/92545)，
·编码谷氨酸脱氢酶的gdhA基因(Nucleic Acids Research 11：5257-5266(1983)；Gene 23：199-209(1983)；DE19907347)，
·编码PTS磷酸转移酶系统的磷酸组氨酸蛋白质己糖磷酸转移酶的ptsHIcrr操纵子ptsH基因(WO 03/004674)，
·编码PTS磷酸转移酶系统的酶I的ptsHIcrr操纵子ptsI基因(WO 03/004674)，
·编码PTS磷酸转移酶系统的葡萄糖特异性IIA组分的ptsHIcrr操纵子crr基因(WO 03/004674)，
·编码葡萄糖特异性IIBC组分的ptsG基因(WO 03/004670)，
·编码半胱氨酸合酶A的cysK基因(WO 03/006666)，
·编码cys调节子的调节蛋白的cysB基因(WO 03/006666)，
·编码NADPH亚硫酸还原酶黄素蛋白的cysJIH操纵子cysJ基因(WO 03/006666)，
·编码NADPH亚硫酸还原酶血红素蛋白的cysJIH操纵子cysI基因(WO 03/006666)，
·编码腺苷酸硫酸还原酶的cysJIH操纵子cysH基因(WO 03/006666)，
·编码2-酮戊二酸脱氢酶的脱羧酶亚基的sucABCD操纵子sucA基因(WO 03/008614)，
·编码2-酮戊二酸脱氢酶的二氢硫辛酸-琥珀酰转移酶E2亚基的sucABCD操纵子sucB基因(WO 03/008614)，
·编码琥珀酰-CoA合酶的β-亚基的sucABCD操纵子sucC基因(WO 03/008615)，
·编码琥珀酰-CoA合酶的α-亚基的sucABCD操纵子sucD基因(WO 03/008615)，
·美国国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)的大肠杆菌开放读框(ORF)yjcG的基因产物(登记号NC000913(region 4281276-4282925)，
·美国国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)的大肠杆菌开放读框(ORF)yibD的基因产物(登记号NC000913(region 3787070-3788104)，
·美国国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)的大肠杆菌开放读框(ORF)yaaU的基因产物(登记号NC000913(region 45807-47138))，该读框也称为yaaU-ORF，
·编码L-苏氨酸和L-高丝氨酸输出蛋白的rhtA基因(Astaurova et al.,AppliedBiochemical Microbiology 21:611-616(1985)；RU Patent No.974817)，
·编码L-高丝氨酸和高丝氨酸-内酯输出蛋白的rhtB基因(Zakataeva et al.,FEBS Letters 452(3):228-232(1999)；EP 1013765B1)。
产生L-苏氨酸的肠杆菌科微生物通常具有反馈抗性或脱敏的天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I。反馈抗性天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶是指天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶(由thrA编码，EC:2.7.2.4/EC:1.1.1.3)与野生形式相比，对苏氨酸或苏氨酸与苏氨酸类似物α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)或AHV的混合物或者单独的AHV的抑制作用敏感更低。编码这些脱敏的酶的基因或等位基因也称为thrAFBR等位基因。现有技术描述了编码与野生型蛋白质相比具有氨基酸取代的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶变体的thrAFBR等位基因。相应于NCBI数据库(Bethesda，MD，USA)的登记号U00096.2的大肠杆菌thrA野生型基因的编码区如SEQ ID NO:3所示，由这个基因编码的多肽如SEQ ID NO:4所示。
还公开了粘质沙雷氏菌thrA基因的核苷酸序列，可以在NCBI以登记号X60821获得。粘质沙雷氏菌thrA野生型基因的编码区如SEQ ID NO:5所示，由这个基因编码的多肽如SEQ ID NO:6所示。
已用于本发明方法的产生L-苏氨酸的肠杆菌科微生物优选具有的thrA等位基因编码具有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶变体，该序列包含选自如下一组的一或多个氨基酸取代：
ThrA E253K(L-赖氨酸置换SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示编码的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的第253位的L-谷氨酸；参见Research Disclosure 505,537(2006))，
THRA G330D(L-天冬氨酸置换SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示编码的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶酶第330位的甘氨酸；参见Omori et al.(Journal of Bacteriology175(3),785-794(1993))，
ThrA S345F(L-苯丙氨酸置换SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示编码的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的第345位的L-丝氨酸；参见Lee et al.,Journal of Bacteriology185(18):5442-5451(2003))，
ThrA S352，SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示编码的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶第352位的L-丝氨酸由L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-天冬酰胺、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-色氨酸或L-缬氨酸置换，优选用L-苯丙氨酸置换；见Omori et al.(Journal of Bacteriology 175(3),785-794(1993)和Omoriet al.(Journal of Bacteriology 175(4),959-965(1993)，
ThrA A479T(L-苏氨酸置换SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示编码的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶酶第479位的L-丙氨酸；参见Omori et al.(Journal of Bacteriology175(3),785-794(1993))。
根据SEQ ID NO:4，优选thrAFBR等位基因、thrA E253K(用L-赖氨酸置换编码的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶第253位L-谷氨酸)或者S345F(用L-苯丙氨酸置换编码的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的第345位的L-丝氨酸)。
可以使用上述措施过表达编码天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的本文所述的thrAFBR等位基因。
此外，为了产生L-氨基酸，特别是L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸，除了调节编码膜蛋白或具有氨基酸转运蛋白如氨基酸输出蛋白如rhtC的活性的蛋白质的基因的表达外，消除不希望的继发反应可以是有利的(Nakayama:"Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms",in:Overproduction of Microbial Products,Krumphanzl,Sikyta,Vanek(eds.),AcademicPress,London,UK,1982)。
因此，对于产生L-苏氨酸，例如可以同时减弱、适当时消除或降低选自如下一组的一或多个基因的表达：
·编码苏氨酸脱氢酶的tdh基因(Journal of Bacteriology 169：4716-4721(1987))，
·编码苹果酸脱氢酶(E.C.1.1.1.37)的mdh基因(Archives in Microbiology149：36-42(1987))，
·编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pckA基因(WO 02/29080)，
·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(WO 02/36797)，
·编码磷酸转移酶系统的DgsA调节蛋白的dgsA基因(WO 02/081721)，也称作mlc基因，
·编码果糖阻抑蛋白的fruR基因(WO 02/081698)，也称为cra基因，
·编码sigma38因子的rpoS基因(WO 01/05939)，也称为katF基因，及
·编码天冬氨酸铵裂解酶的aspA基因(WO 03/008603)。
实施这些措施，在适当时，除增强基因的特定措施之外进行这些措施或者这些措施适当组合增强基因的特定措施以增加苏氨酸产生。
在本文中，术语“减弱”描述了在微生物中由相应DNA编码的一或多种酶或蛋白质的细胞内活性或浓度的降低或消除，例如通过使用比亲本菌株或相应酶或蛋白质未重组的微生物中较弱的启动子，或编码具有低活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因，或失活相应的酶或蛋白质或者开放读框架或基因，及在适当情况中组合这些措施。
通常，减弱措施将相应蛋白质的活性或浓度降低至野生型蛋白质的活性或或浓度或者亲本菌株或相应酶或蛋白质未重组的微生物的蛋白质活性或浓度的0-75％、0-50％、0-25％、0-10％或0-5％。亲本菌株或未重组的微生物被理解为对其进行本发明的减弱或消除措施的微生物。
为了实现减弱，例如可以降低或消除基因或开放读框的表达或者酶蛋白质的催化特性。在适当的情况中，可以组合这两种措施。
通过以合适方式进行培养或者通过遗传改变(突变)基因表达的信号结构或者通过反义RNA技术，可以降低基因表达。用于基因表达的信号结构是例如阻抑物基因、激活物基因、操纵基因、启动子、减弱子、核糖体结合位点、起始密码子和终止子。本领域技术人员例如在如下文献中可发现关于这方面的信息，例如Jensen and Hammer(Biotechnologyand Bioengineering 58:191-195(1998))，Carrier and Keasling(BiotechnologyProgress 15:58-64(1999))，Franch and Gerdes(Current Opinion in Microbiology 3:159-164(2000))，Kawano et al.(Nucleic Acids Research 33(19),6268-6276(2005))以及熟知的遗传学和分子生物学教科书如Knippers(“Molekulare Genetik[MolecularGenetics]”,6th edition,Georg Thieme Verlag,Stuttgart,Germany,1995)或者Winnacker(“Gene und Klone[Genes and Clones]”,VCH Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany,1990)。
现有技术领域已知导致酶蛋白质的催化性质改变或降低的突变。可提及的例如是Qiu and Goodman(Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997))，Yano etal.(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 95:5511-5515(1998))及Wente and Schachmann(Journal of BiologicalChemistry 266:20833-20839(1991))的文章。总结内容可见于已知的遗传学和分子生物学教科书，如Hagemann(“Allgemeine Genetik[General Genetics]”,Gustav FischerVerlag,Stuttgart,1986)。
考虑的突变是至少一个(1个)碱基对或核苷酸的转换、颠换、插入和缺失。根据突变引发的氨基酸取代对酶活性的影响，可以提及的是错义突变或无义突变。错义突变导致蛋白质中用不同的氨基酸置换指定氨基酸，其中氨基酸置换特别是非保守的。由此削弱蛋白质的功能性能力或活性，并将其降低至0-75％、0-50％、0-25％、0-10％或0-5％的值。无义突变导致基因编码区中的终止密码子，从而过早终止翻译。在基因中至少一个碱基对的插入或缺失导致移码突变，这反过来导致错误的氨基酸被掺入或翻译过早终止。如果由于突变而在编码区中形成终止密码子，这也导致翻译过早终止。至少一个(1个)或更多个密码子的缺失通常也导致酶活性的完全丧失。WO 03/074719描述了通过使用合适的t-RNA抑制蛋白抑制编码区中的终止密码子突变以降低基因表达。
产生这些突变的指导属于现有技术，可得自已知的遗传学和分子生物学教科书，如Knippers(“Molekulare Genetik[Molecular Genetics]”,6th edition,Georg ThiemeVerlag,Stuttgart,Germany,1995)，Winnacker(“Gene und Klone[Genes and Clones]”,VCH Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany,1990)或者Hagemann(“AllgemeineGenetik[General Genetics]”,Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1986)的教科书。
通过基因或等位基因交换可以将基因中的合适突变掺入合适菌株中。
常用方法是Hamilton et al.(Journal of Bacteriology 171:4617-4622(1989))描述的基因交换方法，使用条件复制型pSC101衍生物pMAK705进行。也可以使用现有技术中描述的其它方法，例如Martinez-Morales et al.(Journal of Bacteriology181:7143-7148(1999))或Boyd et al.(Journal of Bacteriology 182:842-847(2000))的方法。
同样可以通过接合或转导将相关基因突变或者影响相关基因或开放读框表达的突变转移到不同菌株中。
在适当的情况中，可以使用增强和减弱措施的任何组合。
本发明还涉及使用上述重组的肠杆菌科微生物发酵制备L-氨基酸，特别是L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸的方法，其中另外进一步增强、特别是过表达希望的L-氨基酸的生物合成途径的基因，和/或其中至少部分减弱降低希望的L-氨基酸形成的代谢途径。
关于选自产物浓度(产量/体积)、产物产量(形成的产物/消耗的碳源)和产物形成(形成的产物/体积和时间)或者其它处理参数及其组合的一或多个参数，所述细菌或者使用这些细菌的发酵过程的性能基于未重组微生物或亲本菌株或者使用这种微生物或亲本菌株的发酵过程，改良至少0.5％、至少1％、至少1.5％或至少2％。
根据本发明，制备的微生物分批培养、补料分批培养、重复补料分批培养或者连续培养(DE102004028859.3或US5,763,230)。这种方法在教科书Chmiel(Bioprozesstechnik1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik[Bioprocess technology 1.Introductionto bioprocess technology](Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991))或者Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen[Bioreactors and peripheralinstallations](Vieweg Verlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994))中总结。
在分批方法中，除了少数例如氧和pH校正剂之外，所有开始材料以单一反应混合物的形式导入，及在所得培养基中培养微生物。
在补料分批方法中，首先通过分批培养微生物(分批阶段)。然后在培养物中连续或分批地加入制备所述产物需要的起始材料，适当时加入多种起始材料(进料阶段)。在制备-L氨基酸的情况中，所述起始材料是碳源。
重复补料分批方法是一种补料分批方法，其中在发酵完成后，将获得的部分发酵液用作接种物以开始另一个重复补料分批方法。在适当的情况中，可以重复多次这种循环。例如在WO 02/18543和WO 05/014843中描述了重复补料分批方法。
在连续方法中，在分批或补料分批流程之后向培养物中连续地添加一或多种及适当时所有起始材料并同时除去发酵液。例如，在专利文献US 5,763,230、WO 05/014840、WO05/014841和WO 05/014842中描述了连续方法。
使用的培养基必须以合适方式满足特定菌株的需要。美国细菌学会手册Manualof Methods for General Bacteriology(Washington D.C.,USA,1981包含用于培养多种微生物的培养基的描述。术语培养培养基、发酵培养基和营养培养基及培养基可互换使用。
培养基通常例如含有一种或多种碳源、氮源和磷源。
糖和碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和适当时纤维素、油和脂肪如大豆油、葵花油、花生油和椰子油、脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸、醇如甘油和乙醇及有机酸如乙酸可用作碳源。这些物质可以单独使用或作为混合物使用。
有机含氮化合物如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵，可用作氮源。氮源可以单独使用或作为混合物使用。
磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐可用作磷源。
另外，培养基必须含有生长所需的金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，还可以使用必需的生长促进剂，例如氨基酸和维生素。也可以将合适的前体加入培养基中。所述成分可以以一次性混合物的形式加入培养物中或在培养期间适当地补料加入。
