CN110747129A - 利用gaba促进微藻中油脂和gaba快速积累的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利用GABA促进微藻中油脂和GABA快速积累的方法，属于生物工程领域。步骤为：以葡萄糖为碳源异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用新鲜的BG‑11培养基稀释重悬浮藻细胞作为诱导藻液；用双蒸水配制100mmol/L的GABA母液，将其添加到含有40μmol/L镉诱导藻液中稀释GABA浓度为0.25‑25mmol/L，并置于温度为24～26℃、光照条件下诱导培养。本发明可提高油脂和GABA含量，同时利用微藻吸收了重金属镉，也为利用微藻生产GABA和生物处理工业废水提供了新的思路。

Description

利用GABA促进微藻中油脂和GABA快速积累的方法
技术领域
本发明涉及利用GABA促进微藻中油脂和GABA快速积累的方法，属于生物工程领域。
背景技术
微藻生物质作为替代陆生植物生产生物燃料的原料，因其可以进行光合作用，能有效利用太阳能将水、二氧化碳和无机盐转化为有机物。微藻具有光合利用率高、生长速度快、对生长环境要求低及储能物质(油脂、烃)含量高等优点已被广泛研究。
在异养条件下微藻利用葡萄糖等有机碳源可快速积累生物质，大大缩短了藻细胞生长周期，提高了细胞生物量产率，但异养条件下培养的藻细胞品质较差，一般获得的藻细胞油脂含量较低，因此异养阶段一般不适于积累油脂。而采用两阶段法诱导微藻积累油脂成为当今研究的热点，Zhao等利用“异养-光诱导”大幅度提高了微藻中油脂含量。
除了合成油脂外，微藻在非生物胁迫下可积累其他的代谢物，如色素、蛋白质等。GABA(γ-氨基丁酸)是一种四碳非蛋白类氨基酸，因其具有抗氧化、可调控植物在生物和非生物胁迫下的抗性被广泛关注。因此，GABA(γ-氨基丁酸)不仅是一种代谢物更是一种新型的植物生长调节剂。此外，前人报道研究表明植物生长调节剂可调控微藻在非生物胁迫下的生长和代谢。而GABA(γ-氨基丁酸)用于调控微藻生长和油脂合成还未见报道。
镉(Cd)作为工业废水中最主要的重金属污染源之一，对动物和人类有很强的毒害作用；此外，镉(Cd)对植物生长和发育也会产生较强的负面效应，因此，清除和回收环境中的镉尤为重要。采用生物吸附可以有效清除环境中的镉离子(Cd2+)。Zhao等报道了镉胁迫有助于微藻中油脂的合成，但会抑制微藻生长，进而增加利用微藻产油的成本；而GABA(γ-氨基丁酸)作为植物生长调节剂，可能有利于缓解微藻对镉(Cd)毒的抗性，因此采用添加外源GABA(γ- 氨基丁酸)诱导微藻在镉(Cd)胁迫下同时积累油脂和內源GABA (γ-氨基丁酸)，一方面可能进一步提高微藻油脂产率，同时用于生产副产物GABA(γ-氨基丁酸)，另一方面也为微藻吸附废水中的重金属镉(Cd)提供了新的思路。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明提供利用GABA促进微藻中油脂和GABA快速积累的方法，采用可异养的微藻，进行藻种异养的培养使藻细胞在短时间内快速生长，随后稀释至适量的浓度进行光自养培养，利用外源添加GABA(γ-氨基丁酸)促进镉胁迫藻细胞大量积累油脂和內源GABA(γ-氨基丁酸)，同时借助微藻吸收Cd2+(镉离子)；本发明操作简单，能够缩短藻细胞的生长周期，提高微藻中油脂的产率和GABA含量，同时吸附培养基中的Cd2+(镉离子)。
利用GABA促进微藻中油脂和GABA快速积累的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a、诱导藻液的制备：以葡萄糖为碳源的BG-11培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期5000r/min离心5min收集藻细胞，在超净台中，用灭菌后新鲜的BG-11培养基稀释重悬浮藻细胞至0.7g/L作为诱导藻液,向其中加入Cd2+，得到含有40μmol/L Cd2 +的诱导藻液；
b、诱导藻细胞积累油脂和GABA：将GABA和双蒸水配制得到 100mmol/L的GABA母液，将GABA母液添加到步骤(a)的诱导藻液中稀释GABA浓度为0.25-25mmol/L，并置于温度为24-26℃、光照条件下诱导培养，得到最终的培养液。
进一步的，所述单针藻为单针藻菌株。