发酵通常在pH5.5-9.0、特别是pH6.0-8.0进行。碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或者酸性化合物如磷酸或硫酸，以合适方式用于控制培养物的pH。消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制发泡。可以向培养基中加入合适的选择性作用物质如抗生素，以维持质粒的稳定性。将氧气或含氧气体混合物如空气通入培养物中以维持有氧条件。培养温度通常为25℃-45℃，优选30℃-40℃。微生物的作用导致L-氨基酸在发酵液或培养液中浓缩或积累。继续培养直至形成最大量的希望的L-氨基酸。这个目标通常在10-160小时内达到。在连续方法中可以进行更长的培养时间。
发酵液或培养液是指其中微生物已在一定温度培养一定时间的发酵培养基。
在发酵完成后，由此获得的发酵液包含：a)由于所述微生物的细胞增殖而产生的微生物的生物量(细胞群)，b)在发酵过程中产生的L-氨基酸，c)在发酵过程中产生的有机副产物，及d)未被所述发酵消耗的所用发酵培养基的组分和起始材料，例如维生素如硫胺素或盐如硫酸镁。
随后可以收集产生的培养液或发酵液，并且可以回收或分离希望的L-氨基酸或含L-氨基酸的产物。
在一种方法变化中，适当时浓缩发酵液，随后纯化或分离纯的或几乎纯形式的L-氨基酸。离子交换层析、结晶、提取方法及用活性炭处理是纯化L-氨基酸的典型方法。这些方法产生基本上纯的L-氨基酸，含量≥90重量％、≥95重量％、≥96重量％、≥97重量％、≥98重量％或≥99重量％。
在另一种方法变化中，同样可以从产生的发酵液中制备产物，通过完全(100％)或几乎完全即多于或大于(>)90％、>95％、>97％、>99％地除去存在于发酵液中的细菌生物量并将发酵液的其余成分大部分剩余在产物中，即程度为30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％、或者90％-100％，优选大于或等于(≥)50％、≥60％、≥70％、≥80％、≥90％或≥95％或者完全(100％)剩余在产物中。
如离心、过滤、倾析或絮凝等分离方法或其组合用于除去或分离生物量。
然后使用已知方法凝结或浓缩所得发酵液，例如使用旋转蒸发器、薄膜蒸发器或降膜蒸发器，通过反渗透或通过纳米过滤，或这些方法的组合。
然后使用冷冻干燥、喷雾干燥或喷雾粒化或使用其它方法将该浓缩的培养液加工成优选可流动的细粉末。然后使用合适的压缩或粒化方法可将这种可流动的细粉末转变为易流动、可储存的粗粒，且在很大程度上无尘的产物。在这方面，总共超过90％的水被除去，由此产物中的水含量低于10重量％、低于5重量％、低于4重量％或低于3重量％。
通过离子交换层析，优选阳离子交换层析，及随后使用茚三酮的柱后衍生化分离所述L-氨基酸，可以分析L-氨基酸，以确定在发酵过程中一或多个点的浓度，如Spackmanet al.(Analytical Chemistry 30:1190-1206(1958))所述。也可以使用邻苯二醛而不是茚三酮进行柱后衍生化。关于离子交换层析的综述文章可见于Pickering(LC·GC(Magazine of Chromatographic Science)7(6),484-487(1989))。
同样可以例如通过使用邻苯二醛或异硫氰酸苯酯进行柱前衍生化，及通过反相层析(RP)、优选以高效液相层析(HPLC)形式分级分离获得的氨基酸衍生物。这种方法在例如Lindroth et al.(Analytical Chemistry 51:1167-1174(1979))中描述。
进行光度测定检测(吸光度，荧光性)。
关于氨基酸分析的总结可见于教科书例如Bioanalytik[Bioanalytics]，Lottspeich and Zorbas(Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg,Germany1998)。
根据本发明的方法用于发酵制备L-氨基酸，例如L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸，特别是L苏氨酸。
附图简述
图1：表达质粒pMW219_P(allel)rhtC的图谱。
图2：基因置换载体pKO3rhtC-Pmut的图谱。
所述的碱基对数目是在再现性测量中获得的近似值。使用的缩写和名称具有以下含义：
BssHII：限制酶BssHII的裂解位点
HindIII：限制酶HindIII的裂解位点
KpnI：限制酶KpnI的裂解位点
NcoI：限制酶NcoI的裂解位点
SpeI：限制酶SpeI的裂解位点
XbaI：限制酶XbaI的裂解位点
Cm：氯霉素抗性基因
Km：卡那霉素抗性基因
lacZ″：lacZα基因片段的5'部分
'lacZ'：lacZα基因片段的3'部分
oriC：复制起点
rhtC：苏氨酸输出蛋白RhtC的基因
sacB：sacB基因
repA：复制蛋白RepA的基因
进一步的细节可见于实施例。
在下文通过非限制性实施例和举例的实施方案例证本发明。
实施例
以下微生物于1999年4月29日作为纯培养物保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，Germany)，其中于2000年7月31日转变为根据布达佩斯条约的保藏：
·大肠杆菌菌株DM1300，DSM 12791
根据布达佩斯条约以下微生物在2004年7月15日保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，Germany)
·大肠杆菌菌株MG442，DSM 16574
大肠杆菌的基本培养基(M9)和完整培养基(LB)由J.H.Miller(A short coursein bacterial genetics(1992),Cold Spring Harbor Laboratory Press)描述。从大肠杆菌中分离质粒DNA及所有的限制、Klenow处理和碱性磷酸酶处理的技术根据Sambrook etal.(Molecular cloning.A laboratory manual(1989),Cold Spring Harbor LaboratoryPress)所述进行。除非另有说明，大肠杆菌的转化是根据Chung et al.(Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America,USA(1989)86:2172-2175)所述进行。制备菌株和转化体时的保温温度为37℃。
实施例1:大肠杆菌K-12菌株DM1180的制备
从菌株VL334开始分几个步骤制备DM1180，菌株VL334作为CMIM B-1641购自俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM，Moscow，Russia)。菌株CMIM B-1641在专利US-A-4,278,765中描述。
制备菌株期间的保温温度为37℃。在根据Hamilton等所述的基因交换方法情况中，使用温度30℃和44℃。
1.scr基因基因座的转导
将噬菌体P1在大肠杆菌野生型菌株H155(Smith and Parsell,Journal ofGeneral Microbiology(1975)87:129-140)中倍增，并将大肠杆菌K12菌株MG1655(Guyeret al.,Cold Spring Harbor Symp.,Quant.Biology(1981)45:135-140)用分离的噬菌体裂解物感染。可以使用蔗糖作为碳源的MG1655转导物通过在含蔗糖(2g/l)的基本培养基上铺板而获得。再次从称作MG1655scr+的选择的克隆中制备P1裂解物，并用噬菌体裂解物转导菌株VL334。在含蔗糖的基本培养基上选择后获得菌株VL334scr+。
2.通过靶向基因交换缺失染色体tdh基因
为了在tdh基因中掺入缺失，使用Hamilton et al.(Journal of Bacteriology(1989)171:4617-4622)描述的方法，这种方法基于使用质粒pMAK705与温度敏感性复制子。质粒pDR121(Ravnikar and Somerville,Journal of Bacteriology(1987)169:4716-4721)含有来自大肠杆菌的3.7千碱基对(kbp)大DNA片段，其上编码tdh基因。为了产生tdh基因区域的缺失，将pDR121用限制酶ClaI和EcoRV裂解，在用Klenow酶处理后连接分离的5kbp大DNA片段。将连接混合物转化到大肠杆菌菌株DH5α中，在其中已加入50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上选择含有质粒的细胞。
通过质粒DNA分离和用EcoRI对照裂解可以证实成功缺失tdh基因。分离出1.7kbp的大EcoRI片段，并与已用EcoRI部分消化的质粒pMAK705连接。将连接混合物转化到DH5α中，在其中加入20μg/ml氯霉素的LB琼脂上选择含有质粒的细胞。通过质粒DNA分离和用EcoRI裂解证实成功的克隆。产生的pMAK705衍生物称为pDM32。
对于基因交换，用质粒pDM32转化VL334scr+。使用Hamilton等描述的选择方法进行质粒编码的缺失构建体的染色体tdh基因交换，使用以下寡核苷酸引物通过标准PCR方法(Innis et al.(1990),PCR protocols.A guide to methods and Applications,Academic Press)进行验证：
Tdh1：5'-TCGCGACCTATAAGTTTGGG-3' (SEQ ID NO:15)
Tdh2：5'-AATACCAGCCCTTGTTCGTG-3' (SEQ ID NO:16)
这个菌株称作VL334scr+Δtdh。
3.质粒pYN7parB的构建
从菌株VL334/pYN7中分离质粒pYN7，该菌株在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM，Moscow，Russia)保藏为CMIM B-1684(US-A-4,278,765)。
通过预备琼脂糖凝胶电泳，借助于限制酶HindIII和BamHI，从质粒pYN7中分离出含有thrABC-操纵子的长度为6.25kbp的DNA片段。
质粒pBR322(Bolivar et al.,Gene 2,95-113(1977))购自Pharmacia BiotechCo.(Uppsala，Sweden)并用限制酶HindIII和BamHI处理。通过预备琼脂糖凝胶电泳分离长度为4.3kbp的DNA片段。将两个DNA片段混合，用T4-DNA连接酶处理，用连接混合物转化菌株DH5α。在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂上选择后，获得含有质粒的转化体，所述质粒的结构相应于质粒pYN7。
从转化体中分离质粒，用酶EcoRI部分裂解及用酶HindIII完全裂解，与分离的parB基因区域连接。为此，将质粒pKG1022(Gerdes，Biotechnology(1988)6:1402-1405)用酶EcoRI和HindIII裂解，在1％琼脂糖凝胶中分离裂解批次，借助于QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN GmbH,Hilden,Germany)分离629bp的大parB片段。连接混合物用于转化菌株VL334scr+Δtdh。在其中已加入50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂中进行含pYN7parB的细胞的选择。parB基因区域的成功克隆可以通过质粒DNA分离和用EcoRI和HindIII对照裂解证实。
4.苏氨酸抗性自发突变体的分离
从菌株VL334scr+Δtdh/pYN7parB开始，在含苏氨酸(60g/l)的最小琼脂上分离自发突变体。选择的L-苏氨酸抗性单个菌落在具有如下成分的基本培养基上进一步倍增：3.5g/l Na2HPO4*2H2O，1.5g/l KH2PO4，1g/l NH4Cl，0.1g/l MgSO4*7H2O，2g/l葡萄糖，20g/l琼脂，50mg/l氨苄青霉素。
在该步骤后，称作DM1180的突变体对60g/l的L-苏氨酸具有抗性，但是在进一步的实验中抗性和生产力不稳定。此外，不能获得更高的L-苏氨酸抗性水平。DM1180具有导致对α-氨基-β-羟基戊酸抗性的许多突变，ilvA基因中的突变导致任选部分和可补偿的L-异亮氨酸需求，以及tdh基因中的突变导致苏氨酸氢化酶被减弱或者关闭，以及使用蔗糖的基因，及具有一个氨苄青霉素抗性基因。通过测序研究获得的突变菌株DM1180。
实施例2:大肠杆菌K-12菌株DM1300的制备
为了在进一步菌株开发过程中保持稳定的菌株，通过排除质粒从苏氨酸合成中解除苏氨酸抗性，以强化苏氨酸生物合成。
在无抗生素的完全培养基中保温后，从DM1180分离出无质粒衍生物。
在适当补充的基本琼脂上，然后选择呈现出异亮氨酸和苏氨酸营养缺陷的且能在含有60g/l L-苏氨酸的基本培养基上倍增的那些克隆。将这些克隆之一用质粒pYN7parB转化；在含有氨苄青霉素的完全培养基上进行含质粒细胞的选择。然后，在具有如下成分的基本培养基上分离转化体：3.5g/lNa2HPO4*2H2O，1.5g/l KH2PO4，1g/l NH4Cl,0.1g/l MgSO4*7H2O,2g/l葡萄糖,20g/l琼脂，50mg/l氨苄青霉素。然后在含有L-苏氨酸(80g/l)的最小琼脂上分离具有增加的苏氨酸抗性的突变体。
以这种方式分离的突变体称为DM1300。这个新菌株是L-甲硫氨酸原养型，其对至少80g/l的L-苏氨酸具有抗性。
实施例3:使用大肠杆菌菌株DM1180和DM1300通过补料分批发酵生产苏氨酸
为了比较发酵生产L-苏氨酸的能力，将大肠杆菌菌株DM1180和DM1300的各个菌落在具有如下成分的基本琼脂上倍增：3.5g/lNa2HPO4*2H2O，1.5g/l KH2PO4，1g/l NH4Cl，0.1g/l MgSO4*7H2O，2g/l蔗糖，20g/l琼脂，50mg/l氨苄青霉素。将培养物在37℃下保温5天。用接种物接种具有如下成分的10ml预培养物并在Infors AG(Bottmingen，Switzerland)的Infors HT Multitron标准振荡保温仪中在37℃和180rpm保温16小时：2g/l酵母提取物，10g/l(NH4)2SO4，1g/l KH2PO4，0.5g/lMgSO4*7H2O,15g/l CaCO3,20g/l蔗糖，50mg/l氨苄青霉素。将0.5ml体积的这种第一液体预培养物移至1402g预培养基M1-439中(表2)。在来自Sartorius(Sartorius Stedim Systems GmbH，Guxhagen，Germany，Model
Figure BDA0002161363590000313
B)的2升搅拌反应器发酵罐中进行分批发酵。预培养基M1-439含有表2中列出的成分。培养物在37℃的温度培养14.25小时，体积通气比(volume-specific aeration)为0.71vvm，氧分压为10％的空气饱和度，pH值为7.0。
将0.5ml体积的这种第二液体预培养物移至1402g预培养基A1-80中(表3)。在来自Sartorius(Sartorius Stedim Systems GmbH，Guxhagen，Germany，Model
Figure BDA0002161363590000312
B)的2升搅拌反应器发酵罐中进行分批发酵。预培养基A1-80含有表3中列出的成分。将培养物在37℃温度培养9.25小时，体积通气比为0.71vvm，氧分压为10％空气饱和度，pH为7.0。
为了接种包含于来自Sartorius(Sartorius Stedim Systems GmbH，Guxhagen，Germany，Model
Figure BDA0002161363590000321
B)的2升搅拌反应器发酵罐中的1223g主培养基M1-246(表4)，加入在A1-80培养基中的179g第三液体预培养物。主培养基M1-246含有表4中列出的成分。将培养物在37℃温度培养，通气量为1升/分钟，最小搅拌速度为800rpm，pH值为7.0，氧分压为10％空气饱和度，直至达到残留糖浓度为5g/l。然后将培养物在37℃温度、10％空气饱和度的氧分压和pH7.0条件下再培养30小时。在此期间，加入浓度为550.0g/kg的665g蔗糖溶液。
在不同时间，使用来自Hach Lange GmbH(Berlin，Germany)的DR 2800型光度计确定在660nm测量波长的光密度(OD)，并使用SYKAM Vertriebs GmbH(Fürstenfeldbruck,Germany)的SYKAM S435氨基酸分析仪通过离子交换层析及茚三酮柱后反应检测以确定形成的L-苏氨酸的浓度。
表1给出了这种发酵的结果。
表1
Figure BDA0002161363590000322
在47.5小时后，在来自DM1300发酵的最终样品中检测到107.2g/l的L-苏氨酸浓度，相比之下在来自DM1180发酵的最终样品中检测到93.9g/l。
表2：培养基M1-439的组成
成分 浓度(每kg)
蔗糖 33.6g
酵母提取物 4.8g
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 4.8g
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 1.92g
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.38g
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 19mg
MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O 12mg
氨苄青霉素 50mg
Structol 0.6g
表3：培养基A1-80的组成
成分 浓度(每kg)
蔗糖 33.6g
酵母提取物 8.0g
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 4.8g
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 1.92g
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.38g
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 19mg
MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O 12mg
Structol 0.6g
表4：培养基M1-246的组成
成分 浓度(每kg)
蔗糖 33.6g
玉米浆 10.0g
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 8.2g
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 1.00g
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.38g
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 20mg
MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O 12mg
Structol 0.1g
实施例4:测序
通过测序研究获得的突变菌株DM1300并将基因组序列与DM1180的序列进行比较。
以这种方式，可以在rhtC基因的可能启动子区域中鉴别点突变。rhtC的野生型启动子区的序列(PrhtC WT)如SEQ ID NO:7示出。rhtC的突变启动子区的相应序列(PrhtC等位基因)如SEQ ID NO:8示出。
实施例5:构建表达质粒pMW219_P(allel)rhtC和pMW219_P(WT)rhtC
使用聚合酶链式反应(PCR)和合成的寡核苷酸扩增包括上游区域的大肠杆菌K12rhtC基因。基于大肠杆菌K-12MG1655中rhtC基因的核苷酸序列(登记号NC_000913.3(Region:4007757-4008377),Blattner et al.(Science 277:1453-1474(1997))合成PCR引物(Eurofins Genomics GmbH，Ebersberg，Germany)：