进一步的，所述步骤(b)中光照强度为30-35μmol m-2s-1。
进一步的，利用有机溶剂提取步骤(b)得到的培养液中藻细胞内的油脂：将由步骤b得到的最终的培养液经5000r/min离心富集5 min，收集藻细胞，用蒸馏水反复洗涤3次后，-20℃冷冻过夜，利用冻干机冻干12h制成干藻粉后称取0.15g，加入石英砂并研磨混匀，再加入有机溶剂重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂。
进一步的，所述的有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，其中氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:2；所述石英砂的质量为干藻粉质量的 2倍。
进一步的，通过高效液相色谱测量GABA的含量：将所述干藻粉取0.1g与6mL 4％(v/v)乙酸溶液一起研磨，匀浆液在室温下提取1h且每间隔20min涡旋振荡一次，6037×g离心15min，收集上清液并加入4mL优级纯乙醇，去除大分子聚合物，振荡混匀，随后取2mL液体16770×g离心20min，收集1mL上清液，在0.1MPa，45℃条件下真空干燥，使乙醇和乙酸挥发，残余物用0.5mL蒸馏水溶解， 2683×g离心10min后进行样品衍生化，取300μL样品上清液真空干燥，将干燥后的残余物溶解于60μL乙醇-水-三乙胺，真空干燥，残余物溶解于90μL乙醇-水-三乙胺-PITC中，室温反应20min，形成PITC-GABA，然后真空干燥，将干燥后的残余物溶解于600μL含体积分数80％A相和体积分数20％B相中，pH为5.8，将样品衍生化后，然后用0.45μm的滤膜过滤，待测；洗脱梯度由A/B相组成，洗脱梯度0.6mL/min等梯度洗脱，检测波长254nm处的峰面积，每 50min进样一次；准确称取0.1g GABA标准品，用超纯水配制成1g/L的母液，以GABA标准品浓度12.5、25、50、100、200和500mg/L 为横坐标，及每个标准品浓度对应波长254nm处的峰面积为纵坐标构建GABA标准曲线，得到GABA标准曲线：y＝28.241x+396.17， R2＝0.9922，y为峰面积，x为GABA浓度，mg/L；通过标准曲线得到GABA浓度c(mg/L)，最终得到GABA含量：P(mg/g)＝ c(mg/L)V(mL)/m(g)。
进一步的，所述A相为将8.205g无水乙酸钠、0.5mL三乙胺、 0.7mL乙酸、5mL乙腈，加水定容至1L得到；所述B相由乙腈和水组成，其中乙腈和水体积比为3：2；所述乙醇-水-三乙胺体积比为 2：2：1；所述乙醇-水-三乙胺-PITC体积比为7：1：1：1。
进一步的，利用电感耦合等离子体质谱检测藻细胞内Cd2+含量：量取0.05g所述干藻粉装入消解管，加入3mL浓硝酸和2mL双氧水，180℃微波加热25min，将消解后的液体转移至新的玻璃管中并稀释至25mL,利用ICP-MS测定藻细胞内Cd2+含量。
本发明的有益效果为：
本发明工序简单方便、环保，不仅提高了微藻中油脂和內源 GABA(γ-氨基丁酸)的积累，而且有效吸收了Cd2+(镉离子)；
本发明显著提高了微藻在镉胁迫下的油脂含量，当外源添加2.5 mmol/L GABA(γ-氨基丁酸)下油脂含量比对照组提高了1.49倍，较单独镉胁迫下提高了1.09倍；GABA(γ-氨基丁酸)含量较对照组和单独镉胁迫下分别提高了50.03％和10.88％。
本发明中当添加0和2.5mmol/L GABA(γ-氨基丁酸)时，微藻细胞内Cd2+(镉离子)含量分别为524.6和453.66μg/g，GABA(γ- 氨基丁酸)的添加抑制了微藻对Cd2+(镉离子)的吸收，提高了对微藻在镉胁迫下的抗性。
附图说明
图1为不同处理组中单针藻细胞内Cd2+的含量。
具体实施方式
下面结合图1及具体实施方式，对本发明作进一步说明。
对比例1：未添加GABA和Cd2+的情况下，测量微藻中油脂和内源GABA的含量，具体步骤如下：
(1)诱导藻液的制备：在温度为25℃条件下，以葡萄糖为碳源的BG-11培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期 (生物量达到5g/L)收集藻细胞，用新鲜的BG-11培养基稀释重悬浮藻细胞至0.7g/L作为诱导藻液；
(2)诱导藻细胞积累油脂和GABA：将诱导藻液置于温度为 25℃、光照条件下诱导培养，得到最终的培养液；
(3)利用有机溶剂提取步骤(2)藻细胞内的油脂：其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:2；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将(2)中得到的最终的培养液经5000r/min离心富集5min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称取0.15g加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2倍。其生物量为0.8g/L，油脂含量为细胞干重的 37.07％(见表1)，油脂产率为73.99mg/L/d。
(4)提取步骤(2)藻细胞内的GABA：将(3)中的干藻粉取 0.1g与6mL 4％(v/v)乙酸溶液一起研磨，匀浆液在室温下提取1h (间隔20min涡旋振荡一次)，6037×g离心15min，收集上清液并加入4mL优级纯乙醇，去除大分子聚合物，振荡混匀，取2mL液体16770×g离心20min，收集1mL上清液，真空干燥(0.1MPa，45℃)，使乙醇和乙酸挥发，残余物用0.5mL蒸馏水溶解，2683×g离心10min 后进行样品衍生化，取300μL样品上清液真空干燥，残余物溶解于 60μL乙醇-水-三乙胺(体积比2：2：1)，真空干燥，残余物溶解于 90μL乙醇-水-三乙胺-PITC(体积比7：1：1：1)中，室温反应20min，形成PITC-GABA，然后真空干燥，残余物溶解于600μL含体积分数 80％A相(8.205g无水乙酸钠，0.5mL三乙胺，0.7mL乙酸，5mL 乙腈，加水定容至1L)和体积分数20％B相(乙腈和水体积比为3： 2)，pH为5.8，将样品衍生化后，然后用0.45μm的滤膜过滤，待测。洗脱梯度由洗脱液A(8.205g无水乙酸钠，0.5mL三乙胺，0.7mL乙酸，5mL乙腈，加水定容至1L)和洗脱液B(乙腈和水体积比为 3：2)组成，洗脱梯度0.6mL/min等梯度洗脱，检测波长254nm处的峰面积，50min进样一次。准确称取0.1g GABA标准品，用超纯水配制成1g/L的母液，以GABA标准品浓度12.5、25、50、100、 200和500mg/L为横坐标，及每个标准品浓度对应波长254nm处的峰面积为纵坐标构建GABA标准曲线，得到GABA标准曲线：y＝ 28.241x+396.17，R2＝0.9922，y为峰面积，x为GABA浓度，mg/L；通过标准曲线得到GABA浓度c(mg/L)，最终得到GABA含量：P(mg/g) ＝c(mg/L)V(mL)/m(g)。其胞内GABA为16.09mg/g(表1)。
实施例1：只添加Cd2+的情况下，测量微藻中油脂和内源GABA的含量，具体步骤如下：
(1)诱导藻液的制备：在温度为25℃条件下，以葡萄糖为碳源的BG-11基础培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期(生物量达到5g/L)收集藻细胞，用新鲜的BG-11培养基稀释重悬浮藻细胞至0.7g/L作为诱导藻液；
(2)诱导藻细胞积累油脂和GABA：将含有40μmol/L Cd2+诱导藻液置于温度为25℃、光照条件下诱导培养，得到最终的培养液；
(3)利用有机溶剂提取步骤(2)藻细胞内的油脂；其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:2；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将(2)得到的最终的培养液经5000r/min离心富集5min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称0.15g加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2倍。其生物量为0.76g/L，油脂含量为细胞干重的 50.6％(见表1)，油脂产率为96.65mg/L/d，其油脂含量和油脂产率较对照组分别增加了1.36和1.31倍。