PrhtC-1:5’-GCATGTTGATGGCGATGACG-3’(SEQ ID NO:17)
PrhtC-2:5’-CTGTTAGCATCGGCGAGGCA-3’(SEQ ID NO:18)
使用“QIAGEN DNeasy Blood&Tissue Kit”(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)根据厂商指导分离用于PCR的大肠杆菌K-12MG1655和大肠杆菌DM1300染色体DNA。将大约800bp的DNA片段(SEQ ID NO:12)在标准PCR条件下(Innis et al.(1990)PCR Protocols.AGuide to Methods and Applications,Academic Press)使用Phusion DNA聚合酶(NewEngland Biolabs GmbH,Frankfurt,Germany)和特异性引物扩增。
扩增的PrhtC片段用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)清理，然后将每个片段连接于已经用酶SmaI消化的低拷贝载体pMW219(Nippon Gene，Toyama，Japan)。将大肠杆菌菌株DH5α(Grant et al.；Proceedings of the National Academy ofSciences USA 87:4645-4649(1990))用连接混合物转化并在含有50μg卡那霉素/ml的LB琼脂上选择含有质粒的细胞。
在分离质粒DNA后，通过使用酶KpnI/HindIII或BssHII进行对照裂解可以证实克隆成功的事实。质粒被称作pMW219_P(allel)rhtC(图1)和pMW219_P(WT)rhtC。
实施例6：使用菌株MG442/pMW219_P(allel)rhtC或pMW219_P(WT)rhtC制备L-苏氨酸
产生L-苏氨酸的大肠杆菌菌株MG442在专利说明书美国专利号4,278,765中描述，在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM,Moscow,Russia)保藏为CMIM B-1628，及根据布达佩斯条约在德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ,Braunschweig,Germany)保藏为DSM 16574。为了检测增加P(allel)rhtC和P(WT)rhtC拷贝数的作用，将菌株MG442用实施例5描述的表达质粒pMW219_P(allel)rhtC或pMW219_P(WT)rhtC及用载体pMW219转化，在含有50μg卡那霉素/ml的LB琼脂上选择含有质粒的细胞。这获得菌株MG442/pMW219_P(allel)rhtC、MG442/pMW219_P(WT)rhtC和MG442/pMW219。然后在具有如下组成的基本培养基上进一步增殖选择的各个菌落：3.5g的Na2HPO4.2H2O/l，1.5g的KH2PO4/l，1g的NH4Cl/l，0.1g的MgSO4.7H2O/l，2g葡萄糖/l，20g琼脂/l，50mg卡那霉素/l。在包含于100ml Erlenmeyer培养瓶中的10ml分批培养物中检测L-苏氨酸的形成。为此，接种如下组成的10ml预培养基并在Infors AG(Bottmingen,Switzerland)的Infors HT Multitron标准振荡保温仪上在37℃和180rpm保温16小时：2g酵母提取物/l，10g的(NH4)2SO4/l，1g的KH2PO4/l，0.5g的MgSO4.7H2O/l，15g的CaCO3/l，20g葡萄糖/l，50m卡那霉素/l。在每种情况中，将250μl这种预培养物接种于10ml生产培养基(25g的(NH4)2SO4/l，2g的KH2PO4/l，1g的MgSO4.7H2O/l，0.03g的FeSO4.7H2O/l，0.018g的MnSO4*1H2O/l，30g的CaCO3/l,20g葡萄糖/l，50mg卡那霉素/l)并在37℃保温48小时。保温后，使用来自Tecan Group AG(Switzerland)的GENiosTM平板读器在660nm测量波长下确定培养悬浮液的光密度(OD)。然后使用来自SYKAMVertriebs GmbH(Fürstenfeldbruck,Germany)的SYKAM S435氨基酸分析仪，通过离子交换层析和包含茚三酮检测的柱后反应，确定已通过过滤灭菌的培养上清液中所得L-苏氨酸的浓度。实验结果如表5所示。
表5
OD
菌株 (660nm) L-苏氨酸g/l
MG442/pMW219 5.1 1.8
MG442/pMW219_P(WT)rhtC 5.6 4.6
MG442/pMW219_P(allel)rhtC 4.9 5.9
在L-苏氨酸低生产大肠杆菌菌株MG442中，通过rhtC的质粒结合的过表达可见苏氨酸产量显著增加，来自DM1300的等位基因显著多于WTrhtC。
这个效应比EP 1 013 765的实施例3中描述的更明显。在此描述了菌株MG442/pVIC40,pRhtC的10.2g/L苏氨酸累积，而对照菌株MG442/pVIC40(具有质粒结合的增加的thrABC基因表达)产生4.9g/L。载体pRhtC是pUC21衍生物，其在细菌细胞中提供rhtC基因的高拷贝数，pMW219衍生物是低拷贝质粒。显然，中等表达水平的rhtC更有利于提高L-苏氨酸生产力，在rhtC基因的可能启动子区域中的点突变通过以有利方式进一步调节表达水平而改善生产能力。
实施例7：使用菌株DM1300/pMW219_P(allel)rhtC或pMW219_P(WT)rhtC制备L-苏氨酸
为了测试在能合成超过100g/L的L-苏氨酸的高生产菌株中增加两个rhtC基因变体的拷贝数的作用，用在实施例5中描述的表达质粒pMW219_P(allel)rhtC或pMW219_P(WT)rhtC及用载体pMW219转化实施例2描述的大肠杆菌菌株DM1300，及在含有50μg氨苄青霉素/ml和50μg卡那霉素/ml的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。这获得菌株DM1300/pMW219_P(allel)rhtC、DM1300/pMW219_P(WT)rhtC和DM1300/pMW219。然后在具有如下组成的基本培养基上进一步增殖选择的各个菌落：3.5g的Na2HPO4.2H2O/l，1.5g的KH2PO4/l，1g的NH4Cl/l，0.1g的MgSO4.7H2O/l，2g蔗糖/l，20g琼脂/l，50μg氨苄青霉素/ml和50mg卡那霉素/l。在包含在100ml Erlenmeyer培养瓶中的10ml分批培养物中检查L-苏氨酸的形成。为此，接种如下组成的10ml预培养基并在Infors AG(Bottmingen,Switzerland)的Infors HT Multitron标准振荡保温仪上在37℃和180rpm保温16小时：2g酵母提取物/l，10g的(NH4)2SO4/l，1g的KH2PO4/l，0.5g的MgSO4.7H2O/l，15g的CaCO3/l，20g蔗糖/l，50μg氨苄青霉素/ml和50mg卡那霉素/l。在每种情况中，将250μl该这种预培养物接种到10ml生产培养基(25g的(NH4)2SO4/l，2g的KH2PO4/l，1g的MgSO4.7H2O/l，0.03g的FeSO4.7H2O/l，0.018g的MnSO4*1H2O/l，30g的CaCO3/l，20g蔗糖/l，50μg氨苄青霉素/ml和50mg卡那霉素/l)中并在37℃保温48小时。保温后，使用来自Tecan Group AG
Figure BDA0002161363590000361
Switzerland)的GENiosTM平板读器在660nm测量波长下确定培养悬浮液的光密度(OD)。
然后使用来自SYKAM Vertriebs GmbH(Fürstenfeldbruck,Germany)的SYKAMS435氨基酸分析仪，通过离子交换层析和包括茚三酮检测的柱后反应，确定已过滤灭菌的培养上清中所得L-苏氨酸的浓度。实验结果如表6所示。
表6
OD
菌株 (660nm) L-苏氨酸g/l
DM1180 4.9 8.9
DM1300 5.2 12.6
DM1300/pMW219 4.2 11.2
DM1300/pMW219_P(WT)rhtC 4.3 10.6
DM1300/pMW219_P(allel)rhtC 4.8 10.7
通常，由于2-质粒系统引起的“代谢负担”，第二质粒的表达降低高生产菌株中L-苏氨酸的产生。但有趣的是，与空载体对照DM1300/pMW219相比，P(WT)rhtC和P(allel)rhtC(如实施例6中基本生产菌株MG442的低拷贝pMW219衍生物)的同样过表达导致L-苏氨酸产量没有改善甚至降低，这两个等位基因在此没有区别。
为了排除任何质粒特异性效应，我们通过在pSU9parBrhtC(一种具有质粒稳定区parB的多拷贝衍生物)上表达rhtC基因来测试不同的载体系统。这导致DM1300中L-苏氨酸产量的进一步降低：在如上述相同的保温条件下仅产生8.2g/l的L-苏氨酸，OD(660nm)为4.8。
显然，过强的rhtC表达在高生产菌株中是不利的。
实施例8:交换载体PKO3_P(allele)rhtC的构建
使用聚合酶链式反应(PCR)和合成的寡核苷酸扩增PrhtC等位基因。基于大肠杆菌K12MG1655中PrhtC基因的核苷酸序列(登记号NC_000913.3,range:4007757-4008377,Blatter et al.(Science 277:1453-1462(1997))合成PCR引物(Eurofins GenomicsGmbH,Ebersberg,Germany)。
引物设计和PCR
reqQ_1 5'GCCGTTGTCTGGAAGAGAAG 3'(SEQ ID NO:19)
rht1r 5'ATCAATCCACTTCGCCAGAC 3'(SEQ ID NO:20)
根据厂商的数据用“QIAGEN DNeasy Blood&Tissue Kit”(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)分离用于PCR的染色体大肠杆菌DM1300 DNA。使用两种特异性引物“reqQ_1”和“rht1r”，在标准PCR条件下使用Phusion DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific，Wattham，MA USA)通过PCR扩增片段“P(allele)RhtC Insert”(Innis et al.:PCRprotocols.A guide to methods and applications,1990,Academic Press)。
所得产物“P(allele)RhtC_Insert”的长度为1412bp。
将插入体克隆进pKO3
根据厂商的说明将扩增的“P(allele)RhtC_Insert”连接于载体pCR-Blunt II-TOPO(Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit，Thermo Fisher Scientific，Wattham，MA USA)并转化进大肠杆菌菌株TOP10中。在含有50μg卡那霉素/ml的LB琼脂上选择含有质粒的细胞。分离质粒DNA后，载体用酶NcoI裂解，并在裂解后在0.8％琼脂糖凝胶中检测，命名为pCRB1-rhtC-Pmut。
然后用酶XbaI和SpeI裂解载体pCRB1-rhtC-Pmut，及在0.8％琼脂糖凝胶中分离rhtC片段；然后将其从凝胶(QIAquick Gel Extraction Kit，QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)中分离并连接于基因置换载体pKO3(Link et al,1997,J.Bacteriol.,179,20,6228-6237)。
还用XbaI切割载体pKO3，同时用碱性磷酸酶去磷酸化。通过QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)纯化消化物。
为了连接，将载体和插入体以1:3的摩尔比与T4连接酶连接。大肠杆菌菌株NEB5alpha的化学感受态细胞用1ml连接混合物转化并铺板于含有20mg/l氯霉素的LB琼脂上。将该平板在30℃保温40小时。
质粒的对照
通过用限制酶NcoI消化质粒pKO3rhtC-Pmut证实成功克隆。
挑取10个菌落并在30℃/180rpm条件下在10ml LB+20mg/l氯霉素中培养过夜。
第二天，将2ml培养物离心并从沉淀中制备DNA制备物。
连接产物可包含两个方向的插入体。可以使用NcoI限制消化检测其是否存在以及方向：
·方向A插入体：片段1250bp和5912BP
·方向B插入体：片段930BP和6232bp
·pKO3空载体：片段5681bp(线性化)
用NcoI切割10个质粒克隆并在0.8％TAE琼脂糖凝胶上分离产物。选择包含方向“A”的插入体的克隆并称作“pKO3rhtC-Pmut”。
使用引物“pKO3-L”和“PKO3-R”对这个克隆的插入体进行测序。
PKO3-L 5'AGGGCAGGGTCGTTAAATAGC 3' (SEQ ID NO:21)
PKO3-R 5'TTAATGCGCCGCTACAGGGCG 3' (SEQ ID NO:22)
使用引物“pKO3-L”和“PKO3-R”(Eurofins Genomics GmbH，Ebersberg，Germany)确定扩增片段“P(allele)RhtC_Insert”的DNA序列。已经证实了预期的PrhtC等位基因序列，克隆的片段如SEQ ID NO:14示出。
产生的交换载体pKO3rhtC-Pmut如图2所示。
实施例9:MG442的rhtC野生型启动子与PrhtC等位基因的交换
为了将PrhtC等位基因导入大肠杆菌L-苏氨酸生产菌株的染色体中，可以应用以下方法，所述方法是用大肠杆菌菌株MG442中PrhtC的位置特异性诱变举例描述(实施例6)。
为了针对质粒编码的突变构建体交换染色体rhtC启动子，将MG442用质粒pKO3rhtC-Pmut转化。使用Link et al.(Journal of Bacteriology 179:6228-6237(1997))描述的选择程序进行基因交换且已通过测序验证。
交换后，MG442中的PrhtC等位基因如SEQ ID NO:7所示(由Eurofins GenomicsGmbH，Ebersberg，Germany测序)。获得的菌株称作MG442_P(allele)RhtC。
实施例10:使用菌株MG442_P(allele)RhtC制备L-苏氨酸
选择的MG442_P(allele)RhtC和MG442的各个菌落可以在具有以下组成的基本培养基上增殖：3.5g的Na2HPO4.2H2O/l，1.5g的KH2PO4/l，1g的NH4Cl/l，0.1g的MgSO4.7H2O/l，2g葡萄糖/l，20g琼脂/l。可以在包含在100ml Erlenmeyer培养瓶中的10ml分批培养物中检查L-苏氨酸的形成。为此，可以接种具有如下组成的10ml预培养基并在37℃和180rpm在InforsAG(Bottmingen,Switzerland)的Infors HT Multitron标准振荡保温仪上保温16小时：2g酵母提取物/l，10g的(NH4)2SO4/l，1g的KH2PO4/l，0.5g的MgSO4.7H2O/l，15g的CaCO3/l，20g葡萄糖/l。在每种情况中，可将250μl这种预培养物接种到10ml生产培养基(25g的(NH4)2SO4/l，2g的KH2PO4/l，1g的MgSO4.7H2O/l，0.03g的FeSO4.7H2O/l，0.018g的MnSO4*1H2O/l，30g的CaCO3/l，20g葡萄糖/l)并在37℃保温48小时。保温后，可以使用来自Tecan Group AG(Switzerland)的GENiosTM平板读器在660nm测量波长下确定培养悬浮液的光密度(OD)。
然后可以使用来自SYKAM Vertriebs GmbH(Fürstenfeldbruck,Germany)的SYKAMS435氨基酸分析仪，通过离子交换层析法和包含茚三酮检测的柱后反应，确定已经过滤灭菌的培养上清液中所得L-苏氨酸的浓度。
本文引用的所有参考文献均全文并入作参考。现已充分描述了本发明，本领域技术人员了解在不影响本发明的精神或范围或其任何实施方案的前提下，可以在宽且等价的条件、参数等范围内实施本发明。
如下序列包含在序列表中：
SEQ ID No.:描述:
1.大肠杆菌rhtC基因的核苷酸序列
2.大肠杆菌RhtC蛋白的氨基酸序列
3.大肠杆菌thrA基因的核苷酸序列
4.大肠杆菌ThrA蛋白的氨基酸序列
5.粘质沙雷氏菌thrA基因的核苷酸序列
6.粘质沙雷氏菌ThrA蛋白的氨基酸序列
7.野生型大肠杆菌rhtC启动子的核苷酸序列
8.突变的大肠杆菌rhtC启动子的核苷酸序列
9.具有天然存在的5'-侧翼区的野生型大肠杆菌rhtC启动子的核苷酸序列
10.大肠杆菌rhtC基因的核苷酸序列，包括上游和下游核苷酸序列
11.大肠杆菌RhtC蛋白的氨基酸序列
12.含有rhtC基因的长度为0.8kbp的DNA序列的核苷酸序列(此处有突变)
13.RhtC蛋白的氨基酸序列
14.含有等位基因rhtC交换片段的长度为1.4kbp的DNA序列的核苷酸序列
15.引物Tdh1的核苷酸序列
16.引物Tdh2的核苷酸序列
17.引物PrhtC-1的核苷酸序列
18.引物PrhtC-2的核苷酸序列
19.引物reqQ_1的核苷酸序列
20.引物rht1r的核苷酸序列
21.引物PKO3-L的核苷酸序列
22.引物PKO3-R的核苷酸序列
序列表
<110> 赢创德固赛有限公司
<120> 使用改良的肠杆菌科菌株制备 L 氨基酸的方法
<130> 201700370
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 621
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(621)
<223> rhtC Kodierregion
<400> 1
atg ttg atg tta ttt ctc acc gtc gcc atg gtg cac att gtg gcg ctt 48
Met Leu Met Leu Phe Leu Thr Val Ala Met Val His Ile Val Ala Leu
1 5 10 15
atg agc ccc ggt ccc gat ttc ttt ttt gtc tct cag acc gct gtc agt 96
Met Ser Pro Gly Pro Asp Phe Phe Phe Val Ser Gln Thr Ala Val Ser
20 25 30
cgt tcc cgt aaa gaa gcg atg atg ggc gtg ctg ggc att acc tgc ggc 144
Arg Ser Arg Lys Glu Ala Met Met Gly Val Leu Gly Ile Thr Cys Gly
35 40 45
gta atg gtt tgg gct ggg att gcg ctg ctt ggc ctg cat ttg att atc 192
Val Met Val Trp Ala Gly Ile Ala Leu Leu Gly Leu His Leu Ile Ile
50 55 60
gaa aaa atg gcc tgg ctg cat acg ctg att atg gtg ggc ggt ggc ctg 240
Glu Lys Met Ala Trp Leu His Thr Leu Ile Met Val Gly Gly Gly Leu
65 70 75 80
tat ctc tgc tgg atg ggt tac cag atg cta cgt ggt gca ctg aaa aaa 288