(4)提取步骤(2)藻细胞内的GABA：将(3)中的干藻粉取 0.1g冻干后的干藻粉与6mL 4％(v/v)乙酸溶液一起研磨，匀浆液在室温下提取1h(间隔20min涡旋振荡一次)，6037×g离心15min，收集上清液并加入4mL优级纯乙醇，去除大分子聚合物，振荡混匀，取2mL液体16770×g离心20min，收集1mL上清液，真空干燥 (0.1MPa，45℃)，使乙醇和乙酸挥发，残余物用0.5mL蒸馏水溶解，2683×g离心10min后进行样品衍生化，取300μL样品上清液真空干燥，残余物溶解于60μL乙醇-水-三乙胺(体积比2：2：1)，真空干燥，残余物溶解于90μL乙醇-水-三乙胺-PITC(体积比7：1： 1：1)中，室温反应20min，形成PITC-GABA，然后真空干燥，残余物溶解于600μL含体积分数80％A相(8.205g无水乙酸钠，0.5mL 三乙胺，0.7mL乙酸，5mL乙腈，加水定容至1L)和体积分数20％B 相(乙腈和水体积比为3：2)，pH为5.8，将样品衍生化后，然后用0.45μm的滤膜过滤，待测。洗脱梯度由洗脱液A(8.205g无水乙酸钠，0.5mL三乙胺，0.7mL乙酸，5mL乙腈，加水定容至1L) 和洗脱液B(乙腈和水体积比为3：2)组成，洗脱梯度0.6mL/min 等梯度洗脱，检测波长254nm处的峰面积，50min进样一次。准确称取0.1gGABA标准品，用超纯水配制成1g/L的母液，以GABA 标准品浓度12.5、25、50、100、200和500mg/L为横坐标，及每个标准品浓度对应波长254nm处的峰面积为纵坐标构建GABA标准曲线，得到GABA标准曲线：y＝28.241x+396.17，R2＝0.9922，y为峰面积，x为GABA浓度，mg/L；通过标准曲线得到GABA浓度 c(mg/L)，最终得到GABA含量：P(mg/g)＝c(mg/L)V(mL)/m(g)。其胞内GABA为21.77mg/g(表1)，较对照组增加了35.3％。
(5)将(3)中的干藻粉量取0.05g干藻粉装入消解管，加入3 mL浓硝酸和2mL双氧水，180℃微波加热25min，将消解后的液体转移至新的玻璃管中并稀释至25mL，过滤后利用ICP-MS测定藻细胞内Cd2+含量为4196.83μg/g(图1)。
实施例2：只添加2.5mM GABA的情况下，测量微藻中油脂和内源 GABA的含量，具体步骤如下：
(1)诱导藻液的制备：在温度为25℃条件下，以葡萄糖为碳源的BG-11基础培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期(生物量达到5g/L)收集藻细胞，用新鲜的BG-11培养基稀释重悬浮藻细胞至0.7g/L作为诱导藻液；
(2)诱导藻细胞积累油脂和GABA：用双蒸水配制100mmol/L 的GABA母液，将GABA母液添加到步骤(1)诱导藻液中稀释GABA 浓度为2.5mmol/L，并置于温度为25℃、光照条件下诱导培养，得到最终的培养液；
(3)利用有机溶剂提取步骤(2)藻细胞内的油脂；其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:2；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将(2)得到的最终的培养液经5000r/min离心富集5min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称0.15g加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2倍。其生物量为0.83g/L，油脂含量为细胞干重的 44.28％(见表1)，油脂产率为91.82mg/L/d，分别较对照组增加了 1.19和1.24倍，同时只达到了单独镉胁迫下的87.51％和95％。
(4)提取步骤(2)藻细胞内的GABA：将(3)得到的干藻粉取0.1g与6mL 4％(v/v)乙酸溶液一起研磨，匀浆液在室温下提取 1h(间隔20min涡旋振荡一次)，6037×g离心15min，收集上清液并加入4mL优级纯乙醇，去除大分子聚合物，振荡混匀，取2mL 液体16770×g离心20min，收集1mL上清液，真空干燥(0.1MPa， 45℃)，使乙醇和乙酸挥发，残余物用0.5mL蒸馏水溶解，2683×g 离心10min后进行样品衍生化，取300μL样品上清液真空干燥，残余物溶解于60μL乙醇-水-三乙胺(体积比2：2：1)，真空干燥，残余物溶解于90μL乙醇-水-三乙胺-PITC(体积比7：1：1：1)中，室温反应20min，形成PITC-GABA，然后真空干燥，残余物溶解于600μL含体积分数80％A相(8.205g无水乙酸钠，0.5mL三乙胺， 0.7mL乙酸，5mL乙腈，加水定容至1L)和体积分数20％B相(乙腈和水体积比为3：2)，pH为5.8，将样品衍生化后，然后用0.45μm 的滤膜过滤，待测。