Tyr Leu Cys Trp Met Gly Tyr Gln Met Leu Arg Gly Ala Leu Lys Lys
85 90 95
gag gcg gtt tct gca cct gcg cca cag gtc gag ctg gcg aaa agt ggg 336
Glu Ala Val Ser Ala Pro Ala Pro Gln Val Glu Leu Ala Lys Ser Gly
100 105 110
cgc agt ttc ctg aaa ggt tta ctg acc aat ctc gct aat ccg aaa gcg 384
Arg Ser Phe Leu Lys Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asn Pro Lys Ala
115 120 125
att atc tac ttt ggc tcg gtg ttc tca ttg ttt gtc ggt gat aac gtt 432
Ile Ile Tyr Phe Gly Ser Val Phe Ser Leu Phe Val Gly Asp Asn Val
130 135 140
ggc act acc gcg cgc tgg ggc att ttt gcg ctg atc att gtc gaa acg 480
Gly Thr Thr Ala Arg Trp Gly Ile Phe Ala Leu Ile Ile Val Glu Thr
145 150 155 160
ctg gcg tgg ttt acc gtc gtt gcc agc ctg ttt gcc ctg ccg caa atg 528
Leu Ala Trp Phe Thr Val Val Ala Ser Leu Phe Ala Leu Pro Gln Met
165 170 175
cgc cgt ggt tat caa cgt ctg gcg aag tgg att gat ggt ttt gcc ggg 576
Arg Arg Gly Tyr Gln Arg Leu Ala Lys Trp Ile Asp Gly Phe Ala Gly
180 185 190
gcg tta ttt gcc gga ttt ggc att cat ttg att att tcg cgg tga 621
Ala Leu Phe Ala Gly Phe Gly Ile His Leu Ile Ile Ser Arg
195 200 205
<210> 2
<211> 206
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 2
Met Leu Met Leu Phe Leu Thr Val Ala Met Val His Ile Val Ala Leu
1 5 10 15
Met Ser Pro Gly Pro Asp Phe Phe Phe Val Ser Gln Thr Ala Val Ser
20 25 30
Arg Ser Arg Lys Glu Ala Met Met Gly Val Leu Gly Ile Thr Cys Gly
35 40 45
Val Met Val Trp Ala Gly Ile Ala Leu Leu Gly Leu His Leu Ile Ile
50 55 60
Glu Lys Met Ala Trp Leu His Thr Leu Ile Met Val Gly Gly Gly Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Cys Trp Met Gly Tyr Gln Met Leu Arg Gly Ala Leu Lys Lys
85 90 95
Glu Ala Val Ser Ala Pro Ala Pro Gln Val Glu Leu Ala Lys Ser Gly
100 105 110
Arg Ser Phe Leu Lys Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asn Pro Lys Ala
115 120 125
Ile Ile Tyr Phe Gly Ser Val Phe Ser Leu Phe Val Gly Asp Asn Val
130 135 140
Gly Thr Thr Ala Arg Trp Gly Ile Phe Ala Leu Ile Ile Val Glu Thr
145 150 155 160
Leu Ala Trp Phe Thr Val Val Ala Ser Leu Phe Ala Leu Pro Gln Met
165 170 175
Arg Arg Gly Tyr Gln Arg Leu Ala Lys Trp Ile Asp Gly Phe Ala Gly
180 185 190
Ala Leu Phe Ala Gly Phe Gly Ile His Leu Ile Ile Ser Arg
195 200 205
<210> 3
<211> 2463
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2463)
<223> thrA-Kodierregion
<400> 3
atg cga gtg ttg aag ttc ggc ggt aca tca gtg gca aat gca gaa cgt 48
Met Arg Val Leu Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asn Ala Glu Arg
1 5 10 15
ttt ctg cgt gtt gcc gat att ctg gaa agc aat gcc agg cag ggg cag 96
Phe Leu Arg Val Ala Asp Ile Leu Glu Ser Asn Ala Arg Gln Gly Gln
20 25 30
gtg gcc acc gtc ctc tct gcc ccc gcc aaa atc acc aac cac ctg gtg 144
Val Ala Thr Val Leu Ser Ala Pro Ala Lys Ile Thr Asn His Leu Val
35 40 45
gcg atg att gaa aaa acc att agc ggc cag gat gct tta ccc aat atc 192
Ala Met Ile Glu Lys Thr Ile Ser Gly Gln Asp Ala Leu Pro Asn Ile
50 55 60
agc gat gcc gaa cgt att ttt gcc gaa ctt ttg acg gga ctc gcc gcc 240
Ser Asp Ala Glu Arg Ile Phe Ala Glu Leu Leu Thr Gly Leu Ala Ala
65 70 75 80
gcc cag ccg ggg ttc ccg ctg gcg caa ttg aaa act ttc gtc gat cag 288
Ala Gln Pro Gly Phe Pro Leu Ala Gln Leu Lys Thr Phe Val Asp Gln
85 90 95
gaa ttt gcc caa ata aaa cat gtc ctg cat ggc att agt ttg ttg ggg 336
Glu Phe Ala Gln Ile Lys His Val Leu His Gly Ile Ser Leu Leu Gly
100 105 110
cag tgc ccg gat agc atc aac gct gcg ctg att tgc cgt ggc gag aaa 384
Gln Cys Pro Asp Ser Ile Asn Ala Ala Leu Ile Cys Arg Gly Glu Lys
115 120 125
atg tcg atc gcc att atg gcc ggc gta tta gaa gcg cgc ggt cac aac 432
Met Ser Ile Ala Ile Met Ala Gly Val Leu Glu Ala Arg Gly His Asn
130 135 140
gtt act gtt atc gat ccg gtc gaa aaa ctg ctg gca gtg ggg cat tac 480
Val Thr Val Ile Asp Pro Val Glu Lys Leu Leu Ala Val Gly His Tyr
145 150 155 160
ctc gaa tct acc gtc gat att gct gag tcc acc cgc cgt att gcg gca 528
Leu Glu Ser Thr Val Asp Ile Ala Glu Ser Thr Arg Arg Ile Ala Ala
165 170 175
agc cgc att ccg gct gat cac atg gtg ctg atg gca ggt ttc acc gcc 576
Ser Arg Ile Pro Ala Asp His Met Val Leu Met Ala Gly Phe Thr Ala
180 185 190
ggt aat gaa aaa ggc gaa ctg gtg gtg ctt gga cgc aac ggt tcc gac 624
Gly Asn Glu Lys Gly Glu Leu Val Val Leu Gly Arg Asn Gly Ser Asp
195 200 205
tac tct gct gcg gtg ctg gct gcc tgt tta cgc gcc gat tgt tgc gag 672
Tyr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Cys Leu Arg Ala Asp Cys Cys Glu
210 215 220
att tgg acg gac gtt gac ggg gtc tat acc tgc gac ccg cgt cag gtg 720
Ile Trp Thr Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Cys Asp Pro Arg Gln Val
225 230 235 240
ccc gat gcg agg ttg ttg aag tcg atg tcc tac cag gaa gcg atg gag 768
Pro Asp Ala Arg Leu Leu Lys Ser Met Ser Tyr Gln Glu Ala Met Glu
245 250 255
ctt tcc tac ttc ggc gct aaa gtt ctt cac ccc cgc acc att acc ccc 816
Leu Ser Tyr Phe Gly Ala Lys Val Leu His Pro Arg Thr Ile Thr Pro
260 265 270
atc gcc cag ttc cag atc cct tgc ctg att aaa aat acc gga aat cct 864
Ile Ala Gln Phe Gln Ile Pro Cys Leu Ile Lys Asn Thr Gly Asn Pro
275 280 285
caa gca cca ggt acg ctc att ggt gcc agc cgt gat gaa gac gaa tta 912
Gln Ala Pro Gly Thr Leu Ile Gly Ala Ser Arg Asp Glu Asp Glu Leu
290 295 300
ccg gtc aag ggc att tcc aat ctg aat aac atg gca atg ttc agc gtt 960
Pro Val Lys Gly Ile Ser Asn Leu Asn Asn Met Ala Met Phe Ser Val
305 310 315 320
tct ggt ccg ggg atg aaa ggg atg gtc ggc atg gcg gcg cgc gtc ttt 1008
Ser Gly Pro Gly Met Lys Gly Met Val Gly Met Ala Ala Arg Val Phe
325 330 335
gca gcg atg tca cgc gcc cgt att tcc gtg gtg ctg att acg caa tca 1056
Ala Ala Met Ser Arg Ala Arg Ile Ser Val Val Leu Ile Thr Gln Ser
340 345 350
tct tcc gaa tac agc atc agt ttc tgc gtt cca caa agc gac tgt gtg 1104
Ser Ser Glu Tyr Ser Ile Ser Phe Cys Val Pro Gln Ser Asp Cys Val
355 360 365
cga gct gaa cgg gca atg cag gaa gag ttc tac ctg gaa ctg aaa gaa 1152
Arg Ala Glu Arg Ala Met Gln Glu Glu Phe Tyr Leu Glu Leu Lys Glu
370 375 380
ggc tta ctg gag ccg ctg gca gtg acg gaa cgg ctg gcc att atc tcg 1200
Gly Leu Leu Glu Pro Leu Ala Val Thr Glu Arg Leu Ala Ile Ile Ser
385 390 395 400
gtg gta ggt gat ggt atg cgc acc ttg cgt ggg atc tcg gcg aaa ttc 1248
Val Val Gly Asp Gly Met Arg Thr Leu Arg Gly Ile Ser Ala Lys Phe
405 410 415
ttt gcc gca ctg gcc cgc gcc aat atc aac att gtc gcc att gct cag 1296
Phe Ala Ala Leu Ala Arg Ala Asn Ile Asn Ile Val Ala Ile Ala Gln
420 425 430
gga tct tct gaa cgc tca atc tct gtc gtg gta aat aac gat gat gcg 1344
Gly Ser Ser Glu Arg Ser Ile Ser Val Val Val Asn Asn Asp Asp Ala
435 440 445
acc act ggc gtg cgc gtt act cat cag atg ctg ttc aat acc gat cag 1392
Thr Thr Gly Val Arg Val Thr His Gln Met Leu Phe Asn Thr Asp Gln
450 455 460
gtt atc gaa gtg ttt gtg att ggc gtc ggt ggc gtt ggc ggt gcg ctg 1440
Val Ile Glu Val Phe Val Ile Gly Val Gly Gly Val Gly Gly Ala Leu
465 470 475 480
ctg gag caa ctg aag cgt cag caa agc tgg ctg aag aat aaa cat atc 1488
Leu Glu Gln Leu Lys Arg Gln Gln Ser Trp Leu Lys Asn Lys His Ile
485 490 495
gac tta cgt gtc tgc ggt gtt gcc aac tcg aag gct ctg ctc acc aat 1536
Asp Leu Arg Val Cys Gly Val Ala Asn Ser Lys Ala Leu Leu Thr Asn
500 505 510
gta cat ggc ctt aat ctg gaa aac tgg cag gaa gaa ctg gcg caa gcc 1584
Val His Gly Leu Asn Leu Glu Asn Trp Gln Glu Glu Leu Ala Gln Ala
515 520 525
aaa gag ccg ttt aat ctc ggg cgc tta att cgc ctc gtg aaa gaa tat 1632
Lys Glu Pro Phe Asn Leu Gly Arg Leu Ile Arg Leu Val Lys Glu Tyr
530 535 540
cat ctg ctg aac ccg gtc att gtt gac tgc act tcc agc cag gca gtg 1680
His Leu Leu Asn Pro Val Ile Val Asp Cys Thr Ser Ser Gln Ala Val
545 550 555 560
gcg gat caa tat gcc gac ttc ctg cgc gaa ggt ttc cac gtt gtc acg 1728
Ala Asp Gln Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Glu Gly Phe His Val Val Thr
565 570 575
ccg aac aaa aag gcc aac acc tcg tcg atg gat tac tac cat cag ttg 1776
Pro Asn Lys Lys Ala Asn Thr Ser Ser Met Asp Tyr Tyr His Gln Leu
580 585 590
cgt tat gcg gcg gaa aaa tcg cgg cgt aaa ttc ctc tat gac acc aac 1824
Arg Tyr Ala Ala Glu Lys Ser Arg Arg Lys Phe Leu Tyr Asp Thr Asn
595 600 605
gtt ggg gct gga tta ccg gtt att gag aac ctg caa aat ctg ctc aat 1872
Val Gly Ala Gly Leu Pro Val Ile Glu Asn Leu Gln Asn Leu Leu Asn
610 615 620
gca ggt gat gaa ttg atg aag ttc tcc ggc att ctt tct ggt tcg ctt 1920
Ala Gly Asp Glu Leu Met Lys Phe Ser Gly Ile Leu Ser Gly Ser Leu
625 630 635 640
tct tat atc ttc ggc aag tta gac gaa ggc atg agt ttc tcc gag gcg 1968
Ser Tyr Ile Phe Gly Lys Leu Asp Glu Gly Met Ser Phe Ser Glu Ala
645 650 655
acc acg ctg gcg cgg gaa atg ggt tat acc gaa ccg gac ccg cga gat 2016
Thr Thr Leu Ala Arg Glu Met Gly Tyr Thr Glu Pro Asp Pro Arg Asp
660 665 670
gat ctt tct ggt atg gat gtg gcg cgt aaa cta ttg att ctc gct cgt 2064
Asp Leu Ser Gly Met Asp Val Ala Arg Lys Leu Leu Ile Leu Ala Arg
675 680 685
gaa acg gga cgt gaa ctg gag ctg gcg gat att gaa att gaa cct gtg 2112
Glu Thr Gly Arg Glu Leu Glu Leu Ala Asp Ile Glu Ile Glu Pro Val
690 695 700
ctg ccc gca gag ttt aac gcc gag ggt gat gtt gcc gct ttt atg gcg 2160