洗脱梯度由洗脱液A(8.205g无水乙酸钠，0.5mL 三乙胺，0.7mL乙酸，5mL乙腈，加水定容至1L)和洗脱液B(乙腈和水体积比为3：2)组成，洗脱梯度0.6mL/min等梯度洗脱，检测波长254nm处的峰面积，50min进样一次。准确称取0.1g GABA 标准品，用超纯水配制成1g/L的母液，以GABA标准品浓度12.5、 25、50、100、200和500mg/L为横坐标，及每个标准品浓度对应波长254nm处的峰面积为纵坐标构建GABA标准曲线，得到GABA标准曲线：y＝28.241x+396.17，R2＝0.9922，y为峰面积，x为GABA 浓度，mg/L；通过标准曲线得到GABA浓度c(mg/L)，最终得到GABA 含量：P(mg/g)＝c(mg/L)V(mL)/m(g)。其胞内GABA为18.91mg/g(表 1)，比对照组增加了17.53％，但较单独镉胁迫下有一定的下降。
实施例3：添加浓度为0.25mmol/L的GABA和含有40μmol/L Cd2+的情况下，测量微藻中油脂和内源GABA的含量，具体步骤如下：
(1)诱导藻液的制备：在温度为25℃条件下，以葡萄糖为碳源的BG-11基础培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期(生物量达到5g/L)收集藻细胞，用新鲜的BG-11培养基稀释重悬浮藻细胞至0.7g/L作为诱导藻液；
(2)诱导藻细胞积累油脂和GABA：用双蒸水配制100mmol/L 的GABA母液，将GABA母液添加到步骤(1)的含有40μmol/L Cd2+诱导藻液中稀释GABA浓度为0.25mmol/L，并置于温度为24℃、光照条件下诱导培养，得到最终的培养液；
(3)利用有机溶剂提取步骤(2)藻细胞内的油脂；其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:2；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将步骤(2)得到的最终的培养液经5000r/min离心富集5min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称0.15g加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2倍。其生物量为0.78g/L，油脂含量为细胞干重的53.26％(见表1)，油脂产率为103.75mg/L/d，其油脂产率较对照组和单独镉胁迫下分别增加了1.4和1.07倍。
(4)提取步骤(2)藻细胞内的GABA：将(3)得到的干藻粉取0.1g与6mL 4％(v/v)乙酸溶液一起研磨，匀浆液在室温下提取 1h(间隔20min涡旋振荡一次)，6037×g离心15min，收集上清液并加入4mL优级纯乙醇，去除大分子聚合物，振荡混匀，取2mL 液体16770×g离心20min，收集1mL上清液，真空干燥(0.1MPa， 45℃)，使乙醇和乙酸挥发，残余物用0.5mL蒸馏水溶解，2683×g 离心10min后进行样品衍生化，取300μL样品上清液真空干燥，残余物溶解于60μL乙醇-水-三乙胺(体积比2：2：1)，真空干燥，残余物溶解于90μL乙醇-水-三乙胺-PITC(体积比7：1：1：1)中，室温反应20min，形成PITC-GABA，然后真空干燥，残余物溶解于600μL含体积分数80％A相(8.205g无水乙酸钠，0.5mL三乙胺， 0.7mL乙酸，5mL乙腈，加水定容至1L)和体积分数20％B相(乙腈和水体积比为3：2)，pH为5.8，将样品衍生化后，然后用0.45μm 的滤膜过滤，待测。洗脱梯度由洗脱液A(8.205g无水乙酸钠，0.5mL 三乙胺，0.7mL乙酸，5mL乙腈，加水定容至1L)和洗脱液B(乙腈和水体积比为3：2)组成，洗脱梯度0.6mL/min等梯度洗脱，检测波长254nm处的峰面积，50min进样一次。准确称取0.1g GABA 标准品，用超纯水配制成1g/L的母液，以GABA标准品浓度12.5、 25、50、100、200和500mg/L为横坐标，及每个标准品浓度对应波长254nm处的峰面积为纵坐标构建GABA标准曲线，得到GABA标准曲线：y＝28.241x+396.17，R2＝0.9922，y为峰面积，x为GABA 浓度，mg/L；通过标准曲线得到GABA浓度c(mg/L)，最终得到GABA 含量：P(mg/g)＝c(mg/L)V(mL)/m(g)。其胞内GABA为21.56mg/g(表 1)，与单独镉胁迫下相当。
(5)将(3)得到的干藻粉量取0.05g干藻粉装入消解管，加入 3mL浓硝酸和2mL双氧水，180℃微波加热25min，将消解后的液体转移至新的玻璃管中并稀释至25mL，过滤后利用ICP-MS测定藻细胞内Cd2+含量为4037.6μg/g(图1)，低于单独镉胁迫下的镉含量。
实施例4：添加浓度为2.5mmol/L的GABA和含有40μmol/L Cd2+的情况下，测量微藻中油脂和内源GABA的含量，具体步骤如下：
(1)诱导藻液的制备：在温度为25℃条件下，以葡萄糖为碳源的BG-11基础培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期(生物量达到5g/L)收集藻细胞，用新鲜的BG-11培养基稀释重悬浮藻细胞至0.7g/L作为诱导藻液；
(2)诱导藻细胞积累油脂和GABA：用双蒸水配制100mmol/L 的GABA母液，将GABA母液添加到步骤(1)的含有40μmol/L Cd2+诱导藻液中稀释GABA浓度为2.5mmol/L，并置于温度为25℃、光照条件下诱导培养，得到最终的培养液；
(3)利用有机溶剂提取步骤(2)藻细胞内的油脂：其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:2；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将步骤(2)得到的最终的培养液经5000r/min离心富集5min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称0.15g加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2倍。其生物量为0.81g/L，油脂含量为细胞干重的55.37％(见表1)，油脂产率为111.54mg/L/d，其油脂产率分别较对照组和单独镉胁迫下提高了1.51和1.15倍。
(4)提取步骤(2)藻细胞内的GABA：将(3)得到的干藻粉取0.1g与6mL 4％(v/v)乙酸溶液一起研磨，匀浆液在室温下提取 1h(间隔20min涡旋振荡一次)，6037×g离心15min，收集上清液并加入4mL优级纯乙醇，去除大分子聚合物，振荡混匀，取2mL 液体16770×g离心20min，收集1mL上清液，真空干燥(0.1MPa， 45℃)，使乙醇和乙酸挥发，残余物用0.5mL蒸馏水溶解，2683×g 离心10min后进行样品衍生化，取300μL样品上清液真空干燥，残余物溶解于60μL乙醇-水-三乙胺(体积比2：2：1)，真空干燥，残余物溶解于90μL乙醇-水-三乙胺-PITC(体积比7：1：1：1)中，室温反应20min，形成PITC-GABA，然后真空干燥，残余物溶解于600μL含体积分数80％A相(8.205g无水乙酸钠，0.5mL三乙胺， 0.7mL乙酸，5mL乙腈，加水定容至1L)和体积分数20％B相(乙腈和水体积比为3：2)，pH为5.8，将样品衍生化后，然后用0.45μm 的滤膜过滤，待测。洗脱梯度由洗脱液A(8.205g无水乙酸钠，0.5mL 三乙胺，0.7mL乙酸，5mL乙腈，加水定容至1L)和洗脱液B(乙腈和水体积比为3：2)组成，洗脱梯度0.6mL/min等梯度洗脱，检测波长254nm处的峰面积，50min进样一次。准确称取0.1g GABA 标准品，用超纯水配制成1g/L的母液，以GABA标准品浓度12.5、 25、50、100、200和500mg/L为横坐标，及每个标准品浓度对应波长254nm处的峰面积为纵坐标构建GABA标准曲线，得到GABA标准曲线：y＝28.241x+396.17，R2＝0.9922，y为峰面积，x为GABA 浓度，mg/L；通过标准曲线得到GABA浓度c(mg/L)，最终得到GABA 含量：P(mg/g)＝c(mg/L)V(mL)/m(g)。其胞内GABA为24.14mg/g(表 1)，其含量较单独镉胁迫下提高了10.89％。