Leu Pro Ala Glu Phe Asn Ala Glu Gly Asp Val Ala Ala Phe Met Ala
705 710 715 720
aat ctg tca caa ctc gac gat ctc ttt gcc gcg cgc gtg gcg aag gcc 2208
Asn Leu Ser Gln Leu Asp Asp Leu Phe Ala Ala Arg Val Ala Lys Ala
725 730 735
cgt gat gaa gga aaa gtt ttg cgc tat gtt ggc aat att gat gaa gat 2256
Arg Asp Glu Gly Lys Val Leu Arg Tyr Val Gly Asn Ile Asp Glu Asp
740 745 750
ggc gtc tgc cgc gtg aag att gcc gaa gtg gat ggt aat gat ccg ctg 2304
Gly Val Cys Arg Val Lys Ile Ala Glu Val Asp Gly Asn Asp Pro Leu
755 760 765
ttc aaa gtg aaa aat ggc gaa aac gcc ctg gcc ttc tat agc cac tat 2352
Phe Lys Val Lys Asn Gly Glu Asn Ala Leu Ala Phe Tyr Ser His Tyr
770 775 780
tat cag ccg ctg ccg ttg gta ctg cgc gga tat ggt gcg ggc aat gac 2400
Tyr Gln Pro Leu Pro Leu Val Leu Arg Gly Tyr Gly Ala Gly Asn Asp
785 790 795 800
gtt aca gct gcc ggt gtc ttt gct gat ctg cta cgt acc ctc tca tgg 2448
Val Thr Ala Ala Gly Val Phe Ala Asp Leu Leu Arg Thr Leu Ser Trp
805 810 815
aag tta gga gtc tga 2463
Lys Leu Gly Val
820
<210> 4
<211> 820
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 4
Met Arg Val Leu Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asn Ala Glu Arg
1 5 10 15
Phe Leu Arg Val Ala Asp Ile Leu Glu Ser Asn Ala Arg Gln Gly Gln
20 25 30
Val Ala Thr Val Leu Ser Ala Pro Ala Lys Ile Thr Asn His Leu Val
35 40 45
Ala Met Ile Glu Lys Thr Ile Ser Gly Gln Asp Ala Leu Pro Asn Ile
50 55 60
Ser Asp Ala Glu Arg Ile Phe Ala Glu Leu Leu Thr Gly Leu Ala Ala
65 70 75 80
Ala Gln Pro Gly Phe Pro Leu Ala Gln Leu Lys Thr Phe Val Asp Gln
85 90 95
Glu Phe Ala Gln Ile Lys His Val Leu His Gly Ile Ser Leu Leu Gly
100 105 110
Gln Cys Pro Asp Ser Ile Asn Ala Ala Leu Ile Cys Arg Gly Glu Lys
115 120 125
Met Ser Ile Ala Ile Met Ala Gly Val Leu Glu Ala Arg Gly His Asn
130 135 140
Val Thr Val Ile Asp Pro Val Glu Lys Leu Leu Ala Val Gly His Tyr
145 150 155 160
Leu Glu Ser Thr Val Asp Ile Ala Glu Ser Thr Arg Arg Ile Ala Ala
165 170 175
Ser Arg Ile Pro Ala Asp His Met Val Leu Met Ala Gly Phe Thr Ala
180 185 190
Gly Asn Glu Lys Gly Glu Leu Val Val Leu Gly Arg Asn Gly Ser Asp
195 200 205
Tyr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Cys Leu Arg Ala Asp Cys Cys Glu
210 215 220
Ile Trp Thr Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Cys Asp Pro Arg Gln Val
225 230 235 240
Pro Asp Ala Arg Leu Leu Lys Ser Met Ser Tyr Gln Glu Ala Met Glu
245 250 255
Leu Ser Tyr Phe Gly Ala Lys Val Leu His Pro Arg Thr Ile Thr Pro
260 265 270
Ile Ala Gln Phe Gln Ile Pro Cys Leu Ile Lys Asn Thr Gly Asn Pro
275 280 285
Gln Ala Pro Gly Thr Leu Ile Gly Ala Ser Arg Asp Glu Asp Glu Leu
290 295 300
Pro Val Lys Gly Ile Ser Asn Leu Asn Asn Met Ala Met Phe Ser Val
305 310 315 320
Ser Gly Pro Gly Met Lys Gly Met Val Gly Met Ala Ala Arg Val Phe
325 330 335
Ala Ala Met Ser Arg Ala Arg Ile Ser Val Val Leu Ile Thr Gln Ser
340 345 350
Ser Ser Glu Tyr Ser Ile Ser Phe Cys Val Pro Gln Ser Asp Cys Val
355 360 365
Arg Ala Glu Arg Ala Met Gln Glu Glu Phe Tyr Leu Glu Leu Lys Glu
370 375 380
Gly Leu Leu Glu Pro Leu Ala Val Thr Glu Arg Leu Ala Ile Ile Ser
385 390 395 400
Val Val Gly Asp Gly Met Arg Thr Leu Arg Gly Ile Ser Ala Lys Phe
405 410 415
Phe Ala Ala Leu Ala Arg Ala Asn Ile Asn Ile Val Ala Ile Ala Gln
420 425 430
Gly Ser Ser Glu Arg Ser Ile Ser Val Val Val Asn Asn Asp Asp Ala
435 440 445
Thr Thr Gly Val Arg Val Thr His Gln Met Leu Phe Asn Thr Asp Gln
450 455 460
Val Ile Glu Val Phe Val Ile Gly Val Gly Gly Val Gly Gly Ala Leu
465 470 475 480
Leu Glu Gln Leu Lys Arg Gln Gln Ser Trp Leu Lys Asn Lys His Ile
485 490 495
Asp Leu Arg Val Cys Gly Val Ala Asn Ser Lys Ala Leu Leu Thr Asn
500 505 510
Val His Gly Leu Asn Leu Glu Asn Trp Gln Glu Glu Leu Ala Gln Ala
515 520 525
Lys Glu Pro Phe Asn Leu Gly Arg Leu Ile Arg Leu Val Lys Glu Tyr
530 535 540
His Leu Leu Asn Pro Val Ile Val Asp Cys Thr Ser Ser Gln Ala Val
545 550 555 560
Ala Asp Gln Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Glu Gly Phe His Val Val Thr
565 570 575
Pro Asn Lys Lys Ala Asn Thr Ser Ser Met Asp Tyr Tyr His Gln Leu
580 585 590
Arg Tyr Ala Ala Glu Lys Ser Arg Arg Lys Phe Leu Tyr Asp Thr Asn
595 600 605
Val Gly Ala Gly Leu Pro Val Ile Glu Asn Leu Gln Asn Leu Leu Asn
610 615 620
Ala Gly Asp Glu Leu Met Lys Phe Ser Gly Ile Leu Ser Gly Ser Leu
625 630 635 640
Ser Tyr Ile Phe Gly Lys Leu Asp Glu Gly Met Ser Phe Ser Glu Ala
645 650 655
Thr Thr Leu Ala Arg Glu Met Gly Tyr Thr Glu Pro Asp Pro Arg Asp
660 665 670
Asp Leu Ser Gly Met Asp Val Ala Arg Lys Leu Leu Ile Leu Ala Arg
675 680 685
Glu Thr Gly Arg Glu Leu Glu Leu Ala Asp Ile Glu Ile Glu Pro Val
690 695 700
Leu Pro Ala Glu Phe Asn Ala Glu Gly Asp Val Ala Ala Phe Met Ala
705 710 715 720
Asn Leu Ser Gln Leu Asp Asp Leu Phe Ala Ala Arg Val Ala Lys Ala
725 730 735
Arg Asp Glu Gly Lys Val Leu Arg Tyr Val Gly Asn Ile Asp Glu Asp
740 745 750
Gly Val Cys Arg Val Lys Ile Ala Glu Val Asp Gly Asn Asp Pro Leu
755 760 765
Phe Lys Val Lys Asn Gly Glu Asn Ala Leu Ala Phe Tyr Ser His Tyr
770 775 780
Tyr Gln Pro Leu Pro Leu Val Leu Arg Gly Tyr Gly Ala Gly Asn Asp
785 790 795 800
Val Thr Ala Ala Gly Val Phe Ala Asp Leu Leu Arg Thr Leu Ser Trp
805 810 815
Lys Leu Gly Val
820
<210> 5
<211> 2460
<212> DNA
<213> Serratia marcescens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2460)
<223> thrA Kodierregion
<400> 5
atg cga gtg ctg aaa ttt ggc gga acc tcg gta gcg aat gcg gaa cgt 48
Met Arg Val Leu Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asn Ala Glu Arg
1 5 10 15
ttt ctg cgc gtc gcc gac atc atg gag agt aac gcg cgt cag gga cag 96
Phe Leu Arg Val Ala Asp Ile Met Glu Ser Asn Ala Arg Gln Gly Gln
20 25 30
gta gcc acg gtc ttg tcc gcc ccc gca aag atc acc aac cat ctg gtg 144
Val Ala Thr Val Leu Ser Ala Pro Ala Lys Ile Thr Asn His Leu Val
35 40 45
gcg atg atc gac aaa acg gtg gcg ggc cag gac att ctg ccg aat atg 192
Ala Met Ile Asp Lys Thr Val Ala Gly Gln Asp Ile Leu Pro Asn Met
50 55 60
agc gac gcc gag cgg atc ttt gcc gac ctg ctg agc gga ctg gcg cag 240
Ser Asp Ala Glu Arg Ile Phe Ala Asp Leu Leu Ser Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80
gcg ctg ccg ggc ttt gaa tac gat cgt ttg aaa ggc gtg gtc gat cag 288
Ala Leu Pro Gly Phe Glu Tyr Asp Arg Leu Lys Gly Val Val Asp Gln
85 90 95
gaa ttc gcg cag ctc aaa cag gtg ctg cat ggc gtc tcg ctg ctg ggg 336
Glu Phe Ala Gln Leu Lys Gln Val Leu His Gly Val Ser Leu Leu Gly
100 105 110
cag tgc ccg gac agc gtg aac gcg gcg atc atc tgc cgt ggc gaa aag 384
Gln Cys Pro Asp Ser Val Asn Ala Ala Ile Ile Cys Arg Gly Glu Lys
115 120 125
ctc tcc atc gcc atc atg gaa ggg gtg ttc cgc gcc aag ggt tat ccg 432
Leu Ser Ile Ala Ile Met Glu Gly Val Phe Arg Ala Lys Gly Tyr Pro
130 135 140
gtc acg gtg atc aac ccg gtg gag aaa ctg ctg gcg cag ggc cac tac 480
Val Thr Val Ile Asn Pro Val Glu Lys Leu Leu Ala Gln Gly His Tyr
145 150 155 160
ctg gag tcc acc gtg gac atc gcc gag tct acg ctg cgc atc gcc gcc 528
Leu Glu Ser Thr Val Asp Ile Ala Glu Ser Thr Leu Arg Ile Ala Ala
165 170 175
gcg gcg atc ccg gcc gat cac atc gtg ctg atg gcc ggt ttc acc gcc 576
Ala Ala Ile Pro Ala Asp His Ile Val Leu Met Ala Gly Phe Thr Ala
180 185 190
ggt aat gat aag ggc gag ctg gtg gtg ctg ggc cgc aac ggc tcc gac 624
Gly Asn Asp Lys Gly Glu Leu Val Val Leu Gly Arg Asn Gly Ser Asp
195 200 205
tat tcc gcc gcg gtg ctg gcc gcc tgc ctg cgc gcc gac tgt tgc gag 672
Tyr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Cys Leu Arg Ala Asp Cys Cys Glu
210 215 220
atc tgg acc gac gtc gac ggc gtt tat acc tgc gat ccg cgc acc gtg 720
Ile Trp Thr Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Cys Asp Pro Arg Thr Val
225 230 235 240
ccg gac gcc agg tta ctg aaa tcg atg tcg tac cag gaa gcg atg gag 768
Pro Asp Ala Arg Leu Leu Lys Ser Met Ser Tyr Gln Glu Ala Met Glu
245 250 255
ctt tcc tat ttc ggc gcc aaa gtg tta cac ccc cgc acc atc act ccg 816
Leu Ser Tyr Phe Gly Ala Lys Val Leu His Pro Arg Thr Ile Thr Pro
260 265 270
att gcc cag ttt caa atc cct tgc ctg att aaa aac acc tcc aac ccg 864
Ile Ala Gln Phe Gln Ile Pro Cys Leu Ile Lys Asn Thr Ser Asn Pro
275 280 285
cag gcc ccc ggc acg ctg atc ggc aaa gac agc acc gat gcc gat atg 912
Gln Ala Pro Gly Thr Leu Ile Gly Lys Asp Ser Thr Asp Ala Asp Met
290 295 300
ccg gtg aag ggc atc acc aac ctg aac aac atg gcg atg atc aac gtc 960
Pro Val Lys Gly Ile Thr Asn Leu Asn Asn Met Ala Met Ile Asn Val
305 310 315 320
tcc ggc ccg ggc atg aaa ggc atg gtc ggc atg gcc gca cgg gtc ttc 1008
Ser Gly Pro Gly Met Lys Gly Met Val Gly Met Ala Ala Arg Val Phe
325 330 335
gcc gtg atg tcg cgc gcc ggc att tcg gtg gtg ctg atc acc caa tcc 1056
Ala Val Met Ser Arg Ala Gly Ile Ser Val Val Leu Ile Thr Gln Ser
340 345 350
tct tcc gaa tac agc atc agc ttc tgc gtg ccg cag ggt gaa ctg cag 1104
Ser Ser Glu Tyr Ser Ile Ser Phe Cys Val Pro Gln Gly Glu Leu Gln
355 360 365
cgc gcc cgt cgc gcg ctg gaa gag gag ttc tat ctg gag ctg aaa gac 1152
Arg Ala Arg Arg Ala Leu Glu Glu Glu Phe Tyr Leu Glu Leu Lys Asp
370 375 380