(5)将(3)得到的干藻粉量取0.05g干藻粉装入消解管，加入 3mL浓硝酸和2mL双氧水，180℃微波加热25min，将消解后的液体转移至新的玻璃管中并稀释至25mL，过滤后利用ICP-MS测定藻细胞内Cd2+含量为3629.25μg/g(图1)，显著低于单独镉胁迫下的镉含量。
实施例5：添加浓度为25mmol/L的GABA和含有40μmol/L Cd2+的情况下，测量微藻中油脂和内源GABA的含量，具体步骤如下：
(1)诱导藻液的制备：在温度为25℃条件下，以葡萄糖为碳源的BG-11基础培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期(生物量达到5g/L)收集藻细胞，用新鲜的BG-11培养基稀释重悬浮藻细胞至0.7g/L作为诱导藻液；
(2)诱导藻细胞积累油脂和GABA：用双蒸水配制100mmol/L 的GABA母液，将GABA母液添加到步骤(1)的含有40μmol/L Cd2+诱导藻液中稀释GABA浓度为25mmol/L，并置于温度为26℃、光照条件下诱导培养，得到最终的培养液；
(3)利用有机溶剂提取步骤(2)藻细胞内的油脂；其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:2；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将步骤(2)得到的最终的培养液经5000r/min离心富集5min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称0.15g加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2倍。其生物量为0.79g/L，油脂含量为细胞干重的54.3％(见表1)，油脂产率为107.82mg/L/d，其油脂产率分别较对照组和单独镉胁迫下提高了1.46和1.12倍。
(4)提取步骤(2)藻细胞内的GABA：将(3)得到的干藻粉取0.1g与6mL 4％(v/v)乙酸溶液一起研磨，匀浆液在室温下提取 1h(间隔20min涡旋振荡一次)，6037×g离心15min，收集上清液并加入4mL优级纯乙醇，去除大分子聚合物，振荡混匀，取2mL 液体16770×g离心20min，收集1mL上清液，真空干燥(0.1MPa， 45℃)，使乙醇和乙酸挥发，残余物用0.5mL蒸馏水溶解，2683×g 离心10min后进行样品衍生化，取300μL样品上清液真空干燥，残余物溶解于60μL乙醇-水-三乙胺(体积比2：2：1)，真空干燥，残余物溶解于90μL乙醇-水-三乙胺-PITC(体积比7：1：1：1)中，室温反应20min，形成PITC-GABA，然后真空干燥，残余物溶解于600μL含体积分数80％A相(8.205g无水乙酸钠，0.5mL三乙胺， 0.7mL乙酸，5mL乙腈，加水定容至1L)和体积分数20％B相(乙腈和水体积比为3：2)，pH为5.8，将样品衍生化后，然后用0.45μm 的滤膜过滤，待测。洗脱梯度由洗脱液A(8.205g无水乙酸钠，0.5mL 三乙胺，0.7mL乙酸，5mL乙腈，加水定容至1L)和洗脱液B(乙腈和水体积比为3：2)组成，洗脱梯度0.6mL/min等梯度洗脱，检测波长254nm处的峰面积，50min进样一次。准确称取0.1g GABA 标准品，用超纯水配制成1g/L的母液，以GABA标准品浓度12.5、 25、50、100、200和500mg/L为横坐标，及每个标准品浓度对应波长254nm处的峰面积为纵坐标构建GABA标准曲线，得到GABA标准曲线：y＝28.241x+396.17，R2＝0.9922，y为峰面积，x为GABA 浓度，mg/L；通过标准曲线得到GABA浓度c(mg/L)，最终得到GABA 含量：P(mg/g)＝c(mg/L)V(mL)/m(g)。其胞内GABA为24.96mg/g(表 1)，与单独镉胁迫下相当。
(5)将(3)得到的干藻粉量取0.05g干藻粉装入消解管，加入 3mL浓硝酸和2mL双氧水，180℃微波加热25min，将消解后的液体转移至新的玻璃管中并稀释至25mL，过滤后利用ICP-MS测定藻细胞内Cd2+含量为3746μg/g(图1)，显著低于单独镉胁迫下的镉含量。
表1不同处理组中单针藻生物量、油脂含量、油脂产率和GABA含量
*表示P＜0.05，**表示P＜0.01.