ggc gtg ctg gat ccg ctg gac gtg atg gaa cgc ctg gcg atc atc tcg 1200
Gly Val Leu Asp Pro Leu Asp Val Met Glu Arg Leu Ala Ile Ile Ser
385 390 395 400
gtg gtt ggc gac ggc atg cgc acc ctg cgc ggc att tcc gca cgc ttc 1248
Val Val Gly Asp Gly Met Arg Thr Leu Arg Gly Ile Ser Ala Arg Phe
405 410 415
ttc tcc gcg ctg gcg cgc gcc aac atc aat atc gtt gcc atc gcc caa 1296
Phe Ser Ala Leu Ala Arg Ala Asn Ile Asn Ile Val Ala Ile Ala Gln
420 425 430
ggg tct tcc gaa cgt tcc att tcg gtg gtg gtc agc aat gat tcc gcc 1344
Gly Ser Ser Glu Arg Ser Ile Ser Val Val Val Ser Asn Asp Ser Ala
435 440 445
acc acc ggc gtg cgc gtc agc cac cag atg ctg ttc aac acc gat cag 1392
Thr Thr Gly Val Arg Val Ser His Gln Met Leu Phe Asn Thr Asp Gln
450 455 460
gtg atc gaa gtg ttc gtc atc ggc gtc ggc ggc gtc ggc ggg gcg ctg 1440
Val Ile Glu Val Phe Val Ile Gly Val Gly Gly Val Gly Gly Ala Leu
465 470 475 480
atc gag cag atc tat cgc cag cag ccg tgg ctg aag caa aaa cat atc 1488
Ile Glu Gln Ile Tyr Arg Gln Gln Pro Trp Leu Lys Gln Lys His Ile
485 490 495
gat ctg cgg gtg tgc ggc atc gcc aac tcg cgc gtg atg ctg acc aat 1536
Asp Leu Arg Val Cys Gly Ile Ala Asn Ser Arg Val Met Leu Thr Asn
500 505 510
gtg cac ggc atc gcg ctg gac agc tgg cgc gac gcg ctg gcc ggc gcg 1584
Val His Gly Ile Ala Leu Asp Ser Trp Arg Asp Ala Leu Ala Gly Ala
515 520 525
cag gag ccg ttc aat ctc ggc cgt ctg atc cgg ctg gtg aag gaa tat 1632
Gln Glu Pro Phe Asn Leu Gly Arg Leu Ile Arg Leu Val Lys Glu Tyr
530 535 540
cac ctg ctg aac ccg gtg atc gtc gac tgt acc tcc agt cag gcg gtg 1680
His Leu Leu Asn Pro Val Ile Val Asp Cys Thr Ser Ser Gln Ala Val
545 550 555 560
gcc gat cag tac gtg gac ttc ctg gcg gac ggc ttc cat gtg gtg acg 1728
Ala Asp Gln Tyr Val Asp Phe Leu Ala Asp Gly Phe His Val Val Thr
565 570 575
ccg aac aaa aag gcc aac acc tcg tcg atg aac tat tat cag caa ctg 1776
Pro Asn Lys Lys Ala Asn Thr Ser Ser Met Asn Tyr Tyr Gln Gln Leu
580 585 590
cgc gcg gcc gcc gcc ggt tcg cat cgc aag ttc ctg tac gac acc aac 1824
Arg Ala Ala Ala Ala Gly Ser His Arg Lys Phe Leu Tyr Asp Thr Asn
595 600 605
gtc ggt gcc ggt ctg ccg gtg att gag aac ctg caa aac ctg ctg aac 1872
Val Gly Ala Gly Leu Pro Val Ile Glu Asn Leu Gln Asn Leu Leu Asn
610 615 620
gcc ggt gat gaa ctg gta cgt ttc tcc ggt atc ctg tcc ggc tcg ctg 1920
Ala Gly Asp Glu Leu Val Arg Phe Ser Gly Ile Leu Ser Gly Ser Leu
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tcc ttt atc ttc ggc aag ctg gac gaa ggg ctg tcg ctg tcg gcg gcg 1968
Ser Phe Ile Phe Gly Lys Leu Asp Glu Gly Leu Ser Leu Ser Ala Ala
645 650 655
acc ctg cag gcc cgg gcc aac ggc tac acc gag ccg gat ccg cgc gac 2016
Thr Leu Gln Ala Arg Ala Asn Gly Tyr Thr Glu Pro Asp Pro Arg Asp
660 665 670
gat ctg tcc ggg atg gat gtg gcg cgt aag ctg ctg atc ctg gcg cgc 2064
Asp Leu Ser Gly Met Asp Val Ala Arg Lys Leu Leu Ile Leu Ala Arg
675 680 685
gag gcc ggt tac aaa ctg gaa ctg agc gat atc gag gtc gag ccg gtg 2112
Glu Ala Gly Tyr Lys Leu Glu Leu Ser Asp Ile Glu Val Glu Pro Val
690 695 700
ctg ccg ccg tcc ttc gac gcg tcg ggc gac gtg gac acc ttc ctg gcg 2160
Leu Pro Pro Ser Phe Asp Ala Ser Gly Asp Val Asp Thr Phe Leu Ala
705 710 715 720
cgg ttg ccg gag ctg gat aaa gag ttc gcg cgc aac gtg gct aac gcc 2208
Arg Leu Pro Glu Leu Asp Lys Glu Phe Ala Arg Asn Val Ala Asn Ala
725 730 735
gcc gag caa ggc aag gtg ctg cgc tat gtc ggc ctg atc gac gaa ggg 2256
Ala Glu Gln Gly Lys Val Leu Arg Tyr Val Gly Leu Ile Asp Glu Gly
740 745 750
cgc tgc aag gtg cgc att gag gcg gtg gac ggc aac gat ccg ttg tat 2304
Arg Cys Lys Val Arg Ile Glu Ala Val Asp Gly Asn Asp Pro Leu Tyr
755 760 765
aaa gtg aag aac ggc gag aac gcg ctg gcc ttc tac agc cgc tac tat 2352
Lys Val Lys Asn Gly Glu Asn Ala Leu Ala Phe Tyr Ser Arg Tyr Tyr
770 775 780
cag ccg ttg ccg ctg gtg ctg cgc ggc tac ggc gcc ggt aac gat gtg 2400
Gln Pro Leu Pro Leu Val Leu Arg Gly Tyr Gly Ala Gly Asn Asp Val
785 790 795 800
act gca gcg ggc gta ttc gcc gat ctg ctg cgc aca ctg tca tgg aag 2448
Thr Ala Ala Gly Val Phe Ala Asp Leu Leu Arg Thr Leu Ser Trp Lys
805 810 815
ttg gga gtt taa 2460
Leu Gly Val
<210> 6
<211> 819
<212> PRT
<213> Serratia marcescens
<400> 6
Met Arg Val Leu Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asn Ala Glu Arg
1 5 10 15
Phe Leu Arg Val Ala Asp Ile Met Glu Ser Asn Ala Arg Gln Gly Gln
20 25 30
Val Ala Thr Val Leu Ser Ala Pro Ala Lys Ile Thr Asn His Leu Val
35 40 45
Ala Met Ile Asp Lys Thr Val Ala Gly Gln Asp Ile Leu Pro Asn Met
50 55 60
Ser Asp Ala Glu Arg Ile Phe Ala Asp Leu Leu Ser Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80
Ala Leu Pro Gly Phe Glu Tyr Asp Arg Leu Lys Gly Val Val Asp Gln
85 90 95
Glu Phe Ala Gln Leu Lys Gln Val Leu His Gly Val Ser Leu Leu Gly
100 105 110
Gln Cys Pro Asp Ser Val Asn Ala Ala Ile Ile Cys Arg Gly Glu Lys
115 120 125
Leu Ser Ile Ala Ile Met Glu Gly Val Phe Arg Ala Lys Gly Tyr Pro
130 135 140
Val Thr Val Ile Asn Pro Val Glu Lys Leu Leu Ala Gln Gly His Tyr
145 150 155 160
Leu Glu Ser Thr Val Asp Ile Ala Glu Ser Thr Leu Arg Ile Ala Ala
165 170 175
Ala Ala Ile Pro Ala Asp His Ile Val Leu Met Ala Gly Phe Thr Ala
180 185 190
Gly Asn Asp Lys Gly Glu Leu Val Val Leu Gly Arg Asn Gly Ser Asp
195 200 205
Tyr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Cys Leu Arg Ala Asp Cys Cys Glu
210 215 220
Ile Trp Thr Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Cys Asp Pro Arg Thr Val
225 230 235 240
Pro Asp Ala Arg Leu Leu Lys Ser Met Ser Tyr Gln Glu Ala Met Glu
245 250 255
Leu Ser Tyr Phe Gly Ala Lys Val Leu His Pro Arg Thr Ile Thr Pro
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Ser Gly Pro Gly Met Lys Gly Met Val Gly Met Ala Ala Arg Val Phe
325 330 335
Ala Val Met Ser Arg Ala Gly Ile Ser Val Val Leu Ile Thr Gln Ser
340 345 350
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355 360 365
Arg Ala Arg Arg Ala Leu Glu Glu Glu Phe Tyr Leu Glu Leu Lys Asp
370 375 380
Gly Val Leu Asp Pro Leu Asp Val Met Glu Arg Leu Ala Ile Ile Ser
385 390 395 400
Val Val Gly Asp Gly Met Arg Thr Leu Arg Gly Ile Ser Ala Arg Phe
405 410 415
Phe Ser Ala Leu Ala Arg Ala Asn Ile Asn Ile Val Ala Ile Ala Gln
420 425 430
Gly Ser Ser Glu Arg Ser Ile Ser Val Val Val Ser Asn Asp Ser Ala
435 440 445
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450 455 460
Val Ile Glu Val Phe Val Ile Gly Val Gly Gly Val Gly Gly Ala Leu
465 470 475 480
Ile Glu Gln Ile Tyr Arg Gln Gln Pro Trp Leu Lys Gln Lys His Ile
485 490 495
Asp Leu Arg Val Cys Gly Ile Ala Asn Ser Arg Val Met Leu Thr Asn
500 505 510
Val His Gly Ile Ala Leu Asp Ser Trp Arg Asp Ala Leu Ala Gly Ala
515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Ala Asp Gln Tyr Val Asp Phe Leu Ala Asp Gly Phe His Val Val Thr
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580 585 590
Arg Ala Ala Ala Ala Gly Ser His Arg Lys Phe Leu Tyr Asp Thr Asn
595 600 605
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Thr Leu Gln Ala Arg Ala Asn Gly Tyr Thr Glu Pro Asp Pro Arg Asp
660 665 670
Asp Leu Ser Gly Met Asp Val Ala Arg Lys Leu Leu Ile Leu Ala Arg
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Glu Ala Gly Tyr Lys Leu Glu Leu Ser Asp Ile Glu Val Glu Pro Val
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Leu Pro Pro Ser Phe Asp Ala Ser Gly Asp Val Asp Thr Phe Leu Ala
705 710 715 720
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725 730 735
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740 745 750
Arg Cys Lys Val Arg Ile Glu Ala Val Asp Gly Asn Asp Pro Leu Tyr
755 760 765
Lys Val Lys Asn Gly Glu Asn Ala Leu Ala Phe Tyr Ser Arg Tyr Tyr
770 775 780
Gln Pro Leu Pro Leu Val Leu Arg Gly Tyr Gly Ala Gly Asn Asp Val
785 790 795 800
Thr Ala Ala Gly Val Phe Ala Asp Leu Leu Arg Thr Leu Ser Trp Lys
805 810 815
Leu Gly Val
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
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<222> (1)..(6)
<220>
<221> -10_signal
<222> (24)..(30)
<220>
<221> start transcription
<222> (35)..(35)
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<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> -35_signal
<222> (1)..(6)
<220>
<221> -10_signal
<222> (24)..(30)
<220>
<221> mutation
<222> (24)..(24)
<223> transition c -> t
<220>
<221> start transcription
<222> (35)..(35)
<400> 8
tagtcagcag cataaaaaag tgctagtatg aagac 35
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<211> 204
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> -35_signal
<222> (139)..(144)
<220>
<221> -10_signal
<222> (162)..(168)
<220>
<221> start transcription
<222> (173)..(173)
<400> 9
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gatggcgatg acgaagagta gtcagcagca taaaaaagtg ccagtatgaa gactccgtaa 180
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<210> 10
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<212> DNA
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<220>
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attgagatgg ctgaacagat gccgatcacc gccagcgaaa tgctcagcgt taacggcgtt 60
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gatggcgatg acgaagagta gtcagcagca taaaaaagtg ccagtatgaa gactccgtaa 180
acgtttcccc cgcgagtcaa atgt atg ttg atg tta ttt ctc acc gtc gcc 231
Met Leu Met Leu Phe Leu Thr Val Ala
1 5
atg gtg cac att gtg gcg ctt atg agc ccc ggt ccc gat ttc ttt ttt 279
Met Val His Ile Val Ala Leu Met Ser Pro Gly Pro Asp Phe Phe Phe
10 15 20 25
gtc tct cag acc gct gtc agt cgt tcc cgt aaa gaa gcg atg atg ggc 327
Val Ser Gln Thr Ala Val Ser Arg Ser Arg Lys Glu Ala Met Met Gly
30 35 40
gtg ctg ggc att acc tgc ggc gta atg gtt tgg gct ggg att gcg ctg 375
Val Leu Gly Ile Thr Cys Gly Val Met Val Trp Ala Gly Ile Ala Leu
45 50 55
ctt ggc ctg cat ttg att atc gaa aaa atg gcc tgg ctg cat acg ctg 423
Leu Gly Leu His Leu Ile Ile Glu Lys Met Ala Trp Leu His Thr Leu
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att atg gtg ggc ggt ggc ctg tat ctc tgc tgg atg ggt tac cag atg 471
Ile Met Val Gly Gly Gly Leu Tyr Leu Cys Trp Met Gly Tyr Gln Met
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cta cgt ggt gca ctg aaa aaa gag gcg gtt tct gca cct gcg cca cag 519
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gtc gag ctg gcg aaa agt ggg cgc agt ttc ctg aaa ggt tta ctg acc 567
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110 115 120
aat ctc gct aat ccg aaa gcg att atc tac ttt ggc tcg gtg ttc tca 615
Asn Leu Ala Asn Pro Lys Ala Ile Ile Tyr Phe Gly Ser Val Phe Ser
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ttg ttt gtc ggt gat aac gtt ggc act acc gcg cgc tgg ggc att ttt 663
Leu Phe Val Gly Asp Asn Val Gly Thr Thr Ala Arg Trp Gly Ile Phe
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gcg ctg atc att gtc gaa acg ctg gcg tgg ttt acc gtc gtt gcc agc 711
Ala Leu Ile Ile Val Glu Thr Leu Ala Trp Phe Thr Val Val Ala Ser
155 160 165
ctg ttt gcc ctg ccg caa atg cgc cgt ggt tat caa cgt ctg gcg aag 759
Leu Phe Ala Leu Pro Gln Met Arg Arg Gly Tyr Gln Arg Leu Ala Lys
170 175 180 185
tgg att gat ggt ttt gcc ggg gcg tta ttt gcc gga ttt ggc att cat 807
Trp Ile Asp Gly Phe Ala Gly Ala Leu Phe Ala Gly Phe Gly Ile His
190 195 200
ttg att att tcg cgg tga tgccagacgc gtcttcagag taagtcggat 855
Leu Ile Ile Ser Arg
205
aaggcgttta cgccgcatcc gacattattt ttcacgcatg cctcgccgat gctaacagcg 915
ctcccaccag cataaacaac gagccgaaaa tcttattcag cgccttcatc tgctttggtc 975
ctttaatcca tagagcaatc cgttgagcaa gggtggcgta accgatcatc acaataatat 1035
cgaccacaat agtggtgacg ccgagcacga tatactgcat cagttgcggc tgttgcggca 1095
tgatgaattg cggaaatagc gccgccagaa acaca 1130
<210> 11
<211> 206
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 11
Met Leu Met Leu Phe Leu Thr Val Ala Met Val His Ile Val Ala Leu
1 5 10 15
Met Ser Pro Gly Pro Asp Phe Phe Phe Val Ser Gln Thr Ala Val Ser
20 25 30
Arg Ser Arg Lys Glu Ala Met Met Gly Val Leu Gly Ile Thr Cys Gly
35 40 45
Val Met Val Trp Ala Gly Ile Ala Leu Leu Gly Leu His Leu Ile Ile
50 55 60
Glu Lys Met Ala Trp Leu His Thr Leu Ile Met Val Gly Gly Gly Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Cys Trp Met Gly Tyr Gln Met Leu Arg Gly Ala Leu Lys Lys
85 90 95
Glu Ala Val Ser Ala Pro Ala Pro Gln Val Glu Leu Ala Lys Ser Gly
100 105 110
Arg Ser Phe Leu Lys Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asn Pro Lys Ala
115 120 125
Ile Ile Tyr Phe Gly Ser Val Phe Ser Leu Phe Val Gly Asp Asn Val
130 135 140
Gly Thr Thr Ala Arg Trp Gly Ile Phe Ala Leu Ile Ile Val Glu Thr
145 150 155 160
Leu Ala Trp Phe Thr Val Val Ala Ser Leu Phe Ala Leu Pro Gln Met
165 170 175
Arg Arg Gly Tyr Gln Arg Leu Ala Lys Trp Ile Asp Gly Phe Ala Gly
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Ala Leu Phe Ala Gly Phe Gly Ile His Leu Ile Ile Ser Arg
195 200 205
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<212> DNA
<213> Escherichia coli
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<221> gene
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<223> rhtC coding region
<220>
<221> CDS
<222> (92)..(712)
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gcatgttgat ggcgatgacg aagagtagtc agcagcataa aaaagtgcta gtatgaagac 60
tccgtaaacg tttcccccgc gagtcaaatg t atg ttg atg tta ttt ctc acc 112
Met Leu Met Leu Phe Leu Thr
1 5
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Val Ala Met Val His Ile Val Ala Leu Met Ser Pro Gly Pro Asp Phe
10 15 20
ttt ttt gtc tct cag acc gct gtc agt cgt tcc cgt aaa gaa gcg atg 208
Phe Phe Val Ser Gln Thr Ala Val Ser Arg Ser Arg Lys Glu Ala Met
25 30 35
atg ggc gtg ctg ggc att acc tgc ggc gta atg gtt tgg gct ggg att 256
Met Gly Val Leu Gly Ile Thr Cys Gly Val Met Val Trp Ala Gly Ile
40 45 50 55
gcg ctg ctt ggc ctg cat ttg att atc gaa aaa atg gcc tgg ctg cat 304
Ala Leu Leu Gly Leu His Leu Ile Ile Glu Lys Met Ala Trp Leu His
60 65 70
acg ctg att atg gtg ggc ggt ggc ctg tat ctc tgc tgg atg ggt tac 352
Thr Leu Ile Met Val Gly Gly Gly Leu Tyr Leu Cys Trp Met Gly Tyr
75 80 85
cag atg cta cgt ggt gca ctg aaa aaa gag gcg gtt tct gca cct gcg 400
Gln Met Leu Arg Gly Ala Leu Lys Lys Glu Ala Val Ser Ala Pro Ala
90 95 100
cca cag gtc gag ctg gcg aaa agt ggg cgc agt ttc ctg aaa ggt tta 448
Pro Gln Val Glu Leu Ala Lys Ser Gly Arg Ser Phe Leu Lys Gly Leu
105 110 115
ctg acc aat ctc gct aat ccg aaa gcg att atc tac ttt ggc tcg gtg 496
Leu Thr Asn Leu Ala Asn Pro Lys Ala Ile Ile Tyr Phe Gly Ser Val
120 125 130 135
ttc tca ttg ttt gtc ggt gat aac gtt ggc act acc gcg cgc tgg ggc 544
Phe Ser Leu Phe Val Gly Asp Asn Val Gly Thr Thr Ala Arg Trp Gly
140 145 150
att ttt gcg ctg atc att gtc gaa acg ctg gcg tgg ttt acc gtc gtt 592
Ile Phe Ala Leu Ile Ile Val Glu Thr Leu Ala Trp Phe Thr Val Val
155 160 165
gcc agc ctg ttt gcc ctg ccg caa atg cgc cgt ggt tat caa cgt ctg 640
Ala Ser Leu Phe Ala Leu Pro Gln Met Arg Arg Gly Tyr Gln Arg Leu
170 175 180
gcg aag tgg att gat ggt ttt gcc ggg gcg tta ttt gcc gga ttt ggc 688
Ala Lys Trp Ile Asp Gly Phe Ala Gly Ala Leu Phe Ala Gly Phe Gly
185 190 195
att cat ttg att att tcg cgg tga tgccagacgc gtcttcagag taagtcggat 742
Ile His Leu Ile Ile Ser Arg
200 205
aaggcgttta cgccgcatcc gacattattt ttcacgcatg cctcgccgat gctaacag 800
<210> 13
<211> 206
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 13
Met Leu Met Leu Phe Leu Thr Val Ala Met Val His Ile Val Ala Leu
1 5 10 15
Met Ser Pro Gly Pro Asp Phe Phe Phe Val Ser Gln Thr Ala Val Ser
20 25 30
Arg Ser Arg Lys Glu Ala Met Met Gly Val Leu Gly Ile Thr Cys Gly
35 40 45
Val Met Val Trp Ala Gly Ile Ala Leu Leu Gly Leu His Leu Ile Ile
50 55 60
Glu Lys Met Ala Trp Leu His Thr Leu Ile Met Val Gly Gly Gly Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Cys Trp Met Gly Tyr Gln Met Leu Arg Gly Ala Leu Lys Lys
85 90 95
Glu Ala Val Ser Ala Pro Ala Pro Gln Val Glu Leu Ala Lys Ser Gly
100 105 110
Arg Ser Phe Leu Lys Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asn Pro Lys Ala
115 120 125
Ile Ile Tyr Phe Gly Ser Val Phe Ser Leu Phe Val Gly Asp Asn Val
130 135 140
Gly Thr Thr Ala Arg Trp Gly Ile Phe Ala Leu Ile Ile Val Glu Thr
145 150 155 160
Leu Ala Trp Phe Thr Val Val Ala Ser Leu Phe Ala Leu Pro Gln Met
165 170 175
Arg Arg Gly Tyr Gln Arg Leu Ala Lys Trp Ile Asp Gly Phe Ala Gly
180 185 190
Ala Leu Phe Ala Gly Phe Gly Ile His Leu Ile Ile Ser Arg
195 200 205
<210> 14
<211> 1412
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> mutation
<222> (806)..(806)
<223> rhtC promotermutation, WT-> Mut: C->T
<220>
<221> gene
<222> (849)..(1412)
<223> 5磖egion coding sequence rhtC
<400> 14
gccgttgtct ggaagagaag ccgcaggggc agttgcagga tatcgagcgc cacaaactca 60
atgcgatggg cgcgtttgcc gaagcgcaaa cttgccgtcg tctggtattg ctgaactatt 120
ttggcgaagg gcgtcaggag ccgtgcggga actgcgatat ctgcctcgat ccgccgaaac 180
agtacgacgg ttcaaccgat gctcagattg ccctttccac cattggtcgt gtgaatcagc 240
ggtttgggat gggttatgtg gtggaagtga ttcgtggtgc taataaccag cgtatccgcg 300
actatggtca tgacaaactg aaagtctatg gcatgggccg tgataaaagc catgaacatt 360
gggtgagcgt gatccgccag ctgattcacc tcggcctggt gacgcaaaat attgcccagc 420
attctgccct acaactgaca gaggccgcgc gcccggtgct gcgcggcgaa tcctctttgc 480
aacttgccgt gccgcgtatc gtggcgctca aaccgaaagc gatgcagaaa tcgttcggcg 540
gcaactatga tcgcaaactg ttcgccaaat tacgcaaact gcgtaaatcg atagccgatg 600
aaagtaatgt cccgccgtac gtggtgttta acgacgcaac cttgattgag atggctgaac 660
agatgccgat caccgccagc gaaatgctca gcgtcaacgg cgttgggatg cgcaagctgg 720
aacgctttgg caaaccgttt atggcgctga ttcgtgcgca tgttgatggc gatgacgaag 780
agtagtcagc agcataaaaa agtgctagta tgaagactcc gtaaacgttt cccccgcgag 840
tcaaatgtat gttgatgtta tttctcaccg tcgccatggt gcacattgtg gcgcttatga 900
gccccggtcc cgatttcttt tttgtctctc agaccgctgt cagtcgttcc cgtaaagaag 960
cgatgatggg cgtgctgggc attacctgcg gcgtaatggt ttgggctggg attgcgctgc 1020
ttggcctgca tttgattatc gaaaaaatgg cctggctgca tacgctgatt atggtgggcg 1080
gtggcctgta tctctgctgg atgggttacc agatgctacg tggtgcactg aaaaaagagg 1140
cggtttctgc acctgcgcca caggtcgagc tggcgaaaag tgggcgcagt ttcctgaaag 1200