结合先异养后自养的两阶段方法，发现镉胁迫可显著促进微藻中油脂的积累，但会抑制藻细胞的生长；添加外源GABA可以进一步提高微藻在镉胁迫下的油脂含量。此外，较单独镉胁迫下2.5mM GABA显著地提高了其油脂含量和油脂产率并降低了其胞内镉含量；同时增加了內源GABA含量。通过此诱导微藻的方法，既实现了藻细胞中油脂的快速、大量积累，同时提高了副产物GABA含量，从而降低了微藻生物炼制的成本，也为利用微藻处理工业废水提供了新的思路。
以上所述，仅是本发明的较佳案例，并不对本发明做出任何限制，凡是针对本发明技术内容对以上实施案例所做的任何简单修改、变更、模仿均属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (8)

1.利用GABA促进微藻中油脂和GABA快速积累的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a、诱导藻液的制备：以葡萄糖为碳源的BG-11培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期5000r/min离心5min收集藻细胞，在超净台中，用灭菌后新鲜的BG-11培养基稀释重悬浮藻细胞至0.7g/L作为诱导藻液,向其中加入Cd2+，得到含有40μmol/L Cd2+的诱导藻液；
b、诱导藻细胞积累油脂和GABA：用GABA和双蒸水配制得到100mmol/L的GABA母液，将GABA母液添加到步骤(a)的诱导藻液中稀释GABA浓度为0.25-25mmol/L，并置于温度为24-26℃、光照条件下诱导培养，得到最终的培养液。
2.根据权利要求1所述的利用GABA促进微藻中油脂和GABA快速积累的方法，其特征在于：所述单针藻为单针藻菌株。
3.根据权利要求1所述的利用GABA促进微藻中油脂和GABA快速积累的方法，其特征在于：所述步骤(b)中光照强度为30-35μmol m-2s-1。
4.据权利要求1所述的利用GABA促进微藻中油脂和GABA快速积累的方法，其特征在于：利用有机溶剂提取步骤(b)得到的培养液中藻细胞内的油脂：将由步骤b得到的最终的培养液经5000r/min离心富集5min，收集藻细胞，用蒸馏水反复洗涤3次后，-20℃冷冻过夜，利用冻干机冻干12h制成干藻粉后称取0.15g，加入石英砂并研磨混匀，再加入有机溶剂重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂。
5.据权利要求4所述的利用GABA促进微藻中油脂和GABA快速积累的方法，其特征在于：所述的有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，其中氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:2；所述石英砂的质量为干藻粉质量的2倍。
6.据权利要求4所述的利用GABA促进微藻中油脂和GABA快速积累的方法，其特征在于：通过高效液相色谱测量GABA的含量：将所述干藻粉取0.1g与6mL 4％(v/v)乙酸溶液一起研磨，匀浆液在室温下提取1h且每间隔20min涡旋振荡一次，6037×g离心15min，收集上清液并加入4mL优级纯乙醇，去除大分子聚合物，振荡混匀，随后取2mL液体16770×g离心20min，收集1mL上清液，在0.1MPa，45℃条件下真空干燥，使乙醇和乙酸挥发，残余物用0.5mL蒸馏水溶解，2683×g离心10min后进行样品衍生化，取300μL样品上清液真空干燥，残余物溶解于60μL乙醇-水-三乙胺，真空干燥，将干燥后的残余物溶解于90μL乙醇-水-三乙胺-PITC中，室温反应20min，形成PITC-GABA，然后真空干燥，将干燥后的残余物溶解于600μL含体积分数80％A相和体积分数20％B相中，pH为5.8，将样品衍生化后，然后用0.45μm的滤膜过滤，待测；洗脱梯度由A/B相组成，洗脱梯度0.6mL/min等梯度洗脱，检测波长254nm处的峰面积，每50min进样一次；准确称取0.1g GABA标准品，用超纯水配制成1g/L的母液，以GABA标准品浓度12.5、25、50、100、200和500mg/L为横坐标，及每个标准品浓度对应波长254nm处的峰面积为纵坐标构建GABA标准曲线，得到GABA标准曲线：y＝28.241x+396.17，R2＝0.9922，y为峰面积，x为GABA浓度，mg/L；通过标准曲线得到GABA浓度c(mg/L)，最终得到GABA含量：P(mg/g)＝c(mg/L)V(mL)/m(g)。
7.根据权利要求6所述的利用GABA促进微藻中油脂和GABA快速积累的方法，其特征在于：所述A相为将8.205g无水乙酸钠、0.5mL三乙胺、0.7mL乙酸、5mL乙腈，加水定容至1L得到；所述B相由乙腈和水组成，其中乙腈和水体积比为3：2；所述乙醇-水-三乙胺体积比为2：2：1；所述乙醇-水-三乙胺-PITC体积比为7：1：1：1。
8.据权利要求4所述的利用GABA促进微藻中油脂和GABA快速积累的方法，其特征在于：利用电感耦合等离子体质谱检测藻细胞内Cd2+含量：量取0.05g所述干藻粉装入消解管，加入3mL浓硝酸和2mL双氧水，180℃微波加热25min，将消解后的液体转移至新的玻璃管中并稀释至25mL,利用ICP-MS测定藻细胞内Cd2+含量。
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