gtttactgac caatctcgct aatccgaaag cgattatcta ctttggctcg gtgttctcat 1260
tgtttgtcgg tgataacgtt ggcactaccg cgcgctgggg catttttgcg ctgatcattg 1320
tcgaaacgct ggcgtggttt accgtcgttg ccagcctgtt tgccctgccg caaatgcgcc 1380
gtggttatca acgtctggcg aagtggattg at 1412
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> primer Tdh1
<400> 15
tcgcgaccta taagtttggg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> primer Tdh2
<400> 16
aataccagcc cttgttcgtg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> primer PrhtC-1
<400> 17
gcatgttgat ggcgatgacg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> primer PrhtC-2
<400> 18
ctgttagcat cggcgaggca 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> primer reqQ_1
<400> 19
gccgttgtct ggaagagaag 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> primer rht1r
<400> 20
atcaatccac ttcgccagac 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> misc
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> primer PKO3-L
<400> 21
agggcagggt cgttaaatag c 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> misc
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> PKO3-R
<400> 22
ttaatgcgcc gctacagggc g 21
201700370 Ausland 1

Claims (15)

1.一种重组的分泌L-氨基酸的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)微生物，其包含具有启动子活性的DNA片段，所述DNA片段功能性地连接编码膜蛋白的多核苷酸，特征在于所述具有启动子活性的DNA片段包含SEQ ID NO:8。
2.权利要求1的微生物，特征在于所述具有启动子活性的DNA片段在3'末端连接携带核糖体结合位点的第二DNA片段。
3.权利要求1的微生物，特征在于所述具有启动子活性的DNA片段在3'末端连接具有SEQ ID NO:9的位置174-204的核苷酸序列的第二DNA片段。
4.权利要求1的微生物，特征在于所述具有启动子活性的DNA片段在3'末端连接具有SEQ ID NO:9的位置174-204的核苷酸序列的第二DNA片段，所述第二DNA片段在其3'末端连接编码所述膜蛋白的多核苷酸。
5.前述任一项权利要求的微生物，特征在于所述具有启动子活性的DNA片段在5'末端连接具有SEQ ID NO:9的位置1-138的核苷酸序列的DNA片段。
6.前述任一项权利要求的微生物，特征在于所述膜蛋白是具有氨基酸转运蛋白活性的蛋白质。
7.权利要求6的微生物，特征在于所述具有氨基酸转运蛋白活性的蛋白质是具有氨基酸输出蛋白活性的蛋白质。
8.权利要求7的微生物，特征在于所述具有氨基酸输出蛋白活性的蛋白质具有与SEQID NO:2的序列至少90％相同的氨基酸序列。
9.权利要求8的微生物，特征在于所述具有氨基酸输出蛋白活性的蛋白质具有与SEQID NO:2的序列至少95％相同的氨基酸序列。
10.权利要求9的微生物，特征在于所述具有氨基酸输出蛋白活性的蛋白质包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列，和/或特征在于所述具有氨基酸输出蛋白活性的蛋白质由包含SEQ IDNO:1的核苷酸序列的多核苷酸编码。
11.权利要求1-9任一项的微生物，特征在于所述具有启动子活性的DNA片段存在于所述微生物的染色体中，或者可选地，特征在于所述具有启动子活性的DNA片段位于染色体外复制载体上。
12.权利要求1-11任一项的微生物，特征在于其产生L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸。
13.一种制备L-氨基酸或者含有L-氨基酸的饲料添加剂的方法，所述方法包含：
(i)在培养基中发酵权利要求1-12任一项的微生物；
(ii)富集发酵液和/或细胞中的所述L-氨基酸；及任选地
(iii)分离所述L-氨基酸。
14.一种具有启动子活性的DNA片段，其功能性地连接编码膜蛋白的多核苷酸，特征在于所述具有启动子活性的DNA片段包含SEQ ID NO:8。
15.包含SEQ ID NO:8的DNA片段作为调节编码膜蛋白或氨基酸转运蛋白的基因的表达水平的启动子的用途。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113728105B (zh) * 2018-12-26 2024-05-28 大象株式会社 生产l-氨基酸的大肠杆菌突变株或谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的l-氨基酸的生产方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1260393A (zh) * 1998-12-23 2000-07-19 味之素株式会社 新基因和生产l－氨基酸的方法

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU875663A1 (ru) 1978-06-30 1982-09-15 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Штаммы е.coLI ВНИИГенетика VL 334 @ N6 и ВНИИГенетика VL 334 @ N7-продуценты L-треонина и способ их получени
SU943282A1 (ru) 1979-07-13 1982-07-15 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Способ получени L-треонина
JPS565099A (en) 1979-06-25 1981-01-20 Ajinomoto Co Inc Production of l-histidine through fermentation process and microorganism used therefor
JPS5618596A (en) 1979-07-23 1981-02-21 Ajinomoto Co Inc Production of l-lysine through fermentation process
JPS5685289A (en) 1979-12-13 1981-07-11 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-valine by fermentation
US4371614A (en) 1980-08-22 1983-02-01 Ajinomoto Co., Inc. E.Coli bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-tryptophan
SU974817A1 (ru) 1981-06-16 1990-08-23 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Способ получени L-треонина
JPS6437295A (en) 1987-07-31 1989-02-07 Kyowa Hakko Kogyo Kk Production of l-threonine by fermentation
US4990487A (en) 1988-03-11 1991-02-05 The University Of Tokyo Superconductive optoelectronic devices
DE3891417T1 (de) 1988-10-25 1991-01-10 Vnii Genetiki Selektsii Promy Stamm der bakterien escherichia coli bkiim b-3996, produziert von l-threonin
JP3036930B2 (ja) 1991-11-11 2000-04-24 協和醗酵工業株式会社 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法
JP3131311B2 (ja) 1992-10-27 2001-01-31 協和醗酵工業株式会社 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法
JP3151075B2 (ja) 1992-12-22 2001-04-03 協和醗酵工業株式会社 アラニンの製造法
ATE210728T1 (de) 1993-10-28 2001-12-15 Ajinomoto Kk Herstellungsverfahren einer substanz
CA2152885C (en) 1994-06-30 2007-05-01 Tetsuo Nakano Process for producing l-leucine
JP3717970B2 (ja) 1995-05-31 2005-11-16 協和醗酵工業株式会社 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法
JP4032441B2 (ja) 1995-08-30 2008-01-16 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造方法
GB2304718B (en) 1995-09-05 2000-01-19 Degussa The production of tryptophan by the bacterium escherichia coli
US5763230A (en) 1996-03-22 1998-06-09 Triple-A B.V. P/A Produkschap Voor Veevoedor Amino acid fermentation processes
US5939307A (en) 1996-07-30 1999-08-17 The Archer-Daniels-Midland Company Strains of Escherichia coli, methods of preparing the same and use thereof in fermentation processes for l-threonine production
SK284235B6 (en) 1997-10-04 2004-11-03 Forschungszentrum Juelich Gmbh Method for microbial production of amino acids of the aspartate and/or glutamate family and agents which can be used in the said method
KR100270509B1 (ko) 1998-08-14 2000-11-01 고두모 신규 미생물 및 이를 이용한 엘- 쓰레오닌의 제조방법
KR100270510B1 (ko) 1998-08-14 2000-11-01 고두모 신규 미생물 및 이를 이용한 엘- 쓰레오닌의 제조방법
DE19907347A1 (de) 1999-02-20 2000-08-24 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
JP2003204788A (ja) 1999-07-19 2003-07-22 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
KR100468391B1 (ko) 1999-08-26 2005-01-27 대상 주식회사 쓰레오닌 제조 미생물 및 제조방법
RU2212447C2 (ru) 2000-04-26 2003-09-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Штамм escherichia coli - продуцент аминокислоты (варианты) и способ получения аминокислот (варианты)
CN100443592C (zh) 2000-05-27 2008-12-17 德古萨股份公司 发酵制备l-苏氨酸的方法
AU2002220542A1 (en) 2000-08-31 2002-03-13 Degussa A.G. Fermentation process for the preparation of l-threonine
US7220571B2 (en) 2000-09-28 2007-05-22 Archer-Daniels-Midland Company Escherichia coli strains which over-produce L-threonine and processes for the production of L-threonine by fermentation
CN1680547A (zh) 2000-09-30 2005-10-12 德古萨股份公司 使用肠细菌科菌株发酵生产l－氨基酸的方法
WO2002036797A2 (en) 2000-11-04 2002-05-10 Degussa Ag Process for the fermentative preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family
KR100397423B1 (ko) 2001-02-13 2003-09-13 씨제이 주식회사 Ｌ-쓰레오닌의 제조방법
DE10116518A1 (de) 2001-04-03 2002-10-17 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE60230040D1 (de) 2001-07-06 2009-01-08 Evonik Degussa Gmbh Fermentationsverfahren zur herstellung von l-aminosäuren unter verwendung von stämmen aus der familie der enterobacteriaceae
ES2313555T3 (es) 2001-07-11 2009-03-01 Evonik Degussa Gmbh Proceso para la preparacion de l-treonina que utiliza cepas de la familia enterobacteriaceas.
EP1407025B1 (en) 2001-07-18 2008-04-23 Evonik Degussa GmbH Process for the preparation of l-threonine using strains of the enterobacteriaceae family which contain an enhanced male gene
EP1407021B1 (en) 2001-07-18 2008-02-27 Evonik Degussa GmbH Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family which contain an attenuated ugpb gene
US7319026B2 (en) 2002-03-07 2008-01-15 Degussa Ag Amino acid-producing bacteria and a process for preparing L-amino acids
WO2005014842A1 (en) 2003-08-01 2005-02-17 Degussa Ag Process for the preparation of l-threonine
WO2005014840A1 (en) 2003-08-01 2005-02-17 Degussa Ag Process for the preparation of l-threonine
DE102004028859A1 (de) 2003-08-01 2005-02-24 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Threonin
EP1649032A1 (en) 2003-08-01 2006-04-26 Degussa AG Process for the preparation of l-threonine
DE102004029639A1 (de) 2003-08-12 2005-03-24 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Threonin
US9713359B2 (en) 2015-05-06 2017-07-25 Yu Hsieh Industrial Co., Ltd. Shoe body with arch suspended support

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1260393A (zh) * 1998-12-23 2000-07-19 味之素株式会社 新基因和生产l－氨基酸的方法
US20050239177A1 (en) * 1998-12-23 2005-10-27 Livshits Vitaliy A Novel gene and method for producing L-amino acids

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI: ""Sequence 12 from patent US 11053526，MX927149.1"", 《GENBANK》, pages 1 *
ROBERT C. BREWSTER 等: ""Tuning Promoter Strength through RNA Polymerase Binding Site Design in Escherichia coli"", 《PLOS COMPUTATIONAL BIOLOGY》, vol. 8, no. 12, pages 1 - 10 *
董迅衍 等: ""微生物生产L-苏氨酸的代谢工程研究进展"", 《食品与生物技术学报》, vol. 35, no. 12, pages 1233 - 1240 *

Also Published As

Publication number Publication date
PH12019000285A1 (en) 2021-04-26
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